KR20110025215A - 방사성 동위원소 표지로 표지된 항―ｃｄｈ３ 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방사성 동위원소로 표지될 수 있는 항-CDH3 항체에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 방법 및 활성성분으로서 항-CDH3 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. CDH3은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암 세포에서 강하게 발현하므로, 본 발명은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암 치료법에서 유용하다.

Description

방사성 동위원소 표지로 표지된 항―ＣＤＨ３ 항체 및 이의 용도{ANTI―CDH３ANTIBODIES LABELED WITH RADIOISOTOPE LABEL AND USES THEREOF}

우선권

본 출원은 2008년 6월 30일 출원된 미국 가출원 제 61/076,982호에 근거하며, 그 내용 전체가 본 명세서에 참조로서 통합된다.

본 발명은 방사성 동위원소 표지가 결합된 항-CDH3 항체를 이용하여 암 세포를 손상시키는 방법, 또는 이러한 목적을 위한 조성물에 관한 것이다.

카데린(Cadherin)은 칼슘 의존적 세포내 결합을 형성하는 세포-세포 결합 당단백질이며, 형태발생(morphogenesis) 및 성체 조직 및 기관의 발달과 유지에 있어서 필수적인 역할을 수행한다(Conacci-Sorrell M, et al., J Clin Invest, 109:987-91,(2002)). 배아발생(embryogenesis) 중, 특정한 카데린의 세포 발현은 세포 분류 및 조직 계층화의 과정에 있어서 매우 중요한 특이항체 상호작용을 야기한다(Nose A, et al., Cell, 54:993-1001,(1988), Steinberg MS, et al.,. Proc Natl Acad Sci USA, 91:206-9,(1994) 및 Takeichi M. Science, 251:1451-5,(1991)). 이러한 세포 결합의 변화는 세포 불안정성에 중요한 역할을 수행하며, 섬세하게 조절되는 상피 구조의 분화 과정을 변화시킬 수 있다(Daniel CW, et al., Dev Biol, 169:511-9,(1995) and Nose A and Takeichi M. J Cell Biol, 103:2649-58,(1986)). 이러한 이유로, 카데린의 기능적 손실 또는 과발현 및 이러한 단백질을 안호화하는 유전자의 조절의 기저에 있는 분자적 기작은 발암(carcinogenesis)와 관련되어 왔다(Behrens J. Cancer Metastasis Rev, 18:15-30(1999)).

상기 카데린 패밀리는 특이적 조직 분포를 보이는 클래스 E-, P-, N- 카데린을 포함하는 다양한 하위 패밀리로 나누어진다(Takeichi M. Development, 102:639-55(1988)). 비록 E-카데린은 모든 상피 조직에서 발현되지만, P-카데린(CDH3)의 발현은 전립선 및 피부를 포함하는 오직 계층화된 상피의 기저(basal) 또는 아래 층, 및 유방 근육상피세포에 제한된다(Takeichi M. J Cell Biol 103:2649-58,(1986) and Shimoyama Y, et al., Cancer Res, 49:2128-33(1989)).

또한, 현재 다수의 증거가 비정상적인 P-카데린 발현이 세포의 증식이 결장, 유방, 폐, 갑상선, 및 자궁의 종양과 관련된다는 것을 밝혔다(Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654,(2001) ; 및 Stefansson, et al., J. Clin. Oncol. 22(7):1242-1252(2004)). 인간 P-카데린은 외음 표피암(vulvar epidermoid carcinoma)에 대하여 생성된 NCC-CAD-299 단일클론 항체가 인식하는 항원이라고 보고되었다(Shimoyama, et al., Cancer Res., 49:2128-2133(1989)). 유착(adhesion)과 세포내 신호전달을 매개하는 P-카데린의 조절은 생체 내(in vivo)에서 암 세포의 증식과 생존을 감소시킬 것으로 예측된다. 이에 따라, P-카데린은 세포증식 및 고형암의 진행에 특징이 있다고 보는 중요한 역할의 관점에서, P-카데린에 대한 항체를 생성하는 것은 다양한 암을 갖은 환자에게 치료학적 이익을 제공할 수 있으므로 바람직하다.

암 특이적 분자에 대한 단일클론 항체는 암 치료에 있어서 유용하다는 것이 증명되어 왔다(Harris, M.(2004). Lancet Oncol, 5, 292-302.). 유방암, 악성 림프종 및 결장암을 위한 트라추즈맵(trastuzumab)(Baselga, J.(2004). Oncology, 61, SuuplSuupl 2 14-21.), 리툭시맵(rituximab)(Maloney, D.G., et al.(1997). Blood, 90, 2188-2195.) 및 베바시시주맙(bevacizumab)(Ferrara, N., et al.(2004). Nat Rev Drug Discov, 3, 391-400.)과 같은 인간화(humanized) 또는 키메라(chimeric) 항체의 임상학적 활용의 성공적인 사례 이외에도, 다른 분자 표적에 대한 다양한 단일클론 항체가 개발중에 있으며, 이들의 항 종양 활성이 평가되고 있다. 이러한 단일클론 항체는 효과적인 치료가 없는 암을 갖고 있는 환자에게 희망을 제공할 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 단일클론 항체의 다른 중요한 문제 중 하나는 표적 분자를 발현하는 세포에 대한 단일클론 항체의 작용으로 인한 심각한 독성 없이 암세포 선택적인 치료 효과의 획득이다(Crist, W.M., et al.(2001). J Clin Oncol, 19, 3091-3102.; Wunder, J.S., et al.(1998). J Bone Joint Surg Am, 80, 1020-1033.; Ferguson, W.S. and Goorin, A.M.(2001). Cancer Invest, 19, 292-315, WO2002/097395, WO2004/110345, WO2006/114704, WO2007/102525.).

본 발명은 서열번호 3에 나타난 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는, CDH3에 대한 단일클론 항체를 제공한다. 이 항체의 생체 내 종양 결합 활성은 방사성 핵종(radionuclides)을 이용한 종래의 방법에 더불어 근적외선 형광을 이용한 생체 내 이미지 시스템의 형광을 이용하여 나타난다. 본 발명은 다수의 암 세포주를 가지고 있는 이종이식 마우스에서 90Y-표지된 항-CDH3 단일클론 항체(클론#6) 및 이의 키메라(ch-#6)의 1회 또는 2회 투여로 치료받는 경우, 상기 마우스에서 유의적인 항종양 효과의 증거를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 하기와 관련된다:

[1] 서열번호 3에 나타난 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편. 구체적인 실시예에서, 상기 본 발명의 항체 또는 단편은 서열번호 13, 14 및 15에 나타난 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR) 또는 이와 기능적으로 동등한 CDR(즉, 상기 동일한 항원결정기와 결합)를 포함하는 H 체인 V 부위(Heavy chain Variable region), 및 서열번호 16, 17 및 18 에 나타난 아미노산 서열을 갖는 CDR 또는 이와 기능적으로 동등한 CDR(즉, 상기 동일한 항원결정기와 결합)을 포함하는 L 체인 V 부위(light chain Variable region)를 포함하고, CDH3 단백질 또는 이의 부분 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포함한다.

[2] 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 방사성 동위 원소 표지로 표지될 수 있다. 구체적인 실시예에서, 상기 방사성 동위원소 표지는 ⁹⁰이트륨(⁹⁰yttrium, ⁹⁰Y), ¹²⁵아이오딘(¹²⁵iodine, ¹²⁵I) 및 ¹¹¹인듐(¹¹¹indium, ¹¹¹In)으로 구성된 군에서 선택된다.

[3] 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 약학적으로 유효한 양을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 조성물. 구체적인 실시예에서, 상기 암은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암이다.

[4] 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 약학적으로 유효한 양을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 암의 예방 또는 치료 방법. 구체적인 실시예에서, 상기 암은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암이다.

[5] 하기의 단계를 포함하는 개체 내 CDH3 관련 질환 또는 상기 질환이 발달할 수 있는 성향을 진단 또는 예후를 위한 방법

(a) 상기 개체로부터 유래한 샘플 또는 시료를 본 발명에 따른 항체 또는 단편과 접촉시키기;

(b) 상기 샘플 또는 시료에서 CDH3 단백질의 유무를 검출하기; 및

(c) 대조군에 비하여 CDH3 단백질의 상대적 수도(relative abundance)에 근거하여, 상기 개체가 상기 질환을 겪거나 또는 상기 질환이 발달할 위험이 있는지를 결정하기.

구체적인 실시예에서, 상기 암은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암 세포이다.

[6] 본 발명의 항체 또는 단편을 포함하는 CDH3 관련 질환의 진단 또는 예후를 위한 키트. 구체적인 실시예에서, 상기 암은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암이다.

[도 1] 도 1은 세포주에서 CDH3 발현 결과를 나타낸다. 상위 패널(pannel)은 각 항체를 이용한 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 나타낸다. KLM-1 및 H358는 CDH3 양성 암 세포주이다. MIAPaCa-2는 음성 대조군 세포주이다. 항 erbB2는 양성 대조군으로서 이용한다. 모든 기재된 항-CDH3 항체 클론은 특이적으로 상기 CDH3를 발현하는 세포를 인식한다. 하위 패널은 암 세포주에서 CDH3 유전자의 반정량적 RT-PCR 분석 결과를 나타내는 그림이다.
[도 2의 A-B] 도 2의 A는 Alexa 647-표지된 항체 클론을 각각 투여한 후, 종양을 갖고 있는 마우스의 생체내(in vivo) 형광 이미지를 나타낸다. 형광 표지된 항체 클론은 정맥으로 투여된다. 모든 형광 이미지는 투여 이후, 3, 24, 48 및 72 시간째 획득되었다. Alexa647의 형광 신호는 적색이 높은 농도라는 것을 의미하는 의사색체(pseudo-color)화 되었다. 도 2의 B는 EBC1 인간 폐암 이종이식된 각각의 마우스에서 ¹¹¹In-표지된 항-CDH3 항체의 생물학적 분포를 나타낸다(B: 클론1).
[도 2의 C-D] 도 2의 C 내지 D는 EBC1 인간 폐암 이종이식된 각각의 마우스에서 ¹¹¹In-표지된 항-CDH3 항체의 생물학적 분포를 나타낸다(C: 클론3, D: 클론4).
[도 2의 E-F] 도 2의 E 내지 F는 EBC1 인간 폐암 이종이식된 각각의 마우스에서 ¹¹¹In-표지된 항-CDH3 항체의 생물학적 분포를 나타낸다(E: 클론5, F: 클론6).
[도 3의 A-B] 도 3의 A 내지 B는 ¹¹¹In-표지된 클론#6 항체 또는 대조군 항체의 생물학적 분포를 나타낸다. 상기 이식된 종양(A: EBC-1, B: SW948), 간, 신장, 장, 위, 비장, 췌장, 폐, 심장, 근육 및 뼈는 투여 48시간 후 분리되고, 상기 방사성 활성이 측정되었다. 블랙 박스(Black box)는 각각의 조직에서 항-CDH3 항체의 축적을 나타낸다.
[도 3의 C-D] 도 3의 C 내지 D는 ¹¹¹In-표지된 클론#6 항체 또는 대조군 항체의 생물학적 분포를 나타낸다. 상기 이식된 종양(C: KLM-1, D: H1373), 간, 신장, 장, 위, 비장, 췌장, 폐, 심장, 근육 및 뼈는 투여 48시간 후 분리되고, 상기 방사성 활성이 측정되었다. 블랙 박스는 각각의 조직에서 항-CDH3 항체의 축적을 나타낸다.
[도 3의 E] 도 3의 E는 ¹¹¹In-표지된 항-CDH3 키메라 또는 마우스 항체 #6, 또는 대조군으로서 정상 인간 IgG 또는 마우스 IgG1의 생물학적 분포를 나타낸다. 상기 이식된 종양(H1373), 간, 신장, 장, 위, 비장, 췌장, 폐, 심장, 근육 및 뼈는 투여 48시간 후 분리되고, 상기 방사성 활성이 측정되었다. 블랙 박스는 각각의 조직에서 항-CDH3 키메라 항체의 축적을 나타낸다. 화이트 박스(White box)는 각각의 조직에서 항-CDH3 마우스 항체의 축적을 나타낸다.
[도 4의 A-B] 도 4는 종양 성장에 ⁹⁰Y-표지된 항-CDH3 항체(클론#6)의 효과를 나타낸다. 도 4의 A는 ⁹⁰Y-표지된 항-CDH3 항체(클론#6)의 1회 투여가 누드 마우스에 이식된 EBC-1 세포의 성장을 억제하는 것을 나타낸다. 도 4의 B는 상기 투여 이후, 종양 조직의 HE 염색을 나타낸다. 오른쪽 패널에 나타난 바와 같이, 상기 종양 조직이 에오신(eosin)에 의해서 염색된 섬유조직을 대체하고 있다(적색).
[도 5의 A-B] 도 5의 A는 ⁹⁰Y-표지된 항-CDH3 항체(클론#6)의 1회 투여가 누드 마우스에 이식된 SW948 세포의 성장을 억제하는 것을 나타낸다. 도 5의 B 는 종양의 외관 사진을 나타낸다. 상기 ⁹⁰Y-표지된 항-CDH3 항체 투여 이후, 상기 종양은 명백히 감소한다.
[도 6] 도 6은 ⁹⁰Y-표지된 항-CDH3 항체(클론#6)의 1회 투여가 누드 마우스에 이식된 KLM-1 세포의 성장을 억제하는 것을 나타낸다.
[도 7] 도 7은 ⁹⁰Y-표지된 항-CDH3의 1회 투여가 누드 마우스에 이식된 SW948 세포의 성장을 억제하는 것을 나타낸다.
[도 8] 도 8은 ⁹⁰Y-표지된 항-CDH3 키메라 항체(ch-#6)의 1회 투여가 누드 마우스에 이식된 KLM-1 세포의 성장을 억제하는 것을 나타낸다. CHX 및 SCN는 각각 p-SCN-Bn-CHX-A"-DTPA 및 p-SCN-Bn-DTPA를 나타낸다. 항체는 ⁹⁰Y를 이용한 방사성 표지를 위한 이러한 이작용 킬레이터에 결합된다.

본 발명은 항-CDH3 항체, 조성물 및 암의 예방 및 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 구체적인 실시예에서, 상기 항체는 방사성 동위원소 표지로 표지된다.

췌장암 환자로부터 수득한 췌장암 세포 및 정상 세포의 유전자 발현 분석을 위한 cDNA 마이크로어레이가 보고된 바 있다(Nakamura et al.,(2004) Oncogene; 23: 2385-400). 췌장암 세포에서 특이적으로 발현이 증가된 다수의 유전자가 잇따라 동정되었다. 췌장암 세포에서 발현이 변화되는 유전자들 중, 하나의 유전자인 주요 기관에서 발현이 낮은 세포질막 단백질을 암호화하는 태반 카데린(P-카데린; CDH3)(Genbank Accession No.NM_001793; SEQ ID No.1, 2) 유전자는 췌장암 치료법을 위한 표적 유전자로서 선택되었다. 또한, 유사한 CDH3의 과발현이 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 및 간암 세포주와 같은 다른 암 세포주에서 확인되었다(WO/2007/102525).

정의

본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 지정된 단백질 또는 이의 펩티드에 특이적으로 반응하는 면역글로불린 및 이의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 인간 항체, 영장류화된 항체, 키메라 항체, 이중특이성 항체, 인간화 항체, 다른 단백질 또는 방사성 표지에 융합된 항체, 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 명세서의 항체는 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 구체적으로 온전한 단일클론 항체, 다클론 항체, 최소 2개의 온전한 단일클론 항체로부터 형성된 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 항체 단편을 포함한다. "항체"는 모든 유형을 나타낸다(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM).

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부이며, 일반적으로 상기 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명에서 항체 단편은 상기 온전한 항체의 항원 결합 일부를 포함할 수 있다. 상기 본 명세서에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 단순 "항체 부분" 또는 "항체 단편")는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 지닌 하나 또는 다수의 항체의 면역 활성 단편을 일컫는다(예를 들어, CDH3). 항체의 항원 결합 능력은 전체 길이 항체의 단편에 의해서 발휘될 수 있다는 것이 밝혀진바 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 선형 항체; 단일 체인 항체 분자가 포함된다. 구조와 상관없이, 항체 단편은 상기 온전한 항체에 의해서 인식되는 상기 동일한 항원에 결합한다. 또한, 상기 용어 "항체 단편"은 L 체인 가변 부위로 구성된 폴리펩티드, H 및 L 체인의 가변 부위로 구성된 "Fv" 단편, L 및 H 가변 부위가 펩티드 링커에 의해서 연결된 재조합 단일 체인 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 초가변 부위과 유사한 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위와 같은 특이적 항원에 결합하는 합성 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드를 포함한다.

당업자는 상기 본 발명의 항체의 서열에 상당부분 상응하는 가변 부위(상보성 결정 부위 포함)을 포함하는 항체가 언급된 서열로부터 변이될 수 있으며, 동일한 항원 결정기를 특이적으로 계속 인식할 수 있다고 이해할 것이다. 상기 서열로부터 이러한 변이는 상기 서열 내의 동일한 아미노산의 백분율의 측면에서 기재될 수 있다. 몇몇의 실시예에서, 이러한 비율은 약 90%에서 약 100%이며, 예를 들어, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이다.

