CN105111313A - 抗cdh3抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗CDH3抗体，其能用放射性同位素标记。此外，本发明提供包含抗CDH3抗体作为活性成分的药物组合物和方法。由于CDH3在胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌细胞中强烈表达，本发明在胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌治疗中是有用的。

Description

抗CDH3抗体及其用途

本申请是基于申请日为2009年12月28日，申请号为200980163482.X，发明名称为：“抗CDH3抗体及其用途”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及抗CDH3抗体，使用所述抗体来治疗或预防或诊断CDH3相关疾病的方法，以及包含所述抗体的药物组合物或诊断试剂盒。

背景技术

钙粘蛋白是细胞-细胞粘附糖蛋白，它们形成钙依赖性细胞间连接点，而且在系统发生中及在成年组织和器官的发育和维持中发挥至关重要的作用(NPL1)。在胚胎发生期间，特定钙粘蛋白的细胞表达导致嗜同性相互作用，这些相互作用在细胞分选和组织分层的过程中是至关重要的(NPL2-4)。这些细胞附着的改变在细胞失稳中发挥重要作用，而且可改变受到细致调节的上皮结构分化过程(NPL5-6)。因为这个原因，已经有人暗示钙粘蛋白的功能丧失或过表达以及编码这些蛋白的基因的背后的控制分子机制与癌发生有关(NPL7)。

钙粘蛋白家族细分成多个亚家族，包括经典的E-、P-、和N-钙粘蛋白，每个亚家族表现出独特的组织分布(NPL8)。虽然E-钙粘蛋白在所有上皮组织中表达，但是P-钙粘蛋白(CDH3)的表达仅仅局限于分层的上皮的基底层或下层，包括前列腺和皮肤，而且还局限于乳腺肌上皮细胞(NPL9-10)。

现在有大量的证据也揭示异常P-钙粘蛋白表达与细胞增殖及与结肠、乳腺、肺、甲状腺、和宫颈的肿瘤有关(NPL11-12)。人P-钙粘蛋白据报告是被针对外阴表皮样癌生成的NCC-CAD-299单克隆抗体识别的抗原(NPL10)。预期对P-钙粘蛋白介导的粘附和细胞内信号传导的调控会导致体内肿瘤细胞增殖和存活降低。因而，鉴于P-钙粘蛋白似乎在细胞增殖和实体瘤进展中拥有关键作用，期望生成针对P-钙粘蛋白的抗体，它能给具有多种癌症的患者提供治疗效益。

针对癌症特异性分子的单克隆抗体已经证明在癌症治疗中是有用的(NPL13)。除了用于乳腺癌、恶性淋巴瘤和结肠癌的人源化或嵌合抗体诸如曲妥单抗(NPL13)、利妥昔单抗(NPL14)和贝伐单抗(NPL15)等临床应用的成功例子之外，有若干针对其它分子靶标的单克隆抗体正处于开发中，而且人们正在评估它们的抗肿瘤活性。预期这些单克隆抗体会给具有没有有效疗法的肿瘤的患者带来希望。关于这些单克隆抗体的其它重要问题之一，是实现针对癌细胞的选择性治疗效果，而避免由于它们对表达靶分子的细胞的特异性反应而造成的严重毒性(NPL17-19，PTL1-4)。

引用列表

专利文献

PTL1：WO2002/097395

PTL2：WO2004/110345

PTL3：WO2006/114704

PTL4：WO2007/102525

非专利文献

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NPL4：TakeichiM.Science,251:1451-5,(1991)

NPL5：DanielCW,etal.,DevBiol,169:511-9,(1995)

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NPL8：TakeichiM.Development,102:639-55(1988)

NPL9：TakeichiM.JCellBiol103:2649-58,(1986)

NPL10：ShimoyamaY,etal.,CancerRes,49:2128-33(1989)

NPL11：Gamallo,ModernPathology,14:650-654,(2001)

NPL12：Stefansson,etal.,J.Clin.Oncol.22(7):1242-1252(2004)

NPL13：Harris,M.LancetOncol,5:292-302(2004)

NPL14：Baselga,J.Oncology,61:SuuplSuupl214-21(2004)

NPL15：Maloney,D.G.,etal.Blood,90:2188-2195(1997)

NPL16：Ferrara,N.,etal.NatRevDrugDiscov,3:391-400(2004)

NPL17：Crist,W.M.,etal.JClinOncol,19:3091-3102(2001)

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NPL19：Ferguson,W.S.andGoorin,A.M.CancerInvest,19:292-315(2001)

发明概述

本发明提供针对CDH3的单克隆抗体，它们特异性识别CDH3多肽，诸如具有SEQIDNO：2所示氨基酸序列的多肽，或其片段。本发明提供了用⁹⁰Y标记的抗CDH3单克隆抗体在携带癌细胞系的异种移植小鼠中具有显著的抗肿瘤活性。

具体而言，本发明涉及下面各项：

[1]一种抗体或其片段，其中所述抗体包含H(重)链V(可变)区和L(轻)链V区，其中所述H链V区和L链V区选自下组：

(a)包含具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的H链V区中所含的互补决定区(CDR)或与之功能上等同的CDR的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的L链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的L链V区；

(b)包含具有SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:28的氨基酸序列的L链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的L链V区；

(c)包含具有SEQIDNO:36所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:44的氨基酸序列的L链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的L链V区；和

(d)包含具有SEQIDNO:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:60的氨基酸序列的L链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的L链V区，

且其中所述抗体能够结合CDH3多肽或其部分肽。

在典型的实施方案中，所述抗体选自下组：小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体片段、以及单链抗体。

[2]本发明的抗体或其片段能够与细胞毒剂、治疗剂、放射性同位素标记物或荧光标记物缀合。在典型的实施方案中，抗体被放射性同位素标记物标记。在更典型的实施方案中，放射性同位素标记物选自⁹⁰钇(⁹⁰Y)、¹²⁵碘(¹²⁵I)和¹¹¹铟(¹¹¹In)。

[3]在受试者中治疗或预防与CDH3有关的疾病，或抑制表达CDH3的细胞的生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其片段。

[4]一种用于受试者中与CDH3有关的疾病或发生该疾病的倾向的诊断或预后的方法，其包括

(a)使来自所述受试者的样品或标本接触本发明的抗体或其片段；

(b)检测所述样品或标本中CDH3多肽；并

(c)基于与对照相比CDH3蛋白的相对丰度来确定所述受试者是否患有或有风险发生所述疾病。

[5]用于在受试者中治疗或预防与CDH3有关的疾病，或抑制表达CDH3的细胞的生长的药物组合物，所述组合物包含有效量的本发明的抗体或其片段，以及可药用的担载体或赋形剂。

[6]一种用于与CDH3有关的疾病的诊断或预后的试剂盒，该试剂盒包含本发明的抗体或片段。

本发明包括以下内容：

实施方式1.一种抗体或其片段，其中所述抗体包含H(重)链V(可变)区和L(轻)链V区，其中所述H链V区和L链V区选自下组：

(a)包含具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的H链V区中所含的互补决定区(CDRs)或与之功能上等同的CDRs的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的L链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的L链V区；

(b)包含具有SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:28的氨基酸序列的L链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的L链V区；

(c)包含具有SEQIDNO:36所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:44的氨基酸序列的L链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的L链V区；和

(d)包含具有SEQIDNO:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:60的氨基酸序列的L链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的L链V区，

且其中所述抗体能够结合CDH3多肽或其部分肽。

实施方式2.实施方式1的抗体或其片段，其中所述H链V区和L链V区选自下组：

(a)包含具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，和包含具有SEQIDNO:14所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:16所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:18所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区，

(b)包含具有SEQIDNO:22所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:24所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:26所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，和包含具有SEQIDNO:30所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:32所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:34所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区；

(c)包含具有SEQIDNO:38所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:40所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:42所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，和包含具有SEQIDNO:46所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:48所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:50所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区；和

(d)包含具有SEQIDNO:54所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:70，74，78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:58所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，和包含具有SEQIDNO:62所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:64所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区。

实施方式3.实施方式1或2的抗体或其片段，其中所述抗体选自下组：小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段、和单链抗体。

实施方式4.实施方式3的抗体或其片段，其中所述抗体包含具有选自SEQIDNO:4,20,36,68,72,76和80的氨基酸序列的H链V区，和/或具有选自SEQIDNO:12,28,44和60的氨基酸序列的L链V区。

实施方式5.实施方式4的抗体或其片段，其中所述抗体包含：

(a)具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的L链V区；

(b)具有SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDNO:28所示的氨基酸序列的L链V区；

(c)具有SEQIDNO:36所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDNO:44所示的氨基酸序列的L链V区；或

(d)具有SEQIDNO:68，72，76或80所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDNO:60所示的氨基酸序列的L链V区。

实施方式6.实施方式4或5的抗体或其片段，其中所述抗体是嵌合抗体。

实施方式7.实施方式6的抗体或其片段，其中所述抗体是人源化抗体。

实施方式8.实施方式7的抗体或其片段，其中所述人源化抗体还包含人抗体FR(框架)区和/或人抗体C区。

实施方式9.实施方式1-8中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体与细胞毒剂、治疗剂、放射性同位素标记物或荧光标记物缀合。

实施方式10.实施方式9的抗体或其片段，其中所述放射性同位素标记物选自90钇(⁹⁰Y)和111铟(¹¹¹In)。

实施方式11.一种用于在受试者中治疗或预防与CDH3有关的疾病或抑制表达CDH3的细胞的生长的方法，其中所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求1-10中任一项的抗体或片段。

实施方式12.一种用于在受试者中诊断与CDH3有关的疾病或发生该疾病的倾向的方法，其中所述方法包括

(a)使来自所述受试者的样品或标本接触权利要求1-10中任一项的抗体或片段；

(b)检测所述样品或标本中的CDH3多肽；并

(c)基于与对照相比CDH3多肽的相对丰度来判断所述受试者是否患有或有风险发生所述疾病。

实施方式13.一种用于治疗或预防与CDH3有关的疾病或抑制表达CDH3的细胞生长的药物组合物，其中所述药物组合物包含有效量的依照权利要求1-10中任一项的抗体或片段和可药用的担载体或赋形剂。

实施方式14.一种用于诊断与CDH3有关的疾病的试剂盒，其中所述试剂盒包含依照权利要求1-10中任一项的抗体或片段。

附图简述

图1显示⁹⁰Y标记的抗CDH3抗体(克隆#3、#4、#5和#6)对肿瘤生长的影响。⁹⁰Y标记的抗CDH3抗体，特别是克隆#3、#4、和#6，有效地抑制了裸小鼠中移植的H1373细胞的生长，而施用无标记的抗CDH3抗体没有显示肿瘤生长的抑制。

