KR101131401B1 - 암 세포 세포독성을 매개하는 키메라 및 인간화된 항-ｃｄ44 항체 - Google Patents

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Abstract

단쇄 히알루론산 (HA) 결합 당단백질인 CD44 는 다양한 정상 조직, 모든 조혈성 세포 및 여러 암 조직에서 발현된다. PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마 H460-16-2 의 CD44 에 대한 모노클로날 항체는 이미 암성 질환 개질 항체 (CDMAB) 인 것으로 나타났고, 이는 전립선암 및 유방암을 포함한 암 모델에서 세포독성에 의해 종양 덩어리를 감소시키고 종양 성장을 방지하는 것으로 나타났다. 상기 모노클로날 항체의 가변 영역을 또한 단리하고, 서열화하여, 상기 모노클로날 항체를 넘어서는 향상된 항-종양 활성을 가진 키메라 항체를 제조하였다. 현재, 모 PTA-4621 모노클로날 항체와 유사한 CD44 결합 활성을 갖도록 인간화된 항체를 제조한다. 모노클로날, 키메라 및 인간화된 항체는 암 치료를 위해 독소, 효소, 방사성 화합물, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 조혈성 세포에 접합될 수 있다. 이들 항체는 또한 세포 상에서의 CD44 발현을 측정하기 위한 결합 어세이에서 사용된다.
Figure R1020097024868
CDMAB

Description

암 세포 세포독성을 매개하는 키메라 및 인간화된 항-ＣＤ44 항체 {CHIMERIC AND HUMANIZED ANTI-CD44 ANTIBODIES THAT MEDIATE CANCER CELL CYTOTOXICITY}
본 발명은 암성 질환의 진단 및 치료, 특히 종양 세포의 세포독성의 조정 ; 및 가장 특히 세포독성 반응을 개시하는 수단으로서, 임의로 하나 이상의 CDMAB/화학치료제와 병용한 암성 질환 개질 항체 (CDMAB) 의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 CDMAB 를 이용하는 결합 어세이에 관한 것이다.
암에서 CD44 : 인간 백혈구에 대한 모노클로날 항체의 배양 (raising) 은 CD44 항원 ; 다양한 정상 조직 및 모든 유형의 조혈 세포 상에서 발현되는 단일 사슬 히알루론산 (HA) 결합 당단백질의 발견을 초래하였다. 이는 본래 림프구 활성화 및 귀소 (homing) 와 관련 있었다. 현재, 이의 추정의 생리학적 역할은 또한, 염증 유전자의 활성화, 세포 주기의 조정, 세포 증식의 유도, 분화 및 발달의 유도, 세포골격 재구성 및 세포 이동의 유도, 및 세포 생존/세포자살에 대한 내성을 포함한다.
인간에서, CD44 의 단일 유전자 복사본은 염색체 11, 11p13 의 짧은 팔에 위치한다. 상기 유전자는 19 개의 엑손을 함유하고 ; 처음의 5 개는 불변이고, 다음의 9 개는 가변성이며, 그 다음의 3 개는 불변이고, 마지막 2 개는 가변성이 다. 선별적 스플라이싱은 1000 개가 넘는 상이한 아이소폼을 초래할 수 있다. 그러나, 현재 단지 수십개의 자연 발생 변이체만이 규명되었다.
CD44 표준 당단백질은 N-말단 세포외 (20 개 아미노산 리더 (leader) 서열, 및 막 근처 영역 (85 개 아미노산) 포함) 도메인 (270 개 아미노산), 막관통 영역 (21 개 아미노산) 및 세포질 꼬리 (72 개 아미노산) 로 이루어진다. 세포외 영역은 또한, N-말단에 연결 모듈을 함유한다. 상기 영역은 길이가 92 개 아미노산이고, 다른 HA 결합 연결 단백질에 대한 동종성을 나타낸다. CD44 의 마우스 및 인간 형태 간에 높은 동종성이 있다. 단백질의 변이체 형태는 엑손 5 의 카르복시 말단에 삽입되고 발현되는 경우 세포외에 위치한다.
CD44 의 혈청 용해성 형태는 또한, 자연적으로 발생하고, 정지 코돈 (가변 영역 내에 있음) 또는 단백용해성 활성으로부터 발생할 수 있다. TNF-α 를 포함하여 다양한 자극으로부터의 세포의 활성화는 CD44 수용체의 발산 (shedding) 을 초래한다. 수용체의 발산은 또한 종양 세포에서도 나타나며, 이는 또한, 인간 혈청에서의 CD44 의 농도를 10-배 이하까지 증가시킬 수 있다. 높은 CD44 혈청 농도는 악성임을 제시한다 (난소암은 제외).
CD44 의 표준 형태는 대략 37 kD 의 분자량을 가진 것으로 존재한다. 번역후 개질은 분자량을 80 ~ 90 kD 까지 증가시킨다. 이러한 개질은 아스파라긴 잔기에서의 아미노 말단 세포외 도메인 N-연결된 글리코실화, 세포외 도메인의 카르복시 말단에 있는 세린/트레오닌 잔기에서의 O-연결된 글리코실화 및 글리코스아미노글리칸 첨가를 포함한다. 스플라이스 변이체의 크기 범위는 80 ~ 250 kD 일 수 있다.
포유류에서 세포외 기질 (ECM) 상에 위치한 다당류인 HA 는 1 차 CD44 리간드인 것으로 생각된다. 그러나, CD44 는 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등과 같은 단백질에 결합하는 것으로 밝혀졌다. HA 결합 및 글리코실화 간에 관계가 있는 것으로 보인다. 불활성 CD44 (HA 에 결합하지 않음) 는 가장 높은 수준의 글리코실화를 가지나, 활성 CD44 (결합 HA) 는 가장 낮은 수준의 글리코실화를 갖고, 한편, 유도성 CD44 (사이토카인, 모노클로날 항체, 성장 인자 등에 의해 활성화되지 않는 한, HA 에 결합하지 않거나 또는 약하게 결합함) 는 활성 및 불활성 형태 사이 즈음의 글리코실화 수준을 갖는다.
CD44 는 세포의 상호작용, 자극 및 환경에 의존하는 신호 전달 경로를 통해 그의 기능 중 일부를 매개할 수 있다. 이들 경로 중 일부는 NFκB 신호 캐스캐이드 (염증 반응에 포함됨), Ras-MAPK 신호 전달 경로 (세포 주기 및 증식의 활성화와 연관), Rho 패밀리의 단백질 (세포골격 재구성 및 세포 이동과 연관) 및 PI3-K-관련 신호 경로 (세포 생존과 연관) 를 포함한다. 상기 언급된 기능 모두는 종양 질환 개시 및 진행과 밀접하게 연관되어 있다. CD44 는 또한, 다양한 추가 기작을 통해 암에서 역할을 하는 것에 관련 있었다. 이들은 CD44 의 세포 표면상에 존재하는 세포 표면 프로테오글리칸에 의한 성장 인자, 케모카인 및 사이토카인의, 악성과 관련된 수용체에의 제시를 포함한다. 또한, CD44-HA 복합체의 내재화 후에 리소좀 히알루로니다아제에 의한 HA 의 세포내 분해는 ECM 을 통한 종양 침윤성 및 혈관신생 유도의 경향을 잠재적으로 증가시킬 수 있다. 또한, 생존 또는 세포자살 신호의 전달은 표준 또는 가변 CD44 수용체를 통해 발생하는 것으로 보인다. CD44 는 또한, 세포 분화 및 이동에 관여하는 것으로 제안되었다. 이러한 기작 중 전부는 아니라도 많은 것들은 환경적 및 세포 의존적이고, 일부는 다양한 발견을 하게 한다. 따라서, 어떤 결론을 도출할 수 있기 전에 더 많은 연구가 필요하다.
암에서의 CD44 의 잠재적인 기능을 입증하기 위해서, CD44 의 발현 연구를 수행하여, 수용체의 구별되는 발현이 질환 진행과 상호관련 있는지를 알아보았다. 그러나, 일치하지 않는 발견이 대부분의 종양 유형에서 관찰되었고, 이는 아마도 연구자 간의 시약, 기술, 병리학적 스코어링 및 세포 유형 차이의 조합으로 인한 것이다. 신세포 암종 및 비-호지킨스 림프종은 높은 CD44 발현 종양을 갖는 환자가 비-CD44 발현 종양을 갖는 환자 또는 CD44 를 낮게 발현하는 종양을 갖는 환자보다 더 짧은 생존 기간을 가졌다는 예외가 있는 것으로 보인다.