둘 또는 이상의 폴리펩티드 서열의 문맥에 있어서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 비율은, 하기 기재된 디폴트(default) 기준으로 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 이용하여 측정하거나, 또는 매뉴얼 정렬 및 비주얼 검사(visual inspection)(예를 들어, NCBI 웹사이트의 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 또는 이와 유사한 사이트 참조)에 의해서 측정되었을 때, 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정한 비율을 갖는(즉, 비교 윈도우(comparison window) 또는 지정된 부분에 대한 최대한 대응을 위하여 비교하고 정렬하였을 때, 특정 부분에 대하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 동일성) 둘 또는 그 이상의 서열 또는 하위서열을 일컫는다. 그리고 이러한 서열은 "상당히 동일한"이라고 일컫는다. 또한, 이러한 정의는 테스트 서열의 상보를 일컫거나, 이에 적용될 수 있다. 또한, 상기 정의는 결손 및/또는 첨가된 서열뿐만 아니라, 치환된 서열을 포함한다. 하기에 기재된 바와 같이, 상기 바람직한 알고리즘은 갭(gap) 등을 확인할 수 있다. 바람직하게, 동일성은 약 25개 아미노산 길이인 부분에 존재하며, 더욱 바람직하게는 50 ~ 100개 아미노산 길이 부분에 존재한다.

서열 비교에 있어서, 일반적으로 하나의 서열은 테스트 서열이 비교되는 참조서열로서 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 테스트 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 만약 필요하면 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 기준이 지정된다. 바람직하게, 디폴트 프로그램 기준이 이용될 수 있으며, 또는 대안적인 기준이 지정될 수 있다. 그리고 상기 서열 비교 알고리즘은 상기 프로그램 기준에 근거하여, 참조 서열에 상대적인 테스트 서열의 서열 동일성 비율을 계산한다.

본 명세서에 사용한 "비교 윈도우(comparison window)"는 두 개의 서열이 최적화되게 정렬된 후, 인접한 위치의 동일한 수의 참조 서열을 비교한 서열에서 20 내지 600개, 보통 약 50개 내지 약 200개, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 150개로 구성된 군에서 선택되는 인접한 위치중 어느 하나의 단편에 대한 참조가 포함된다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적화된 정렬이 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)의 국소 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat' l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)의 유사성 탐색 방법, 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 자동화된 수행, 또는 매뉴얼 정렬 및 비주얼 검사(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1987-2005, Wiley Interscience) 참조)에 의해서 수행될 수 있다.

서열 동일성 비율 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 바람직한 예로는 Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402(1977) 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)에서 각각 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 명세서에서 본 발명의 핵산 또는 단백질 서열 동일성 비율을 확인하기 위하여 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 공개적으로 National Center for Biotechnology Information을 통해서 이용가능하다.

항체의 생산

본 발명의 요지는 CDH3에 대한 항체를 이용한다. 이러한 항체는 공지된 방법에 의해서 제공될 것이다.

본 발명에 따라 사용되는 항체의 생산을 위한 바람직한 기술이 기재된다.

(i) 다클론 항체

바람직하게 다클론 항체는 상기 관련 있는 항체(예를 들어, 서열번호 3) 및 보조제의 피하(sc) 또는 복강(ip)으로의 다수의 주사에 의해서 생성된다. 이는 면역력을 갖게 되는 종에서 예를 들어, 키홀-림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민(serum albumin), 소 티로글로불린(bovine thyroglobulin), 또는 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙시니미드 에스테르(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(시스테인(cysteine) 잔기를 통한 결합), N-하이드록시숙시니미드(N-hydroxysuccinimide)(라이신(lysine) 잔기를 통함), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 석신산무수물(succinic anhydride), SOC12, 또는 R과 R이 다른 알킬 그룹인 R'N=C=NR와 같은 이작용 또는 유도체화 시약(derivatizing agent)를 이용한 콩 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)와 같은 면역성인 단백질에 관련있는 항원을 결합시키는데 유용할 수 있다.

동물들은 단백질의 100 mcg 또는 5 mcg 또는 결합체(각각 토끼 또는 마우스용)를 3배 부피의 Freund's complete 보조제와 결합하고, 상기 용액을 여러 위치에 피부내로 주입하여 상기 항원, 면역성의 컨쥬게이트(conjugates), 또는 유도체에 대하여 면역력을 갖는다. 한 달 뒤, 상기 동물은 여러 위치에 파히 주입에 의해서 Freund's complete 보조제 내의 원래의 펩티드 또는 결합체의 1/5 내지 1/10의 양으로 증가된다. 7일 내지 14일이 지난 후, 상기 동물에서 혈액을 채취하고, 상기 혈청은 항체의 농도를 위해서 분석한다. 동물은 상기 농도가 안정기에 접어들 때까지 부스트된다. 바람직하게, 상기 동물은 상기 동일한 항원의 컨쥬게이트에 의해서 부스트(boost)되나, 다른 단백질 및/또는 다른 교차 연결을 통하여 연결된 항원에 결합될 수 있다.

또한, 결합체는 단백질 융합과 같은 재조한 세포 배양에서 생성될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제(aggregating agent)를 상기 면역반응을 증가시키기 위하여 적절하게 사용할 수 있다.

( ii ) 단일클론 항체

단일클론 항체는 실질적으로 동종의 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 발생하는 변이를 제외한 동일한 군을 포함하는 개별적인 항체의 군으로부터 획득된다. 따라서, 상기 변형된 한정된 "단일클론"은 개별적인 항체의 혼합물이 되지 않는 항체의 특성을 의미한다.

예를 들어, 상기 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256: 495(1975)에 의해서 최초로 기재된 하이브리도마(hybridoma) 방법을 이용하여 제조되거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해서 제조될 수 있다(미국 특허 제 4,816,567).

상기 하이브리도마 방법에 있어서, 마우스 또는 햄스터와 같은 다른 적합한 숙주 동물은 본 명세서에서 면역을 위해 사용된 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 이끌어냄으로써 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내(in vitro)에서 면역력을 갖을 수 있다. 그리고, 림프구는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 적합한 융합제를 이용하여 하이브리도마 세포를 생성하기 위하여 골수종(myelanoma)세포와 결합된다(Goding, Monocolonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986)).

그리고 상기 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게 융합되지 않은 모체의(parental) 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 또는 다수의 물질을 포함하는 적합한 배양액에서 심은 뒤에 배양된다. 예를 들어, 만약 상기 모체 골수종 세포가 히포크산틴-구아닌포스포리보실 전달효소(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase)(HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되었다면, 상기 하이브리도마용 배양액은 일반적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 물질인 히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(아미노프테린(aminopterin)), 및 티미딘(thymidine)(HAT 배지)를 포함할 것이다.

바람직한 골수종 세포는 효과적으로 융합되며, 상기 선택된 항체 생산 세포에 의해서 높은 수준으로 안정적으로 항체 생산을 보장하며, HAT 배지와 같은 배지에 대하여 민감한 세포이다. 이러한 세포 중, 바람직한 골수종 세포주는 Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, California USA)에서 이용할 수 있는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래한 세포주, 및 American Type Culture Collection(Manassas, Virginia, USA)에서 이용할 수 있는 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포와 같은 마우스 골수종 라인이 있다. 또한, 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종(heteromyeloma) 세포주가 인간 단일클론 항체 생산한다는 것이 기재된바 있다(Kozbor, J. Immunol., 133: 300 1(1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

하디브리도마 세포가 배양되는 배양액은 상기 항원에 대한 단일클론 항체의 생성 분석에 사용된다. 바람직하게, 상기 하이브리도마 세포에 의해서 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 방사 면역 검정(radioimmunoassay, RIA) 또는 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)과 같은 시험관 내 결합 분석에 의해서 확인된다.

상기 단일클론 항체의 결합 친화성은 예를 들어, Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220(1980)의 30 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해서 확인될 수 있다.

하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 결합성, 및/또는 활성의 항체를 생산한다고 확인된 후, 상기 클론은 희석 방법의 제한에 의해서 서브클론되고 표준 방법에 의해서 배양된다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986)). 이러한 목적을 위한 적합한 배약액은 예를 들어, D-MEM 또는 RPML-1640 배지가 포함된다. 추가로, 상기 하이브리도마 세포는 동물의 복수 종양과 같이 생체 내(in vivo)에서 배양될 수 있다.

상기 서브클론에 의해서 분비되는 단일클론 항체는 상기 배양액, 복수액, 또는 예를 들어, 단백질 A-세파로즈(Protein A-Sepharose), 하이드록시라파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography), 젤 크로마토그래피(gel electrophoresis), 투석(dialysis), 또는 친화성 크로마토그래피(친화성 크로마토그래피(affinity chromatography))와 같은 일반적인 면역글로불린 정제 방법에 의한 혈청으로부터 분리된다.

상기 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 분리되고, 일반적인 방법(예를 들어, 마우스 항체의 H 및 L 체인을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여)을 이용하여 시퀀싱된다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 원천으로서 역할을 한다. 한번 분리되면, 상기 DNA는 발현 벡터에 삽입된 다음, 이는 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 위해서, 형질전환되지 않았으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 E. coli 세포, 유인원 COS 세포, 중국햄스터난소세포(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주세포내로 형질전환된다. 상기 항체를 암호화하는 DNA의 박테리아 내의 재조합 발현에 관한 리뷰 논문에는 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262(1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188(1992)이 포함된다.

CDH3에 대해 반응성이 있는 특이적인 항체 또는 항체 단편을 생산하는 또다른 방법은 CDH3 단백질 또는 펩티드를 갖는 박테리아에서 발현되는, 면역글로불린 유전자, 또는 이의 일부를 암호화하는 발현 라이브러리 스크리닝이 있다. 예를 들어, 완전한 Fab 단편, VH 부분 및 Fv 부분은 파지(phage) 발현 라이브러리를 이용한 박테리아에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Ward et al., Nature 341: 544-546(1989) ; Huse et al., Science 246: 1275- 1281(1989) ; and McCafferty et al., Nature 348: 552-554(1990)를 참조하라. 예를 들어, CDH3 펩티드를 이용한 라이브러리 스크리닝은 CDH3에 반응하는 면역글로불린 단편을 동정할 수 있다. 대안적으로, 상기 SCID-hu 마우스(Genpharm에서 이용가능함)는 항체 또는 이의 단편을 생산하기 위하여 사용될 수 있다.

추가적인 실시예에서, 항체 또는 항체 단편은 McCafferty et al., Nature, 348: 552-554(1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628(1991)에 기재된 기술을 이용하여 생산된 항체 파지(phage) 라이브러리로부터 분리될 수 있으며, Marks et al., J MoL BioL, 222: 581-597(1991)에서는 파지(phage) 라이브러리를 이용하여 마우스 및 인간 항체를 각각 분리하는 방법이 기재된다. 잇따른 문헌에서는 체인 셔플링(chain shuffling)에 의한 높은 친화력(nM 범위)은 인간 항체의 생산이 기재되어 있으며(Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783(1992)), 또한 매우 큰 파지 라이브러리(phage libraries)를 제조하기 위한 전략으로서 조합 감염(combinatorial infection) 및 생체 내 재조합이 기재되어 있다. 따라서, 이러한 기술은 단일클론 항체를 분리하기 위한 종래의 단일클론 항체 하이브리도마 기술로 대체될 수 있다.

또한, 상기 DNA는 예를 들어, 인간 H 및 L 체인 불변 도메인(domain)의 서열을 유사한 마우스 서열로 치환하거나(미국 특허 제 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. ScL USA, 81: 6851(1984)), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드를 암호화 서열의 전부 또는 일부를 암호화하는 면역글로불린과 공유적으로 결합에 의해서 변형될 수 있다.

전형적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 또는 이들은 항원에 대한 특이성을 갖는 항원 결합위치와 다른 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원 결합위치를 포함하는 키메라 2가염색체 항체를 만들기 위하여, 항체의 항원결합위치의 하나의 가역 도메인을 치환한다.

서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는, CDH 단백질의 세포 외 도메인에 결합하는 어떠한 항체는 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 항체가 서열번호 3을 인식하는 한, 이러한 항체는 본 발명의 방법, 또는 조성물에 이용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 인식하는 항체는 적어도 막통과(transmembrane) 및 이의 세포외 도메인으로 구성되는 CDH를 발현하는 세포에 결합할 수 있다.

반면, 본 발명은 또한 CDH3 관련 질환의 치료 또는 진단에 적합한 항체를 제공한다. 특히, 하기의 특성으로 정의되는 상기 항체는 이러한 목적을 위해서 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항체의 VH 및 VL 도메인은 각각 프레임 워크 부분으로 나뉘어진 CDR1, CDR2, 및 CDR3로 지정된 세 개의 CDR을 포함한다. 상기 CDR의 아미노산 서열은 상기 항체가 CDH에 결합할 수 있는 한, 특정하게 한정되지 않는다. 바람직한 CDR 아미노산 서열의 실시예는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:

VH CDR1 : SYWIH(서열번호 13),

VH CDR2 : EIDPSDNYTYYNQNFKG(서열번호 14),

VH CDR3 : SGYGNLFVY(서열번호 15),

VL CDR1 : SATSSVTYMY(서열번호 16),

VL CDR2 : RTSNLAS(서열번호 17), 및

VL CDR3 : QHYHIYPRT(서열번호 18)

CDR을 예측할 수 있는 방법 중 하나는 Kabat E. A. et al.(1991) Sequence of Proteinss of Immunological Interest. 5th Edition. NIH Publication No. 91-3242에 기재된다.

보다 바람직한 실시예에서, VH는 서열번호 11의 아미노산 서열에 상응하며, VH는 서열번호 12의 아미노산 서열에 상응한다.

본 발명에 따르면, 상기 단일클론 항체 및 이의 결합 단편은 하기로 특징지어질 수 있다:

i) 서열번호 11 및 12의 아미노산 서열에 의해서 정의되는 가변 부위을 포함하는 항체;

ii) 본 명세서에 기재된 CDR의 아미노산 서열에 의해서 정의되는 단일클론 항체와 같이, 동일한 항원결정기에 결합할 수 있는 항체;

iii) 상기 아미노산 서열에 의해서 정의되는 단일클론 항체의 결합 단편; 또는

iv) 상기 아미노산 서열에 의해서 정의되는 단일클론 항체와 같이, 동일한 항원결정기에 결합할 수 있는 단일클론 항체의 결합 단편.

상기 분자 생물의 표준 기술은 키메라 및 CDR 이식된 산물을 암호화하는 DNA 서열을 제조하는데 이용할 수 있다. 관심있는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자는 예를 들어 항체 생성 세포의 RNA로부터 상기 가변 부위을 합성하기 위하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어, Larrick et al., "Methods: a Companion to Methods in Enzymology", vol. 2: 페이지 106(1991) ; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application; Ritter et al.(eds.), 페이지 166(Cambridge University Press, 1995), 및 Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications; Birch et al.(eds.), 페이지 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995)를 참조하라). 상기 키메라 및 CDR 이식된 산물을 암호화하는 DNA 서열을 올리고뉴클레오티드 합성 기술만을 이용하거나, 부분적으로 이용하여 합성할 수 있다. 위치지정 돌연변이(Site-directed mutagenesis) 및 중합효소 연쇄반응 기술은 적절하게 이용할 수 있다. 예를 들어, Jones et al.,(1986) Nature.;321:522-5에 의해서 기술한 올리고뉴클레오티드 직접 합성이 이용될 수 있다. 또한, 예를 들어, Verhoeyen et al.,(1988) Science.;239:1534-6 또는 Riechmann et al.,(supra)에 의해서 기술된, 이미 존재하는 가변 부위의 올리고뉴클레오티드 직접 돌연변이(oligonucleotide directed mutagenesis)가 이용될 수 있다. 또한, 예를 들어 Queen et al.,(1989) Proc Natl Acad Sci USA.;86:10029-33; PCT Publication WO 90/07861에서 기재된 T4 DNA 중합 효소를 이용한 비어있는 올리고뉴클레오티드를 효소로 채우는 것을 이용할 수 있다.

어떠한 숙주 세포/벡터 시스템이 CDR 이식된 H 및 L 체인을 암호화하는 DNA 서열의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어, E. coli, 및 다른 미생물 시스템은 특히 FAb 및 (Fab' )2 단편과 같은 항체 단편, 및 예를 들어, 단일-체인 Fvs와 같은 특히 Fv 단편 및 단일-체인 항체 단편의 발현을 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유류, 숙주 세포 발현 시스템과 같은 진핵생물은 특히 완전한 항체 분자를 포함하는 큰 CDR 이식된 항체 산물의 생산에 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO 세포 및 골수종 또는 하이브리도마 세포주를 포함한다.

( iii ) 인간화 항체

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 알려져 왔다. 바람직하게, 인간화 항체는 비-인간 근원으로부터 하나 또는 다수의 아미노산 잔기를 도입한다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 라고 부르며, 이는 전형적으로 "임포트" 가역 도메인으로부터 얻는다. 인간화는 반드시 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 부위 서열로 치환하는 Winter 및 그의 동료의 방법을 따라 수행된다(Jones et al., Nature, 321: 522-525(1986) ; Reichmann et al., Nature, 332: 323-327(1988) ; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536(1988)). 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 본래의 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터 유래된 상응되는 서열에 의해서 거의 치환되지 않은 키메라 항체(미국 특허 제 4,816,567호)이다. 실제, 인간화 항체는 일반적으로 몇몇의 초가변 부위 잔기 및 일부의 가능한 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터 유래된 잔기에 의해서 치환된 인간 항체이다.

상기 인간화 항체를 제조하기 위해서 사용되는 L 및 H의 모든 인간 가역 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위하여 매우 중요하다. 소위 "최적화"된 방법에 따르면, 설치류 항체의 가역 도메인의 서열은 알려진 인간 가역 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크리닝된다. 그리고, 상기 설치류의 서열과 가장 유사한 인간 서열은 상기 인간화 항체를 위한 인간 프레임 워크 부분(framework region, FR)로서 인정된다(Suns et al., J. Immunol., 151: 2296(1993) ; Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901(1987)). 다른 방법은 모든 인간 항체의 L 또는 H 체인의 특정 서브그룹의 일치하는 서열로부터 유래된 특정한 프레임 워크 부분을 이용한다. 상기 동일한 프레임 워크는 다른 다양한 인간화 항체에 이용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285(1992) ; Presta et al., J. Immunol., 151: 2623(1993)).