图2显示抗CDH3抗体(克隆#3、#4、#5和#6)的还原型SDS-PAGE分析。克隆#3、#4、#5的条带图样揭示了与IgG重链和轻链对应的两条带，而克隆#6的图样揭示了两条重链带和一条轻链带。

实施方案详述

本发明涉及抗CDH3抗体、包含它们的组合物、及它们在治疗或预防与CDH3有关的疾病如癌症中的用途。在一个典型的实施方案中，所述抗体是用放射性同位素标记物标记的。

已经报告了用于对自胰腺癌患者收集的胰腺癌细胞和正常细胞进行基因表达分析的cDNA微阵列(Nakamura等，Oncogene(2004)，23:2385-400)。随后鉴定了在胰腺癌细胞中表达特异性增强的多种基因。胎盘钙粘蛋白(P-钙粘蛋白；CDH3)，一种胞质膜蛋白，是这些基因之一，在主要器官中呈现低表达水平。对于癌症治疗的靶基因来说这样的特征是合适的，因为可以避免副作用的危险。另外，在其它癌细胞系中确认了类似的CDH3过表达，诸如肺、结肠直肠、前列腺、乳腺、胃和肝癌细胞系(WO/2007/102525)。

定义

如本文中使用的，术语“抗体”意图包括与指定蛋白质或其肽特异性起反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、融合至其它蛋白质或放射性标记物的抗体、和抗体片段。另外，本文中的抗体以最广义使用，而且明确覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。“抗体”指所有类(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。

“抗体片段”指完整抗体的一部分，一般包含完整抗体的抗原结合区或可变区。因而，在本发明中，抗体片段可以包含完整抗体的一个或多个抗原结合部分。如本文中使用的，术语抗体的“抗原结合部分”指抗体保留特异性结合抗原(例如CDH3)的能力的一种或多种免疫学活性片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实施。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')₂、和Fv片段；线性抗体；和单链抗体分子。不管结构如何，抗体片段结合被完整抗体识别的同一抗原。术语“抗体片段”还包括结合特定抗原的合成的或遗传工程改造的多肽，诸如由轻链可变区组成的多肽、由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽接头相连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)、和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。

如本文中使用的，与CDR“功能上等同”是指CDR赋予具备它们的抗体以与具有原CDR的抗体基本上相等的抗原结合活性和抗原特异性。与CDR功能上等同的例子包括原始CDR替换、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基者。只要保持抗原结合活性和抗原特异性，氨基酸突变的数目和百分比没有特别限制。不过，一般优选改变可变区中所含的原始CDR的氨基酸序列的20％以下。更优选地，突变的百分比为15％以下，10％以下，5％以下。在优选的实施方案，氨基酸突变的数目是10个以下，5个以下，4个以下，3个以下，2个以下，1个以下。本领域技术人员会理解可以接受的保留原始CDR的性质的突变。

抗体的生成

本发明使用针对CDH3的抗体。这些抗体将通过已知方法来提供。

描述了用于生成依照本发明使用的抗体的例示技术。

(i)单克隆抗体

单克隆抗体是从一群基本上同质的抗体获得的，基本上同质即构成群体的各个抗体是相同的，除了可能以极小量存在的天然突变外。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的这样的特征，即其不是分立(discrete)抗体的混合物。

例如，单克隆抗体可通过最初由Kohler等,Nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。

在杂交瘤方法中，用CDH3多肽免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发出生成或能够生成会特异性结合CDH3多肽的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外用CDH3多肽免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，《MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice》，59-103，AcademicPress，1986)。

将制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常可含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系包括鼠源骨髓瘤系，诸如可从SalkInstituteCellDistributionCenter(SanDiege，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生鼠源骨髓瘤系，及可从AmericanTypeCultureCollection(Manassas，Virginia，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等人，《MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications》，51-63，MarcelDekker,Inc.，NewYork，1987)。

对于其中生长着杂交瘤细胞的培养基，测定培养基中针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)的30Scatchard分析来测定。

在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，《MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice》，59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。

编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是所述DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到宿主细胞中，诸如原本不产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等,Curr.OpinioninImmunol.5:256-262(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。

另一种生成针对CDH3反应性的特异性抗体或抗体片段的方法是用CDH3蛋白或肽筛选在细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。例如，可以使用噬菌体表达文库在细菌中表达整个Fab片段、VH区和Fv区。参见例如Ward等，Nature，341:544-546(1989)；Huse等，Science，246:1275-1281(1989)；及McCafferty等，Nature，348:552-554(1990)。用例如CDH3肽筛选此类文库能鉴定出与CDH3反应性的免疫球蛋白片段。或者，可使用SCID-hu小鼠(可得自Genpharm)来生成抗体或其片段。

在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等,Nature348:552-554(1990)所述技术构建的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等,Nature352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等,Nuc.AcidsRes.21:2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

还可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列替代同源鼠源序列(美国专利4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851(1984))，或通过共价偶联免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。

典型地，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生这样的嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点，和对另一种不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

本发明提供适合于治疗或诊断疾病，和/或抑制表达CDH3的细胞生长的抗体。本发明还提供适于诊断CDH3相关疾病的抗体。在本发明中，成功地建立了鼠源单克隆抗体克隆#3、#4和#5，而且这些抗体，尤其是#3，被证明可有效抑制表达CDH3的细胞(例如癌细胞)生长。进一步，这些抗体在它们的可变区中没有糖基化位点。该性质对于治疗药的开发是有利的，因为它可以支持抗体的均一性。

此外，在本发明中，成功建立了克隆#6的没有糖基化位点的变体。克隆#6已经被证明是具有抑制多种表达CDH3的细胞生长的能力的抗体，但是它在H链V区的CDR2中具有一个糖基化位点。本发明的变体的天冬酰胺残基被改变为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺残基。

小鼠单克隆抗体#3、克隆#4和#5的H链V区的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:4、20、36。小鼠单克隆抗体克隆#3、克隆#4和#5的L链V区的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:12、28、44。进一步，克隆#6的变体的H链V区的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:68、72、76和80。克隆#6的变体的L链V区的氨基酸序列示于SEQIDNO:60。

H链V区和L链V区中所含的CDR可以根据本领域公知的方法来确定。例如，Kabat等人(KabatE.A.etal.(1991)SequenceofProteinsofImmunologicalInterest.5thEdition)或Chothia等人(Chothiaetal.J.Mol.Biol.(1987)196；901-917)描述的方法通常被用来确定CDR。

因此，本发明提供抗体或其片段，包含H链V区和L链V区，其中所述H链V区和L链V区选自下组：

(a)包含具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的H链V区中所含的互补决定区(CDR)或与之功能上等同的CDR的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的L链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的L链V区；

(b)包含具有SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:28的氨基酸序列的L链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的L链V区；

(c)包含具有SEQIDNO:36所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:44的氨基酸序列的L链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的L链V区；和

(d)包含具有SEQIDNO:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:60的氨基酸序列的L链V区中所含的CDR或与之功能上等同的CDR的L链V区，

且其中所述抗体能够结合CDH3多肽或其部分肽。

在优选的实施方案中，CDR可根据Kabat定义(KabatE.A.etal.(1991)SequenceofProteinsofImmunologicalInterest.5thEdition)来确定。每个克隆的根据Kabat定义确定的CDR如下所述。

克隆#3的各CDR的氨基酸序列为H链V区中的CDR1:SFWIH(SEQIDNO:6),CDR2:NIDPSDSETHYNQYFKD(SEQIDNO:8)和CDR3:GGTGFSS(SEQIDNO:10)；L链V区中的CDR1:KASQDIDSYLS(SEQIDNO:14),CDR2:RANRLVD(SEQIDNO:16),和CDR3:LQYDEFPRT(SEQIDNO:18)。

克隆#4的各CDR的氨基酸序列为H链V区中的CDR1:SYWMH(SEQIDNO:21),CDR2:NIDPSDSETHYNQNFND(SEQIDNO:24)和CDR3:GGTGFAY(SEQIDNO:26)；L链V区中的CDR1:KASQDINNYLG(SEQIDNO:30),CDR2:RTDRLIE(SEQIDNO:32),和CDR3:LQYDEFPRM(SEQIDNO:34)。

克隆#5的各CDR的氨基酸序列为H链V区中的CDR1:SYWMH(SEQIDNO:38),CDR2:NIDPSDSETHYNQKFNDRA(SEQIDNO:40)和CDR3:GGTGFAY(SEQIDNO:42)；L链V区中的CDR1:KASQDINNYLG(SEQIDNO:46),CDR2:RTDRLIE(SEQIDNO:48),和CDR3:LQYDEFPRM(SEQIDNO:50)。

克隆#6的变体的各CDR的氨基酸序列为H链V区中的CDR1:SYWIH(SEQIDNO:54),CDR2:EIDPSDSYTYYNQNFKG(SEQIDNO:70),EIDPSDTYTYYNQNFKG(SEQIDNO:74),EIDPSDAYTYYNQNFKG(SEQIDNO:78)或EIDPSDQYTYYNQNFKG(SEQIDNO:82)及CDR3:SGYGNLFVY(SEQIDNO:58)；L链V区中的CDR1:SATSSVTYMY(SEQIDNO:62),CDR2:RTSNLAS(SEQIDNO:64),和CDR3:QHYHIYPRT(SEQIDNO:66)。

因此，本发明还提供抗体或其片段，其中所述抗体包含H链V区和L链V区，其中所述H链V区和L链V区选自：

(a)包含具有如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，以及包含具有如SEQIDNO:14所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:16所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:18所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区；

(b)包含具有如SEQIDNO:22所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:24所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:26所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，以及包含具有如SEQIDNO:30所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:32所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区；

(c)包含具有如SEQIDNO:38所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:40所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:42所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，以及包含具有如SEQIDNO:46所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:48所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:50所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区；和

(d)包含具有如SEQIDNO:54所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:70,74,78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:58所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，以及包含具有如SEQIDNO:62所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:64所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区。

上述“包含具有如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区”的H链V区(VH)的一个例子是具有如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的VH。上述“包含具有如SEQIDNO:14所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:16所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区”的L链V区(VL)的一个例子是具有如SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的VL。