암과의 이러한 연관성으로 인해, CD44 는 항암 치료 발달의 표적이 되었다. 여전히, 표준 또는 변이체 형태의 CD44 가 종양 진행에 필요한 것인지는 분쟁의 소지가 있다. CD44 가 종양 유형 및 심지어 세포 유형 의존적일 수 있음을 관점에서 그리고 다시 지지하는 생체 내 동물 데이타가 존재한다. 상이한 치료 접근법에는 용해성 CD44 단백질, 히알루로난 합성효소 cDNA, 히알루로니다아제, CD44 안티센스 및 CD44 특이적 항체의 주입이 포함된다. 각각의 접근법은 어느 정도 성공하였고, 그리하여 항-CD44 암 치료에 대한 지지를 제공하였다.
변이 및 표준 CD44 특이적 모노클로날 항체 둘 다 실험적으로 생성되었으나, 대부분의 경우 이들 항체는 내인성 생물학적 활성을 갖고 있지 않으며, 그보다는 이들이 인지하는 CD44 유형에 특이적으로 결합한다. 그러나, 시험관 내 또는 생체 내에서 활성인 것이 일부 있다 (그러나 일반적으로 둘 다는 아님). 다수의 항-CD44 항체가 세포 사건을 매개하는 것으로 보인다. 예를 들어, 쥣과 항체 A3D8 는 인간 적혈구 Lutheran 항원 CD44 표준 형태에 대한 것으로서, CD2 (9-1 항체) 및 CD3 (OKT3 항체) 매개 T 세포 활성화를 증진시키는 것으로 나타났고 ; 또다른 항-CD44 항체가 유사한 효과를 가졌다. A3D8 또한 단핵구로부터의 IL-1 방출 및 T 림프구로부터의 IL-2 방출을 유도하였다. 흥미롭게도, 다우노루비신, 미톡산트론 및 에토포사이드와 같은 약물과 함께 A3D8 을 사용하면, 2 차 메신저 세라마이드의 발생을 없앰으로써 HL60 및 NB4 AML 세포에서 세포자살 유도를 억제하였다. 내인성 활성을 갖지 않고 CD44 의 유사한 에피토프에 대한 것인 J173 항체는 약물-유도 세포자살을 억제하지 않았다. 또한, A3D8 및 또다른 항-CD44 모노클로날 항체인 H90, 뿐만 아니라 히알루로난은 급성 골수성 백혈병 (AML) 환자의 백혈모구 (leukemic blast) 에서 분화를 유도하였다. 그러나 동일한 연구에서, CD44 의 표준 형태에도 결합하는 J173 항체는 동일 세포의 분화를 유도하지 않았다. 흥미롭게도, H90 은 J173 에 의해 결합된 환자의 하위군의 AML 세포에 결합하지 않았으며, 이는 이들 항체가 별개의 에피토프를 인지함을 지시한다. 별도의 연구에서, A3D8 및 H90 둘 다 다수의 AML-유래 세포주의 말단 분화를 유도하였다. 85-110 kD 및 200 kD 형태의 CD44 에 대한 NIH44-1 항체는 저자들이 CD44 의 가교 또는 응집으로서 추측한 경로를 통해 T-세포 증식을 증대시 켰다. 이를 종합하면, 이와 같은 항체가 암 치료제로서 사용하기에 적합하다는 증거가 없는데, 그 이유는 이들 항체가 암에 대한 것이 아니고 (예를 들어, 림프구를 활성화시킴), 세포 증식을 유도하거나, 또는 세포독성제와 함께 사용된 경우 약물-유도성 암세포 사멸을 억제시켰기 때문이다.
다수의 항-CD44 항체는 생체 내에서의 항-종양 효과를 나타내는 것으로 기술되었다. 항체 H90 은 인간 적혈구 (RBC) 를 마우스에 면역화시킴으로써 생성되는 마우스 모노클로날 항체이고, 보도에 따르면 CD44 의 모든 아이소폼에 결합한다. 상기 항체를, 인간 AML 세포를 주입하였던 방사선 조사를 받은 NOD-SCID 마우스에 4 주 동안 1 주에 3 회 투여하면, 이들 세포에 의한 재분할을 차단하였다. 또한, 이들 동물로부터의 AML 세포를 단계 계대배양하는 것은 상기 세포를 H90 항체로 처치를 받았던 동물에서 수득한 경우, 수여자 마우스를 재증식시키는데 실패하였다. 상기 항체의 효과는 백혈구 줄기세포의 분화, 및 AML 세포와 적절한 영역과의 상호작용을 방해함으로써 매개되는 것으로 보였다. 또한, 인간 제대혈 줄기세포를 사용한, 방사선 조사를 받은 NOD-SCID 동물의 재분할은 상기 처치에 의해 손상을 받지 않았으며, 이는 항체의 선택적인 효과 및 또한 AML 과 정상 인간 조혈모 줄기세포 간의 중요한 표현형적 차이를 지시한다.
CD44 의 v6 변이체에 대한 마우스 IgG1 인 항체 1.1ASML 은 래트 췌장 선암종 BSp73ASML 의 림프절 및 폐 전이를 감소시키는 것으로 나타났다. 처치를 받은 동물의 생존은 동시에 증가되었다. 상기 항체는 단지 림프절 군체 형성 (군체 형성) 전에 투여된다면 효과적이었고, 림프절 내에서의 세포 증식을 방해하는 것으로 가정되었다. 시험관 내에서의 종양 세포에 대한 항체의 직접적인 세포독성은 없었고, 항체는 보체-매개 세포독성, 또는 면역 효과기 세포 기능을 향상시키지 않았다. 인간 세포에 대한 항체의 유용성은 기술되지 않았다.
Breyer 등은 정위-이식된 래트 신경교아세포종의 진행을 방해하기 위한, 시판의 CD44 항체의 용도를 기술하였다. 래트 신경교세포종 세포주 C6 를 전두엽에 이식하였고, 1 주일 후에, 상기 래트에 항체를 대뇌 주사에 의해 3 회 처치하였다. 처치를 받은 래트는 감소된 종양 성장을 보였고, 완충제 또는 아이소타입 대조군 처치 래트보다 더 높은 체중을 나타내었다. 항체는 시험관 내에서 세포가 세포외 기질 성분으로 코팅된 커버슬립에 부착되는 것을 억제할 수 있었으나, 세포에 대한 임의의 직접적인 세포독성 효과를 가지지는 못하였다. 상기 항체는 인간 세포에 대해 테스트되지 않았다.
CD44 에 대한 항체 (IM-7.8.1) 의 효능을 CD44v10 에 대한 항체 (K926) 의 효능과 비교하는 연구를 수행하였다. CD44 아이소폼 둘 다를 발현하는 고도로 전이성인 쥣과 골수종 세포주인 B16F10 을 마우스에 정맥내로 이식하였다. 2 일 후, 연구 기간 동안 매 3 일마다 항체를 투여하였다. 두 항체 모두 폐 전이의 수를 50% 초과의 유의한 감소를 초래하였고 ; 두 항체 간에 효능에 있어서 유의한 차이가 없었다. 항체는 시험관 내 증식에 영향을 주지 못하였고, Zawadzki 등은 종양 성장의 억제가 CD44 와 그의 리간드와의 상호작용을 차단하는 항체로 인한 것이었다고 가정하였다. IM-7.8.1 을 사용하는 다른 연구에서, Zahalka 등 은 항체 및 그의 F(ab')2 절편이 쥣과 T-세포 림프종 LB 에 의한 림프절 침윤을 차단할 수 있었다고 기술하였다. 이는 마우스에 유의한 생존 이점을 부여하였다. Wallach-Dayan 등은 자발적으로 종양을 형성하지 않는 LB-TRs 쥣과 림프종을 CD44v4-v10 으로 트랜스펙션하면 종양 형성 능력을 부여하였다고 나타내었다. IM-7.8.1 투여는 아이소타입 대조군 항체와 비교해 이식된 트랜스펙션된 세포의 종양 크기를 감소하였다. 이들 연구 중 어느 것도 상기 항체에 대한 인간 유용성을 기술하지 않았다.