항체는 상기 항원에 대한 높은 친화력 및 다른 적절한 생물학적 특성을 보유할 수 있다는 점에서 더욱 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모체 및 인간화 서열의 삼차원 모델을 이용한 모체 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해서 제조된다. 삼차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 컴퓨터 프로그램은 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 삼차원 형태 구조를 설명하고 나타내는데 가능하다. 이러한 표현의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 상기 잔기의 가능한 역할, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 기능에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 상기 표적 항원의 친화력을 증가시키는 것과 같은 원하는 항체의 특성을 얻기 위하여 상기 수용체 및 임포트 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 상기 초가변 부위 잔기는 항원 결합 영향에 직접적이고 가장 많이 관련된다.

( iv ) 인간 항체

인간화(humanization)에 대안적으로, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 이제는 면역화된 후, 내인성 면역글로불린 생산이 부재된 상태에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 생산할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식 계열 돌연변이 마우스에서 항체 H-체인 연결 부분(JH) 유전자의 동형 접합성 결손은 내인성 항체 생산을 완전히 억제하는 결과를 낳는다는 것이 기재되어 왔다. 상기 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 집합체(array)의 변이 마우스 생식계열로의 전이는 항원 도전(challenge)에 대한 인간 항체의 생산을 야기한다. 예를 들어, Jakobovits et al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90: 255 1(1993) ; Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258(1993) ; Bruggermann et al., Year in immuno., 7: 33(1993) ; 및 미국 특허 제 5,591,669,5,589,369 및 5,545,807를 참조하라.

대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature 348: 552-553(1990))은 시험관 내에서 면역력이 없는 기증자로부터 면역글로불린 가역(V) 도메인을 이용하여 인간 항체 및 항체 단편을 생산하는데 이용할 수 있다. 이러한 기술에 따르면, V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 사상 박테리오파의 메이저 코트(major coat) 또는 마이너 코트(minor coat) 중 어느 하나에 인-프레임(in-frame)으로 서브클론되고, 상기 파지 분자의 표면에 기능적 항체 단편으로서 나타난다. 상기 사상 분자는 파지 게놈의 단일 가닥의 DNA 카피를 가지고 있어, 상기 항체의 기능적 특성에 근거한 선택은 또한 이러한 특성을 보이는 상기 항체를 암호화하는 유전자의 선택으로 이어진다. 따라서, 상기 파지는 상기 B 세포의 몇몇 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형태로 수행될 수 있다 ; 이에 대한 리뷰는 예를 들어, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-57 1(1993)를 참조하라. 다양한 V-유전자 단편의 근원은 파지 디스플레이용으로 사용될 수 있다.

Clackson et al., Nature, 352 : 624-628(1991)는 면역력을 갖는 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소규모의 랜덤 조합 라이브러리(small random combinatorial library)로부터 항 옥사졸론(oxazolone) 항체의 다양한 집합체(array)를 분리했다. 면역력이 없는 인간 기증자로부터 얻은 V 유전자의 레퍼토리는 제조될 수 있으며, 항원(자가 항원 포함)의 다양한 집합체(array)에 대한 항체는 필수적으로 Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597(1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734(1993)에 의해서 기재된 기술에 따라 분리될 수 있다. 또한, 미국 특허 제 5,565,332호 및 5,573,905호를 참조하라.

또한, 인간 항체는 시험관 내 활성화된 B 세포에 의해서 생산될 수 있다(미국 특허 20 5,567,610 및 5,229,275). SCID 마우스를 이용한 인간 항체를 생성하는 바람직한 방법은 공동으로 소유된, 함께 계류중인 출원서에 기재된다.

(v) 항체 단편

다양한 기술이 항체의 단편을 생산하기 위하여 개발되어 왔다. 전통적으로 이러한 단편은 온전한 항체의 단백질 가수분해를 통해서 유래된다(예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117(1992) and Brennan et al., Science, 229: 81(1985)를 참조하라). 그러나, 이러한 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해서 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리(phage libraries)로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. coli로부터 직접적으로 얻을 수 있으며, F(ab') 2 단편을 형성하기 위하여 화학적으로 결합될 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167(1992)). 또 다른 시도에 따르면, F(ab') 2 단편은 재조합 숙주 세포배양으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술에는 당업자에게는 명백할 것이다. 다른 실시예에서, 상기 항체의 선택은 단일 체인 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제 5,571,894; 및 미국 특허 제 5,587,458를 참조하라, 또한, 상기 항체 단편은 예를 들어 미국 특허 제 5,641,870호에 기재된 "선형 항체"가 될 수 있다.

( vi ) 이중특이성 항체

이중특이성 항체는 적어도 두 개의 상이한 에피토프(epitope)에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 예를 들어, 항 암 세포 마커 결합 암(arm)은 상기 암 세포에 대한 세포 방어 기작에 중점을 두기 위하여, T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3)와 같은 백혈구에서 유발하는 분자, 또는 FcyRI(CD64), FcyRII(CD32) 및 FcyRIH(CD 16)와 같은 IgG(FcyR)을 위한 Fc 수용체에 결합하는 암(arm)과 결합될 수 있다. 또한, 이중특이성 항체는 상기 암 세포에 대한 세포독성제를 국소화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 암 세포 마커-결합 암(arm), 및 세포독성제(예를 들어, 사포린(saporin), 항 인터페론-알파(interferon-a), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid), 리신 A 체인(ricin A chain), 메토트렉세이트(메토트렉세이트(methotrexate)) 또는 방사성 동위원소 햅틴(hapten))와 결합하는 암(arm)을 갖는다. 이중특이성 항체는 전체 길이의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab) 2 이중특이성 항체)로서 제조될 수 있다.

이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져있다. 종래의 전체 길이의 이중특이성 항체 생산은 H 체인와 L 체인이 다른 특이성을 가지고 있는, 상기 두 개의 면역글로불린 H 체인-L 체인 쌍의 동시 발현에 기반을 둔다(Millstein et al., Nature, 305: 537-539(1983)). 면역글로불린 H 및 L 체인의 임의적인 분류로 인하여, 이러한 하이브리도마(quadromas)는 10개의 다른 항체분자 분자의 가능성이 있는 혼합물을 생산하며, 이중 오직 하나만이 올바른 이중특이성 구조를 갖는다. 대개 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 단계에서 수행되는 상기 올바른 분자의 분획은 다소 번거로우며, 산물의 생산량이 매우 낮다. 유사한 과정이 WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659(1991)에 나타난다.

다른 접근법에 따르면, 상기 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가역 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열과 융합된다. 바람직하게, 상기 융합은 적어도 힌지(hinge), CH2, 및 CH3 부분의 일부를 포함하는 면역글로불린 H 체인 불변 도메인과 된다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 첫 번째 H 체인 불변 부분(CHI)을 포함한다. 상기 면역글로불린 H 체인 융합을 암호화하는 DNA 및, 만약 원한다면, 상기 면역글로불린 L 체인은 분리된 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체로 같이 전이된다. 이는 상기 제조에 사용된 세 개의 폴리펩티드 체인의 불균등한 비율이 최적의 생산량을 제공할 때, 실시예에서 세 개의 폴리펩티드 단편의 상호적인 비율 조정에 있어서 커다란 유연성을 제공한다. 그러나, 이는 적어도 동일한 비율의 두 개의 폴리펩티드 체인의 발현이 높은 생산물을 만들거나 또는 상기 비율이 현저하게 중요하지 않은 경우, 하나의 발현 벡터로 두 개 또는 세 개 모두의 폴리펩티드 체인을 암호화하는 서열이 삽입될 수 있다.

이러한 방법의 바람직한 실시예에서, 상기 이중특이성 항체는 하나의 암(arm)에서 첫 번째 결합 특이성이 있는 하이브리드 면역글로불린 H, 및 다른 암(arm)에서 (두 번째 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 H 체인-L 체인 쌍으로 구성된다. 면역글로불린 L 체인의 존재할 때, 상기 이중특이성 분자의 1/2내에 면역글로불린 L 체인의 존재가 용이한 분리를 제공하기 때문에, 이러한 비대칭적인 구조가 원하지 않는 면역글로불린 체인 조합으로부터 원하는 이중특이성 화합물의 분리를 촉진한다는 것이 알려졌다. 이러한 접근은 WO 94/04690에서 밝혀진다. 이중특이성 항체를 생산의 보다 자세한 사항은 예를 들어 Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210(1986)를 참조하라.

미국 특허 제 5,731,168호에 기재된 다른 방법에 따르면, 항체 분자 한 쌍의 인터페이스(interface)는 재조합 세포배양에서 수득되는 헤테로다이머(heterodimer)의 비율을 최대화하기 위하여 조절될 수 있다. 상기 바람직한 인터페이스는 적어도 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 상기 첫 번째 항체 분자의 인터페이스로부터 하나 또는 다수의 작은 아미노산 측쇄는 커다란 측쇄(예를 들어, 타이로신(tyrosine) 또는 트립토판(tryptophan))로 대체된다. 상기 커다란 측쇄와 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상되는 "공간(cavities)"은 커다란 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌(alanine) 또는 트레오닌(threonine))로 두 번째 항체 분자의 인터페이스와 교체하여 만든다. 이는 호모다이머(homodimer)와 같은 원하지 않는 최종산물에 대하여 상기 헤테로다이머(heterodimer)의 생산을 증가시키는 기작을 제공한다.

이중특이성 항체는 교차 연결 또는 "헤테로컨쥬게이트(heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들어, 상기 헤테로컨쥬게이트 항체 중 하나는 아비딘(avidin)과 결합할 수 있으며, 교차 연결된 항체는 바이오틴(biotin)과 결합될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 원하지 않는 세포에 대하여 면역 시스템을 표적화(미국 특허 제 4,676,980), 및 HIV 감염(WO 91/00360, WO 92/200373, and EP 03089)을 치료하는데 제안되어왔다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 어떠한 편리한 교차 연결(cross-linking)을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 교차 연결제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 다양한 교차 연결 기술과 더불어 미국 특허 제 4,676,980호에 밝혀져있다.

또한, 항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 제조하는 기술은 상기 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 화학적 결합(chemical linkage)을이용하여 제조될 수 있다. Brennan et al., Science, 229: 81(1985)는 온전한 항체가 단백질 가수분해로 나뉘어져 F(ab') 2 단편을 생성하는 방법을 기재한다. 이러한 단편은 다이싸이올(dithiol) 복합제인 아비산 나트륨(sodium arsenite)의 존재하에서 인접한 다이싸이올(dithiol)을 안정화시키며 분자 사이의 이황화 형성을 방지하기 위하여 감소된다. 그리고 상기 생성된 Fab' 단편은 티오타이드로벤조에이트(thionitrobenzoate, TNB) 유도체로 전환된다. 그리고 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 메르카포에틸아민(mercaptoethylamine)을 이용하여 Fab'-티올(thiol)로 축소되며, 상기 이중특이성 항체를 형성하기 위하여 다른 동몰(equimolar)양의 Fab'-TNB 유도체와 혼합된다. 상기 생성된 이중특이성 항체는 효소의 선택적인 부동화(immobilization)를 위한 시약(agent)으로 사용될 수 있다.

최근의 개발은 E. col로부터 이중특이성 항체를 형성하기 위하여 화학적으로 결합될 수 있는 Fab'-SH 단편의 직접적인 수득(recovery)을 가속화시켜왔다. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 2 17-225(1992)는 인간화 이중특이성 항체 F(ab') 2 분자 전체의 생산을 기재한다. Fab' 단편 각각은 E. coli로부터 개별적으로 분비되며, 상기 이중특이성 항체로부터 직접적으로 시험관내(in vitro) 화학적 결합이 이루어진다.

또한, 재조합 세포배양으로부터 직접적으로 이중특이성 항체 단편을 제조하고 분리하는 다양한 기술이 기재되었다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 류신 지퍼(leucine zipper)를 이용하여 생산되었다(Kostelny et al., J Immunol. 148(5): 1547-1553(1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터 상기 류신 지퍼는 유전자 융합에 의한 두 개의 다른 항체의 Fab' 일부와 연결되었다. 상기 항체 호모다이머(homodimer)는 모노머(monomer)를 형성하기 위하여, 힌지(hinge) 부분은 감축되었으며, 그리고 상기 항체 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하기 위하여 재산화(re-oxidized)된다. 또한, 이러한 방법은 상기 항체 호모다이머 생산에 이용될 수 있다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448(1993)에 의해서 기재된 "디아체(diabody)" 기술은 이중특이성 항체 단편 제조를 위한 대안적인 기작을 제공한다. 상기 단편은 동일한 사슬에 두 도메인 사이 쌍(pair)을 형성하기에는 너무 짧은 링커(linker)에 의해, H 체인 가역 도메인(VH)과 L 체인 가역 도메인(VL) 체인를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 강제로 결합하게 되서, 두 개의 항원 결합 부위를 형성한다. 또한, 단일-체인 Fv(sFv) 다이머의 용도에 의한 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전략이 보고된바 있다. Gruber et al., J ; Immunol., 152: 5368(1994)를 참조하라.

두 개 이상의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이성(trispecific) 항체가 제조될 수 있다. Tutt et al. J ; Immunol. 147: 60(1991).

항체 컨쥬게이트 및 다른 변형

본 명세서의 방법에 사용되거나 제조 항목에 포함된 항체는 추가적으로 세포독성제 또는 치료학적 약제에 결합된다.

본 명세서에 사용된 치료학적 약제는 암 치료에 유용한 모든 화학치료학적 약제가 포함된다. 화학치료학적 약제의 예로는 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파마이드(cyclosphosphamide)와 같은 알킬제화 ; 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan) 및 피포설판(piposulfan)과 같은 알킬 설포네이트(alkyl sulfonates) ; 벤조도파(benzodopa), 카르보쿠원(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 유레도파(uredopa)와 같은 아지리딘(aziridines) ; 에틸렌이민(ethylenimine) 및 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라마이드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌에티오포스포라마이드(triethylenethiophosphaoramide) 및 트리메틸오로멜라민(trimethylolomelamine)을 포함하는 메틸아멜라민(methylamelamine) ; 클로람부실(chlorambucil), 클로나파진(chlornaphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라머스틴(estramustine), 이포마이드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드(mechlorethamine oxide hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 노벰비에힌(novembiehin), 펜에스테린(phenesterine), 프레드니머스틴(pred니무스틴(nimustine)), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard)와 같은 질소 머스타드(nitrogen mustard) ; 카무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine)과 같은 니트로수아레스(nitrosureas) ; 아클라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 오트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(actinomycin), 칼리키마이신(calicheamicin), 카라비신(carabicin), 카미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모이니신(chromoinycins), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이담비신(idambicin), 마르셀마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycins), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페프로마이신(peplomycin), 포피로마이신(poffiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 퀄라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin)과 같은 항생제 ; 메토트렉세이트(methotrexate) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)과 같은 항 대사산물 ; 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 피트롭테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate)와 같은 폴산(folic acid) 유사체 ; 플루다라빈(fludarabine), 6-메르랍토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine)과 같은 퓨린(purine) 유사체 ; 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에녹시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine)과 같은 피리미딘(pyrimidine) 유사체 ; 클라우스테론(calusterone), 드로모스타노론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탠(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone)과 같은 5-FU; 안드로겐(androgen) ; 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토테인(mitotane), 트릴로스테인(trilostane)과 같은 항부신 ; 프로닐릭산(frolinic acid)과 같은 폴산 리플레니셔(folic acid replenisher) ; 아세글라톤(aceglatone) ; 알도포스파미드 글리코사이드(aldophosphamide glycoside) ; 아미노레불린산(aminolevulinic acid) ; 아마사크린(amsacrine) ; 베스트라부실(bestrabucil) ; 비산트렌(bisantrene) ; 에타트렉세이트(edatraxate) ; 티포파민(defofamine) ; 데메콜신(demecolcine) ; 디아지쿠온(diaziquone) ; 엘포르니틴(elfornithine) ; 엘립티니움 아세테이트(elliptinium acetate) ; 에토글루시드(etoglucid) ; 갈리움 나이트레이트(gallium nitrate) ; 하이드록시우레아(hydroxyurea) ; 렌티난(lentinan) ; 로니다민(lonidamine) ; 미토구아존(mitoguazone) ; 미토산트론(mitoxantrone) ; 모피다몰(mopidamol) ; 니트라크린(nitracrine) ; 펜토스타틴(pentostatin) ; 페나멧(phenamet) ; 피라루비신(pirarubicin) ; 포도필리닉산(podophyllinic acid) ; 2-에틸하이드라지드(2-ethylhydrazide) ; 프로카바진(procarbazine) ; PSK&코매트(PSK&commat) ; 라족산(razoxane) ; 시조프란(sizofrran) ; 스피로게르마늄(spirogermanium) ; 테누아진산(tenuazonic acid) ; 트리아지쿠원(triaziquone) ; 2, 2', 2"-트리클로로트리에틸아민(2, 2', 2"-trichlorotriethylamine) ; 우레탄(urethan) ; 빈데신(vindesine) ; 다카바진(dacarbazine) ; 마노무스틴(mannomustine) ; 미토브로니톨(mitobronitol) ; 미토락톨(mitolactol) ; 피포브로만(pipobroman) ; 가시토신(gacytosine) ; 아라비노시드(arabinoside)("Ara-C") ; 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) ; 티오테파(thiotepa) ; 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel)(TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀(doxetaxel)(TAXOTEW, Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, France)과 같은 탁소이드(taxoids) ; 클로람부실(chlorambucil) ; 젬시타빈(gemcitabine) ; 6-티오구아닌(thioguanine) ; 메르캅토퓨린(mercaptopurine) ; 메토트렉세이트(methotrexate) ; 시스플라틴(cisplatin) 및 키르보플라틴(carboplatin)과 같은 백금 유사체(platinum analogs) ; 빈블라스틴(vinblastine) ; 백금(platinum) ; 에토포시드(etoposide)(VP-16) ; 이포마이드(ifosfamide) ; 미토마이신 C(mitomycin C) ; 미토산트론(mitoxantrone) ; 빈크리스틴(vincristine) ; 비노렐빈(vinorelbine) ; 나벨빈(navelbine) ; 노반트론(novantrone) ; 테니포시드(teniposide) ; 다우노마이신(daunomycin) ; 아미노프테린(aminopterin) ; 젤로다(xeloda) ; 이반드로네이트(ibandronate) ; CPT-11 ; 토포이소머레이즈 억제제(topoisomerase inhibitor) RFS 2000 ; 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine, DMFO) ; 레틴산(retinoic acid) ; 에스페라미신(esperamicins) ; 카페시타빈(capecitabine) ; 및 약학적 허용 가능한 염, 산 또는 상기 중 어느 하나의 유도체가 포함된다. 또한, 이러한 치료학적 약제에는 종양에 대한 호르몬을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항 에스트로겐과 같은 항 호르몬제가 포함되며, 예를 들어 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 아로마타아제 억제 4(5)-이미다졸(aromatase inhibiting 4(5)-imidazoles), 4 하이드록시타목시펜(4 hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), 오나프리스톤(onapristone), 및 토레미펜(toremifene)(Fareston) ; 및 플루타미드(flutamide), 니루타미드(nilutamide), 비카루타미드(bicalutamide), 류프로리드(leuprolide), 및 고세렐린(goserelin)과 같은 항 안드로겐(androgen) ; 및 약학적 허용 가능한 염, 산 또는 상기 중 어느 하나의 유도체를 포함한다.