上述“包含具有如SEQIDNO:22所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:24所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:26所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区”的VH的一个例子是具有如SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的VH。上述“包含具有如SEQIDNO:30所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:32所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区”的VL的一个例子是具有如SEQIDNO:28所示的氨基酸序列的VL。

上述“包含具有如SEQIDNO:38所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:40所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:42所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区”的VH的一个例子是具有如SEQIDNO:36所示的氨基酸序列的VH。上述“包含具有如SEQIDNO:46所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:48所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:50所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区”的VL的一个例子是具有如SEQIDNO:44所示的氨基酸序列的VL。

上述“包含具有如SEQIDNO:54所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:70,74,78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:58所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区”的VH的一个例子是具有如SEQIDNO:68，72，76，或80所示的氨基酸序列的VH。上述“包含具有如SEQIDNO:62所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO:64所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区”的VL的一个例子是具有如SEQIDNO:60所示的氨基酸序列的VL。

因此，在一个实施方案中，本发明提供抗体或其片段，其中所述抗体包含具有选自SEQIDNO:4,20,36,68,72,76和80的氨基酸序列的H链V区，和/或具有选自SEQIDNO:12、28、44和60的氨基酸序列的L链V区。

在优选的实施方案中，本发明的抗体包含：

(a)具有如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的H链V区，和具有如SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的L链V区；

(b).具有如SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的H链V区，和具有如SEQIDNO:28所示的氨基酸序列的L链V区；

(c)具有如SEQIDNO:36所示的氨基酸序列的H链V区，和具有如SEQIDNO:44所示的氨基酸序列的L链V区；或

(d)具有如SEQIDNOs:68,72,76或80所示的氨基酸序列的H链V区，和具有如SEQIDNO:60所示的氨基酸序列的L链V区。

本发明的抗体可以通过常规方法制备。例如，所述抗体可以通过将编码抗体多肽的多肽整合到合适的载体中，将该载体导入宿主，并根据常规基因重组技术从所述宿主产生抗体来制备(参见，例如，Vandamme,A.M.etal.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767-75)。

编码本发明抗体的V区的多核苷酸的核酸序列可以从本发明的抗体的V区的氨基酸序列推导出来。例如，SEQIDNO:3和11所示的核酸序列可以分别用作编码克隆#3的VH和VL的核酸序列。例如，SEQIDNO:19和27所示的核酸序列可以分别用作编码克隆#4的VH和VL的核酸序列。例如，SEQIDNO:35和43所示的核酸序列可以分别用作编码克隆#5的VH和VL的核酸序列。例如，SEQIDNO:67、71、75或79，和59所示的核酸序列可以分别用作编码克隆#6的变体的VH和VL的核酸序列。编码本发明抗体的V区的多核苷酸可基于所述序列信息通过常规方法如固相技术(BeaucageSL&IyerRP,Tetrahedron(1992)48,2223-311；Matthesetal.,EMBOJ(1984)3,801-5)和寡核苷酸合成技术(Jonesetal.Nature(1986)321,522-5)来合成。

编码抗体V区的多核苷酸整合到含有编码抗体恒定(C)区的多核苷酸的表达载体中。

为了制备本发明中使用的抗体，将编码抗体的多肽(抗体基因)整合到表达载体中，使得抗体基因能够在表达控制元件(例如增强子、启动子)的控制下表达。用该表达载体转化宿主细胞以表达抗体。

在抗体基因的表达中，可以将编码H链的多核苷酸和编码L链的多核苷酸整合到不同的表达载体中，然后用所得的重组表达载体共转化宿主细胞。或者，可以将编码H链的多核苷酸和编码L链的多核苷酸一起整合到一个表达载体中，然后用所得的重组表达载体转化宿主细胞(例如，WO94/11253)。

抗体基因可以用已知的方法表达。为了在哺乳动物细胞中表达，可以将常规的有用启动子、要表达的抗体基因和多聚(A)信号(位于抗体基因的3’端的下游)可操作地连接。例如，作为有用的启动子/增强子系统，可以使用人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子系统。

其他启动子/增强子系统，例如，源自病毒(例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿病毒40(SV40))者和源自哺乳动物细胞者(例如人延伸因子1α(HEF1α)，也可以用于在本发明中表达抗体。

当使用SV40启动子/增强子系统时，可以容易地利用Mulligan等人(Nature(1979)277,108-14.)的方法来进行基因表达。当使用HEF1α启动子/增强子系统时，可以容易地利用Mizushima等人(NucleicAcidsRes.(1990)18,5322.)的方法来进行基因表达。

对于在大肠杆菌中进行表达，可将常规可用的启动子、用于分泌目标抗体的信号序列和抗体基因操作性连接在一起。作为启动子，可使用lacZ启动子或araB启动子。当使用lacZ启动子时，可以按照Ward等人(Ward等，Nature(1098)341，544-6；FASBEJ.(1992)6，2422-7)所述的方法进行基因表达，而当使用araB启动子时，可以按照Better等人(Better等，Science(1988)240，1041-3)所述的方法进行基因表达。

对于用于分泌抗体的信号序列而言，当须将目标抗体分泌到大肠杆菌周质间隙时，可使用pelB信号序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379-83)。将分泌至周质间隙的抗体分离出来，然后重折叠，使抗体呈合适构型。

可使用来自病毒(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV))等的复制起点。为了增加宿主细胞系统中的基因拷贝数，表达载体还可含有选择标记基因，例如氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。为了产生本发明所用的抗体，任何表达系统(包括真核细胞系统和原核细胞系统)都可使用。真核细胞包括已建立的动物细胞系(例如哺乳动物、昆虫、霉菌和真菌、酵母)。原核细胞包括细菌细胞例如大肠杆菌细胞。优选本发明所用的抗体在哺乳动物细胞(例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero和HeLa细胞)中表达。

然后，在体外或体内培养转化宿主细胞以产生目标抗体。可采用任何已知方法进行宿主细胞的培养。本文所用的培养基可以是DMEM培养基、MEM培养基、RPMI1640培养基或IMDM培养基。培养基可含有血清补充物，例如胎牛血清(FCS)。

在重组抗体的产生中，除了上述宿主细胞外，转基因动物也可用作宿主。例如，将抗体基因插入到原本在动物乳汁中产生的蛋白质(例如β-酪蛋白)的编码基因的预定位置上，以制备融合基因。将含有引入抗体基因的融合基因的DNA片段注射到非人类动物胚胎中，然后将胚胎引入雌性动物中。带有胚胎的雌性动物怀有转基因非人类动物。转基因非人类动物或其后代的乳汁分泌出目标抗体。为了增加含抗体乳汁的量，可将合适激素给予转基因动物(Ebert，K.M.等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。

可将如上所述表达和产生的抗体从细胞或宿主动物体内分离出来并纯化。本发明所用的抗体的分离和纯化可在亲和柱上进行。常规使用的抗体分离和纯化的其它方法也可采用；因此并不具体限定方法。例如，各种色谱、过滤、超滤、盐析和透析方法都可单独使用或组合使用，以分离纯化目标抗体(AntibodiesALaboratoryManual.Harlow，DavidLane编著，ColdSpringHarborLaboratory，1988)。

(ii)嵌合抗体和人源化抗体

在本发明中，可使用人工修饰的重组抗体，包括嵌合抗体和人源化抗体。这些修饰抗体可由任何已知方法来制备。例如，可使用为产生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-5；Neuberger等，1984，Nature，312：604-8；Takeda等，1985，Nature，314：452-4)。

嵌合抗体是分子中的不同部分来自不同动物物种的分子，例如具有鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子，例如“人源化抗体”。

本发明的嵌合抗体可如下制备：将抗体V区的编码DNA与人抗体C区的编码DNA连接起来，将连接产物整合到表达载体中，然后将所得重组表达载体导入宿主中，产生嵌合抗体。人源化抗体也可称为“重塑(reshaped)人抗体”，其中将非人类哺乳动物(例如小鼠)抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体上。产生这样的人源化抗体的通用遗传重组方法也是已知的(例如EP125023；WO96/02576)。

具体地讲，设计并合成将小鼠抗体CDR与构架区(FR)连接在一起的DNA序列，所述合成是通过PCR方法，用设计成具有与CDR和FR终止区重叠的区域的若干寡核苷酸作为引物。将所得DNA与人抗体C区的编码DNA连接起来，将连接产物整合到表达载体中。将所得重组表达载体引入到宿主中，因而产生人源化抗体(例如WO96/02576)。

选择与CDR连接的FR，使得CDR可构成功能性抗原结合位点。必要时，可以替换抗体V区FR中的氨基酸，使重塑人抗体的CDR可构成合适的抗原结合位点(Sato，K.等，CancerRes.(1993)53，851-6)。

嵌合抗体由非人类哺乳动物抗体来源的V区和人抗体来源的C区组成。人源化抗体由非人类哺乳动物抗体来源的CDR和人抗体的FR和C区组成。人源化抗体可用于临床用途，因为针对人体的抗体抗原性降低。本发明所用的嵌合抗体或人源化抗体的一个具体实例是抗体中的V区来自小鼠单克隆抗体克隆#3、#4、#5或克隆#6的变体的抗体，或者抗体中的CDR来自小鼠单克隆抗体克隆#3、#4、#5或克隆#6的变体的抗体。产生这样的嵌合抗体和人源化抗体的方法如下所述。

例如，首先，从抗体生成细胞的RNA通过使用聚合酶链式反应(PCR)等制备编码克隆#3、#4、#5或克隆#6的变体的抗体的V区或CDR的基因(参见例如Larrick等，"Methods:aCompaniontoMethodsinEnzymology"，第2卷，第106页，1991；Courtenay-Luck，"GeneticManipulationofMonoclonalAntibody"，收录于MonoclonalAntibody:Production,EngineeringandClinicalApplication，Ritter等编，第166页，CambridgeUniversityPress，1995，及Ward等，"GeneticManipulationandExpressionofAntibody"，收录于MonoclonalAntibody:PrinciplesandApplications，Birch等编，第137页，Wiley-Liss，Inc.，1995)。编码抗体V区或CDR的多核苷酸可以通过寡核苷酸合成技术来合成(如Jones等，(1986)Nature，321:522-5)。然后，按照常规方法对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切取目标DNA片段，回收，纯化并连接到载体DNA上。

可用已知连接试剂盒将所得DNA和载体DNA连接起来，构建重组载体。可按照以下已知方法制备载体DNA：J.Sambrook等，“MolecularCloning”，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989。载体DNA用限制酶消化，然后可以用已知方法或使用自动测序仪测定所需DNA的核苷酸序列。