GKW.A3, 마우스 IgG2a 는 인간 CD44 에 대해 특이적이고, SCID 마우스에서 인간 골수종 이종 이식의 형성 및 전이를 예방한다. 상기 항체를 전이성 인간 세포주 SMMU-2 와 혼합한 다음, 피하 주사하였다. 처치는 이후 3 주 동안 계속되었다. 4 주 후, 10 마리의 마우스 중 단 1 마리만이 주사 부위에서 종양이 생겼고, 비처리 동물은 100% 종양이 생겼다. 상기 항체의 F(ab')2 절편은 종양 형성을 동일하게 억제하였으며, 이는 작용 기작이 보체 또는 항체-의존성 세포성 세포독성에 의존하지 않았음을 제시한다. 종양 세포를 처음 항체 주사 1 주일 전에 주사하였다면, 동물 중 80% 가 1 차 부위에서 종양이 생겼다. 그러나, 생존 기간은 여전히 유의하게 증가되었다고 나타났다. 지연된 항체 투여는 1 차 종양 형성에는 아무런 영향을 주지 못하였음에도, 이는 비처리 동물에서는 존재하였던 폐, 신장, 부신, 간 및 복막에의 전이를 완전히 예방하였다. 상기 항체는 시험관 내에서 세포주에 대한 직접적인 세포독성을 가지지 않고, 또한, SMMU-2 세 포의 증식을 방해하지 않으며, 전이 또는 성장에 영향을 미침으로써 종양 형성에 주요한 영향을 가지는 것으로 보인다. 상기 항체의 하나의 주목할만한 특징은 상기 항체가 CD44 의 모든 아이소폼을 인지한다는 것이었고, 이는 치료 용도에 대한 제한된 가능성을 제시한다.
Strobel 등은 마우스 이종 이식 모델에서 인간 난소암세포의 복막 이식을 억제시키기 위한, 항-CD44 항체 (클론 515) 의 용도를 기술한다. 인간 난소 세포주 36M2 를 항-CD44 항체 또는 대조군 항체의 존재 하에 마우스에 복강내로 이식하고, 그런 다음 다음 20 일에 걸쳐서 처치물을 투여하였다. 5 주 후, 항체 처리 군의 복강에서 유의하게 더 적은 결절이 있었다. 항-CD44 및 대조군 처리군 둘 다의 결절은 동일 크기였고, 일단 세포가 이식되었으며, 항체가 종양 성장에 아무런 영향을 미치지 못하였음을 제시한다. 세포를 피하에 이식히였을 때, 또한 종양 성장에 아무런 효과가 없었으며, 이는 항체 자체는 항-증식 또는 세포독성 효과를 갖고 있지 않았음을 지시한다. 또한, 시험관 내에서 세포 성장에 대한 항체의 효과가 없었다.
BIWA 1 로서도 지정된 VFF-18 은 폴리펩타이드의 360 ~ 370 영역에 대해 특이적인 CD44 의 v6 변이체에 대한 고친화성 항체이다. 상기 항체는 12 명의 환자에서의 1 상 임상 시도에서 99m테크네튬-표지 컨쥬게이트로서 사용되었다. 항체를 두경부 편평상피 세포 암종 환자에서 안정성 및 표적화 능력에 대해 테스트하였다. 주사 후 40 시간째에, 주사된 투여량의 14% 가 종양에 의해 흡수되었고, 신장, 비장 및 골수를 포함한 다른 기관에서는 최소한으로 축적되었다. 상기 항체의 이례적으로 높은 친화성이 종양의 더 깊은 층으로의 침투를 예방하였음에도 불구하고, 고도로 선택적인 종양 결합은 방사성면역치료에서 상기 항체의 역할을 제시한다. BIWA 1 의 적용을 추가로 제한하는 것은 쥣과 항체의 면역원성 (12 명의 환자 중 11 명이 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 를 발달시켰음), 종양 및 항체-용해성 CD44 복합체의 형성을 통한 비균질한 축적이다. WO 02/094879 는 HAMA 반응을 극복하도록 지정된 VFF-18 의 인간화된 버전인 BIWA 4 로 지정된 것을 개시한다. BIWA 4 는 모 VFF 18 항체보다 유의하게 더 낮은 항원 결합 친화성을 가진 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, 더 낮은 친화성의 BIWA 4 항체는 더 높은 친화성의 BIWA 8 인간화된 VFF-18 항체보다 탁월한 종양 흡수 특징을 가졌다. 99m테크네튬 (Technetium)-표지 및 186레늄 (Rhenium)-표지 BIWA 4 항체를 33 명의 환자의 1 상 임상 시도에서 평가하여, 안정성, 용인성, 종양 축적 및 186Re-표지 BIWA 4 의 경우에는 최대 용인 투여량을 알아보았다. 99mTc-표지 BIWA 4 의 종양 관련 흡수가 있는 것으로 보였다. 많은 것들이 안정한 질환을 가졌음에도 불구하고 186Re-표지 BIWA 4 의 모든 투여량을 사용해서 관찰된 종양 반응은 없었으며 ; 투여량 제한 독성은 60 mCi/m2 에서 발생하였다. 50 ~ 65% 의 부작용 비율이 있었고 33 명의 환자 중 12 명의 환자가 중증의 부작용 (혈소판감소증, 백혈구감소증 및 발열) 을 가졌고, 모두 186Re-표지 BIWA 4 로 치료를 받은 그 중 6 명은 치료 과정 또는 질환 진행으로 인한 후속치료 동안에 사망하였다. 2 명의 환자에서 인간 항-인간 항체 (HAHA) 가 발달되었다. 186Re-표지 BIWA 4 의 1 상 투여량 증강 시험을 20 명의 환자에서 수행하였다. 경구 점막염 및 투여량-제한 혈소판감소증 및 백혈구감소증이 관찰되었고 ; 1 명의 환자에서 HAHA 반응이 발생하였다. 60 mCi/m2 의 최고 투여량으로 치료를 받은 5 명의 환자에서 안정한 질환이 관찰되었다. 달성되는 효능에 대한 용인성 및 안정성 둘 다의 면에서 허용가능한 것으로 보였음에도 불구하고, 이들 연구는 임상 연구에서 다른 비-방사성동위원소 접합 생물학적 치료와 비교해 부작용의 비율이 더 높다. 미국 특허 출원 제 2003/0103985 호는 종양 치료에서 사용하기 위한, BIWI 1 로서 지정된, 마이탄시노이드에 접합된 VFF-18 의 인간화된 버전을 개시한다. 인간화된 VFF 18 항체인 BIWA 4 가 독소에 접합된 경우, 즉, BIWI 1 은 외음부의 인간 유표피 암종, 인두의 편평상피 세포 암종 또는 유방 암종의 마우스 모델에서 유의한 항-종양 효과를 가진 것으로 밝혀졌다. 비접합 버전인 BIWA 4 는 항-종양 효과를 가지지 않았다. 불치의 두경부암 환자에 대한 BIWI1 의 한 1 상 시도에서, 최대 용인 투여량은 중증의 피부 독성 결과로서 환자 중 1 명의 사망으로 인해 시도가 조기에 방해를 받음으로써 측정될 수 없었다. 마찬가지로 두경부암 환자를 이용한 BIWI1 의 유사한 2 차 시도에서, MTD 를 측정하였고, 이는 피부 독성의 결과였다. 이미 화학치료를 받았던 전이성 유방암 환자를 이용한 BIWI1 의 3 차 시도에서, 가장 흔 한 독성은 경미하고 일시적인 피부 장애였다. 상기 연구에서, 효능의 객관적인 측정이 없었더라도, 치료된 환자 중 50% 는 투여량-독립적인 안정한 질환을 나타내었다. 모든 시도의 전반적인 음성 위험도 대 (vs) 효능 평가는 치명적인 사건의 예측가능성의 부재로 인해, 상기 약물의 추가의 발달을 지속시키지 못하였다.