또한, 항체, 및 칼리키마이신(calicheamicin), 메이탄신(maytansine)(미국 특허 제 5,208,020호), 트리코텐(trichothene) 및 CC 1065와 같은 하나 또는 다수의 작은 분자 독소의 결합이 본 명세서에 고려된다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 하나 또는 다수 메이탄신(maytansine) 분자(예를 들어, 항체 분자당 약 1 내지 약 10 메이탄신(maytansine) 분자)에 결합된다. 예를 들어, 메이탄신(maytansine)는 메이탄시노이드 항체 컨쥬게이트를 생성하기 위하여, May-SH3로 감축될 수 있는 May SS-Me로 변환될 수 있으며, 변형된 항체와 반응될 수 있다(Chari et al. Cancer Research 52: 127-131(1992)).

대안적으로, 상기 항체는 하나 또는 다수 칼리키마이신(calicheamicin) 분자에 결합될 수 있다. 상기 칼리키마이신(calicheamicin) 계열의 항생제는 피코몰(picomole) 이하의 농도에서 분해되는 이중 나선 DNA를 생성할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리키마이신(calicheamicin)의 구조적 유사체는 감마1I(gamma1I), 알파2I(alpha2I), 알파3I(alpha3I), N-아세틸-감마lI(N-acetyl-gammalI), PSAG 및 OI1(Hinman et al. Cancer Research 53 : 3336-3342(1993) 및 Lode et al, Cancer Research 58: 2925-2928(1998))를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 체인(diphtheria A chain), 디프테리아 독소(diphtheria toxin)의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 체인(exotoxin A chain)(슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 체인(ricin A chain), 아브린 A 체인(abrin A chain), 모데신 A 체인(modeccin A chain), 알파 사르신(alpha sarcin), 알레유라이트 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센(tricothecenes)을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 출판된 WO 93/21232를 참조하라.

본 발명은 추가적으로 다양한 방사성 동위원소와 결합된 항체를 고려한다. 그 예로는 ¹¹¹In, ^{2 ll}At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ^{2 l2}Bi, ³²P 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 본 발명에서, 본 발명의 항체는 사용되기 바로 직전에 방사성 핵종(radio-nuclide)으로 표지되거나 또는 방사성으로 표지된 항체로서 제공될 수 있다. 당업자는 공지된 기술에 의해서 종양 특이적 항체에 결합되고, 종양 세포 및 조직에 특이적으로 손상을 주는 위치로 전달될 수 있는 다양한 방사성 핵종 및 화학세포독성제가 있다는 것을 인식할 것이다(예를 들어, 미국 특허 제4,542,225호 내지 1985년 9월에 발표된 W. A. Blattler et al., 1985; 및 Pastan et al., 1986, Cell, 47:641-648를 참조하라). 예를 들어, 사용하기에 적합한 가시화제 및 세포독성제는 ¹²⁵I, ¹²³I. ¹¹¹In(예를 들어, Sumerdon et al., 1990, Nucl. Med. Biol., 17:247-254), 및 ^{99 m}Tc; 플루오레세인(fluorescein) 및 로다민(rhodamine)과 같은 형광 표지 ; 루시페린(luciferin)과 같은 화학발광(chemiluminescent) 표지, 및 자기공명영상검사(magnetic resonance imaging)에 사용되는 상자성(paramagnetic)이온(Lauffer et al., 1991, Magnetic Resonance in Medicine, 22:339-342)을 포함한다. 항체는 당업계에 알려지고 수행되는 프로토콜 및 기술을 이용하여 이러한 시약들에 의해서 표지될 수 있다. 예를 들어, Wenzel 및 Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York, 1983; Colcer et al., 1986, Meth. Enzymol., 121:802-816; 및 항체의 방사성 표지에 관련된 기술을 위한 Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Eds. Baldwin et al., Academic Press, 1985, pp. 303-316를 참조하라. 이트륨-90(⁹⁰Y) 표지된 단일클론 항체는 상기 종양 또는 암 세포 및/또는 조직으로 전달되는 양을 최대화시키는 반면, 정상 조직에 대한 독성을 제한시키는 것이 기재되었다 (예를 들어, Goodwin and Meares, 1997, Cancer Supplement, 80:2675-2680). 다른 세포독성 방사성 핵종에 포함되나, 이에 한정되지 않는 아이오딘-131(¹³¹I) 및 레니움(Rhenium)-186은 또한 본 발명의 단일클론 항체를 표지하는데 이요될 수 있다. 상기 방사성 핵종 가운데, 이트륨-90(⁹⁰Y)은 높은 베타 에너지(2.3 MeV vs 0.61 MeV)를 상기 종양에 전달하고, 부피가 크거나 거의 혈관이 없는 종양에 특히 유리한 표적 및 인접한 세포를 모두 죽이는 능력을 높이는 결과를 낳는 5 내지 10 mm의 경로 길이(path length)를 갖기 때문에, 이트륨-90(⁹⁰Y)은 방사선 면역치료법에 적합할 수 있다. 상기 이용된 검출할 수 있으며/검출되는 표지는 사용되는 이미지 방식(modality)에 따라서 선택된다. 예를 들어, 인듐-111(¹¹¹In), 테크네튬-99m(Technetium-99m, ^{99 m}Tc), 또는 아이오딘 131(¹³¹I)와 같은 방사성 표지는 평면 스캐너 또는 단일 또는 단일광자 단층촬영(single photon emission computed tomography, SPECT)에 사용될 수 있다. 또한, 플루오린(Fluorine)-19와 같은 양전자방출(positron-emitting) 표지는 양전자 방출 단층 촬영법(positron emission tomography, PET)에 사용될 수 있다. 가드리니움(Gadlinium)(III) 또는 망간(II)과 같은 상자성(paramagnetic) 이온은 자기공명영상검사(magnetic resonance imaging, MRI)에 이용될 수 있다. 또한, 상기 단일클론 항체는 주입 후, 예를 들어 X-ray, CAT스캔, 또는 MRI에 의한 암 세포의 가시화를 위해서 방사선 비투과성(radio-opaque) 표지로 표지될 수 있다. 특히, CDH3 관련 질환(예를 들어, 암)에 있어서 상기 암 내에서 상기 표지의 위치는 상기 질환의 전이를 결정하는 것을 가능하게 한다. 상기 CDH를 발현하는 암 내에서 있으며, 검출할 수 있는 표지의 양은, 예를 들어 진단받은 개체의 암 또는 종양의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 가능하게 한다.

상기 항체 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 N-숙시니미딜-3-(2-미리일디트리올) 프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(2-pyriylditliol) propionate)(SPDP), 숙시니미딜-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), 이미노티올렌(iminothiolane)(IT), (디메틸 아디피미데이트 HCL(dimethyl adipimidate HCL)와 같은) 이미도에스테르(imidoesters)의 이작용 유도체, (디숙시니미딜 서버레이트(disuccinimidyl suberate)와 같은) 활성 에스테르, (글루타렐데하이드(glutareldehyde)와 같은) 알데하이드(aldehydes), (비스-p-(아지도펜조일) 헥산디아민(bis(p-azidobenzoyl)과 같은) 비스-아지도(bis-azido) 화합물, (비스-(p-디아조니움벤조일)-에틸렌디아민(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine)과 같은) 비스-디아조니움(bis-diazonium) 유도체, (토일렌 2,6-디이노사이네이트(tolyene 2,6-diisocyanate))와 같은) 디이노사이네이트(diisocyanates), 및 (1, 5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)과 같은) 비스-활성 플루오린(bis-active Fluorine) 화합물과 같은 다양한 이작용 단백질 결합제를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 리신(ricin) 면역독소는 Vitetta et al. Science 238: 1098(1987)에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1 이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜택아세트 산(1 isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid, MX-DTPA)은 상기 항체에 방사성핵산(radionucleotide)을 결합시키는 킬레이트제( chelating agent)의 예이다. 상기 링커는 상기 세포내에서 세포독성제의 방출을 촉진시키는 "분해될 수 있는(cleavable) 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성(acid-labile) 링커, 펩티다아제 민감성(peptidase-sensitive) 링커, 디메틸(dimethyl) 링커 또는 이황화 포함(disulfide-containing) 링커(Charm et al. Cancer Research 52: 127-131(1992))가 이용될 수 있다.

대안적으로, 상기 항제와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해서 제조될 수 있다.

다른 실시예에서, 상기 항체는 상기 항체-수용체 컨쥬게이트가 환자에게 투여되고, 제거제(clearing agent)를 이용하여 결합되지 않은 컨쥬게이트를 순환으로부터 제거하고, 그리고 세포독성제(예를 들어, 방사성핵산(radionucleotide))가 결합된 "리간드"(예를 들어, 아비딘(avidin))가 투여되고, 종양의 선표적화(pretargeting)에 사용되기 위하여, (스트렙타비딘(streptavidin)과 같은) "수용체"에 결합될 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 전구약물(예를 들어, 펩티딜 화학 치료학적 약제, W081/01145 참조)을 활성 항암제(예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 제 4,975,278 참조)로 전환시키는 전구약물 활성 효소에 결합될 수 있다.

이러한 컨쥬게이트의 효소 성분은 전구 약물을 더욱 활성화시키며, 세포독성 형태로 변환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 모든 효소를 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 효소는 인산염을 포함하는 전구 약물을 프리 약물(free drug)로 전환시키는데 유용한 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase); 황산염(sulfate)을 포함하는 전구 약물을 프리 약물(free drug)로 전환시키는데 유용한 아릴설파타아제(arylsulfatase); 비-독성5-플루오로사이토신(non-toxic5-fluorocytosine)을 항암제인 플루오로우라실(fluorouracil)로 전환시키는데 유용한 싸이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase); 펩티드를 포함하는 전구약물을 프리 약물(free drug)로 전환시키는데 유용한 세라티아 프로테아즈(serratia protease), 서몰리신(thermolysin), 섭틸리신(thermolysin), 카르복시펩티다제(carboxypeptidase) 및 (카텝신(cathepsins) B 및 L과 같은) 카텝신과 같은 프로테아즈(protease); D-아미노산 치환기를 포함하는 전구 약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다아제(D-alanylcarboxypeptidases); 글리코실화되는 전구약물을 프리 약물(free drug)로 전환시키는데 유용한 13-갈락토시다아제(13-galactosidase) 및 뉴라미티다아제(neuraminidase)와 같은 카르보하이드레이트클레이빙(carbohydratecleaving) 효소; 13-락탐스(13-lactams)에서 파생된 약물을 프리 약물(free drug)로 전환시키는데 유용한 13-락타마스(13-lactamase); 아민 질소(amine nitrogen)를 페녹시아세틸(phenoxyacetyl) 또는 페닐아세틸(phenylacetyl) 그룹으로 각각 변형된 약물을 프리 약물(free drug)로 전환시키는데 유용한 페테실린 V 아미다제(penicillin V amidase) 또는 페니실린 G 아미다제(penicillin G amidase)와 같은 페티실린 아미다네(penicillin amidase)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, "아브자임(abzyme)"으로 당업계에 알려진 효소 활성을 갖는 항체는 또한 본 발명의 전구약물을 프리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, Massey, Nature 328: 457-458(1987)를 참조). 항체-아브자임 컨쥬게이트는 본 명세서에 상기 아브자임을 종양 세포군으로 전달하는 것이 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 효소는 상기 논의된 이중기능 교차결합제의 이용과 같은 당업계에 알려진 기술에 의해서 상기 항체와 공유결합될 수 있다. 대안적으로, 최소 본 발명의 효소의 기능적 활성 일부와 연결된 본 발명의 항원의 항원 결합 부분을 최소 포함하는 융합 단백질은 당업계에서 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608(1984) 참조).

상기 발명의 다른 변형이 본 명세서에서 고려될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 폴리오시알킬렌(polyoxyalkylenes), 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)와 같은 다양한 비단백질 폴리머 중 하나와 연결될 수 있다.

또한, 본 명세서에 기재된 상기 항체는 리포좀(liposome)으로서 제조될 수 있다. 상기 항체를 포함하는 리포좀은 Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688(1985) ; Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980) ; 미국특허 제 4,485,045호 및 제 4,544,545호 ; 및 1997년 10월 23일 공개된 W097/38731에 기재된 바와 같이, 당업계에 알려진 방법에 의해서 제조될 수 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 콜레스테롤(cholesterol) 및 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)(PEG-PE)으로부터 파생된 PEG를 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발 방법(reverse phase evaporation)에 의해서 생성될 수 있다. 리포좀은 원하는 직경의 리포좀을 생성하기 위한, 규격화된 구멍 사이즈의 필터를 통해서 밀려나간다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 이황화 교환 반응을 통해서 Martin et al. J ; Biol. Chem. 257: 286-288(1982)와 같이 상기 리포좀에 결합할 수 있다. 화학치료학적 약제는 추가적으로 상기 리포좀내에 포함된다(Gabizon et al. ANational Cancer Inst. 81(19) 1484(1989) 참조).

본 명세서에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형이 고려된다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 특성을 증가시키는 것이 바람직하다. 상기 항체의 아미노산 서열의 변이는 적합한 뉴클레오티드 변형을 상기 항체에 도입시키거나, 또는 펩티드 합성에 의해서 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결손, 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 상기 최종 제조물이 원하는 특성을 갖는 한, 결손, 삽입, 및 치환의 모든 조합은 최종산물에 도달하도록 사용된다. 또한, 상기 아미노산은 글리코실화 부위의 수 또는 위치 변경과 같은, 항체의 번역 후(post-translational) 과정을 변형할 수 있다.

변이에 있어서 바람직한 위치인 상기 항체의 특정 잔기 또는 부분을 동정하기 위한 유용한 방법은 Cunningham 및 Wells Science, 244 : 1081-1085(1989)에 의해서 기재된 "알라닌 스캐닝 돌연변이(alanine scanning mutagenesis)"이다. 여기에서 하나의 잔기 또는 표적 잔기의 그룹이 동정되었으며(예를 들어, 아르기닌(arg), 아스파트산(asp), 히스티딘(his), 라이신(lys), 및 글루탐산(glu)과 같은 전하를 띄는 잔기), 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 끼치기 위하여 중성 또는 음성적으로 전하를 띄는 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌(alanine) 또는 폴리알라닌(polyalanine))으로 대체된다. 그리고 상기 치환에 대하여 기능적 민감도를 증명하는 이러한 아미노산 위치는 추가적으로 또는 다른 변이를 치환위치에 도입시키는 것에 의해서 정제된다. 따라서, 상기 아미노산 서열의 변이를 도입시키는 위치는 미리 지정된 반면, 상기 변이의 특성 그 자체는 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 특정 위치의 변이 결과를 분석하기 위해서, 알라(ala) 스캐닝 또는 임의돌연변이유발(random mutagenesis)이 상기 표적 코돈 또는 부분에서 수행되고, 발현되는 항체 변이가 원하는 활성인지 스캐닝한다.

아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지 100개 또는 이상의 잔기를 포함하고 단일 또는 다수의 아미노산 잔기가 서열내 삽입되는 폴리펩티드의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복시 말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N 말단 메티오닐(methionyl) 잔기를 갖는 항체 또는 상기 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를포함한다. 상기 항체 분자의 다른 추가적인 변이는 효소의 항체 N 또는 C 말단에의 융합 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드를 포함한다.

다른 종류의 변이는 아미노산 치환 변이이다. 이러한 변이는 다른 잔기에 의해서 교체된 상기 항체 분자 내 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 항체의 치환 돌연변이를 위한 가장 관심을 받는 위치는 초가변 부위을 포함하나, FR 변이 또한 고려된다.

상기 항체의 생물학적 특성에 있어서 상당한 변형은 (a) 예를 들어, 시트(sheet) 또는 나선형 구조와 같은 치환 부분의 폴리펩티드 백본(backbone)의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 대부분을 유지하는데 현저히 효과가 다른 치환을 선택함으로써, 완성된다.

자연적으로 생성된 잔기는 공통적인 측쇄의 성격에 따라서 나누어진다:

(1) 소수성: 노르류신(norleucine), 메티오닌(met), 알라닌(ala), 발린(val), 류신(leu), 이소류신(ile);

(2) 중성 소수성: 시스테인(cys), 세린(ser), 트레오닌(thr);

(3) 산성: 아스파르트산(asp), 글루탐산(glu);

(4) 기본: 아스파라진(asn), 글루타민(gln), 히스티딘(his), 라이신(lys), 아르기닌(arg);

(5) 체인 방향성에 영향을 끼치는 잔기: 글라이신(gly), 프롤린(pro); 및

(6) 방항성: 트립토판(trp), 타이로신(tyr), 페닐알라닌(phe).