一旦克隆小鼠单克隆抗体L链和H链的V区的编码DNA片段(在下文中，抗体L链或H链有时可称为“小鼠L链或H链”(对于小鼠抗体)和“人L链或H链”(对于人抗体)，就将小鼠V区的编码DNA与人抗体恒定区的编码DNA连接起来并表达，以产生嵌合抗体。

制备嵌合抗体的标准方法包括将克隆cDNA中存在的小鼠前导序列和V区序列与哺乳动物细胞表达载体中已经存在的人抗体C区的编码序列连接起来。或者，将克隆cDNA中存在的小鼠前导序列和V区序列与人抗体C区的编码序列连接起来，然后再连接到哺乳动物细胞表达载体中。

包含人抗体C区的多肽可以是任何人抗体H链或L链的C区，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4(人H链)或Cλ或Cκ(L链)。为了制备嵌合抗体，先构建两个表达载体；也就是说，构建含有处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的小鼠L链V区和人L链C区的编码DNA的表达载体，以及含有处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的小鼠H链V区和人H链C区的编码DNA的表达载体。然后，宿主细胞(例如哺乳动物细胞(例如COS细胞))用这些表达载体共转化并在体外或体内培养转化细胞以产生嵌合抗体(参见例如WO91/16928)。

或者，将克隆cDNA中存在的小鼠前导序列与小鼠L链V区和人L链C区的编码DNA以及小鼠前导序列与小鼠H链V区和人H链C区的编码DNA都引入到一个表达载体中(参见例如WO94/11523)，再将所述载体用于转化宿主细胞；然后在体外或体内培养转化宿主以产生所需嵌合抗体。可通过将含有编码小鼠H链V区的核苷酸序列的cDNA(在下文中也称为“H链V区的cDNA”)导入含有编码人抗体H链C区的核苷酸序列的基因组DNA(在下文中也称为“H链C区的基因组DNA”)或编码所述区的cDNA(在下文中也称为“H链C区的cDNA”)的合适表达载体中，从而获取用于表达嵌合抗体H链的载体。H链C区包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4区。

具有编码H链C区(尤其是编码Cγ1区)的基因组DNA的表达载体包括例如HEF-PMh-gγ1(WO92/19759)和DHER-INCREMENTE-RVh-PM1-f(WO92/19759)。或者，如先前文献所述方法，采用来自人PBMC(外周血单核细胞)的cDNA制备人恒定区文库(Liu，A.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第84卷，3439-43，1987；Reff，M.E.等，Blood，第83卷，第2期，435-45，1994)。当将编码小鼠H链V区的cDNA插入到这些表达载体中时，可通过PCR方法将合适核苷酸序列引入到所述cDNA中。例如，可用下述PCR引物进行PCR：经设计而使所述cDNA在其5′端具有合适限制酶识别序列和紧邻其起始密码子前的Kozak共有序列，以便改善转录效率的引物；以及经设计而使所述cDNA在其3′端具有合适限制酶识别序列和剪接供体位点，用于基因组DNA的初级转录产物的适当剪接以产生mRNA，以将这些合适核苷酸序列引入到表达载体中的引物。

由此构建的编码小鼠H链V区的cDNA用合适限制酶处理，然后插入到所述表达载体中以构建含有编码H链C区(Cγ1区)的基因组DNA的嵌合H链表达载体。或者，由此构建的编码小鼠H链V区的cDNA可以用合适限制酶处理，与编码所述H链C区Cγ1的cDNA连接，然后插入到表达载体例如pQCXIH(Clontech)中，以构建含有编码嵌合H链的cDNA表达载体。

用于表达嵌合抗体L链的载体可通过将编码小鼠L链V区的cDNA与编码人抗体L链C区的基因组DNA或cDNA连接起来并引入到合适表达载体中来获取。L链C区包括例如κ链和λ链。当构建含有编码小鼠L链V区的cDNA的表达载体时，可将合适核苷酸序列例如识别序列或Kozak共有序列通过PCR方法引入到所述表达载体中。

编码人Lλ链C区的cDNA的完整核苷酸序列可通过DNA合成仪来合成并通过PCR方法来构建。已知人Lλ链C区具有至少4种不同同种型，每种同种型都可用于构建表达载体。所构建的编码人Lλ链C区的cDNA和以上构建的编码小鼠L链V区的cDNA可以在合适限制酶位点间连接并插入到表达载体例如pQCXIH(Clontech)中，以构建含有编码嵌合抗体Lλ链的cDNA的表达载体。可以自例如含有基因组DNA的HEF-PM1k-gk，构建有待与编码小鼠L链V区的DNA连接的编码人Lκ链C区的DNA(参见WO92/19759)。或者，可以如前人所述地采用来自人PBMC(外周血单个核细胞)的cDNA制备人恒定区文库(Liu，A.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第84卷，3439-43，1987；Reff，M.E.等，Blood，第83卷，第2期，435-45，1994)。

可通过PCR方法将合适限制酶的识别序列引入到编码Lκ链C区的DNA的5′端及3′端，如上构建的编码小鼠L链V区的DNA与编码Lκ链C区的DNA可彼此连接并插入到表达载体例如pQCXIH(Clontech)中，以构建含有编码嵌合抗体Lκ链的cDNA的表达载体。

人源化可基本上依照Winter及其同事的方法(Jones等,Nature321:522-525(1986)；Reichmann等,Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science239:1534-1536(1988))，通过用CDR序列替代相应的人抗体序列来实现。

为了制备将小鼠单克隆抗体CDR移植到人抗体上的人源化抗体，理想的是小鼠单克隆抗体FR与人抗体FR之间存在高度同源性。因此，将小鼠单克隆抗体克隆#3、#4、#5或克隆#6的变体的H链和L链的V区与所有已用ProteinDataBank阐明结构的已知抗体的V区之间进行比较。此外，同时还将它们与由Kabat等根据抗体FR的长度、氨基酸的同源性等而分类的人抗体亚组(HSG：人亚组)进行比较(Kabat，E.A.等，USDep，HealthandHumanServices，USGovernmentPrintingOffices，1991)。

设计编码人源化抗体V区的DNA的第一步是根据设计来选择人抗体V区。例如，与小鼠抗体V区FR具有大于80％同源性的人抗体V区FR可用于产生人源化抗体。

在人源化抗体中，C区和所述抗体V区框架(FR)区来自人，而V区的互补决定区(CDR)来自小鼠。可以按照称为CDR移植的方式，通过PCR方法产生包含人源化抗体V区的多肽，只要有适合作为模板人抗体的DNA片段可用。“CDR移植”是指制备编码小鼠来源的CDR的DNA片段并替代人抗体CDR作为模板的方法。如果没有可用作模板的人抗体DNA片段，可通过DNA合成仪来合成数据库中登记的核苷酸序列，并可通过PCR方法来产生人源化抗体V区的DNA。此外，当数据库中仅登记有氨基酸序列时，将可按照以下报道的方法，根据Kabat，E.A.等，载于USDep.HealthandHumanServices，USGovernmentPrintingOffices，1991中报告的抗体的密码子用法的知识，自氨基酸序列推导出完整核酸序列。在DNA合成仪中合成该核酸序列，并可通过PCR方法来制备人源化抗体V区的DNA并引入到合适的宿主中，接着表达它以产生所需多肽。通过PCR方法的CDR移植的通用方法描述于下文，当有作为模板的人抗体DNA片段可用时。

首先，合成对应于相应CDR的小鼠来源的DNA片段。根据先前克隆的小鼠H链和L链的V区的核苷酸序列，合成CDR1至3。例如，当根据小鼠单克隆抗体克隆#3来产生人源化抗体时，H链V区CDR序列可以是SEQIDNO：6(VHCDR1)、8(VHCDR2)和10(VHCDR3)所示的氨基酸序列；而L链V区CDR序列可以是SEQIDNO：14(VLCDR1)、16(VLCDR2)和18(VLCDR3)所示的氨基酸序列。当根据小鼠单克隆抗体克隆#4来产生人源化抗体时，H链V区CDR序列可以是SEQIDNO：22(VHCDR1)、24(VHCDR2)和26(VHCDR3)所示的氨基酸序列；而L链V区CDR序列可以是SEQIDNO：30(VLCDR1)、32(VLCDR2)和34(VLCDR3)所示的氨基酸序列。当根据小鼠单克隆抗体克隆#5来产生人源化抗体时，H链V区CDR序列可以是SEQIDNO：38(VHCDR1)、40(VHCDR2)和42(VHCDR3)所示的氨基酸序列；而L链V区CDR序列可以是SEQIDNO：46(VLCDR1)、48(VLCDR2)和50(VLCDR3)所示的氨基酸序列。当根据小鼠单克隆抗体克隆#6来产生人源化抗体时，H链V区CDR序列可以是SEQIDNO：54(VHCDR1)、70，74，78或82(VHCDR2)和66(VHCDR3)所示的氨基酸序列；而L链V区CDR序列可以是SEQIDNO：62(VLCDR1)、64(VLCDR2)和66(VLCDR3)所示的氨基酸序列。

人源化抗体H链V区的DNA可与任何人抗体H链C区(例如人H链Cγ1区)的DNA连接起来。如上所述，H链V区的DNA可用合适限制酶处理并与处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的编码人H链C区的DNA连接起来，构成含有人源化H链V区和人H链C区的DNA的表达载体。

人源化抗体L链V区的DNA可与任何人抗体L链C区(例如人L链Cλ区)的DNA连接起来。L链V区的DNA可用合适限制酶处理并与处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的编码人Lλ链C区的DNA连接起来，构成含有人源化L链V区和人Lλ链C区的DNA的表达载体。

编码人源化抗体H链V区和人H链C区的DNA以及编码人源化L链V区和人L链C区的DNA也可导入一个表达载体(例如公开于WO94/11523的载体)中，所述载体可用于转化宿主细胞，然后在体内或体外培养转化宿主以产生所需人源化抗体。

为了产生嵌合或人源化抗体，应当制备如上所述的两个表达载体。因此，对于嵌合抗体，构建包含处于表达控制元件(例如增强子/启动子系统)控制之下的小鼠H链V区和人H链C区的编码DNA的表达载体，以及包含处于表达控制元件控制之下的小鼠L链V区和人L链C区的编码DNA的表达载体。对于人源化抗体，构建包含处于表达控制元件控制之下的人源化H链V区和人H链C区的编码DNA的表达载体，以及包含处于表达控制元件控制之下的人源化L链V区和人L链C区的编码DNA的表达载体。