Mab U36 은 암 및 조직 특이성에 대한 선택 및 UM-SCC-22B 인간 하인두 암종 세포 면역화에 의해 생성된 쥣과 모노클로날 IgG1 항체이다. cDNA 클로닝 및 서열 분석을 통한 항원 특징화는 Mab U36 의 표적으로서 케라틴세포-특이적 CD44 스플라이스 변이체 에피칸의 v6 도메인을 규명하였다. 면역조직화학법 연구는 에피토프가 세포막에 제한됨을 보여준다. 더욱이, Mab U36 은 두경부 편평상피 세포 암종 (HNSCC) 의 94% 를 강하게 표지하였고, 이들 종양 내에는 세포 염색에서 균일성이 있었다. 10 명의 환자 99 mTc-표지 Mab U36 연구는 HNSCC 암에 항체가 선택적으로 축적되었음을 보여주었고 (2 일째에 kg 당 20.4 +/- 12.4% 주사된 투여량) ; 부작용은 보고되지 않았으나 2 명의 환자에서 HAMA 가 발생하였다. 방사성-요오드화 쥣과 Mab U36 의 연구에서, 18 명의 환자에서 HAMA 가 3 케이스 있었고, HNSCC 에서 선택적인 균질한 흡수가 있었다. Mab U36 의 항원성을 감소시키고 HAMA 의 비율을 감소시키기 위해, 키메라 항체를 구축하였다. 키메라 항체 및 본래 쥣과 Mab U36 둘 다 ADCC 활성을 가지지 않았다. Mab U36 의 본래의 기능 활성의 증거가 없다. 186Re-표지 키메라 Mab U36 을 사용하여, 치료제로서의 Mab U36 의 유용성을 측정하였다. 상기 1 상 증강 투여량 시도에서, 13 명의 환자에 정탐 투여량의 99 mTc-표지 키메라 Mab U36 을 투여하고, 이어서 186Re-표지 키메라 Mab U36 을 투여하였다. 급성 부작용은 보고되지 않았으나, 후속 치료 투여량은 3 명의 환자 중 2 명에서 골수독성 (myelotoxcity) (1.5 GBq/m2), 및 최대 용인 투여량 (1.0 GBq/m2) 으로 치료받은 1 명의 환자에서 혈소판감소증이 관찰되었다. 종양 크기에 대해서는 어느 정도 효과가 있었음에도 불구하고, 이들 효과는 치료에 대한 객관적인 반응에 대한 범주를 충족시키지 못하였다. 186Re-표지 키메라 Mab U36 의 추가의 연구는 최대 용인 활성을 2.8 Gy 까지 2 배로 하기 위해, 전혈 재주입으로 자극받은 과립구 콜로니-자극 인자를 사용하는 전략을 적용하였다. 상기 다양한 두경부 종양 환자 9 명의 연구에서, 3 명은 약물 관련 빈혈에 대한 수혈 (transfusion) 을 필요로 하였다. 다른 독성은 3 등급 골수독성, 및 2 등급 점막염을 포함한다. 객관적인 종양 반응이 보고되지 않았으나, 그럼에도 불구하고, 안정한 질환이 5 명의 환자에서 3 ~ 5 개월 동안 생성되었다. 따라서, Mab U36 이 고도로 특이적인 항체임에도 불구하고, 항암 효과를 달성하기 위해서는 방사성면역컨쥬게이트를 필요로 하는 단점이 달성될 임상 효과와 관련한 치료와 연관된 독성때문에 그의 유용성을 제한하는 것으로 볼 수 있다.
요약하자면, CD44v6 (1.1ASML) 및 CD44v10 (K926) 모노클로날 항체는 각각 전이성 췌장 선암종을 주사받은 마우스, 및 악성 골수정을 주사받은 마우스에서 전이성 활성을 감소시키는 것으로 보였다. 또다른 항-CD44v6 항체 (VFF-18 및 그 의 유도체) 는 마이탄시노이드 또는 방사성동위원소에 접합된 경우에만 항-종양 효과를 가지는 것으로 보였다. 항-표준 CD44 모노클로날 항체는 또한, 래트 신경교세포종에 의한 대뇌 진행 (항-CD44), 마우스 T 세포 림프종에 의한 림프정 침범 (IM-7.8.1) 을 억제시킬 뿐만 아니라, 누드 마우스에서의 인간 난소암세포주의 이식 (클론 515), 마우스 골수종 세포주의 폐 전이 (IM-7.8.1) 및 SCID 마우스에서의 인간 골수종 세포주의 전이 (GKW.A3) 를 억제시키는 것으로 나타났다. 방사성동위원소 접합 Mab U36 항-CD44v6 항체 및 그의 유도체는 유의한 독성을 수반하였던 임상 시도에서 항-종양 활성을 가졌다. 이들 결과는 강력한 암 치료제로서의 항-CD44 모노클로날 항체의 발달을 지원하고 지지함에도 불구하고, 인간암에 대한 제한된 효능, 안정성 또는 이용가능성을 나타낸다.
따라서, 항체 조성물이 암성 세포 세포독성을 상기 세포 상의 CD44 의 세포 표면 발현에 대한 그의 이점으로서 매개하는 것으로 나타난다면, 매우 유용한 진단 및 치료 과정이 실현될 것이다.
암 치료제로서의 모노클로날 항체 : 암을 나타내는 각각의 개인은 독특하고 개인의 본질로서 다른 암과 상이한 암을 가진다. 상기에도 불구하고, 현재의 치료는 동일 단계에 있는 동일 유형의 암 환자 모두를 동일한 방식으로 치료한다. 이들 환자 중 30% 이상이 1 차 치료에서 실패할 것이고, 따라서 추가의 치료 순환의 증가, 및 치료 실패, 전이 및 결과적으로 사망의 가능성을 증가시킬 것이다. 탁월한 치료 접근법은 특정 개인에 대한 치료의 맞춤화일 것이다. 그 자체가 맞춤화에 기여하는 유일한 현재 치료법은 수술이다. 화학치료법 및 방사선 치료법은 환자에 맞추어질 수가 없고, 수술 자체로는 대부분의 경우 치료를 생성하는데 부적절하다.
모노클로날 항체의 출현으로, 맞춤화된 치료 방법을 개발하는 가능성이 더욱 더 현실화되었는데, 그 이유는 각각의 항체가 단일 에피토프에 대한 것일 수 있기 때문이다. 더욱이, 특정 개인의 종양을 독특하게 한정하는 에피토프의 무리에 관한 항체의 조합을 생성하는 것이 가능하다.
암성 세포 및 정상 세포 간의 유의한 차이를 인지하는 것은 암성 세포가 형질전환된 세포에 특이적인 항원을 함유한다는 것이고, 과학 단체에서는 오랫동안 모노클로날 항체가 이들 암 항원에 특이적으로 결합함으로서 표적 형질전환된 세포를 특이적으로 표적화할 수 있음을 시사하였으며 ; 따라서, 모노클로날 항체가 암세포를 제거하기 위한 "마술 불렛 (Magic Bullets)" 으로서 작용할 수 있다고 믿기 시작한다. 그러나, 현재 광범위하게는, 어떤 단일 모노클로날 항체도 모든 경우의 암에서 작용할 수는 없으며, 모노클로날 항체가 표적화된 암 치료법으로서 한 부류로서 개발될 수 있음을 인지한다. 본 개시된 발명의 기술에 따라 단리되는 모노클로날 항체는 환자에 유리한 방식으로, 예를 들어, 종양 덩어리를 감소시킴으로써 암성 질환 과정을 변형하기 위해 나타내어졌으며, 다양하게는 본원에서 암성 질환 개질 항체 (CDMAB) 또는 "항암" 항체라고 칭해질 것이다.
현재, 암 환자는 보통 소수의 치료 선택을 가진다. 암 치료법에 관한 조직화된 접근법은 포괄적인 생존율 및 사망율의 개선을 가져왔다. 그러나, 특정 개인에 있어서, 이들 향상된 통계는 본질적으로 그들의 개인적인 상황에서의 향상 과 상호연관있지는 않다.
따라서, 의사 (practitioner) 가 동일한 코호트 내 다른 환자와는 독립적으로 각각의 종양을 치료할 수 있게 하는 방법이 제시된다면, 이는 바로 그 한 개인에게 치료법을 맞춤하는 독특한 접근법을 허용할 것이다. 그러한 치료 과정은 이상적으로는 치료율을 증가시키고, 더 나은 결과를 생성하고, 그리하여 오랫동안 필요로 한 것을 충족시킬 것이다.
역사적으로는, 폴리클로날 항체의 사용이 인간 암의 치료에서 제한된 성공을 가지고 사용되어 왔다. 림프종 및 백혈병은 인간 혈장을 사용해 치료되었으나, 연장된 경감 또는 반응은 거의 없었다. 더욱이, 재현가능성이 없었고, 화학치료법과 비교해 추가의 이점이 없었다. 유방암, 골수종 및 신세포 암종과 같은 고형 종양 또한 인간 혈액, 침팬지 혈청, 인간 혈청 및 말 혈청을 사용해 치료하였는데 상응하게는 예측불가능하고 비효과적인 결과였다.
고형 종양에 대한 모노클로날 항체의 많은 임상 시도가 있었다. 1980 년대에, 인간 유방암에 대한 4 개 이상의 임상 시도가 있었는데, 이 시도에서 조직 선택성을 기반으로 하거나 또는 특이적 항원에 대한 항체를 사용하여 47 명의 환자 중에서 단 1 명만이 반응하였다. 1998 년이 되어서야, 인간화된 항-Her2/neu 항체 (허셉틴
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) 와 시스플라틴을 병용해서 성공적인 임상 시도가 있었다. 상기 시도에서, 37 명의 환자에서 반응을 평가하였고, 이 중 약 1/4 이 부분적인 반응율을 보였고, 추가의 1/4 가 최소한의 또는 안정한 질환 진행을 가졌다. 반응자들 중 진행되기까지의 중앙 시간은 8.4 개월이었고, 중앙 반응 기간은 5.3 개 월이었다.