비보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 멤버를 다른 클래스와 교환하는 것을 포함할 것이다.

또한, 상기 항체의 적절한 구조를 유지하는데 관여하지 않는 모든 시스테인 잔기는 일반적으로 세린(serine)과 치환되어 상기 분자의 산화 안정성을 증가시키며, 비정상적인 교차연결을 방지한다. 정반대로, 시스테인 결합은 상기 항체에 첨가되어 이의 안정성을 증가시킬 수 있다(특히, 상기 항체가 Fv 단편과 같은 단편일 때).

바람직한 치환 변이의 종류는 모체 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 또는 다수 초가변 부위 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로 추가적인 개발을 위해서 선택된 최종 변이는 이들이 생성된 모체 항체에 상대적으로 생물학적 특성이 향상될 것이다. 이러한 치환 변이를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이(phage display)를 이용한 친화성 성숙(affinity maturation)이다. 간략하게, 다수의 초가변 부위 위치(예를 들어, 6 ~ 7 위치)는 각 위치에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하기 위하여 변이된다. 따라서, 생성된 항체 변이는 각 입자내 패키지된 M13의 유전자 III 산물과 융합하는 만큼, 사상 파지입자로부터 1가 형태로 표현된다. 그리고 상기 파지-디스플레이 변이는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이들의 생물학적 활성(예를 들어, 생물학적 친화성)을 위해서 스크리닝된다. 변이를 위한 초가변 부위 후보를 동정하기 위하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이는 항원 결합에 현저하게 영향을 미치는 초가변 부위 잔기를 동정하기 위하여 수행된다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 항체와 항원 사이의 접촉점을 동정하기 위하여, 항원-항체 복합체의 크리스탈(crystal) 구조를 분석하는 것은 유용할 수 있다. 이러한 잔기와 인접잔기의 접촉은 본 명세서에 기재된 기술에 따르면, 치환을 위한 후보이다. 이러한 변이가 한번 생성되면, 변이의 패널(panel)은 본 명세서에 기재된 바에 따라 스크리닝되며, 하나 또는 다수의 관련있는 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체는 추가적인 개발을 위해서 선택될 수 있다.

상기 항체의 아미노산 변이의 다른 종류는 상기 항체의 원래의 글리코실화(glycosylation) 패턴을 변화시킨다. 변이시키는 것은 상기 항체에서 발견되는 하나 또는 다수의 카보하이드레이트 반족(carbohydrate moieties)을 삭제, 및/또는 항체 내에 존재하지 않는 하나 또는 다수의 글리코실화 위치를 삽입한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 일반적으로 N-링크 또는 O-링크 중 어느 하나이다. N-링크는 카보하드레이트 반족에 아스파라진(asparagine) 잔기의 측쇄를 첨가하는 것을 의미한다. X가 프롤린(proline)을 제외한 모든 아미노산인, 트리펩티드(tripeptide) 서열 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌은 카보하이드레이트 반족의 아스파라진 측쇄의 효소 결합을 위한 인식 서열이다.

그리고, 폴리펩티드내 이러한 트리펩티드(tripeptide) 서열 중 어느 하나의 존재는 강력한 글리코실화 부위를 만든다. O-링크 글리코실화는 당(sugar)인 N-아세틸갈라토사민(N-aceylgalactosamine), 갈라토오스(galactose), 또는 자일로오스(xylose) 중 어느 하나를 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid), 가장 일반적으로는 세린(seine) 또는 트레오닌(threonine)에 결합시키는 것을 의미하나, 5-하이드록시프롤린(5-hydroxyproline) 또는 5-하이드록시라이신(5-hydroxylysine) 또한 사용될 수 있으다.

상기 항체의 글리코실화 부위로의 첨가는 편리하게 상기 기재한 하나 또는 다수의 트리펩티드 서열(N 링크 글리코실화 부위)을 포함하는 아미노산 서열의 변이에 의해서 완성될 수 있다. 또한, 상기 변이는 본래 항체의 서열(O-링크 글리코실화 부위)에 대하여 하나 또는 다수의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 하나 또는 다수의 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 치환에 의해서 만들어질 수 있다.

상기 항체 변이체의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해서 제조된다. 이러한 방법은 자연적 근원으로부터의 분리(자연적으로 발생한 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개(또는 위치 지정) 돌연변이, PCR 돌연변이, 및 미리 제조된 변이 또는 상기 항체의 비-변이 형태의 카세트 변이에 의해서 제조되나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 사용되는 항체는 실행기 기능, 예를 들어 상기 항체의 항원 의존적 세포 매개 세포독성(Antigen depedent cell-mediated cytoxicity, ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 향상시키기 위하여 변이되는 것이 바람직하다. 이는 항체의 Fc 부분에 하나 또는 다수의 아미노산 치환의 도입에 의해서 만들어질 수 있다. 대안적 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)은 Fc 부분에 도입될 수 있으며, 이 부분내의 체인 내 이황화 결합 형성을 가능하게 한다. 따라서, 상기 호모다이머 항체는 내재화(internalization) 능력 향상 및/또는 보체 매개(complement-mediated) 세포 사멸 및 항체 의존적 세포 독성(ADCC)을 증가시킬 수 있다. Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195(1992) 및 Shopes, B. J linmunol 148 : 2918-2922(1992)를 참조하라.

또한, 증가된 항종양 활성을 갖는 호모다이머 항체는 Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565(1993)에 기재된 바와 같이, 이중기능 교차링커(cross-linkers)를 이용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체는 이중 Fc 부분을 갖도록 조작될 수 있으며, 따라서 보체 분해(complement lysis) 및 ADCC 능력을 증가시킬 수 있다(Stevenson et al. Anti-CancerDrugDesign 3: 2 19-230(1989)를 참조하라).

상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 예를 들어 미국 특허 제 5,739,277호에 기재된 것과 같이 상기 항체(특히 항체 단편)에 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 도입시킬 수 있다. 본 명세서에 사용된, 상기 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프(salvage receptor binding epitope)"는 생체내 상기 IgG 분자의 혈청 반감기를 증가시키는데 중요한 IgG 분자(예를 들어, IgGI, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 부분의 에피토프를 의미한다.

CDH3 관련 질환의 진단 또는 상기 질환의 발병 성향의 진단

본 발명의 항-CDH3 항체는 CDH3 관련 질환을 진단하기 위한 마커로서 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 시료 내의 본 발명의 항-CDH3 항체를 갖고 있는 CDH3 단백질을 검출함으로써, CDH3 관련 질환은 진단될 수 있다. 따라서, 본 발명은 개체 내에서 본 발명의 항-CDH3 항체를 갖고 있는 CDH3 단백질을 검출함으로써, 상기 개체내 CDH3 관련 질환 또는 CDH3 관련 질환의 발병 성향 진단을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(a) 본 발명의 항체 또는 단편을 개체로부터 유래된 샘플 또는 시료와 접촉시키기;

(b) 샘플 또는 시료 내 CDH3 단백질을 검출하기; 및

(c) 대조군에 비하여 CDH3 단백질의 상대적 수도에 근거하여, 상기 개체가 상기 질환을 겪거나 또는 상기 질환이 발달할 위험이 있는지를 판단하기.

특정 실시예에서, CDH3 관련 질환은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암이다.

대안적으로, 다른 실시예에서, 상기 본 발명의 항-CDH3 항체는 살아있는 신체에서 암의 검출 또는 이미지화에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암의 검출 또는 이미지화 방법을 제공한다:

(1) 항-CDH3 항체 또는 이의 결합 단편을 개체에 투여하기;

(2) 살아있는 신체에서 상기 항체의 축적 또는 국소화를 검출하기, 및

(3) 상기 환자 내에서, 상기 항체 또는 이의 결합 단편의 위치를 확인하기

대안적으로, 본 발명에 따르면 암 세포 또는 조직은 환자에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 하기를 포함하는, CGH3가 환자의 종양 조직에 발현하는, 암을 검출하는 방법을 제공한다: 항체 또는 항체 단편이 세포 또는 조직의 CDH3와 특이적으로 결합할 수 있게 하는 상기 개체에 항체 또는 항체 단편을 투여하기; 상기 세포 또는 조직에서 결합된 항체를 가시화하기; 및 상기 환자의 세포 또는 조직에 결합한 항체의 수준이 정상 대조군 세포 또는 조직에 상대적으로 증가하는 것이 상기 환자의 암을 나타내는 것을 특징으로 하는, 정상 대조군 세포 또는 조직에 비하여 상기 세포 또는 조직의 항체 결합의 수준을 비교하기.

바람직하게, 살아있는 신체에 투여한 상기 항체를 추적하기 위해서, 상기 항체는 검출할 수 있는 분자로 표지될 수 있다. 예를 들어 형광 물질, 발광물질, 또는 방사성 동위원소로 표지된 항체의 움직임은 생체내(in vivo)에서 추적될 수 있다. 이러한 분자로 항체를 표지하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

형광 물질 또는 발광 물질로 표지된 항체는 예를 들어 내시경 또는 복강경을 이용하여 관찰할 수 있다. 방사성 동위원소를 이용할 때, 항체의 위치는 상기 방사성 동위원소의 방사능을 추적함으로써 가시화할 수 있다. 본 발명에서, 상기 항-CDH3 항체의 위치는 생체 내에서 암 세포의 존재를 나타낸다.

대안적으로, 본 발명의 항-CDH3 항체는 생체 내 이미지화에 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 검출을 위해서 표지된 항-CDH3 항체는 살아있는 신체에서 CDH3 단백질을 가시화하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광물질, 발광물질, 또는 방사성 동위원소로 표지된 항체의 움직임은 바이오이미징(bioimaging) 시스템을 이용하여 관찰할 수 있다. 방사성 동위원소를 이용할 때, 상기 항체의 위치는 면역신티그라피(immunoscintigraphy)에 의해서 가시화할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는 본 발명의 단일클론 항체 또는 결합 단편을 이용하여 CDH3을 발현하는 암 및 종양의 진단, 진단방법 및 가시화 방법을 제공한다. 본 발명의 항체를 이용한 진단 용도는 주요 종양 및 암뿐만 아니라 전이를 포함한다. 바람직한 실시예에서, CDH3을 발현하는 암은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 진단 방법은, 방사성 원소와 같은 검출가능한 부분(moiety)과 결합 또는 결합되지 않은, 본 발명에 기재된 단일클론 항체 또는 이의 결합단편을 투여, 삽입 또는 도입하는 것을 포함한다. 투여 또는 융합된 이후, 상기 항체 또는 결합 단편은 상기 종양 또는 암 세포에 결합하고, 그 후 상기 결합된 항체 또는 단편의 위치가 검출된다. 검출될 수 있도록 표지된 항체 또는 단편 예를 들어, 방사성 동위원소로 표지된 항체 또는 단편을 위해서, 이미징 도구가 신체 내 시약(agent)의 위치를 파악하기 위하여 사용될 수 있다. 표지되지 않은 항체 또는 단편에 있어서, 두 번째로 검출할 수 있는 시약이 투여되고 이들은 상기 결합된 항체 또는 단편에 위치하여 이들은 적절하게 검출될 수 있다. 유사한 방법이 다른 항체에 적용되어 왔으며, 당업자는 상기 신체 내에서 검출될 수 있도록 결합된 항체 또는 단편의 위치를 가시화하는데 적합한 방법을 알 것이다. 비제한적인 방법으로, 약 10 ~ 1000 마이크로그램(microgram, mcg.), 바람직하게 약 50 ~ 500 mcg, 더욱 바람직하게는 약 100 ~ 300 mcg, 더욱 바람직하게는 약 200 ~ 300 mcg의 정제된 항체가 투여된다. 예를 들어, 인간을 위한 적용 복용량은 몸무게당 약 100 ~ 200 mcg/kg 또는 신체 표면적의 350 ~ 700 mg/m²을 포함한다.

본 발명에 따르면, 개체의 상태를 검사하기 위한 중간 결과가 제공된다. 이러한 중간 결과는 의사, 간호사 또는 전문의에게 개체가 CDH3 관련 질환을 겪고 있는지 확인하는 것을 돕기 위하여 부가적인 정보과 결합될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 개체 유래 조직에서 암 세포를 검출하는데 사용될 수 있으며, 의사에게 상기 개체가 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암을 겪고 있는지 확인할 수 있는 유용한 정보를 제공할 수 있다.

CDH3 관련 질환의 모니터링 및 예측

치료의 효율성 측정:

또한, CDH3 유전자의 차별적인 발현은 CDH3 관련 질환, 췌장암 세포(PaC 세포), 폐암 세포(LuC 세포), 결장암 세포(CC 세포), 전립선암 세포(예, PrC 세포), 유방암 세포(BC 세포), 위암 세포(GC 세포), 또는 간암 세포(LiC 세포)의 치료 경과를 모니터링 및 측정할 수 있도록 한다. 대안적으로, 본 발명에 따르면 PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC의 치료 경과를 모니터링하기 위한 중간 결과가 제공될 수 있다. 이러한 중간 결과는 의사, 간호사 또는 전문의에게 개체가 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암을 겪고 있는지 확인하는 것을 돕기 위하여 부가적인 정보과 결합될 수 있다. 따라서, CDH3 유전자 또는 암호화된 단백질은 PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC의 임상적 결과를 모니터링하기 위한 유용한 예후 마커이다. 대안적으로, 본 발명은 개체 유래 조직의 암 세포를 검출하는데 사용될 수 있으며, PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC의 치료 경과를 측정하기 위한 유용한 정보를 의사에게 제공할 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 테스트 세포군은 PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC를 위한 치료를 받고 있는 개체로부터 제공된다. 만약 가능하다면, 테스트 세포군은 치료 전, 동안, 및/또는 후의 다양한 시간대에서 획득된다. 그리고 상기 테스트 세포에서 CDH3 유전자의 발현은 확인되고, PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC의 상태가 알려진 세포를 포함하는 참조 세포의 동일한 유전자의 발현과 비교한다. 본 발명의 문맥에 있어서, 상기 참조 세포는 관심있는 치료에 노출되지 않아야 한다.

PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC를 취한 특정한 치료 과정의 모니터링 및 측정의 문맥에 있어서, 상기 생물학적 시료는 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암 치료를 받고 있는 개체로부터 유래하여야 한다. 바람직하게 다수의 테스트 생물학적 시료는 상기 치료의 전, 동안 또는 후의 다양한 시간대의 개체로부터 획득된다.

만약 상기 참조 세포군이 비-PaC 세포, 비-LuC 세포, 비-CC 세포, 비- PrC 세포, 비-BC 세포, 비-GC 세포, 또는 비-LiC 세포를 포함하고 있는 경우, 상기 테스트 세포군 및 상기 참조 세포 군내의 CDH3 유전자의 발현의 유사함은 관심 있는 치료가 효과적이라는 것을 의미한다. 그러나, 상기 테스트 세포군 및 장상 대조군 참조 세포군의 CDH3 유전자 발현의 차이는 양호하지 않은 임상적 결과 또는 예후를 의미한다. 유사하게, 상기 참조 세포군이 PaC 세포, LuC 세포, CC 세포, PrC 세포, BC 세포, GC 세포, 또는 LiC 세포를 포함하고 있는 경우, 상기 테스트 세포군과 상기 참조 세포군에서의 CDH3 유전자 발현의 유사함은 관심있는 치료가 효과적인 것을 의미하나, 상기 테스트 세포군과 PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC 대조군 참조 세포군의 CDH3 유전자 발현의 유사성은 양호하지 않은 임상적 결과 또는 예후를 의미한다.

추가적으로, 치료 이후 획득한 개체로부터 유래한 생물학적 시료 내 확인된 CDH3 유전자 발현 수준(즉, 치료 이후 수준)은 치료 시작 이전에 획득한 개체로부터 유래한 생물학적 시료 내 확인된 CDH3 유전자 발현 수준(즉, 치료 이전 수준)과 비교될 수 있다. 치료 이후 시료 내 상기 발현의 감소는 관심있는 치료가 효과적이라는 것을 의미하는 반면, 치료 이후 시료 내 상기 발현의 증가 또는 유지는 양호하지 않은 임상적 결과 또는 예후를 의미한다.

본 명세서에 사용된, 상기 용어 "효과적"은 상기 치료가 CDH3 유전자의 발현의 감소 또는 개체의 PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC의 크기, 확대, 또는 전이 가능성을 이끌어낸다는 것을 의미한다. 관심있는 치료가 예방적으로 적용된다면, 상기 용어 "효과적"은 상기 치료가 폐암 및/또는 식도 종양의 형성을 지연 또는 억제하거나 또는 PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC의 임상적인 증상을 지연, 억제, 또는 경감시킨다는 것을 의미한다. 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간 종양의 측정은 표준 임상 프로토콜을 이용하여 만들 수 있다.

더불어, 효과적인 것은 PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC를 진단 또는 치료하기 위한 모든 알려진 방법과 함께 확인할 수 있다. PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC는 예를 들어, 조직 병리학적 또는 대안적으로 증후성 이형(symptomatic anomalies), 예를 들어, 체중 감소, 식욕 감소, 복통, 요통, 신경성 식욕 부진증, 구역질, 구토 및 불쾌감(generalized malaise), 허약(weakness), 및 황달(jaundice)을 확인함으로써, 진단할 수 있다.