然后，可用这些表达载体共转化宿主细胞例如哺乳动物细胞(例如COS细胞)，在体外或体内培养所得转化细胞以产生嵌合或人源化抗体(参见例如WO91/16928)。或者，可以将编码H链V区和C区的DNA和编码L链V区和C区的DNA连接在一个载体中并转化到合适宿主细胞中以产生抗体。因此，在嵌合抗体的表达中，可将克隆cDNA中存在的小鼠前导序列、小鼠H链V区和人H链C区的编码DNA以及小鼠前导序列、小鼠L链V区和人L链C区的编码DNA引入到一个表达载体(例如公开于例如WO94/11523中的载体)中。在人源化抗体的表达中，可将人源化H链V区和人H链C区的编码DNA以及人源化L链V区和人L链C区的编码DNA引入到一个表达载体(例如公开于例如WO94/11523中的载体)中。这样的载体用于转化宿主细胞并在体内或体外培养转化宿主以产生目标嵌合或人源化抗体。

任何表达系统都可用于产生针对本发明FZD10蛋白的嵌合或人源化抗体。例如，真核细胞包括动物细胞，例如已建立的哺乳动物细胞系、真菌细胞和酵母细胞；原核细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌。优选本发明的嵌合或人源化抗体在哺乳动物细胞(例如COS或CHO细胞)中表达。

用于在哺乳动物细胞中表达的任何常规启动子都可使用。优选使用例如人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子。另外，用于在哺乳动物细胞中进行基因表达的启动子可包括病毒启动子(例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿病毒(SV)40的启动子)和哺乳动物细胞来源的启动子(例如人多肽链延伸因子-1α(HEF-1α)的启动子)。例如，按照Mulligan等人的方法(Mulligan等，Nature，277，108-14，1979)可以容易地使用SV40启动子；Mizushima，S.等人的方法(Mizushima，S.等，NucleicAcidsResearch，18，5322，1990)可容易地与HEF-1α启动子一起使用。

复制起点包括来自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳头瘤病毒(BPV)的那些。此外，表达载体可包含以下酶的基因作为选择标记，用于增加宿主细胞系统中的基因拷贝数：磷酸转移酶APH(3′)II或I(neo)、胸苷激酶(TK)、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)或二氢叶酸还原酶(DHFR)。

用嵌合或人源化抗体的编码DNA转化的转化体经培养而产生的目标嵌合或人源化抗体，可从细胞中分离纯化出来。

可通过使用蛋白A琼脂糖柱进行目标嵌合或人源化抗体的分离纯化，也可使用蛋白质分离纯化时所用的任何方法，因此对此没有限制。例如，可任选选择或组合色谱、超滤、盐析和透析方法以分离纯化嵌合或人源化抗体。

嵌合抗体或人源化抗体分离之后，所得纯化抗体的浓度可通过ELISA测得。

可通过任何已知方法进行抗原结合活性或其它活性(包括嵌合抗体或人源化抗体与正常细胞的结合活性)的测定(AntibodiesALaboratoryManual，Harlow，DavidLane编著，ColdSpringHarborLaboratory，1988)。对于抗体的抗原结合活性的测定方法，可采用ELISA(酶联免疫吸附测定)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)或荧光测定等技术。在ELISA中，通常将本发明的抗体固定在平板上，将本发明的蛋白质施加到平板上，再施加含有所需抗体的样品(如产生抗体的细胞的培养上清液或纯化的抗体)。然后施加用带有酶(如碱性磷酸酶)标记签的识别第一抗体的第二抗体，并将其预温育。洗涤后，在平板中加入酶底物如磷酸对硝基苯酯，测定吸光度，评价目标样品的抗原结合活性。可以使用BIAcore(Pharmacia)评价本发明抗体的结合活性。

为了保持抗原结合活性，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。还有图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序可用。通过检查这些显示图像可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能行使中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需的抗体特征，诸如更高的对靶抗原的亲和力。

(iii)抗体片段

已经开发了多种生成抗体片段的技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来得到这些片段(参见例如Morimoto等,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)及Brennan等,Science229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段，并通过化学方法偶联形成F(ab')₂片段(Carter等,Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，优选的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利5,641,870中所述。所述线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

(iv)双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例如，可以将抗癌细胞标志物臂与可结合白细胞上的触发分子诸如T细胞受体分子(如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，使得细胞防御机制聚焦于癌细胞。双特异性抗体还可用于将胞毒剂定位于癌细胞。这些抗体拥有癌细胞标志物结合臂及结合胞毒剂(如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab)₂双特异性抗体)。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统的全长双特异性抗体制备，当两种链具有不同的特异性时，是基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达(Millstein等,Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成可能有10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，其通常通过亲和层析步骤进行，相当麻烦且产物产量低。WO93/08829及Traunecker等,EMBOJ.10:3655-3659(1991)中公开了类似的流程。

按照一种不同的方法，将具有所需的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选是与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域融合。优选的是，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入各别的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时可提供最优产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链的同比例表达可导致高产量时或在该比例没有特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体是可能的。

在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。人们发现这种不对称结构便于将所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开，这是由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等,MethodsinEnzymology121:210(1986)。

依照美国专利5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，从而使得从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定域的至少一部分C_H3域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)替换。在第二抗体分子的界面上通过用较小氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了提高异二聚体相对于其它非期望的终产物诸如同二聚体的产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980。

文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science229:81(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')₂片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段变得更加容易，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab')₂分子。由大肠杆菌各别分泌每个Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。

还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。(Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区被还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。

考虑高于2价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。

抗体偶联物和其它修饰

本发明的抗体任选偶联至细胞毒剂或治疗剂。

例如，治疗剂包括任何可用于治疗癌症的化疗剂。化疗剂的例子包括烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯类，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylemelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolmelamine)；氮芥类，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idambicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinicacid)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(efornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK&commat；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofirane)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替哌；类紫杉醇(taxoid)，例如帕立他塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)、铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycinC)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；及上述任何物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。此外，治疗剂还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、奥那司酮(onapristone)、和托瑞米芬(toremifene)和抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；及上述任何物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。

本文还设想了抗体与一个或多个小分子毒素(如加利车霉素、美登木素(美国专利5,208,020)、单端孢霉素和CC1065)的偶联物。在本发明的一个优选实施方案中，将抗体偶联至一个或多个美登木素分子(例如约1个至约10个美登木素分子每个抗体分子)。例如可以将美登木素转变成MaySS-Me，MaySS-Me可以还原成May-SH₃并与经修饰的抗体反应(Chari等，CancerResearch52:127-131(1992))以生成美登木素生物碱-抗体偶联物。

或者，可以将抗体偶联至一个或多个加利车霉素分子。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和OI1(Hinman等，CancerResearch53:3336-3342(1993)及Lode等，CancerResearch58:2925-2928(1998))。

可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(PhytolacaAmericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO93/21232。

本发明进一步涵盖偶联有多种放射性同位素的抗体。例子包括¹¹¹In、²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P和Lu的放射性同位素。在本发明中，本发明的抗体可以在即将使用前用放射性核素标记，或者作为放射性标记的抗体来提供。熟练从业人员会认识到有多种放射性核素和化疗细胞毒剂可通过公知技术偶联至肿瘤特异性抗体并投递至某部位以特异性破坏肿瘤细胞和组织(参见例如W.A.Blattler等的美国专利4,542,225，1985年9月17日公告；及Pastan等，1986，Cell，47:641-648)。例如，适合于使用的成像和细胞毒性试剂包括¹²⁵I、¹²³I、¹¹¹In(例如Sumerdon等，1990，Nucl.Med.Biol.，17:247-254)、和99mTc；荧光标记物，诸如荧光素和罗丹明；化学发光标记物，诸如萤光素；和用于磁共振成像的顺磁性离子(Lauffer等，1991，MagneticResonanceinMedicine，22:339-342)。可以使用在本领域已知的并得到实践的方案和技术用此类试剂标记抗体。可以从例如Wenzel和Meares，RadioimmunoimagingandRadioimmunotherapy，Elsevier，NewYork，1983；Colcer等，1986，Meth.Enzymol.，121:802-816；及MonoclonalAntibodyforCancerDetectionandTherapy，Baldwin等编，AcademicPress，1985，pp.303-316中参考放射性标记抗体的技术。钇-90(⁹⁰Y)标记的单克隆抗体已有记载用于使投递至肿瘤或癌细胞和/或组织的剂量最大化，同时限制对正常组织的毒性(例如Goodwin和Meares，1997，CancerSupplement，80:2675-2680)。其它细胞毒性放射性核素，包括但不限于碘-131(¹³¹I)和铼-186也可用于标记本发明的单克隆抗体。在放射性核素中，钇-90(⁹⁰Y)可适合于放射免疫疗法，这是由于钇-90(⁹⁰Y)提供胜过碘-131(¹³¹I)的优点，因为前者可对肿瘤投予更高的贝塔能(2.3MeV比0.61MeV)，且具有5-10mm的路径长度，从而具有更好的杀死靶细胞及邻近细胞的能力，这一点在大体积或显影不良的肿瘤中是特别有利的。依照要使用的成像模式来选择所使用的可检测/检测标记物。例如，放射性标记物，诸如铟-111(¹¹¹In)、锝-99m(^99mTc)、或碘-131(¹³¹I)可用于平面扫描或单光子发射计算机断层照相术(SPECT)。还有，发射正电子的标记物，诸如氟-19可用于正电子发射断层照相术(PET)。顺磁性离子，诸如钆(III)或锰(II)可用于磁共振成像(MRI)。单克隆抗体还可用不透射线的标记物标记以在注射后通过例如X射线、CATscan、或MRI来显现癌细胞。特别地，对于CDH3相关疾病(例如癌症)，通过对标记物在癌症内的定位，可以确定疾病的扩散。例如，表达CDH3的癌症内存在的和可检测的标记物的量容许确定要诊断的受试者中癌症或肿瘤的有无。

抗体与细胞毒剂的偶联物的制备可使用多种双功能蛋白质偶联剂，诸如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚胺二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Charm等,CancerResearch52:127-131(1992))。

或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。

在另一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联，用于肿瘤的预定位，其中对患者施用抗体-受体偶联物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。

可以将本发明的抗体与前体药物活化酶偶联，所述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO88/07378和美国专利4,975,278。

此类偶联物的酶成分包括任何这样的酶，其能够以一定的方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的、具有细胞毒性的形式。