허셉틴
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은 1998 년에 택솔
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과 병용한 1 차 시도에서 판명되었다. 임상 연구 결과, 택솔
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만을 수여받은 군 (3.0 개월) 을 비교하여 항체 치료 + 택솔
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을 수여받은 군 (6.9 개월) 에서 질환 진행까지의 중앙 시간이 증가한 것으로 나타났다. 또한, 중앙 생존에 있어서도 약간의 증가가 있었는데 : 허셉틴
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+ 택솔
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치료 암 (arm) 대 (versus) 택솔
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단독 치료 암에 대해 22 개월 대 18 개월이었다. 또한, 택솔
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단독군을 비교했을 때, 항체 + 택솔
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병용군에서 완전한 반응자들 (8% 대 2%) 과 부분 반응자들 (34% 대 15%) 둘 다의 수가 증가하였다. 그러나, 허셉틴
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+ 택솔
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은 택솔
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단독치료군과 비교해 더 높은 심장독성 발병을 초래하였다 (각각 13 대 1). 또한, 허셉틴
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치료법은 단지, 현재 알려진 기능 또는 생물학적으로 중요한 리간드를 갖고 있지 않은 수용체인 인간 외피 성장 인자 수용체 2 (Her2/neu) 를 과다발현하는 (면역조직화학법 (IHC) 분석을 통해 측정됨) 환자에 대해서만 효과가 있었는데 ; 전이성 유방암을 가진 환자 중 대략 25% 에 대해서였다. 따라서, 유방암 환자에 대한 큰 충족되지 않은 요구가 여전히 존재한다. 허셉틴
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치료로부터 이점을 얻을 수 있는 환자조차 여전히 화학치료가 필요할 것이고, 결과적으로 여전히 어느 정도 이상은 상기 종류의 치료 부작용을 겪게 되어야 할 것이다.
결장직장암을 연구하는 임상 시도는 당단백질 및 당지질 표적 둘 다에 대한 항체를 포함한다. 선암종에 대해 어느 정도 특이성을 갖는 17-1A 와 같은 항체 는 60 명이 넘는 환자에서 2 상 임상 시도를 수행하였고, 여기서 단 1 명의 환자만이 부분 반응을 가졌다. 다른 시도에서, 17-1A 의 사용은 추가의 사이클로포스파미드를 사용하는 프로토콜에서 52 명의 환자 중 단 하나의 완전한 반응 및 2 개의 최소 반응을 생성하였다. 지금까지, 17-1A 의 III 상 임상 시도는 III 기 결장암에 대한 보조 치료로서 향상된 효능을 나타내지 못하였다. 인간화된 쥣과 모노클로날 항체의 사용은 처음에는 이미지로는 판명되었으나, 종양 억제를 초래하지는 못하였다.
단지 최근에는 모노클로날 항체를 사용한 결장직장암 임상 연구에서 임의의 양성적인 결과가 있었다. 2004 년에, 이리노테칸-기재 화학치료에 불응성인 EGFR-발현 전이성 결장직장암 환자의 2 차 치료에 대해 승인되었다. 2-암 (two-arm) II 상 임상 시도 및 1-암 연구 둘 다의 결과는 이리노테칸과 병용한 ERBITUX
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가 각각 23% 및 15% 의 반응율을 가지고, 각각 4.1 개월 및 6.5 개월의 질환 진행까지의 중앙 시간을 가졌음을 나타내었다. 동일한 2-암 II 상 임상 시도 및 또다른 1-암 연구 결과는 ERBITUX
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단독 치료가 각각 11% 및 9% 이 반응율을 가졌고, 각각 1.5 개월 및 4.2 개월의 질환 진행까지의 중앙 시간을 가졌음을 나타내었다
결과적으로, 스위스 및 미국 둘 다에서의 이리노테칸과 병용한 ERBITUX
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치료, 및 미국에서의 ERBITUX
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단독 치료는 1 차 이리노테칸 치료를 실패한 결장암 환자의 2 차 치료로서 승인되었다. 따라서, 스위스에서와 마찬가지로, 허셉틴
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치료는 단지 모노클로날 항체 및 화학치료의 병용으로서 승인되었다. 또한, 스위스 및 미국 둘 다에서의 치료는 단지 2 차 치료로서 환자에 승인되었다. 또한, 2004 년에, AVASTIN
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은 전이성 결장직장암의 1 차 치료로서 정맥내 5-플루오로우라실-기재 화학치료와 병용하는 것이 승인되었다. III 상 임상 연구는 5-플루오로우라실 단독으로 치료받은 환자와 비교해 AVASTIN
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+ 5-플루오로우라실로 치료받은 환자의 중앙 생존의 연장을 나타내었다 (각각 16 개월 대 20 개월). 그러나, 다시, 허셉틴
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및 ERBITUX
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치료와 마찬가지로 단지 모노클로날 항체 및 화학치료의 병용으로서만 승인되었다.
또한, 폐, 뇌, 난소, 췌장, 전립선 및 위암에 대해서도 불량한 결과가 지속된다. 비소세포폐암에 대한 가장 기대할만한 최근의 결과는 치료가 세포-살해 약물 독소루비신에 접합된 모노클로날 항체 (SGN-15; dox-BR96, 항-Sialyl-LeX) 를 화학치료제인 TAXOTERE
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와 병용해서 포함한 II 상 임상 시도에서 나왔다. TAXOTERE
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는 폐암의 2 차 치료에 대한 유일한 FDA 승인받은 화학치료제이다. 초기 데이타는, TAXOTERE
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단독과 비교해 향상된 전체 생존율을 지시한다. 연구에 참여했던 62 명의 환자 중에서, 2/3 이 TAXOTERE
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와 병용하여 SGN-15 를 투여받았으며, 나머지 1/3 은 TAXOTERE
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만 투여받았다. TAXOTERE
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와 병용하여 SGN-15 를 투여받은 환자에 대해, 중앙 전체 생존율은 TAXOTERE
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단독을 투여받은 환자에 대한 5.9 개월과 비교해 7.3 개월이었다. 1 년 및 18 개월의 전체 생존율은 SNG-15 + TAXOTERE
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를 투여받은 환자에 대해서는 각각 29% 및 18% 였 고, TAXOTERE
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단독을 투여받은 환자에 대해서는 각각 24% 및 8% 였다.
임상전으로, 골수종에 대한 모노클로날 항체의 사용에서 약간의 제한된 성공이 있었다. 이들 항체 중 매우 소수만이 임상 시도에 도달하였고, 지금까지 어떤 것도 III 상 임상 시도에서 선호할만한 결과를 나타내거나 또는 승인받지 못하였다.
질환 치료를 위한 신규 약물의 발견은 질환 병인에 기여할 수 있었던 30,000 개의 알려진 유전자의 산물 중에서 적절한 표적의 규명이 없어서 방해받고 있다. 종양학 연구에서, 잠재적인 약물 표적은 종종 이들이 종양 세포에서 과다발현된다는 사실로 인해 간단하게 선택된다. 따라서, 그런 다음 규명된 표적을 많은 화합물과의 상호작용에 대해 스크리닝한다. 잠재적인 항체 치료의 경우, 이들 후보 화합물은 보통 [Kohler 및 Milstein (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler 및 Milstein)] 에 의해 주장된 기본 원리에 따라 모노클로날 항체 생성의 전형적인 방법으로부터 유도된다. 비장 세포를 항원으로 면역화된 마우스에서 수합하고 (예를 들어, 전체 세포, 세포 분획, 정제된 항원), 불멸 하이브리도마 파트너와 융합한다. 생성 하이브리도마를 표적에 대해 매우 열심히 결합하는 항체의 분비에 대해 스크리닝하고 선택한다 허셉틴 및 RITUXIMAB 를 포함하여, 암세포에 대한 많은 치료 및 진단 항체를 이들 방법을 사용하여 제조하고, 그의 친화성을 바탕으로 선별한다. 상기 전략에서 결점은 2-배이다. 우선, 치료 또는 진단 항체 결합에 대한 적절한 표적의 선택은 소수의 주변 조직 특이적 발암원성 방법, 및 과발현에 의한 선택과 같이 결과의 극단적으로 단순한 방법에 의해 제한되고, 이로써, 이들 표적이 규명된다. 두번째로, 가장 큰 친화성으로 수용체에 결합하는 약물 분자는 보통 신호의 개시 또는 억제에 대해 가장 높은 가능성을 가진다는 가정이 항상 그러한 경우일 수는 없다.
유방암 및 결장암의 치료에 대한 일부 진보에도 불구하고, 단일 제제 또는 병용치료로서의 효과적인 항체 치료의 규명 및 발달은 모든 유형의 암에 대해서는 부적절하였다.
선행 특허 :
미국 특허 제 5,750,102 호는 환자의 종양 세포를 MHC 유전자로 트랜스펙션시키는 방법을 개시하며, 상기 MHC 유전자는 환자의 세포 또는 조직에서 클로닝할 수 있다. 다음, 이들 트랜스펙션된 세포를 사용하여, 환자를 백신을 투여한다.