CDH3 관련 질환을 갖고 있는 개체의 예후의 측정:

또한, 본 발명은 CDH3 관련 질환, 예를 들어 PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC를 갖고 있는 개체의 예후를 측정하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 질환 단계의 스펙트럼에 대하여 테스트 세포군의 CDH3 유전자의 발현을 환자로부터 유래한 참조 세포군의 CDH3 유전자의 발현에 대하여 비교하는 단계를 포함한다. 테스트 세포군 및 상기 참조 세포군(들)의 CDH3 유전자의 유전자 발현을 비교하거나 또는 상기 개체로부터 유래한 테스트 세포군에서 시간에 걸친 유전자 발현의 패턴을 비교함으로써, 상기 개체의 예후는 측정될 수 있다.

대안적으로, 본 발명에 따라, PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC를 갖고 있는 개체의 예후를 측정하기 위한 중간 결과가 제공될 수 있다. 이러한 중간 결과는 의산, 간호사 또는 다른 전문의가 개체가 폐암 또는 식도암을 겪고 있는지 확인하는 것을 돕기 위하여, 추가 정보와 결합될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 개체 유래한 조직의 암 세포를 검출하는데 사용할 수 있으며, PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC, 또는 LiC를 갖고 있는 개체의 예후를 측정하기 위한 유용한 정보를 의사에게 제공한다.

예를 들어, 테스트 시료 내 정상 대조군 시료와 비교한 CDH3 유전자의 발현 증가는 양호하지 않은 예후를 의미한다. 반대로, 정상 대조군 시료와 비교하였을 때, 테스트 시료 내 CDH3 유전자 발현의 유사성은 상기 개체의 양호하지 않은 예후를 의미한다.

CDH3 관련 질환의 진단, 예후, 또는 치료를 위한 키트 및 시약:

본 발명은 CDH3 관련 질환의 진단 또는 예후를 위한 키트를 제공한다. 특히, 상기 키트는 상기 CDH3 단백질을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 상기 CDH3 단백질을 검출하기 위한 적합한 시약은 CDH3 단백질에 대한 항체를 포함한다. 바람직하게, 살아있는 신체에 투여된 상기 항체를 추적하기 위해서 상기 항체는 검출할 수 있는 분자로 표지될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 형광물질, 발광물질, 또는 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 항체 표지 및 상기 표지된 항체를 검출하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 모든 표지 및 방법이 본 발명에 적용될 수 있다.

더욱이, 상기 키트는 양성 및 음성 대조군 시약, 및 CDH3 단백질에 대한 항체를 검출할 수 있는 두 번째 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예후가 좋거나 또는 나쁜 개체로부터 획득한 조직 시료는 유용한 대조군 시약으로 역할을 할 수 있다. 본 발명의 키트는 추가적으로 상업적 또는 사용을 위한 설명서가 있는 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입물(예를 들어, 서면, 테이프, CD-ROM, 등)을 포함하는 사용자 스탠드포인트(standpoint)를 포함할 수 있다. 이러한 시약 등은 표지와 함께 용기 내에 유지될 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이얼(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 제조될 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 추가적으로 상기 CDH3 단백질에 대한 항체를 포함하는, 진단될 개체 내의 암을 검출, 이미지화 또는 치료하기 위한 키트를 제공한다. 바람직한 실시에에서, 상기 본 발명의 항체는 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 예를 들어, 상기 본 발명의 키트는 킬레이트제(chelating agent) 및 방사성 물질로 변형된 CDH3을 인식할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. MX-DOPA는 상기 항체를 변형시키는데 바람직한 킬레이트제이다. 반면, 인듐-111(¹¹¹In)은 바이오이미지를 위한 추적자로서 이용될 수 있다. 대안적으로, CDH3을 발현하는 암의 방사선 면역치료법을 위해서, 항체는 베타 핵종(beta nuclides), 예를 들어 이트륨-90(⁹⁰Y)으로 표지될 수 있다. 본 발명에 있어서, 인듐-111(¹¹¹In) 또는 이트륨-90(⁹⁰Y)은 또한 염 또는 이의 용액으로서 제공될 수 있다. 인듐-111(¹¹¹In) 또는 이트륨-90(⁹⁰Y)의 적합한 염은 염화물이다.

바람직한 실시예에서, CDH3 관련 질환은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암이다.

치료학적 용도

하기 기재된 것은 상기 본 발명의 항체를 이용하여 암의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 약학적 조성물이다. 상기 암은 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

특히, 본 발명에 따라 개체의 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법은 상기 항체 또는 상기 기재한 단편이 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

상기 용어 "개체"는 본 명세서에서 췌장, 폐, 결장, 전립선, 유방, 위 또는 간암세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 암으로 고통받는 개체를 의미한다. 본 발명에서 상기 개체는 포유류 및 조류 동물을 포함하는 동물일 수 있다. 예를 들어, 포유류는 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼 및 개를 포함할 수 있다.

상기 본 명세서에 기재한 항체 또는 이의 단편은 CDH3 단백질에 특이적으로 결합하여 상기 항체 또는 이의 단편이 개체에 투여되었을 때, 이는 상기 개체 내에서 CDH3 단백질과 결합하고, CDH3를 발현하는 세포의 발현이 억제될 수 있다. 대안적으로, 상기 항체 또는 이의 단편이 치료학적 부분(moiety)에 결합되어, 개체에 투여될 때, 이는 개체의 CDH3 단백질을 발현하는 부분(즉, 고통받는 부분)으로 전달되고, 치료학적 부분(moiety)은 선택적으로 상기 고통받는 부분으로 전달되어, 그곳에서 작용한다. 이러한 치료학적 부분(moiety)은 알려진 모든 치료학제일 수 있으며, 또는 상기 암에 대하여 치료학적 효과를 갖고 있도록 개발될 수 있으며, 방사성 동위원소 표지 및 화학 치료학적 약제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료제로서 사용될 수 있는 방사성 동위원소 표지는 베타선 에너지 및 이의 방출 효율, 감마선 방출의 존재 또는 부재, 이의 에너지 및 방출 효율, 물리적 반감기 및 표지 방법을 포함하는 다양한 요소에 따라 선택될 수 있다. 일반적으로 이트륨(예를 들어, ⁹⁰Y) 및 아이오딘(예를 들어, ¹²⁵I 및 ¹³¹I)에 근거한 상기 방사성 동위원소가 사용될 수 있다. 화학 치료학적 약제는 알려져 있거나 또는 상기 암을 치료하기 위해서 개발되는 어떠한 것일 수도 있으며, 메토트렉세이트(methotrexate), 탁솔(taxol), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 시스플라틴(cisplatin), 키르보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 독소루비신(doxorubicin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 비노렐빈(vinorelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 및 도세탁셀(docetaxel)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 단편은 선택적으로 CDH3 단백질에 결합될 수 있으며, 정상 세포에는 결합하지 않아, 상기 항체 또는 이의 단편, 또는 방사성 동위원소 또는 화학 치료학적 약제에 의해서 유발될 수 있는 부작용이 효과적으로 회피될 수 있으며, 따라서 상기 치료학적 효과는 매우 높다.

상기 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 단편은 상기 CDH3 관련 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 개체에 투여될 수 있다. 효과적인 양은 항체 또는 이의 단편이 상기 치료받는 개체에서 건강한 이득을 낼 수 있는 것을 의미한다. 상기 약학적 조성물이 본 발명의 항체를 포함하고 있을 때, 투여의 제형 및 방법은 하기 기재된다.

본 명세서에 기재된 특정한 단일클론 항체의 혼합물 또는 이들의 결합단편과 같은 다른 단일클론 항체의 칵테일은 만약 필요하거나, 원한다면 암을 경감시키기 위하여 투여될 수 있다고 이해될 수 있다. 실제로, 암세포에서, 다양한 항원 또는 다른 에피토프(epitope)를 표적으로 하는, 칵테일로의 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편 혼합물의 이용은 상기 항원의 하나를 억제시킬 수 있으므로, 특히 종양 세포 및/또는 암 세포의 침입을 막을 수 있다는 점에서 유리한 접근이다.

본 발명에 따라 사용되기 위한 약학적 조성물은 하나 또는 다수 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 이용하여 종래의 방법으로 제조될 수 있다.

상기 항체 또는 이의 단편은 예를 들어, 1회 주입(bolus) 주사 또는 연속 투여에 의해서 주사로 비경구 투여(즉, 정맥 또는 근육 내)용으로 제조될 수 있다. 주사를 위한 제형은 유닛 복용량 형태로 제시될 수 있으며, 예를 들어 앰플(ampoules) 또는 보조제가 첨가된 다수 복용량 용기에 제시될 수 있다. 상기 조성물은 지성 또는 수성 비히클(vehicle)내에 현탁액, 용액, 또는 에멀젼(emulsion)의 형태로 취할 수 있으며, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 항체는 사용하기 전에 예를 들어, 멸균 발열성 물질 제거수(sterile pyrogen-free water)와 같은 적합한 비히클과 함께 구성되도록 동결건조된 파우더의 형태일 수 있다.

상기 항체 또는 단편, 또는 이와 결합한 치료학적 부분(moiety)의 독성 및 치료학적 효과는 예를 들어, LD50(상기 군의 50%의 치사율을 보이는 복용량) 및 ED50(상기 군의 50%에서 치료학적 효과가 나타나는 복용량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 과정에 의해서 결정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 복용량 비율은 치료학적 인덱스이며, 이는 LD/ED 비율로서 표현될 수 있다.

커다란 치료학적 징후를 보이는 항체 또는 치료학적 반족(moieties)이 바람직하다. 반면, 독성 부작용을 나타내는 항체 또는 반족(moieties)이 이용될 수 있으나, 감염되지 않은 세포의 피해를 가능한 최소화하여, 부작용을 감소시키기 위하여, 영향받는 조직에 이러한 항체 또는 반족(moieties)을 표적으로 하는 전달 시스템을 고안하는 것이 고려될 수 있다.

상기 세포 배양 분석으로부터 획득한 데이터 및 동물 연구는 인간에게 사용하기 위한 복용량의 범위를 준비하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 항체의 복용량은 독성이 없거나 약간 있는 ED50을 포함하는 순환하는 혈장 농도의 범위인 것이 바람직하다. 상기 복용량은 적용되는 투여량 형태, 이용되는 투여 경로 및 결합된 치료학적 부분(moiety)의 종류 및 양에 따라서 이러한 범위에서 변화될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 어떠한 항체에 있어서, 상기 효과적인 복용량은 우선 세포배양 분석으로부터 측정될 수 있다. 복용량은 세포 배양에서 결정된 IC50(즉, 증상의 억제 중간농도를 얻을 수 있는 테스트 항체의 농도)을 포함하는 순환하는 혈장 농도를 획득하기 위하여, 동물 모델에서 제조될 수 있다. 이러한 정보는 인간에 대한 유용한 복용량을 보다 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피법(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)에 의해서 측정될 수 있다.

상기 개체의 상태 및 나이 및/또는 투여 경로에 의존적으로, 당업자는 본 발명의 약학적 조성물의 적합한 용량을 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물이 상기 개체에 하루에 투여되는 개체의 몸무게 kg당 약 3 내지 약 15 mcg, 바람직하게는 개체의 몸무게 kg당 약 10 내지 약 15 mcg의 양으로 투여된다. 상기 투여 간격 및 횟수는 상기 개체의 상태 및 나이, 투여 경로, 및 상기 약학적 조성물에 대한 반응을 고려하여 선택된다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 상기 개체에 1 내지 5회 투여될 수 있으며, 바람직하게는 하루에 1회로 5 내지 10일 동안 투여될 수 있다.

다른 측면에서, 상기 방사성 동위원소 표지된 항체를 포함하는 조성물이 비경구로 투여될 때, 성인 한 명당 투여 용량은 0.1 mCi/kg 내지 1.0 mCi/kg이며, 바람직하게는 0.1 mCi/kg 내지 0.5 mCi/kg이며, 더욱 바람직하게는 한번에 0.4mCi/kg이다.

약학적 조성물은 전신적 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 영향을 미칠 부위에 상기 활성 성분이 전달되도록 표적 전달 방식으로 투여된다.

특정한 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 하나 또는 메토트렉세이트(methotrexate), 탁솔(taxol), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 시스플라틴(cisplatin), 키르보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 독소루비신(doxorubicin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 비노렐빈(vinorelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 및 독세탁셀(docetaxel)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 화학 치료학적 약제와 조합으로 상기 암을 치료 또는 예방을 위해서 사용될 수 있다.

방사선 치료법에 있어서, 어떠한 방사선 치료법 프로토콜도 상기 치료되는 암의 종류에 따라서 사용될 수 있다. 예를 들어, 한정의 방법에 의한 것이 아니라, X선 방출이 투여될 수 있다. 라듐(radium), 코발트(cobalt), 및 그외 다른 원소와 같은 방사선 동위원소를 방출하는 감마선은 또한 조직에 노출되도록 투여될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 화학 치료법 또는 방사선 치료법은 상기 본 발명의 항체를 포함하는 방법 및 조성물을 이용한 다음, 바람직하게는 1, 5시간, 12시간, 하루, 일주일, 한 달, 및 더욱 바람직하게는 수개월(예를 들어, 3개월까지) 투여된다. 상기 본 발명에 따른 방법 및 조성물을 이용한 치료와 이전, 동시에, 또는 그 이후에 투여되는 화학 치료법 또는 방사선 치료법은 당업계에 알려진 어떠한 방법으로도 투여될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 또한 CDH3 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서, 본 발명의 방사선 표지된 항체의 용도를 추가적으로 제공한다.

대안적으로, 본 발명은 CDH3 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 상기 본 발명의 항체를 추가적으로 제공한다. 구체적으로 방사선 면역치료법을 위한 본 발명의 방사선 표지된 항체를 또한 제공한다.

대안적으로, 활성성분으로서 본 발명의 항체를 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 함께 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명은 CDH3 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 방법 또는 과정을 추가적으로 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 활성 성분으로서, 본 발명의 방사선 표지된 항체와 약학적 또는 생리학적 허용 가능한 담체를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물의 제조 방법 및 과정을 추가적으로 제공한다.

또 다른 실시예에서, 활성 성분으로서 본 발명의 항체와 약학적 또는 생리학적 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명은 또한 CDH3 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 본 발명의 방사선 표지된 항체와 약학적 또는 생리학적 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공한다.

추가적인 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 진단받는 개체 내의 암에 대한 바이오이미지 또는 면역신티그라피(immunoscintigraphy)에 이용하기 위한 용도를 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 개체 내의 암을 위한 바이오이미지 또는 방사면역신티그라피의 진단제 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 추가적으로 본 발명은 본 발명의 항체와 약학적 또는 생리학적 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 개체 내의 암에 대한 바이오이미지 또는 방사면역신티그라피의 진단 시약을 조제하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다.

본 명세서에서 인용한 모든 이전 참조는 그 전체가 참조로서 통합된다.

실시예

하기 본 발명을 추가적으로 실시예에 근거하여 설명한다.

재료 및 방법

항체 생산.

세포외 도메인을 암호화하는 CDH3 유전자(서열번호 3)는 암 세포로부터 유래한 cDNA 풀(pool)로부터 증폭되었다. 상기 산물은 pcDNA3.1(Invitrogen, CA)으로 복제되었다. CDH3-특이적 항체를 생산하기 위하여, 마우스는 상기 도메인 발현 벡터(17.5 mcg/주사)를 한 달 동안 2주마다, 피하로 면역화시켰다. 면역 혈청의 농도를 확인한 후, 비장세포(spleenocyte)는 상기 마우스로부터 추출되었으며, 하이브리도마를 제조하기 위하여 골수종 세포와 융합되었다. 발명자들은 상기 암 세포의 표면에 있는 천연의 CDH3 항원을 인식하는 하이브리도마를 스크리닝하였다. 상기 스크리닝을 통하여, 하이브리도마 클론 #6이 높은 수준으로 항원 특이적인 항체를 생산하며, 따라서 이러한 클론은 추가적인 실험을 위해서 항체를 생산하기 위하여 선택되었다. 상기 하이브리도마 클론 #6은 마우스의 복강으로 주입하는데 사용되었다. 상기 복수는 2 내지 3주 후에 수득하였다. 마지막으로 항체는 단백질 A 컬럼을 이용하여 상기 복수로부터 정제되었다(GE Healthcare, NJ).

세포배양.

여섯 개의 암 세포주가 이용되었다: 비소세포 폐암주로서, EBC-1, H1373 및 H358; 췌장암 주로서, KLM-1 및 MIAPaCa-2; 결장암 세포주로서, SW948. 모든 세포주는 미국 세포 표본 보관소( A merican T ype C ulture C ollection)(Manassasm, VA)로부터 획득되었으며, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 EMEM(EBC-1, MIAPaCa-2), RPMI(H358, KLM-1, H1373) 및 L-15(SW948)에서 37℃, 5% CO₂의 습한 대기에서 유지되었다.

유세포 분석.

H358, KLM-1 및 MIAPaCa-2은 초기 포화도(confluency)가 될 때까지 각각 권장되는 배지에서 유지되었다. 그리고, 상기 세포는 세포 표면 항원의 변성을 방지하기 위하여, 세포 용해 용액(Cell Dissociation Solution)(SIGMA, MO)으로 분리되었다. 세포는 PBS(1 × 10⁷ 세포/㎖)로 현탁되었으며, 4℃에서 1시간 동안 테스트 항체로 반응되었다. PBS로 2회 세척한 후, 세포는 7AAD(2.5 mcg/㎖)를 포함하는 Alexa Fluor488 염소 항 마우스 IgG(H+L)(Invitrogen, CA) 20 mcg/㎖과 혼합한 후, 4℃에서 어두운 데서 30분 동안 반응되었다. 테스트 항체의 결합 방식 및 특이성은 제조업자의 지시에 따른 FACS Calibur(Becton Dickinson, NJ)에 의해서 측정되었다.

방사선 표지.