可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒的5-氟胞嘧啶转变为抗癌药氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶(serratiaprotease)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含D-氨基酸替代物的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如13-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将13-内酰胺衍生药物转变为游离药物的13-内酰胺酶；及可用于将氨基氮分别被苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生化的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey,Nature328:457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。

可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗体共价结合，诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建这样的融合蛋白，其包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区(参见例如Neuberger等,Nature312:604-608(1984))。

本文还涵盖抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性聚合物中的一种，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物连接。

本文公开的抗体还可配制成脂质体。可通过本领域已知的方法来制备包含抗体的脂质体，诸如Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985)；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日公布的WO97/38731中描述的。美国专利5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。

特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，以产生具有所需直径的脂质体。可如Martin等,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等,J.ANationalCancerInst.81(19):1484(1989)。

涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可以改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入抗体编码核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列中的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

一种可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描突变”，如CunninghamandWells,Science244:1081-1085(1989)所述。这里，鉴定一个或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些显示出对替代的功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在指定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机突变，并从所表达的抗体变体中筛选所需活性。

氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百或更多残基的多肽，还包括单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶或提高抗体血清半衰期的多肽。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基被替换成不同的残基。抗体中最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但FR改变也在考虑之内。

通过选择替代来实现对抗体生物学特性的实质性修饰，这些替代在保持(a)被替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)分子的靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小等方面的效果上显著不同。

根据共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代将需要用这些类别之一中的成员交换另一类别的成员。

对任何不涉及抗体正确构象的维持的半胱氨酸残基也可加以替代，通常替换成丝氨酸，以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是片段诸如Fv片段时)。

特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体(如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，产生各个位点上所有可能的氨基酸替代。将如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选者。产生这样的变体后，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体进行进一步的开发。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的场合)，或者通过对早先制备的变体或非变体型抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可以修饰本发明中使用的抗体以改善效应器功能，以便例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron等,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992)。

具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等,CancerResearch53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，可工程改造出这样的抗体，其具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。

为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。

诊断与CDH3有关的疾病

本发明的抗体可用作诊断与CDH3有关的疾病(如癌症)的标志物。

更具体地，可通过用本发明的抗体检测源自受试者的样品中的CDH3多肽来诊断与CDH3有关的疾病。据此，本发明提供通过用本发明的抗体检测源自受试者的样品中的CDH3多肽来诊断受试者中与CDH3有关的疾病或发生所述CDH3的倾向的方法。该方法包括下述步骤：

(a)使来自受试者的样品或标本接触本发明的抗体或其片段；

(b)检测样品或标本中的CDH3多肽；并

(c)基于CDH3蛋白与对照相比的相对丰度来判断受试者是否患有或有风险发生疾病。

在一个典型的实施方案中，与CDH3有关的疾病是癌症，更具体地说，胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

或者，在另一个实施方案中，本发明的抗体可用于活体中癌症的检测或成像。更具体地，本发明提供癌症检测或成像的方法，其包括下述步骤：

(1)给受试者施用本发明的抗体或其片段；

(2)检测活体中所述抗体或片段的累积或定位；并

(3)确定患者中抗体或其结合片段的位置。

或者，依照本发明，可检测受试者中的癌细胞或组织。例如，本发明提供用于检测受试者中表达CDH3的癌症的方法，包括：给受试者施用本发明的抗体或其片段，容许所述抗体或片段特异性结合受试者细胞或组织中的CDH3多肽；使细胞或组织中结合的抗体可视化；并将结合于所述细胞或组织的所述抗体的水平与正常对照细胞或组织比较，其中结合于受试者的细胞或组织的抗体的水平相当于正常对照细胞或组织升高指示受试者中有癌症。

优选地，为了追踪施用入活体的抗体，可以用可检测分子标记抗体。例如，可以追踪用荧光物质、发光物质、或放射性同位素标记的抗体的体内行为。用此类分子标记抗体的方法是本领域公知的。

可以观察(例如使用内窥镜或腹腔镜)用荧光物质或发光物质标记的抗体。在使用放射性同位素时，抗体的定位可通过放射性同位素的放射性示踪来成像。在本发明中，本发明的抗体的体内定位或累积证明癌细胞的存在。

相似的方法已经被用于其它抗体，而从业人员会知道适合于身体内结合的抗体或片段的位置成像的多种方法。作为非限制性指导，施用约10-1000微克(mcg.)、优选约50-500mcg、更优选约100-300mcg、更优选约200-300mcg纯化的抗体。例如，人的可应用剂量包括约100-200mcg/kg体重或350-700mg/m²体表面积。

用于诊断与CDH3有关的疾病的试剂盒

本发明提供用于与CDH3有关的疾病的诊断的试剂盒。具体而言，试剂盒包括本发明的抗体或其片段作为CDH3多肽的检测试剂。在一个实施方案中，用于本发明的试剂盒的抗体可以用荧光物质、发光物质、或放射性同位素标记。标记抗体和检测带标记抗体的方法是本领域公知的，本发明可采用任何标记物和方法。

另外，试剂盒可包括阳性和阴性对照试剂，和用于检测本发明的抗体的第二抗体。例如，自健康正常受试者或非癌组织获得的组织样品可充当有用的阴性对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括从商业和用户立场看可取的其它材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明的包装插页(例如书面的、磁带、CD-ROM等)。这些试剂和此类可以装在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以由各种材料制成，诸如玻璃或塑料。

在其它实施方案中，本发明进一步提供用于要诊断的受试者内癌症的检测、成像或治疗的试剂盒，其包括本发明的抗体。或者，本发明还提供包含本发明抗体的诊断试剂，该试剂用于施用到要诊断与CDH3有关的疾病(包括癌症)的受试者体内。在优选的实施方案中，本发明的抗体可以用放射性同位素标记。例如，本发明的试剂盒可以含有本发明的抗体，其经过螯合剂和放射性物质的修饰。MX-DOPA是用于修饰抗体的优选螯合剂。同时，铟-111(¹¹¹In)可用作用于生物成像的示踪剂。或者，为了与CDH3有关的疾病的放射免疫疗法，可以用贝塔核素例如钇-90(⁹⁰Y)标记抗体。在本发明中，也可以以其盐或溶液的形式提供铟-111(¹¹¹In)或钇-90(⁹⁰Y)。铟-111(¹¹¹In)或钇-90(⁹⁰Y)的合适的盐是氯化物。

在一个优选的实施方案中，与CDH3有关的疾病是胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

治疗用途

下面描述的是使用本发明的抗体来治疗和/或预防与CDH3有关的疾病，或抑制表达CDH3的细胞的生长的方法和药物组合物。在典型的实施方案中，与CDH3有关的疾病是癌症，包括但不限于胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌细胞。具体而言，依照本发明在受试者中治疗和/或预防与CDH3有关的疾病，或抑制表达CDH3的细胞的方法包括以有效量给受试者施用本发明的抗体或片段。

本发明中的受试者可以是动物，包括哺乳类和鸟类动物。例如，哺乳动物可以包括人、小鼠、大鼠、猴、家兔、和犬。

本文所述抗体或其片段能特异性结合CDH3多肽，所以当给受试者施用抗体或其片段时，它结合受试者中的CDH3多肽，而且可以遏制表达CDH3的细胞如癌性细胞的生长。或者，当抗体或其片段可偶联有治疗性模块并施用于受试者时，它被投递至受试者中表达CDH3多肽的区域(即患病区域)，从而治疗性模块可以被选择性地投递到患病区域并作用于它。这样的治疗性模块可以是已知的或将会被开发的对癌症具有治疗功效的任何治疗剂，包括但不限于放射性同位素标记物和化疗剂。可根据多种因素来选择可用作治疗剂的放射性同位素标记物，这些因素包括贝塔射线能及其发射效率、发射的伽马射线的有无、其能量和发射效率、物理半衰期、和标记方法。一般地，可使用基于钇(诸如⁹⁰Y)和碘(诸如¹²⁵I和¹³¹I)的放射性同位素标记物。化疗剂可以是已知的或将会被开发的用于治疗癌症的任何试剂，包括但不限于甲氨蝶呤、泰素、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、顺铂、卡铂、丝裂霉素、博来霉素、多柔比星、伊达比星、柔红霉素、放线菌素D、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、帕立他塞、和多西他赛。本发明的抗体或其片段能选择性结合CDH3多肽且不结合正常细胞，所以能有效避免由抗体或其片段或者放射性同位素或化疗剂引起的副作用，因此可以有高的治疗功效。

可以以有效治疗或预防CDH3相关疾病的剂量将本文所述抗体或其片段施用于受试者。有效剂量指抗体或其片段足以在所治疗受试者中产生有益健康的好处的量。下文描述了药物组合物含有本发明抗体或其片段时可采用的制剂和施用方法。

要进一步理解，在必要或想要时，可施用不同单克隆抗体的鸡尾酒(cocktail)，诸如本文中描述的具体的单克隆抗体或其片段的混合物，以缓解与CDH3有关的疾病。确实，在鸡尾酒中使用单克隆抗体或其片段的混合物来靶定疾病细胞上的数种抗原或不同表位是一种有利的办法，特别是用于预防由于肿瘤细胞和/或癌细胞因抗原之一的下调所致的逃逸(evasion)。

依照本发明使用的药物组合物可以以常规方式使用一种或多种药学可接受载体或赋形剂来配制。基因，本发明提供用于治疗或预防与CDH3有关的疾病，或抑制表达CDH3的细胞生长的药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体或其片段，以及可药用的担载体或赋形剂。

抗体或其片段可配制成供通过注射进行的胃肠外施用(即静脉内或肌肉内)，经由例如推注注射或连续输注。供注射用的配制剂可以以单位剂量形式与添加的防腐剂一起在例如安瓿或多剂量容器中提供。组合物可采取油性或水性媒介中的悬浮液、溶液、或乳状液等形式，而且可含有配方剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可以是冻干粉形式，以便于在使用前用合适的媒介例如无菌无热原水构建。

抗体或片段、或其偶联的治疗性模块的毒性和治疗功效，可按照标准药学规程在细胞培养物或实验动物(例如用于测定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中有治疗效果的剂量))中确定。毒性和治疗性效果之间的剂量之比为治疗指数，其可表述为比值LD/ED。