미국 특허 제 4,861,581 호는 포유류의 신생물성 세포 및 정상 세포의 내부세포 성분에는 특이적이나 외부 성분에는 특이적이지 않은 모노클로날 항체를 수득하고, 상기 모노클로날 항체를 표지하고, 상기 표지된 항체를 신생물성 세포를 살해하는 치료를 받은 포유류의 조직과 접촉시키고, 상기 표지된 항체가 신생물성 세포를 변성시키는 내부 세포 성분에 결합하는 것을 측정함으로써 치료의 효능을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 인간 세포내 항원에 대한 항체의 제조 시, 특허권 소유자는 악성 세포가 상기 항원의 통상적인 공급원을 나타낸다는 것을 인지한다.
미국 특허 제 5,171,665 호는 신규 항체 및 그의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로는, 상기 특허는 결장 및 폐의 종양과 같은 인간 종양과 연관된 단백질 항원에 강하게 결합하는 한편, 정상 세포에는 그보다 훨씬 더 약하게 결합하는 특성을 가진 모노클로날 항체의 형성을 교시한다.
미국 특허 제 5,484,596 호는 인간 암 환자의 종양 조직을 수술적으로 제거하고, 상기 종양 조직을 처리하여 종양 세포를 수득하고, 생존가능하나 비종양원성인 종양 세포를 조사하고, 이들 세포를 사용하여 1 차 종양의 재발을 억제시킬 수 있으며 한편으로는 동시에 전이를 억제시킬 수 있는 환자에 대한 환자의 백신을 제조하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 상기 특허는 모노클로날 항체의 발달을 교시하며, 상기 항체는 종양 세포의 표면 항원과 반응한다. 4 행, 45 열 및 이하에서 나타낸 바와 같이, 특허권 소유자는 인간 신생물에서 모노클로날 항체 발현 활성 특이적 면역치료의 발달에 있어서 자생 종양 세포를 사용한다.
미국 특허 제 5,693,763 호는 기원의 외피 조직에 의존하지 않는 인간 암종의 당단백질 항원 특징을 교시한다.
미국 특허 제 5,783,186 호는 Her2 발현 세포에서의 세포자살을 유도하는 항-Her2 항체, 상기 항체 생성 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 사용한 암 치료 방법, 및 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
미국 특허 제 5,849,876 호는 종양 및 비종양 조직 공급원으로부터 정제된 무친 항원에 대한 모노클로날 항체의 제조를 위한 신규 하이브리도마 세포주를 기술한다.
미국 특허 제 5,869,268 호는 목적하는 항원에 특이적인 항체를 생성하는 인간 림프구의 생성 방법, 모노클로날 항체의 생성 방법, 뿐만 아니라 상기 방법에 의해 생성되는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 상기 특허는 특히 암의 진단 및 치료에 유용한 항-HD 인간 모노클로날 항체의 생성에 관한 것이다.
미국 특허 제 5,869,045 호는 인간 암종 세포와 반응성인 항체, 항체 절편, 항체 컨쥬게이트 및 단일 사슬 면역독소에 관한 것이다. 이들 항체 기능이 2-배가 되는 기작은, 분자가 인간 암종의 표면상에 존재하는 세포막 항원과 반응성이라는 점, 및 추가로, 항체가 암종 세포 내에서 내재화하는 능력을 갖고 있다는 점, 결합 후에, 항체-약물 및 항체-독소 컨쥬게이트를 형성하기에 특히 유용하게 한다는 점이다. 그의 비개질 형태에서, 항체는 또한, 특정 농도에서 세포독성을 나타낸다.
미국 특허 제 5,780,033 호는 종양 치료 및 예방을 위한 자가항체의 용도를 개시한다. 그러나, 상기 항체는 나이가 든 포유류에서의 항-핵 자가항체이다. 이 경우, 자가항체를 면역계에서 발견되는 천연 항체 중 한 유형이라고 한다. 자가 항체가 "나이가 든 포유류" 에서 나오기 때문에, 자가항체가 치료될 환자로부터 실제로 가져올 필요는 없다. 또한, 상기 특허는 나이든 포유류의 천연 및 모노클로날 항핵 자가항체 및 모노클로날 항핵 자가항체 생성 하이브리도마 세포주를 개시한다.
미국 특허 제 5,916,561 호는 CD44 유전자의 변이체 엑손 v6 에 대한 특이적 항체, VFF-18, 및 그의 변이체를 개시한다. 상기 항체는 그것이 래트 CD44 v6 변이체보다는 인간 CD44 v6 변이체를 인지한다는 점에서 비교 항체보다 더 나은 향상이다. 또한, 상기 항체는 CD44 v6 발현을 위한 진단 어세이를 개시한다. 상기 항체에 대해 개시된 시험관 내 또는 생체 내 기능은 없었다.
미국 특허 제 5,616,468　호는 CD44 유전자의 인간 엑손 6A 에 의해 암호화되는 서열을 함유하는 합성 펩티드에 대해 생성된 모노클로날 항체, Var3.1 을 개시한다. 구체적으로는, 상기 항체는 인간 CD44 의 90 kD 형태에 결합하지 않고, Hermes-3 항체와 구별된다. CD44 의 v6 변이체의 검출 방법이 제공되며, 뿐만 아니라, 상기 항원을 바탕으로 한 악성 형질변환의 스크리닝 및 어세이 방법이 제공된다. 혈청 내 항원의 검출을 기준으로 한 염증 질환의 스크리닝 방법이 또한 제공된다.
미국 특허 제 5,879,898 호는 43 개 아미노산 펩티드를 생성하는 인간 CD44 변이체 6 의 129 bp 엑손에 결합하는 특이적 항체를 개시한다. 모노클로날 항체는 많은 하이브리도마 세포주 : MAK<CD44>M-1.1.12, MAK<CD44>M-2.42.3, MAK<CD44>M-4.3.16 에 의해서 생성된다. 항체는 신규 CD44 v6 아미노산 서열의 하나 이상의 헥사펩티드를 함유하는 융합 단백질로부터 생성된다. 추가로, 암 진단으로서 사용될 수 있는 엑손 6 변이체의 검출을 위한 면역어세이의 개시내용이 있다. 유의하게는, 개시된 상기 항체의 시험관 내 또는 생체 내 기능은 개시되어 있지 않다.
미국 특허 제 5,942,417 호는 CD44 유사 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 및 그의 변이체를 사용하는 재조합 단백질의 제조 방법을 개시한다. 항체는 이들 폴리펩타이드에 대해 요구되나, 구체적인 예도 없고, 상기 항체를 분비하는 수탁된 클론도 없다. 노던 블롯은, 다양한 유형의 조직 내에서의 폴리뉴클레오타이드의 출현을 나타내나, 상기 폴리뉴클레오타이드의 번역 및 발현이 존재한다는 수반하는 증거는 없다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 유전자 생성물에 대해 만들어지는 항체가 있었다는 증거, 이들 항체가 시험관 내 또는 생체 내 기능을 갖고 있을 거라는 증거, 및 상기의 것들이 인간 암성 질환과 관계있을 것이라는 증거가 없다.
미국 특허 제 5,885,575 호는 CD44 의 변이체 에피토프와 반응하는 항체, 및 상기 항체의 사용을 통한 변이체의 규명 방법을 개시한다. 상기 변이체를 단리된 폴리뉴클레오타이드를 래트 세포로부터 단리하였고, 상기 변이체에 대한 항체, mAb1.1ASML 는 분자량이 120 kD, 150 kD, 180 kD 및 200 kD 인 단백질을 인지한다. 모노클로날 항체 1.1ASML 의 투여는 동종 동계의 (isogenic) 래트에서 래트 BSp73ASML 의 성장 및 전이를 지연시켰다. 유의하게는 1.1ASML 은 LCLC97 인간 큰 세포 폐 암종의 반응성의 결핍으로 나타내는 바와 같이 인간 종양을 인지하지 못한다. 인간 동종체는 LCLC97 로부터 단리되었으나, 상기 동종체를 이지하는 상응하는 항체가 생성되지는 않았다. 따라서, 래트 CD44 의 변이체에 특이적인 항체가 생성되었고, 래트 종양의 성장 및 전이에 영향을 미치는 것으로 나타났더라도, 인간 종양에 대한 상기 항체의 효과에 대한 증거는 없다. 더욱 구체적으로는, 본 발명자들은 상기 항체가 인간 암을 인지하지 못하는 것을 지적한다.