하이브리도마 클론 #6(클론 6)에 의해서 생성된 항-CDH3 마우스 단일클론 항체, 293T 및 대조군 항체에 의해서 생성된 키메라 항체의 클론6(ch-#6), 정상 마우스 IgG1(Nordic immunological laboratories, Tiburg, The Netherlands) 및 정상 인간 IgG는 두 개의 다른 동위원소로 표지되었다; 인듐-111(¹¹¹In) 및 이트륨-90(⁹⁰Y). 항체는 이작용 금속 이온 킬레이트제인 p-SCN-Bn-DTPA 또는 p-SCN-Bn-CHX-A"-DTPA(Macrocyclics, Dallas, TX, USA)로 표지되었다. 항체 1 밀리그램은 이러한 킬레이터와 1:5의 몰(mole) 비율로 디메틸포름아미드(dimethylformamide)에서 결합되었다. 37℃에서 20시간 동안 배양시킨 후, 항체-킬레이터 복합체는 바이옵신 컬럼(Biospin Column) 6(Bio-Rad, Tokyo, Japan)을 이용하여 정제되었다. ¹¹¹InCl₃(Nihon Medi-Physics, Hyogo, Japan) 및 ⁹⁰YCl₃(QSA Global, Brauschweig,Germany)은 각각 동시에 상온에서 0.25 M 아세트산(pH 5.5)으로 5분 동안 미리 전배양 반응되었다. ¹¹¹In- 및 ⁹⁰Y-표지된 항체를 얻기 위하여, 상기 항체-킬레이터 복합체는 ¹¹¹InCl₃ 및 ⁹⁰YCl₃ 용액과 미리 반응된 용액과 각각 37℃에서 1시간 동안 반응되었다. 표지된 항체는 제조업자의 지시에 따른 Biospin Column 6을 이용하여 정제되었다. 이러한 항체의 감소가 표지 되는 과정 가운데 관찰되지 않았다.

이종이식( xenograft ) 모델.

동물 보살핌 및 치료는 군마(Gunma) 대학의 동물 이용 및 동물 협회의 가이드 라인에 따라서 수행되었다. EBC1, SW948, KLM-1 및 H1373 세포 현탁액(1 × 10⁷ 세포)의 100 mcL은 3- 내지 5-주 연령의 누드 마우스(Charles River Laboratories Japan Inc. Yokohama, Japan) 암컷의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사되었다. 이러한 마우스는 상기 종양이 발달할 수 있는 몇 주 동안 유지되었다. 상기 확립된 종양은 종양을 갖고 있는 마우스로부터 분리되었으며, 한 면이 2 mm의 네모 모양의 조직 단편이 되도록 잘랐다. 이러한 단편은 누드 마우스로 순차적으로 이식되었다. 상기 이식 이후, 이러한 마우스는 100 ~ 600 mm³으로 평균 종양 부피가 다다를 때까지 유지시켰다.

생물학적 분포 연구.

확립된 인간 폐암 종양 EBC-1를 갖고 있는 누드 마우스는 임의로 선택되었으며, 두 개의 군으로 나누었다. 상기 마우스는 Alexa647-표지 및 ¹¹¹In-표지(0.5 mCi/mg) 항체를 정맥으로 주입하였다. 형광에 기반한 연구를 위해서, 상기 Alexa647-표지된 항체의 생물학적 분포는 치료 48시간 이후, IVIS 200 바이오이미징 시스템(Caliper Life Sciences, MA)을 이용하여 측정하였다. 방사성 동위원소 기반한 연구를 위해서, 상기 이식된 종양은 각각 투여 3, 24, 48 및 72 시간 이후, 혈액, 간, 신장, 장, 위, 비장, 췌장, 폐, 심장, 근육 및 뼈와 더불어 분리되었다. 모든 조직은 무게를 측정하였며, 감마-웰 카운터(gamma-well counter)에서 방사능을 측정하였으며, 그람(gram) 당 투여량의 비율(%ID/g)이 결정되었다. 구체적으로, ¹¹¹In-표지된 클론 6은 종양(EBC-1, SW948, KLM-1 and H1373)을 각각 갖고 있는 누드 마우스를 이용하여, 48시간째에 분석되었다.

Radiotherapy (1회 투여).

이종이식(xenograft) 마우스는 임의로 3개의 치료군으로 배정되었다. ⁹⁰Y-표지된 항체(4-10 mCi/mg)는 상기 기재한 바와 같이 제조되었다. 상기 마우스는 대조군으로서 정맥으로 ⁹⁰Y-표지 클론 6 또는 ⁹⁰Y-표지 정상 마우스 IgG1를 주입하였다. 주입된 항체의 방사능은 동물당 100 mcCi으로 조정되었다. 상기 치료된 이종이식 마우스의 무게 및 종양 부피는 ⁹⁰Y-표지된 항체 주입 이후, 4주 동안 관찰되었다. 상기 종양의 부피(mm³)는 하기 공식을 이용하여 측정되었다:(가장 짧은 직경)² ×(가장 긴 직경) × 0.5.

방사선 치료(2회 투여).

SW948 이종이식 마우스는 임의로 4개의 치료군으로 배정되었다. 항체는 ⁹⁰Y를 이용한 방사선 표지를 위해서 p-SCN-Bn-DTPA와 결합되었다. ⁹⁰Y-표지된 항체(4-10 mCi/mg)는 상기 기재된 바와 같이 제조되었다. 상기 마우스는 대조군으로서 ⁹⁰Y-표지된 클론 6 또는 90Y-표지된 정상 IgG1를 정맥으로 주입하였다. 두 번째 주입은 상기 첫 번째 주사 14일 이후, ⁹⁰Y-표지된 클론 6을 이용하여 수행되었다. 주입된 항체의 방사능은 동물당 100 mcCi로 조절되었다. 상기 치료된 이종이식 마우스의 무게 및 종양 부피는 첫 번째 ⁹⁰Y-표지된 항체 주입 이후, 7주 동안 관찰되었다. 상기 종양 부피(mm³)는 하기 공식을 이용하여 계산되었다:(가장 짧은 직경)² ×(가장 긴 직경) × 0.5.

HE 염색.

분리된 종양은 얼린 조직 섹션을 제조하기 위하여, 건조한 얼음 위에서 Lab-Tek OCT 화합물(Sakura Finetek USA, CA)에 박았다. 상기 얼린 조직 섹션은 OCT 화합물을 제거하기 위하여 증류수로 세척하며, 자일렌(xylene)으로 5분 동안 2회 처리하였다. 과량의 자일렌을 제거하고, 다시 수화하기 위하여, 상기 섹션은 10초 동안 00%, 90%, 80%, 70% 및 50% 에탄올로 각각 세척하였다. 슬라이드 섹션은 5분 동안 Mayer' s Hematoxilin(Muto Pure Chemicals, Japan)에 담갔으며, 과량의 헤마톡실린(Hematoxilin)은 흐르는 물로 세척하였다. 그리고, 재수화(re-hydrate)는 1% 에오신 Y(Eosin Y)(Muto Pure Chemicals, Japan) 처리 이후, 50%, 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올을 이용하여 수행되었다. 마지막으로, 상기 섹션은 자일렌으로 5분 동안 3회씩 처리한 후, 말리놀(Malinol)(DAIDO SANGYO, Japan)에 의해서 순차적으로 봉하였다.

아미노산 서열.

전체 RNA는 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여, 하이브리도마 클론 #6으로부터 추출되었다. cDNA는 SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 상기 전체 RNA로부터 합성되었다. 상기 단일클론 항체의 가변 부위의 서열은 NovaTaq DNA 중합효소(Novagen) 및 마우스 Ig-프라이머 세트 (Novagen)를 이용하여 증폭되었다. 상기 단일클론 항체의 가변 부위의 서열은 5' 프라이머; H 체인을 위한 MuIgVH5'-B; 5'-GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT-3'(서열번호 4), 및 클론 #6의 L 체인을 위한 MuIg kappa VL5'-G; 5'-ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3'(서열번호 5), 5'-ACTAGTCGACATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3'(서열번호 6), 5'-ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3'(서열번호 7) 및 5'-ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3'(서열번호 8) 및 3' 프라이머; H 체인을 위한 MuIgGVH3'-2; 5'-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3'(서열번호 9) 및 L 체인을 위한 MuIg kappa VL3'-1; 5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3'(서열번호 10)를 이용하여 증폭되었다. PCR 산물은 pCR2.1-TOPO(Invitrogen)으로 클론되었다. 삽입 부분은 시퀀싱하였으며, 상기 클론 #6의 가변 부위의 서열(상기 신호 서열을 제외한)이 확인되었다.

하기의 기호는 상기 프라이머 서열 내의 다른 뉴클레오티드를 위해서 사용된다;

B는 C, G 또는 T를, D는 A, G 또는 T를, A, C 또는 T는 H를 I는 이노신(inosine)을 K는 G 또는 T를 M은 A 또는 C를, R은 A 또는 G를 S는 C 또는 G를 V는 A, C 또는 G를, W는 A 또는 T를 그리고 Y는 C 또는 T임.

키메라 마우스/인간 항체

마우스 단일클론 항체 클론 #6에 근거한 키메라 마우스/인간 항체 ch-#6은 GS 유전자 발현 시스템(Lonza, Switzerland)을 이용하여 제조되었다. H 체인과 L 체인은 모두 오버랩 연장 중합효소 연쇄반응(Overlap extension polymerase chain reaction, OE-PCR)을 이용하여 증폭되었다. 상기 H 체인의 가변부분은 서열번호 23 및 24의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해서 증폭되었다. 상기 인간 IgG1의 불변 부분은 서열번호 27 및 28의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해서 증폭되었다. 이러한 두 개의 PCR 산물은 오버랩 연장을 위해서 말단에 동일한 서열을 포함하고 있었다. 그리고, H 체인의 유전자는 이러한 두 개의 PCR 산물을 가지고, 서열번호 31 및 28의 프라이머를 이용하여 오버랩 연장 PCR에 의해서 증폭되었다. 동일한 q방식으로, 상기 L 체인의 가변 부위은 서열번호 25 및 26의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해서 증폭되었다. L 체인의 유전자는 말 단의 동일한 서열을 포함하고 있는 이러한 두 개의 PCR 산물을 가지고, 서열번호 31 및 28의 프라이머를 이용하여 오버랩 연장 PCR에 의해서 증폭되었다. L 체인 및 H 체인 가변 부위에 해당하는 각각의 유전자들은 인간 kappa의 불변 부분(서열번호 21을 암호화하는 서열번호 19) 및 인간 IgG1(서열번호 22를 암호화하는 서열번호 20)에 의해서 각각 PCR에 의해서 증폭되고, HindIII 및 EcoRI 제한 효소를 이용하여, 항체 발현 벡터 pEE12.4 및 pEE6.4에 각각 클론되었다. 이러한 두 개의 단일 유전자 벡터(SGV)는 제한 효소 NotI 및 PvuI에 의해서 절단되었다. 상기 절단된 H 체인 SGV DNA는 hCMV-MIE 프로모터-H 체인-SV40 전산 단위를 포함하고 있으며, 상기 절단된 L 체인 SGV DNA는 GS 전산 단위 및 hCMV-MIE 프로모터-L 체인 발현 카세트를 포함하고 있다. 정제된 단편은 모두 이중 유전자 발현 벡터를 제조하기 위하여 라이게이션(ligation)되었다. 상기 벡터는 E.coli로 형질전환된 다음 준비되었다. 상기 H-체인과 L-체인을 모두 발현하는 벡터는 293T 세포로 전이되었다. 상기 배지는 혈청이 없는 배지(DMEM; GIBCO, 11965-092)로 교환한 후, 상기 배지 상층액 내의 키메라 항체는 단백질 A 컬럼을 통해서 정제되었다.

결과

첫째, 항-CDH3 항체의 특이성을 측정하기 위하여, CDH3의 발현이 다양한 세포주에서 확인되었다. CDH3 항원은 H358과 KLM-1의 표면에 제시되었으나, MIAPaCa-2의 표면에는 제시되지 않았다(도 1). 상기 H358과 KLM-1과 만족스러운 반응성을 보이나, MIAPaCa-2와는 보이지 않은 항체는 유세포 분석기를 이용하여 스크리닝되었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 모든 스크리닝된 항-CDH3 항체는 자연 CDH3 단백질을 정확하고 특이적으로 인식하였다.

둘째, 항-CDH3 항체의 생물학적 분포는 이종이식(xenocraft) 모델을 이용하여 확인되었다. Alexa647-표지된 항체 #4와 #6은 다른 클론 및 대조군 항체에 비하여, 높은 수준으로 종양이 축적되었다(도 2의 A). #6은 신속한 혈액 정화율(clearance)과 그외와 비교하였을 때, 정상 조직에서 예측치 못하는 정상 조직의 표적화하지 않고, 높은 종양 표적을 보이므로, ⁹⁰Y은 방사선 치료를 위해서 선택되었다. 상기 클론 6의 상기 종양으로의 흡수 최고점은 주입 48시간 이후, 각각 32.0 +/- 3.5%ID/g(EBC-1), 21.4 +/- 2.3%ID/g(SW948), 24.2 +/- 1.2%ID/g(KLM-1), 23.8 +/- 3.1%ID/g(H1373)이었다. 동일한 방식으로, 상기 ch-#6으로 명명되는 클론 6의 키메라 항체의 상기 종양으로의 흡수 최고점은 주입 48시간 이후, 38.0 +/- 3.2%ID/g(H1373)이었다(도 3의 E). 반면, 상기 대조군 IgG의 흡수는 모든 마우스에서 10%ID/g을 절대 넘지 않았다(도 3의 A 내지 E). 이러한 상기 클론 6과 ch-#6의 종양 특이적 흡수는 시간 의존적으로 증가하였다(결과는 보이지 않음). 도 3의 A 내지 E에 나타난 바와 같이, 정상 조직은 배탁적인 CDH3의 발현 수준과 일치하는 상당히 낮은 수준의 흡수를 보였다. 생물학적 분포 연구에 나타난 바와 같이, 상기 클론 6의 흡수는 CDH3 제시 종양 특이적 방식에서 관찰되었다. 따라서, 상기 항체는 방사성 동위원소-표지된 항체 약물로서 개발하는데 이상적인 특성을 가지고 있다.

셋째, ⁹⁰Y-표지된 클론 6과 ch-#6을 이용한 방사선 치료는 이종이식 마우스를 이용하여 수행되었다. 모든 종양은 상기 클론 6과 결합된 이트륨-90으로부터 방출에 의해서 성장률이 급격하게 감소하였으며(도 4의 A, 5의 A, 6, 7) ch-#6과 결합된 이트륨-90으로부터 방출에 의해서 성장률이 급격하게 감소하였다(도 8). 반면, ⁹⁰Y-표지된 대조군 항체는 종양 성장에 있어서 효과를 보이지 않았다(도 4의 A, 5의 A, 6, 7, 8). 따라서, 이러한 치료학적 효과는 상기 항원-항체 반응에 의존하는 것처럼 보였다. EBC-1(폐암) 종양 치료는 단지 한 달 동안 1회의 투입에 의해서 안정적인 질환을 보였다. 종양은 상기 방사선 치료 이후, 분리되고, HE 염색을 수행하였다. 도 4의 B에 나타난 바와 같이, 종양 세포의 수는 급격하게 감소하였으며, 상기 뚜렷한 섬유증은 ⁹⁰Y-표지된 클론 6을 이용한 치료에 의해서 관찰되었다. ⁹⁰Y-표지된 대조군 IgG를 이용하여 치료한 종양에서는 섬유증이 관찰되지 않았다는 것이 주목할만 하다(도 4의 B). 유사하게, SW948(결장암) 종양은 상기 치료에 의해서 부분적인 반응을 보였다(도 5). 상기 이식된 종양은 ⁹⁰Y-표지된 클론 6의 주입 21일 이후에 각 마우스에서 거의 사라졌다(도 5의 B). 반면, KLM-1(췌장암) 종양은 안정병변(stable disease, SD)을 나타냈으며, 치료에 의해서 진행병변(progressive disease, PD)을 보였다(도 6). 그러나 상기 ⁹⁰Y-표지된 클론 6을 이용한 치료는 비-표지 항체를 이용한 치료에 비하여 효과적이었다. ⁹⁰Y-표지된 클론 6의 2회 투여는 모든 마우스에서 1회 투여에 비하여 더욱 효과적이었다(도 7). 더욱이, 클론 6의 키메라 항체인 ⁹⁰Y-표지된 ch-#6은 상기 대조군에 비하여 높은 효율성을 보였다. 도 8의 CHX와 SCN은 재료 및 방법에 기재된 링커를 나타낸다.

종합해보면, 항-CDH3 항체 클론 6와 이트륨-90으로 결합된 ch-#6은 이러한 종양에 대하여 뛰어난 치료학적 효과를 보였다. 따라서, CDH3은 이러한 종양을 위한 매력적인 치료학적 표적이며, 항-CDH3 항체는 이러한 종류의 치료를 위한 유용한 치료학적 약물의 후보이다.

결론적으로, 상기 마우스 Ig H-체인 가변 부위과 L-체인 가변 부위의 아미노산 서열은 하기와 같이 확인되었다:

클론 #6, H-체인 가변 부위(상기 신호 서열을 제외한):

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDNYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(서열번호 11) ; 및

클론 #6, L-체인 가변 부위(상기 신호 서열을 제외한): QIVLTQSPAIMSSSPGEKVTMSCSATSSVTYMYWYQQKPGSSPKPWIFRTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQHYHIYPRTFGGGTKL(서열번호 12).

상기 항체의 CDR(상보성 결정 부위) 서열은 하기와 같이 Kabat정의에 의해서 확인되었다:

클론 #6, SYWIH(서열번호 13) as VH CDR1, EIDPSDNYTYYNQNFKG(서열번호 14) as VH CDR2 및 SGYGNLFVY(서열번호 15) as VH CDR3, SATSSVTYMY(서열번호 16) as VL CDR1, RTSNLAS(서열번호 17) as VL CDR2 및 QHYHIYPRT(서열번호 18) as VL CDR3.