自细胞培养物测定和动物研究获得的数据可用于确定供人体使用的剂量范围。所述抗体的剂量优选在包括ED50在内的循环血浆浓度范围之内，毒性很小或没有毒性。根据所采用的剂量形式、所利用的施用路径及所偶联的治疗性模块的类型和量，剂量可以在此范围内变化。对于本发明的抗体或其片段而言，有效剂量首先可以根据细胞培养物测定来估算。可以在动物模型中配制实现包括IC50(即测试抗体实现症状抑制最大值半数的浓度)在内的循环血浆浓度范围的剂量，如在细胞培养物中测定的。可以利用这样的信息更准确地确定在人体中有用的剂量。血浆中的水平可通过例如高效液相层析来测量。

根据受试者的状况和年龄和/或施用路径，本领域技术人员能选择本发明药物组合物的适宜剂量。例如，以如下的量施用本发明的药物组合物，使得在1天中依照本发明的抗体被施用于受试者的量为约3至约15mcg每kg受试者体重，优选约10至约15mcg每kg受试者体重。可以考虑受试者的状况和年龄、施用路径、及对药物组合物的响应来选择施用间隔和时间。例如，药物组合物可以施用于受试者1至5次，优选1次1天，持续5至10天。

在另一个方面，当胃肠外施用包含放射性同位素标记的抗体的组合物时，单个成人一次施用剂量为0.1mCi/kg至1.0mCi/kg，优选0.1mCi/kg至0.5mCi/kg，更优选0.4mCi/kg。

药物组合物可系统地或局部地施用。优选以靶向投递方式施用，以便将活性成分投递至患病部位。

在具体的实施方案中，本发明的方法和组合物与一种或一组化疗剂一起用于治疗或预防癌症，所述化疗剂包括但不限于甲氨蝶呤、泰素、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、顺铂、卡铂、丝裂霉素、博来霉素、多柔比星、伊达比星、柔红霉素、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、帕立他塞、和多西他赛。

关于放射疗法，根据要治疗的癌症的类型，可使用任何放射疗法方案。例如，但非限制，可施用X射线照射。也可施用发射伽马射线的放射性同位素，诸如镭、钴、和其它的元素的放射性同位素以暴露组织。

在另一个实施方案中，施用化学疗法或放射疗法，优选在使用含有本发明抗体的方法和组合物之后至少1小时、5小时、12小时、1天、1周、1个月、更优选几个月(例如长至3个月)。在使用依照本发明的方法和组合物的治疗之前、同时、或之后施用的化学疗法或放射疗法可通过本领域已知的任何方法来施用。

在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的抗体在制造用于治疗或预防与CDH3有关的疾病的药物组合物中的用途。特别地，本发明进一步提供放射性标记的本发明抗体在制造用于治疗或预防癌症的药物组合物中的用途。

或者，本发明进一步提供供治疗或预防与CDH3有关的疾病用的本发明抗体。特别地，还提供供癌症放射性免疫疗法中使用的放射性标记的本发明抗体。

或者，本发明进一步提供制造用于治疗或预防与CDH3有关的疾病的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将作为活性组分的本发明抗体与药学或生理学可接受的担载体一起配制的步骤。特别地，本发明进一步提供制造用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将作为活性组分的放射性标记的本发明抗体与药学或生理学可接受的担载体一起配制的步骤。

在另一个实施方案中，本发明还提供制造用于治疗或预防与CDH3有关的疾病的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将活性组分与药学或生理学可接受的担载体混合的步骤，其中所述活性组分是本发明的抗体。特别地，本发明进一步提供制造用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将放射性标记的本发明抗体与药学或生理学可接受的担载体混合的步骤。

在又一个实施方案中，本发明提供用于要诊断的受试者体内癌症的生物成像或免疫闪烁成像术的本发明抗体。或者，本发明提供本发明抗体在制造用于受试者体内癌症的生物成像或免疫闪烁成像术的诊断剂中的用途。本发明进一步提供制造用于受试者体内癌症的生物成像或免疫闪烁成像术的诊断剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将本发明的抗体与药学或生理学可接受的担载体混合的步骤。

实施例

下面，基于实施例来进一步解释本发明。

材料和方法

抗体生成

从来源于癌细胞的cDNA池扩增CDH3基因编码的胞外域(SEQIDNO：83)。将产物克隆入pcDNA3.1(Invitrogen，CA)。为了生成CDH3特异性抗体，每两周给小鼠皮下免疫接种域表达载体(17.5μg/次注射)，持续一个月。确认抗血清的滴度后，自小鼠提取脾细胞并与骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤。筛选能产生结合癌细胞表面上的天然CDH3抗原的杂交瘤。通过筛选，确认杂交瘤克隆#3、克隆#4、克隆#5及克隆#6以高水平生成抗原特异性抗体，因此选择了这些杂交瘤来生成抗体供进一步实验用。将杂交瘤克隆#3、克隆#4、克隆#5及克隆#6腹膜内注射给小鼠。2至3周后回收腹水。使用蛋白A柱(GEHealthcare，NJ)自腹水纯化抗体。这里，也用克隆#3、克隆#4、克隆#5和克隆#6来指代抗体。

细胞培养

使用了人非小细胞肺癌系H1373进行体内治疗研究，因为它被确认表达CDH3多肽。H1373购自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，Manassasm，VA)，而且在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的RPMI中于37℃在5％CO₂的增湿气氛中维持。

放射性标记

对于由杂交瘤克隆#3、克隆#4、克隆#5和克隆#6生成的抗CDH3小鼠单克隆抗体，以及对照抗体正常小鼠IgG1(Nordicimmunologicallaboratories，Tiburg，TheNetherlands)，用钇-90(⁹⁰Y)标记。藉由双功能金属离子螯合剂p-SCN-Bn-DTPA或p-SCN-Bn-CHX-A"-DTPA(Macrocyclics，Dallas，TX，USA)用⁹⁰Y标记抗体。在二甲基甲酰胺中分别以1:5的摩尔比将一毫克抗体与该螯合剂缀合。于37℃温育20小时后，使用Biospin柱6(Bio-Rad，Tokyo，Japan)纯化抗体-螯合剂复合物。将⁹⁰YCl₃(QSAGlobal，Brauschweig,Germany)与0.25M乙酸(pH5.5)一起于室温平行预温育5分钟。为了获得⁹⁰Y标记的抗体，分别将抗体-螯合剂复合物与经预温育的⁹⁰YCl₃溶液一起于37℃温育1小时。使用Biospin柱6依照制造商的用法说明纯化经标记的抗体。在标记过程期间，没有观察到这些抗体的降解。

异种移植模型

依照群马大学动物使用和动物委员会的规定实施动物照看和处理。将100微升H1373细胞悬浮液(1x10⁷细胞)皮下接种入雌性3-5周龄裸鼠(CharlesRiverLaboratoriesJapanInc.Yokohama，Japan)的右胁。饲养这些小鼠数周以形成肿瘤。自携带肿瘤的小鼠分离建立的肿瘤，并切割成边长2mm的立方体组织碎块。将这些碎块依次移植入裸鼠。移植后，饲养这些小鼠直至平均肿瘤体积达到100mm³。

放疗

将异种移植小鼠随机指派至十个不同处理组中。如上所述制备⁹⁰Y标记的抗体(4-10mCi/mg)。给小鼠静脉内注射⁹⁰Y标记的或非标记的克隆#3、克隆#4、克隆#5或克隆#6。注射⁹⁰Y标记的正常小鼠IgG1作为对照。将所注射抗体的放射性调整至100微Ci每只动物。在注射后的5周时间里监测经处理的异种移植物小鼠的体重和肿瘤体积。使用下面的公式计算肿瘤体积(mm³)：(最短的直径)²x(最长的直径)x0.5。

还原性SDS-PAGE

将每5μg抗-CDH3抗体与含有4％SDS、125mMTris-HCl(pH6.8)、20％甘油、0.04％溴酚蓝及10％巯基乙醇的SDS缓冲液混合。加热后，将混合物施加到4-20％梯度SDS-PAGE凝胶上。然后将凝胶用考马斯亮蓝R-250(CBB)染色，并用10％甲醇和7％乙酸脱色。用扫描仪获取凝胶图像。

V区氨基酸序列的分析

使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN)自杂交瘤克隆#3、克隆#4和克隆#5提取总RNA。使用SuperScriptII逆转录酶(Invitrogen)自各总RNA合成cDNA。使用NovaTaqDNA聚合酶(Novagen)和小鼠Ig引物集(Novagen)扩增编码单克隆抗体可变区的多核苷酸。用于扩增的引物如下：

MuIgVH5'-B；5'-GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT-3'(SEQIDNO:84)用作重链5'引物；

MuIgkappaVL5'-D(下列引物的混合物)；

5'-ACTAGTCGACATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3'(SEQIDNO:85)和5'-ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3'(SEQIDNO:86)用作轻链5'引物,

MuIgGVH3'-2；5'-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3'(SEQIDNO:87)用作重链5'引物,以及

MuIgkappaVL3'-1；5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3'(SEQIDNO:88)用作轻链3'引物。

将PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。将插入区测序并确定了克隆#3、克隆#4和克隆#5的可变区(除信号序列外)的核酸序列。

以下面的符号表示引物序列中的不同核苷酸；

B代表C、G或T,D代表A、G或T,H代表A,C或T,I代表肌苷酸，K代表G或T、M代表A或C，R代表A或G，S代表C或G，V代表A、C或G，W代表A或T，Y代表C或T。

结果

为了评估CDH3靶向放射免疫疗法的效力，抗-CDH3抗体用发射β射线的同位素⁹⁰Y(t1/2＝64.1小时)放射标记后，通过静脉注射施用给荷肿瘤裸小鼠。用钇-90标记的克隆#3、#4、和#6处理的肿瘤的生长速率被来自这些抗体上缀合的钇-90的放射所显著降低(图1)。尤其是在观察过程中，钇90-标记的克隆#3和克隆#6在H1373异种移植小鼠中强烈阻遏了肿瘤生长。另一方面，⁹⁰Y标记的对照抗体对肿瘤生长未显示出影响。因此，⁹⁰Y标记的抗体的治疗效果似乎依赖于其对肿瘤细胞表面上表达的CDH3多肽的亲和力。任何接受抗体处理的小鼠的体重都没有显著降低(数据未显示)。

与钇-90缀合的抗-CDH3抗体克隆#3、克隆#4和克隆#6对肿瘤发挥出显著的治疗效果。因此，CDH3可能是引人注意的癌症治疗靶标，而抗CDH3抗体可能作为新的肿瘤治疗工具可供使用。