발명의 개요
본 출원은 암성 질환 개질 모노클로날 항체를 암호화하는 하이브리도마 세포주를 단리하기 위해, 미국 특허 제 6,180,357 호에서 교시된 환자 특이적 항-암 항체의 제조 방법을 사용한다. 이들 항체는 하나의 종양에 대해 특이적으로 제조될 수 있고, 따라서 암 치료의 맞춤화를 가능하게 할 수 있다. 본 출원의 맥락에서, 세포-살해 (세포독성) 또는 세포-성장 억제 (세포정지성) 특성을 갖는 항암 항체를 이후 세포독성이라고 말할 것이다. 이들 항체는 암의 스테이징 (staging) 및 진단을 돕기 위해 사용될 수 있고, 종양 전이를 치료하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 또한, 예방 치료의 차원으로서 암 예방에 사용될 수도 있다. 전형적인 약물 발견 패러다임에 따라 생성되는 항체와는 달리, 본 방법에서 생성되는 항체는 이전에는 악성 조직의 성장 및/또는 생존에 없어서는 안되는 것으로 보인 분자 및 경로를 표적으로 할 수 있다. 더욱이, 이들 항체의 결합 친화성은 더 강한 친화성 상호작용을 받을 수 없는 세포독성 사건의 개시에 필요한 조건으로 맞추어진다. 또한, 본 발명의 범위 내에서 표준 화학치료 양식, 예를 들어 방사성핵종을 본 발명의 CDMAB 와 접합하여, 상기 화학치료제의 사용에 초점을 맞춘다. CDMAB 는 또한, 독소, 세포독성 부분, 효소 예를 들어 비오틴 접합된 효소, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 또는 조혈성 세포에 접합될 수 있어서, 항체 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. CDMAB 는 단독으로 또는 하나 이상의 CDMAB/화학치료제와 병용하여 사용될 수 있다.
개별화된 항-암 치료의 전망은 환자를 관리하는 방식에 변화를 가져올 것이다. 가능성있는 임상 시나리오는 제시 시 종양 샘플을 수득하고 이를 보관하는 것이다. 상기 샘플에서, 기존의 암성 질환 개질 항체의 패널로부터 종양의 유형화할 수 있다. 환자를 통상적으로 단계매길 것이나, 환자를 추가로 단계매기는데 있어서 시판의 항체를 사용할 수 있다. 환자를 기존의 항체로 즉시 치료할 수 있고, 종양에 특이적인 항체 패널을 본원에 기술된 방법을 사용하여 또는 본원에 개시된 스크리닝 방법과 함께 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 제조할 수 있다. 생성되는 모든 항체를 항-암 항체의 라이브러리에 첨가할 것인데, 그 이유는 다른 종양이 치료될 종양과 동일한 에피토프의 일부를 가질 수 있다는 가능성이 있기 때문이다. 상기 방법에 따라 생성되는 항체는 이들 항체에 결합하는 암을 가진 환자에서 암성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
항-암 항체 외에도, 환자는 다중-모달 치료 섭생의 일부로서 현재 권고되는 치료법을 받도록 선택될 수 있다. 본 방법을 통해 단리되는 항체는 비암성 세포에 대해 상대적으로 비독성인 사실은 고투여량의 항체의 병용이 단독으로, 또는 통상의 치료와 병용해서 사용될 수 있게 한다. 높은 치료 지수는 또한, 치료 내성인 세포의 출현 경향을 감소시켜야 할 단기간 스케일에서 재치료를 허용할 것이다.
환자가 치료 초기 코스 또는 전이 발달에 대해 불응성이라면, 종양에 대한 특이적인 항체의 생성 방법은 재치료를 위해 반복될 수 있다. 더욱이, 항-암 항체는 전이의 치료를 위해 환자로부터 수득된 적혈구에 접합되고 재주입될 수 있다. 보통 사멸을 초래하는 불량한 결과를 예시하는 전이성 암 및 전이에 대한 효과적인 치료가 거의 없었다. 그러나, 전이성 암은 보통 잘 혈관형성이 되고, 적혈구에 의한 항-암 항체의 전달은 종양 부위에서 항체를 집중시키는 효과를 가질 수 있다. 전이 전에조차, 대부분의 암세포는 그의 생존을 위해 숙주의 혈액 공급에 의존하고, 적혈구에 접합된 항-암 항체는 제자리 종양에 대해 효과적일 수 있다. 대안적으로, 항체는 다른 조혈성 세포, 예를 들어 림프구, 대식세포, 단핵구, 자연 살해 세포 등에 접합될 수 있다.
항체의 부류에는 5 가지가 있고, 각각은 그의 중쇄에 의해 부여되는 기능과 연관있다. 일반적으로 네이키드 (naked) 항체에 의한 암세포 살해는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 통해 매개된다고 생각된다. 예를 들어, 쥣과 IgM 및 IgG2a 항체는 보체계의 C-1 성분의 결합에 의해 인간 보체를 활성화시켜서, 종양 파쇄를 초래할 수 있는 보체 활성화의 전형적인 경로를 활성화시킬 수 있다. 인간 항체에 대해, 가장 효과적인 보체 활성화 항체는 일반적으로 IgM 및 IgG1 이다. IgG2a 및 IgG3 아이소타입의 쥣과 항체는 단핵구, 대식세포, 과립구 및 특정 림프구에 의한 세포 살해를 초래할 Fc 수용체를 갖는 세포독성 세포의 보충 시에 효과적이다. IgG1 및 IgG3 아이소타입 둘 다의 인간 항체는 ADCC 를 매개한다.
Fc 영역을 통해 매개되는 세포독성은 효과기 세포, 그의 상응하는 수용체, 또는 단백질, 예를 들어 NK 세포, T-세포 및 보체의 존재를 필요로 한다. 이들 효과기 기작의 부재 시, 항체의 Fc 부분은 불활성이다. 항체의 Fc 부분은 생체 내에서의 항체의 약물동역학에 영향을 미치는 특성을 부여할 수 있으나, 시험관 내에서는 작동하지 못하는 특성이다.
항체 매개 암 살해의 또다른 가능한 기작은 세포막 내 다양한 화학 결합의 가수분해를 촉매하도록 기능하는 항체, 및 그의 관련 당단백질 또는 당지질, 소위 촉매성 항체의 사용을 통해서일 수 있다.
항체-매개 암세포 살해의 3 가지 추가의 기작이 있다. 제 1 기작은 신체가 암세포에 존재하는 추정의 항원에 대한 면역 반응을 생성하도록 유도하기 위한, 백신으로서의 항체의 사용이다. 제 2 기작은 성장 수용체를 표적으로 하고 그의 기능을 방해하거나 또는 상기 수용체를 하향조절하여 그의 기능을 효과적으로 상실시키기 위한, 항체의 사용이다. 제 3 기작은 직접적인 세포 사멸을 초래할 수 있는 세포 표면 부분의 직접적인 연결, 예컨대 TRAIL R1 또는 TRAIL R2 와 같은 사멸 수용체의 연결, 또는 인테그린 분자 예컨대 알파 V 베타 3 등의 연결에 대한 상기 항체의 효과이다.
암 약물의 임상학적 유용성은 환자에 대한 허용가능한 위험 프로파일 하에서의 약물의 이점을 바탕으로 한다. 암 치료법에서, 생존율은 일반적으로 이점 후에 가장 고려되는 것이었으나, 생명 연장 외에도 많은 다른 잘-인지되는 이점이 있다. 치료가 생존에 부작용을 주지 않는 경우 이들 다른 이점에는 증후의 완화, 부작용에 대한 보호, 재발 또는 무질환 생존까지 걸리는 시간의 연장, 및 진행까지 걸리는 시간의 연장이 포함된다. 이들 범주는 일반적으로 허용되고, 미국 식약청 (F.D.A.) 과 같은 조절 기관 (regulatory body) 이 이들 이점을 생성하는 약물을 승인한다 (Hirschfeld 등 Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002). 이들 범주 외에도, 3 가지 유형의 이점을 예언할 수 있는 다른 종점이 있다는 것이 잘 인지된다. 부분적으로, 미국 식약청에 의해 부여되는 가속화된 승인 방법은 환자 이점을 쉽게 예상할 대리지표가 있음을 알려준다. 2003 년 말 즈음에, 상기 방법 하에 16 가지 약물이 승인되었으며, 이 중 4 가지가 전폭적인 찬성을 받았는데, 즉 후속 조사 연구에서, 대리 종점에 의해 예측되는 바와 같이 직접적인 환자 이점이 나타났다. 고형 종양에서의 약물 효과를 측정하는 하나의 중요한 종점은 치료에 대한 반응을 측정함으로써 종양 덩어리를 평가하는 것이다 (Therasse 등 Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000). 상기 평가를 위한 임상 범주 (RECIST 범주) 는 국제적인 암 전문가 그룹인 [Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group] 에 의해 공표되었다. RECIST 범주에 따른 객관적인 반응에서 나타나는 바와 같이, 종양 덩어리에 대한 기술된 효과를 갖는 약물은 적절한 대조군과 비교해 궁극적으로는 직접적인 환자 이점을 생성하는 경향이 있다. 예비임상 세팅에서, 종양 덩어리는 일반적으로 더욱 직접적으로 평가 및 문서화된다. 예비임상연구가 임상 세팅으로 번역될 수 있다는 점에서, 예비임상 모델에서 연장된 생존을 제공하는 약물은 가장 큰 기대할만한 임상 유용성을 갖는다. 임상 치료에 대한 양성적인 반응을 생성하는 것과 유사하게, 예비임상 세팅에서 종양 덩어리를 감소시킨 약물은 또한, 질환에 대한 유의한 직접적인 효과를 가질 수 있다. 생존의 연장이 암 약물 치료에서의 임상적인 결과 후에 가장 고려되는 것이더라도, 임상적 유용성을 갖는 다른 이점이 있고, 질환 진행에 있어서의 지연과 상호연관있을 수 있는 종양 덩어리 감소는 생존을 연장시킬 수 있다는 이점, 또는 둘 다는 직접적인 이점을 초래할 수 있고 임상적인 영향을 가질 수 있다 (Eckhardt 등 Developmental Therapeutics : Successes 및 Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds ; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, pages 209-219).