산업상 이용가능성

본 발명은 CDH3을 발현하는 암을 생체 내(in vivo)에서 방사선 동위원소로 표지된 항-CDH3 항체를 이용하여 치료할 수 있다는 발견에 적어도 일부 근거한다. CDH3은 본 발명자들에 의해서 췌장, 폐, 대장, 전립선, 유방, 위 또는 간암에서 강하게 발현하는 유전자로서 동정되었다. 따라서, 암의 치료, 예를 들어, 췌장, 폐, 대장, 전립선, 유방, 위 또는 간암은 방사선 동위원소 표지가 표지된 항-CDH3 항체를 이용하여 편리하게 수행될 수 있다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. THE UNIVERSITY OF TOKYO NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION GUNMA UNIVERSITY <120> ANTI-CDH3 ANTIBODIES LABELD WITH RADIOISOTOPE LABEL AND USES THEREOF <130> 10fpi-12-14 <150> US 61/076,982 <151> 2008-06-30 <160> 32 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 4276 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgcgttttaa aaattgtctt tatttacatt ttacagaaag ttgagaaagt gttatttata 60 tggggggtag gggtgctgga gattatgaga ctaataacaa ccctcttagc tcgcaccctt 120 tggcaccact acagcttcca aactctggga ctttctcgac tagcttccct ttgtttagct 180 gtgaaatgga agaagcggtc cgggtgtggc ggctcatgcc tgtaacctga gcactctggg 240 aggcggagga tcgcttgagt ccagaagttc aagaccagct tgggcaacat agggtgaccc 300 tccaccctcc ccccgcccca ccacatcgct acaaaaaatt tttaaaaatt agccgggtgt 360 ggtggcgcaa gcctgtagtc tcagcgggag ctgagggagg agaatcgctt cagcccggga 420 ggtcgaggct gtagtgagcc gagatcgcgc tactgcactc ctgggcgaca gagcgagacc 480 ctgtctccaa aaaaaaaaaa aaaagaaaaa agaggaagtt gtatccaatt cagaaacgcg 540 gtccttcggg acctgctagt tttatacccc ggaggatcct ccccggcggg ctggcacggg 600 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cagggcatcc tgacaaccag gaagggtttg gattttgagg ccaaaaacca 2340 gcacaccctg tacgttgaag tgaccaacga ggcccctttt gtgctgaagc tcccaacctc 2400 cacagccacc atagtggtcc acgtggagga tgtgaatgag gcacctgtgt ttgtcccacc 2460 ctccaaagtc gttgaggtcc aggagggcat ccccactggg gagcctgtgt gtgtctacac 2520 tgcagaagac cctgacaagg agaatcaaaa gatcagctac cgcatcctga gagacccagc 2580 agggtggcta gccatggacc cagacagtgg gcaggtcaca gctgtgggca ccctcgaccg 2640 tgaggatgag cagtttgtga ggaacaacat ctatgaagtc atggtcttgg ccatggacaa 2700 tggaagccct cccaccactg gcacgggaac ccttctgcta acactgattg atgtcaatga 2760 ccatggccca gtccctgagc cccgtcagat caccatctgc aaccaaagcc ctgtgcgcca 2820 ggtgctgaac atcacggaca aggacctgtc tccccacacc tcccctttcc aggcccagct 2880 cacagatgac tcagacatct actggacggc agaggtcaac gaggaaggtg acacagtggt 2940 cttgtccctg aagaagttcc tgaagcagga tacatatgac gtgcaccttt ctctgtctga 3000 ccatggcaac aaagagcagc tgacggtgat cagggccact gtgtgcgact gccatggcca 3060 tgtcgaaacc tgccctggac cctggaaggg aggtttcatc ctccctgtgc tgggggctgt 3120 cctggctctg ctgttcctcc tgctggtgct gcttttgttg gtgagaaaga agcggaagat 3180 caaggagccc ctcctactcc cagaagatga cacccgtgac aacgtcttct actatggcga 3240 agaggggggt ggcgaagagg accaggacta tgacatcacc cagctccacc gaggtctgga 3300 ggccaggccg gaggtggttc tccgcaatga cgtggcacca accatcatcc cgacacccat 3360 gtaccgtcct cggccagcca acccagatga aatcggcaac tttataattg agaacctgaa 3420 ggcggctaac acagacccca cagccccgcc ctacgacacc ctcttggtgt tcgactatga 3480 gggcagcggc tccgacgccg cgtccctgag ctccctcacc tcctccgcct ccgaccaaga 3540 ccaagattac gattatctga acgagtgggg cagccgcttc aagaagctgg cagacatgta 3600 cggtggcggg gaggacgact aggcggcctg cctgcagggc tggggaccaa acgtcaggcc 3660 acagagcatc tccaaggggt ctcagttccc ccttcagctg aggacttcgg agcttgtcag 3720 gaagtggccg tagcaacttg gcggagacag gctatgagtc tgacgttaga gtggtggctt 3780 ccttagcctt tcaggatgga ggaatgtggg cagtttgact tcagcactga aaacctctcc 3840 acctgggcca gggttgcctc agaggccaag tttccagaag cctcttacct gccgtaaaat 3900 gctcaaccct gtgtcctggg cctgggcctg ctgtgactga cctacagtgg actttctctc 3960 tggaatggaa ccttcttagg cctcctggtg caacttaatt ttttttttta atgctatctt 4020 caaaacgtta gagaaagttc ttcaaaagtg cagcccagag ctgctgggcc cactggccgt 4080 cctgcatttc tggtttccag accccaatgc ctcccattcg gatggatctc tgcgttttta 4140 tactgagtgt gcctaggttg ccccttattt tttattttcc ctgttgcgtt gctatagatg 4200 aagggtgagg acaatcgtgt atatgtacta gaactttttt attaaagaaa cttttcccag 4260 aggtgcctgg ggagtg 4276 <210> 2 <211> 829 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Leu Pro Arg Gly Pro Leu Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Val 1 5 10 15 Cys Trp Leu Gln Cys Ala Ala Ser Glu Pro Cys Arg Ala Val Phe Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Val Thr Leu Glu Ala Gly Gly Ala Glu Gln Glu Pro Gly 35 40 45 Gln Ala Leu Gly Lys Val Phe Met Gly Cys Pro Gly Gln Glu Pro Ala 50 55 60 Leu Phe Ser Thr Asp Asn Asp Asp Phe Thr Val Arg Asn Gly Glu Thr 65 70 75 80 Val Gln Glu Arg Arg Ser Leu Lys Glu Arg Asn Pro Leu Lys Ile Phe 85 90 95 Pro Ser Lys Arg Ile Leu Arg Arg His Lys Arg Asp Trp Val Val Ala 100 105 110 Pro Ile Ser Val Pro Glu Asn Gly Lys Gly Pro Phe Pro Gln Arg Leu 115 120 125 Asn Gln Leu Lys Ser Asn Lys Asp Arg Asp Thr Lys Ile Phe Tyr Ser 130 135 140 Ile Thr Gly Pro Gly Ala Asp Ser Pro Pro Glu Gly Val Phe Ala Val 145 150 155 160 Glu Lys Glu Thr Gly Trp Leu Leu Leu Asn Lys Pro Leu Asp Arg Glu 165 170 175 Glu Ile Ala Lys Tyr Glu Leu Phe Gly His Ala Val Ser Glu Asn Gly 180 185 190 Ala Ser Val Glu Asp Pro Met Asn Ile Ser Ile Ile Val Thr Asp Gln 195 200 205 Asn Asp His Lys Pro Lys Phe Thr Gln Asp Thr Phe Arg Gly Ser Val 210 215 220 Leu Glu Gly Val Leu Pro Gly Thr Ser Val Met Gln Val Thr Ala Thr 225 230 235 240 Asp Glu Asp Asp Ala Ile Tyr Thr Tyr Asn Gly Val Val Ala Tyr Ser 245 250 255 Ile His Ser Gln Glu Pro Lys Asp Pro His Asp Leu Met Phe Thr Ile 260 265 270 His Arg Ser Thr Gly Thr Ile Ser Val Ile Ser Ser Gly Leu Asp Arg 275 280 285 Glu Lys Val Pro Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Ala Thr Asp Met Asp 290 295 300 Gly Asp Gly Ser Thr Thr Thr Ala Val Ala Val Val Glu Ile Leu Asp 305 310 315 320 Ala Asn Asp Asn Ala Pro Met Phe Asp Pro Gln Lys Tyr Glu Ala His 325 330 335 Val Pro Glu Asn Ala Val Gly His Glu Val Gln Arg Leu Thr Val Thr 340 345 350 Asp Leu Asp Ala Pro Asn Ser Pro Ala Trp Arg Ala Thr Tyr Leu Ile 355 360 365 Met Gly Gly Asp Asp Gly Asp His Phe Thr Ile Thr Thr His Pro Glu 370 375 380 Ser Asn Gln Gly Ile Leu Thr Thr Arg Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala 385 390 395 400 Lys Asn Gln His Thr Leu Tyr Val Glu Val Thr Asn Glu Ala Pro Phe 405 410 415 Val Leu Lys Leu Pro Thr Ser Thr Ala Thr Ile Val Val His Val Glu 420 425 430 Asp Val Asn Glu Ala Pro Val Phe Val Pro Pro Ser Lys Val Val Glu 435 440 445 Val Gln Glu Gly Ile Pro Thr Gly Glu Pro Val Cys Val Tyr Thr Ala 450 455 460 Glu Asp Pro Asp Lys Glu Asn Gln Lys Ile Ser Tyr Arg Ile Leu Arg 465 470 475 480 Asp Pro Ala Gly Trp Leu Ala Met Asp Pro Asp Ser Gly Gln Val Thr 485 490 495 Ala Val Gly Thr Leu Asp Arg Glu Asp Glu Gln Phe Val Arg Asn Asn 500 505 510 Ile Tyr Glu Val Met Val Leu Ala Met Asp Asn Gly Ser Pro Pro Thr 515 520 525 Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Thr Leu Ile Asp Val Asn Asp His 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Asp Asn Ala Pro Met Phe Asp Pro Gln Lys Tyr Glu Ala His 325 330 335 Val Pro Glu Asn Ala Val Gly His Glu Val Gln Arg Leu Thr Val Thr 340 345 350 Asp Leu Asp Ala Pro Asn Ser Pro Ala Trp Arg Ala Thr Tyr Leu Ile 355 360 365 Met Gly Gly Asp Asp Gly Asp His Phe Thr Ile Thr Thr His Pro Glu 370 375 380 Ser Asn Gln Gly Ile Leu Thr Thr Arg Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala 385 390 395 400 Lys Asn Gln His Thr Leu Tyr Val Glu Val Thr Asn Glu Ala Pro Phe 405 410 415 Val Leu Lys Leu Pro Thr Ser Thr Ala Thr Ile Val Val His Val Glu 420 425 430 Asp Val Asn Glu Ala Pro Val Phe Val Pro Pro Ser Lys Val Val Glu 435 440 445 Val Gln Glu Gly Ile Pro Thr Gly Glu Pro Val Cys Val Tyr Thr Ala 450 455 460 Glu Asp Pro Asp Lys Glu Asn Gln Lys Ile Ser Tyr Arg Ile Leu Arg 465 470 475 480 Asp Pro Ala Gly Trp Leu Ala Met Asp Pro Asp Ser Gly Gln Val Thr 485 490 495 Ala Val Gly Thr Leu Asp Arg Glu Asp Glu Gln Phe Val Arg Asn Asn 500 505 510 Ile Tyr Glu Val Met Val Leu Ala Met Asp Asn Gly Ser Pro Pro Thr 515 520 525 Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Thr Leu Ile Asp Val Asn Asp His 530 535 540 Gly Pro Val Pro Glu Pro Arg Gln Ile Thr Ile Cys Asn Gln Ser Pro 545 550 555 560 Val Arg Gln Val Leu Asn Ile Thr Asp Lys Asp Leu Ser Pro His Thr 565 570 575 Ser Pro Phe Gln Ala Gln Leu Thr Asp Asp Ser Asp Ile Tyr Trp Thr 580 585 590 Ala Glu Val Asn Glu Glu Gly Asp Thr Val Val Leu Ser Leu Lys Lys 595 600 605 Phe Leu Lys Gln Asp Thr Tyr Asp Val His Leu Ser Leu Ser Asp His 610 615 620 Gly Asn Lys Glu Gln Leu Thr Val Ile Arg Ala Thr Val Cys Asp Cys 625 630 635 640 His Gly His Val Glu Thr Cys Pro Gly Pro Trp Lys Gly Gly 645 650 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primerVH5' <400> 4 gggaattcat graatgsasc tgggtywtyc tctt 34 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primerVL5'-1 <400> 5 actagtcgac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 39 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primerVL5'-2 <400> 6 actagtcgac atggatttwc argtgcagat twtcagctt 39 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primerVL5'-3 <400> 7 actagtcgac atggtyctya tvtccttgct gttctgg 37 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primerVL5'-4 <400> 8 actagtcgac atggtyctya tvttrctgct gctatgg 37 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primerVH3' <220> <221> variation <222> (30) <223> n is i <400> 9 cccaagcttc cagggrccar kggataracn grtgg 35 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primerVL3' <400> 10 cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga 30 <210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain variable region <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 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Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 15 Ser Gly Tyr Gly Asn Leu Phe Val Tyr 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 16 Ser Ala Thr Ser Ser Val Thr Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 17 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 18 Gln His Tyr His Ile Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 19 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gaattaaaac gtactgttgc tgctccttct gtttttattt ttcctccttc tgatgaacaa 60 ttaaaatctg gtactgcttc tgttgtttgt ttattaaata atttttatcc tcgtgaagct 120 aaagttcaat ggaaagttga taatgcttta caatctggta attctcaaga atctgttact 180 gaacaagatt ctaaagattc tacttattct ttatcttcta ctttaacttt atctaaagct 240 gattatgaaa aacataaagt ttatgcttgt gaagttactc atcaaggttt atcttctcct 300 gttactaaat cttttaatcg tggtgaatgt 330 <210> 20 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 21 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 20 25 30 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 35 40 45 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 50 55 60 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 65 70 75 80 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 85 90 95 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 110 <210> 22 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIIICDH3#6VH-f <400> 23 aagcttgccg ccaccatgaa atggagctgg gttattctc 39 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH3#6VHCH-r <400> 24 cccttggtgg aggctgcaga gacagtgacc 30 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIIICDH3#6VL-f <400> 25 aagcttgccg ccaccatgga tttacaggtg cagattatca gc 42 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH3#6VLkappa-r <400> 26 cgttttaatt ccagcttggt gcctccacc 29 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH3#6VHCH-f <400> 27 ctctgcagcc tccaccaagg gcccatcgg 29 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRIIgG1-r <400> 28 ttattagaat tcctatcatt tacccggaga cagggagagg c 41 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH3#6VLkappa-f <400> 29 accaagctgg aattaaaacg tactgttgc 29 <210> 30 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRIKappa-r <400> 30 ttattagaat tcctatcaac attcaccacg attaaaagat ttagtaacag g 51 <210> 31 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIIIB72.3CDH3#6H-f <400> 31 cacgaagctt gccgccacca tggaatggag ctgggtgttc ctgttctttc tgtccgtgac 60 cacaggcgtg cattctcagg tccaactgca gcagcctggg 100 <210> 32 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIIIB72.3CDH3#6L-f <400> 32 acgaagcttg ccgccaccat gtctgtgcct acccaggtgc tgggactgct gctgctgtgg 60 ctgacagacg cccgctgtca aattgttctc acccagtctc 100

Claims (15)

1. 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는, 항체 또는 이의 단편.
   
2. 제 1항에 있어서, 서열번호 13, 14 및 15에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR) 또는 이와 기능적으로 동등한 CDR를 포함하는 H 체인 V 부위(Heavy chain Variable region), 및 서열번호 16, 17 및 18 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR 또는 이와 기능적으로 동등한 CDR를 포함하는 L 체인 V 부위(light chain Variable region)를 포함하고, CDH3 단백질 또는 이의 부분 펩티드에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
   
3. 제 2항에 있어서, 항체는 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 단편, 및 단일-체인 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
   
4. 제 3항에 있어서, 항체는 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 H 체인 및/또는 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 L 체인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
   
5. 제 3항에 있어서, 키메라 항체는 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 H 체인 V 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
   
6. 제 3항에 있어서, 키메라 항체는 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 L 체인 V 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
   
7. 제 4항에 있어서, 키메라 항체는 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 H 체인 V 부분 및 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 L 체인 V 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
   
8. 제 2항에 있어서, 항체는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
   
9. 제 8항에 있어서, 인간화 항체는 추가적으로 인간 항체 FR(프레임 워크) 부위 및/또는 인간 항체 C 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
   
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성, 치료학적 약제, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
    
11. 제 10항에 있어서, 방사성 동위원소 표지는 ⁹⁰이트륨(⁹⁰Y, ⁹⁰yttrium) 및 ¹¹¹인듐(¹¹¹In, ¹¹¹indium)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
    
12. 유효한 양의 제 10항 또는 제 11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체 내의 CDH3 관련 질환의 치료 또는 예방 방법.
    
13. 하기의 단계를 개체내 포함하는 CDH3 관련 질환 또는 상기 질환이 발달할 수 있는 성향을 진단 또는 예후를 위한 방법:
    (a) 상기 개체로부터 유래한 샘플 또는 시료를 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 샘플 또는 시료에서 CDH3 단백질을 검출하는 단계; 및
    (c) 대조군에 비하여 CDH3 단백질의 상대적 수도에 근거하여, 상기 개체가 상기 질환을 겪거나 또는 상기 질환이 발달할 위험이 있는지를 판단하기.
    
14. 제 10항 또는 제 11항에 따른 항체 또는 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는, CDH3 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
    
15. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는, CDH3 관련 질환의 진단 또는 예후를 위한 키트.
    

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