小鼠单克隆抗体的H链V区和L链V区的氨基酸序列确定如下：

克隆#3，H链可变区(除信号序列外)：

QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSFWIHWVKQRPMQGLEWIGNIDPSDSETHYNQYFKDRATLTVDRSSSTAYMHLTSLTSEDSAVYYCARGGTGFSSWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:4)(由SEQIDNO:3所示的核酸序列编码)；

克隆#3,L链可变区(除信号序列外):

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIDSYLSWFQQKPGKSPKTLIHRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPRTFGGGTKLEIK(SEQIDNO:12)(由SEQIDNO:11所示的核酸序列编码)；

克隆#4,H链可变区(除信号序列外):

LVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKTSGYTFTSYWMHWIKQRPIQGLEWIGNIDPSDSETHYNQNFNDRATFTVDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGGTGFAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:20)(由SEQIDNO:19所示的核酸序列编码)；

克隆#4,L链可变区(除信号序列外):

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINNYLGWFQQKPGKSPKTLIHRTDRLIEGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDVGTYYCLQYDEFPRMFGGGTKLEIK(SEQIDNO:28)(由SEQIDNO:27所示的核酸序列编码)；

克隆#5,H链可变区(除信号序列外):

LVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPIQGLEWIGNIDPSDSETHYNQKFNDRARLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGGTGFAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:36)(由SEQIDNO:35所示的核酸序列编码)；和

克隆#5,L链可变区(除信号序列外):

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINNYLGWFQQKPGKSPKTLIHRTDRLIEGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDVGTYYCLQYDEFPRMFGGGTKLDIK(SEQIDNO:44)(由SEQIDNO:43所示的核酸序列编码)。

按照Kabat定义确定的抗体CDR序列如下所示：

克隆#3,SFWIH(SEQIDNO:6)(由SEQIDNO:5所示的核酸序列编码)作为VHCDR1,NIDPSDSETHYNQYFKD(SEQIDNO:8)(由SEQIDNO:7所示的核酸序列编码)作为VHCDR2，和GGTGFSS(SEQIDNO:10)(由SEQIDNO:9所示的核酸序列编码)作为VHCDR3,KASQDIDSYLS(SEQIDNO:14)(由SEQIDNO:13所示的核酸序列编码)作为VLCDR1,RANRLVD(SEQIDNO:16)(由SEQIDNO:15所示的核酸序列编码)作为VLCDR2，和LQYDEFPRT(SEQIDNO:18)(由SEQIDNO:17所示的核酸序列编码)作为VLCDR3；

克隆#4,SYWMH(SEQIDNO:22)(由SEQIDNO:21所示的核酸序列编码)作为VHCDR1,NIDPSDSETHYNQNFND(SEQIDNO:24)(由SEQIDNO:23所示的核酸序列编码)作为VHCDR2，和GGTGFAY(SEQIDNO:26)(由SEQIDNO:25所示的核酸序列编码)作为VHCDR3,KASQDINNYLG(SEQIDNO:30)(由SEQIDNO:29所示的核酸序列编码)作为VLCDR1,RTDRLIE(SEQIDNO:32)(由SEQIDNO:31所示的核酸序列编码)作为VLCDR2，和LQYDEFPRM(SEQIDNO:34)(由SEQIDNO:33所示的核酸序列编码)作为VLCDR3；，和

克隆#5,SYWMH(SEQIDNO:38)(由SEQIDNO:37所示的核酸序列编码)作为VHCDR1,NIDPSDSETHYNQKFNDRA(SEQIDNO:40)(由SEQIDNO:39所示的核酸序列编码)作为VHCDR2，和GGTGFAY(SEQIDNO:42)(由SEQIDNO:41所示的核酸序列编码)作为VHCDR3,KASQDINNYLG(SEQIDNO:46)(由SEQIDNO:45所示的核酸序列编码)作为VLCDR1,RTDRLIE(SEQIDNO:48)(由SEQIDNO:47所示的核酸序列编码)作为VLCDR2，和LQYDEFPRM(SEQIDNO:50)(由SEQIDNO:49所示的核酸序列编码)作为VLCDR3。

在还原条件下进行SDS-PAGE分析。凝胶上条带图样的特征是40-50kDa的分子量范围，对应于IgG重链；和20-30kDa的分子量范围，对应于IgG轻链。抗-CDH3抗体克隆#3、克隆#4和克隆#5和通常的IgG一样显示一条重链带和一条轻链带。另一方面，抗-CDH3抗体克隆#6显示了两条重链带和一条轻链带。重链可变区的不完全糖基化导致了还原型SDS-PAGE中额外的重链带。如图2所示，不完全的糖基化影响抗体的均一性，可能在治疗药的开发中造成困难。因此，设计了克隆#6的糖基化位点上具有一个氨基酸替换的克隆#6的变体，以避免H链可变区中的糖基化。这些变体可能比克隆#6更适合应用于基于抗体的癌症药物的开发。

克隆#6变体的H链可变区的氨基酸序列如下所示(下划线标明替换的氨基酸残基)：

克隆#6NS,H-链可变区(除信号序列外):

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDSYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:68)(由SEQIDNO:67所示的核酸序列编码)；

克隆#6NT,H-链可变区(除信号序列外):

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDTYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:72)(由SEQIDNO:71所示的核酸序列编码)；

克隆#6NA,H-链可变区(除信号序列外):

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDAYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:76)(由SEQIDNO:75所示的核酸序列编码)；和

克隆#6NQ,H-链可变区(除信号序列外):

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDQYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO:80)(由SEQIDNO:79所示的核酸序列编码)。

克隆#6变体的L链可变区(除信号序列外)的氨基酸序列与克隆#6相同；

QIVLTQSPAIMSSSPGEKVTMSCSATSSVTYMYWYQQKPGSSPKPWIFRTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQHYHIYPRTFGGGTKLEIK(SEQIDNO:60)(由SEQIDNO:59所示的核酸序列编码)。

根据Kabat定义确定的克隆#6变体的VHCDR2序列为：克隆#6NS为EIDPSDSYTYYNQNFKG(SEQIDNO:70)(由SEQIDNO:69所示的核酸序列编码)、克隆#6NT为EIDPSDTYTYYNQNFKG(SEQIDNO:74)(由SEQIDNO:73所示的核酸序列编码))、克隆#6NA为EIDPSDAYTYYNQNFKG(SEQIDNO:78)(由SEQIDNO:77所示的核酸序列编码))，克隆#6NQ为EIDPSDQYTYYNQNFKG(SEQIDNO:82)(由SEQIDNO:81所示的核酸序列编码))。

这些变体的根据Kabat定义的其他CDR序列与克隆#6的相同；SYWIH(SEQIDNO:54)(由SEQIDNO:53所示的核酸序列编码)作为VHCDR1,SGYGNLFVY(SEQIDNO:58)(由SEQIDNO:57所示的核酸序列编码)作为VHCDR3,SATSSVTYMY(SEQIDNO:62)(由SEQIDNO:61所示的核酸序列编码)作为VLCDR1,RTSNLAS(SEQIDNO:64)(由SEQIDNO:63所示的核酸序列编码)作为VLCDR2，和QHYHIYPRT(SEQIDNO:66)(由SEQIDNO:65所示的核酸序列编码)作为VLCDR3。

工业实用性

本发明至少部分基于如下的发现，即在体内表达CDH3的癌症可以用放射性同位素标记的抗CDH3抗体来治疗。CDH3据报道是在胰腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌或肝癌中强烈表达的基因。因此，癌症(例如胰腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌或肝癌)的治疗可以使用用放射性同位素标记物标记的抗CDH3抗体方便地进行。

Claims (14)

1.一种抗体或其片段，其中所述抗体包含H(重)链V(可变)区和L(轻)链V区，其中所述H链V区和L链V区选自下组：

(a)包含具有SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:28所示的氨基酸序列的L链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的L链V区；

(b)包含具有SEQIDNO:36所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:44所示的氨基酸序列的L链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的L链V区；和

(c)包含具有SEQIDNO:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的H链V区，以及包含具有SEQIDNO:60所示的氨基酸序列的L链V区中所含的CDRs或与之功能上等同的CDRs的L链V区，

且其中所述抗体能够结合CDH3多肽或其部分肽。

2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述H链V区和L链V区选自下组：

(a)包含具有SEQIDNO:22所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:24所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:26所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，和包含具有SEQIDNO:30所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:32所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:34所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区，

(b)包含具有SEQIDNO:38所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:40所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:42所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，和包含具有SEQIDNO:46所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:48所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:50所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区；和

(c)包含具有SEQIDNO:54所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:70，74，78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:58所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，和包含具有SEQIDNO:62所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO:64所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQIDNO:66所示的氨基酸序列的CDR3的L链V区。

3.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体选自下组：小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段、和单链抗体。

4.权利要求3的抗体或其片段，其中所述抗体包含具有选自SEQIDNO:20,36,68,72,76和80的氨基酸序列的H链V区，和/或具有选自SEQIDNO:28,44和60的氨基酸序列的L链V区。

5.权利要求4的抗体或其片段，其中所述抗体包含：

(a)具有SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDNO:28所示的氨基酸序列的L链V区；

(b)具有SEQIDNO:36所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDNO:44所示的氨基酸序列的L链V区；或

(c)具有SEQIDNO:68，72，76或80所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDNO:60所示的氨基酸序列的L链V区。

6.权利要求4的抗体或其片段，其中所述抗体是嵌合抗体。

7.权利要求6的抗体或其片段，其中所述抗体是人源化抗体。

8.权利要求7的抗体或其片段，其中所述人源化抗体还包含人抗体FR(框架)区和/或人抗体C区。

9.权利要求1-8中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体与细胞毒剂、治疗剂、放射性同位素标记物或荧光标记物缀合。

10.权利要求9的抗体或其片段，其中所述放射性同位素标记物选自90钇(⁹⁰Y)和111铟(¹¹¹In)。

11.权利要求1-10任一项的抗体或其片段在制备用于治疗或预防与CDH3有关的疾病或抑制表达CDH3的细胞生长的药物组合物中的用途。

12.权利要求1-10任一项的抗体或其片段在制备用于在受试者中诊断与CDH3有关的疾病或发生该疾病的倾向的作用剂中的用途。

13.一种用于治疗或预防与CDH3有关的疾病或抑制表达CDH3的细胞生长的药物组合物，其中所述药物组合物包含有效量的依照权利要求1-10中任一项的抗体或片段和可药用的担载体或赋形剂。

14.一种用于诊断与CDH3有关的疾病的试剂盒，其中所述试剂盒包含依照权利要求1-10中任一项的抗体或片段。