실질적으로 미국 특허 제 6,180,357 호의 방법을 사용하여, 마우스 모노클로날 항체 H460-16-2 는 환자의 폐 종양 생검 및 NCI-H460 폐암 세포주 둘 다의 세포로 마우스를 면역화시켜서 수득하였다. H460-16-2 항원은 상이한 조직 기원의 다양한 범위의 인간 세포주의 세포 표면상에 발현되었다. 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 피부암 세포주 A2058 은 시험관 내에서의 H460-16-2 의 세포독성 효과를 받기가 쉬웠다.
마우스에 이식하였을 때, 배양액에서의 MDA-MB-231 세포에 대한 H460-16-2 세포독성의 결과를 이들 암세포에 대한 항-종양 활성에 의해 추가로 증진시켰다 (S.N. 10/603,000 에서 개시된 바와 같이). 예비임상 이종 이식 종양 모델은 치료 효능의 유효한 예측자로서 간주된다.
인간 유방암의 예방 생체 내 모델에서, H460-16-2 치료는 아이소타입 대조군 항체보다 치료 기간 동안 종양 성장의 억제에 있어서 유의하게 (p < 0.0001) 더 효과적이었다. 치료 상 (phase) 이 끝날 즈음에, H460-16-2 를 투여받은 마우스는 대조군의 1.3% 정도로만 자란 종양을 가졌다. 후 치료 후속 기간 동안에, H460-16-2 의 치료 효과는 지속되었고, 치료된 군의 평균 종양 부피는 계속해서 측정 시기의 종료시까지 대조군보다 유의하게 더 작았다. 항체 효능의 측정으로서 생존율을 사용하여, H460-16-2 치료군의 사망 위험도가 70 일 후-치료 시에 항체 완충액 대조군 (p=0.028) 의 약 71% 인 것으로 평가되었다. 이들 데이타는, H40-16-2 치료가 대조군 치료군에 비해 생존 이점을 부여한다는 것을 지시하였다. H460-16-2 치료는 안전한 것으로 보였는데, 그 이유는 상기 치료가 체중 감소 및 임상적 피로를 포함한 독성의 임의의 증상을 유도하지 않았기 때문이다. 따라서, H460-16-2 치료는 그것이 인간 유방암의 잘 구축된 모델에서 대조군 치료군과 비교해 종양 성장을 지연시키고 생존율을 증대시켰기 때문에 효과적이었다.
또한, H460-16-2 는 구축된 생체 내 종양 모델에서 MDA-MB-231 세포에 대한 항-종양 활성을 나타내었다 (S.N. 10/603,000 에서 개시된 바와 같이). H460-16-2 를 사용한 치료는 표준 화학치료 약물인 시스플라틴과 비교되었고, 시스플라틴 및 H460-16-2 치료군은 항체 희석 완충액 또는 아이소타입 대조군 항체로 치료된 군과 비교해 유의하게 (p < 0.001) 더 작은 평균 종양 부피를 가졌던 것으로 나타났다. H460-16-2 치료는 시스플라틴 화학치료의 대략 2/3 정도인 종양 억제를 매개하였는데, 그러나 시스플라틴 치료에서는 관찰되었던 2 개의 치료-관련 사멸을 포함하여 유의한 (19.2%) 체중 감소 (p < 0.003) 및 임상적 피로는 없었다. H460-16-2 의 항-종양 활성 및 그의 최소의 독성은 이를 매력적인 항암 치료제가 되게 한다.
또한, 후 치료 기간에서, H460-16-2 는 유의한 생존 이점 (p < 0.02) 을 보여주었는데, 치료 후 70 일이 넘었을 때의 H460-16-2 군에서의 사망 위험도는 아이소타입 대조군 항체군의 사망 위험도의 약 절반이었다. 관찰된 생존 이점은 치료 후 120 일째가 지나도록 계속되었으며, 여기서, 아이소타입 대조군 및 시스플라틴 치료 마우스의 100% 는 사망하였고, 이와 비교해 H460-16-2 치료군은 67% 가 사망하였다. H460-16-2 는 아이소타입 대조군 항체군과 비교해 26% 까지 종양 성장을 지연시킴으로써 종양 억제를 매개하였다. 치료 후 31 일째에, H460-16-2 는 아이소타입 대조군과 비교해 48% 까지 종양 성장을 감소시킴으로써, 종양 크기를 제한하였으며, 이는 치료 종료 시에 관찰된 49% 감소에 상응한다. 구축된 유방암 종양 모델에서, 이러한 결과는, 치료 기간을 넘어서도 종양 억제를 유지하는 H460-16-2 의 잠재력을 지시하였고, 포유류에서 종양 덩어리를 감소시키고 생존을 증대시키는 항체의 능력을 나타내었다.
유방암의 구축된 생체 내 종양 모델에서의 유리한 효과 외에도, 화학치료 약물 (시스플라틴) 와 병용한 H460-16-2 치료는 구축된 생체 내 전립선암 모델에서 PC-3 세포에 대해 항-종양 활성을 나타내었다 (S.N. 10/810,165 에서 개시된 바와 같이). 페어드 t-테스트 (paired t-테스트) 를 사용해, H460-16-2 + 시스플라틴 치료가 완충액 대조군 (p < 0.0001), 시스플라틴 치료 단독 (p=0.004) 또는 H460-16-2 치료 단독 (p < 0.0001) 보다 치료 기간 후에 짧게 종양 성장을 억제하는데 유의하게 더욱 효과적이었다. 치료 기간 종료 시에, H460-16-2 + 시스플라틴을 받은 마우스의 종양은 완충액 대조군의 단지 28.5% 정도로만 자랐다. PC-3 SCID 이종 이식 모델에 대해서, 체중은 질환 진행의 대리 지시자로서 사용될 수 있다. 모든 군의 마우스는 심각한 체중 감소를 겪었다. 상기 연구에서, 모든 군의 마우스는 치료 기간의 종료 시까지 대략 23% 내지 35% 의 체중 감소를 나타내었다. H460-16-2 처리군이 가장 작은 정도의 체중 감소를 나타내었다 (21.7%). 치료 후, 48 일째에, 완충액 대조군 (p=0.5042) 과 비교해 H460-16-2 및 시스플라틴의 치료와 관련하여서는 체중 감소가 유의하게 증가되지 않았다. 따라서, H460-16-2 + 시스플라틴 치료는 인간 전립선 암의 잘-구축된 모델에서 아이소타입 대조군 치료군과 비교해 종양 성장을 지연시켰기 때문에, 효과적이었다.
약물 표적으로서 H460-16-2 에피토프를 입증하기 위해, 정상 인간 조직 내 H460-16-2 항원의 발현을 이미 측정하였다 (S.N. 10/603,000). 상기 작업은 항-CD44 항체 ; 클론 L178 (S.N. 10/647,818, 현재는 미국 특허 제 7,189,397 호에 개시됨) 및 클론 BU75 (S.N. 10/810,165 에 개시됨) 와 비교해서 확장되었다. H460-16-2 를 사용한 IHC 염색에 의해 확인한 바, 간, 신장 (관 외피 세포의 가장자리 염색 제외), 심장 및 폐와 같은 중요 기관의 세포를 포함하여 대부분의 조직은 H460-16-2 항원을 발현하지 않았다. 조직 염색 결과는 H460-16-2 가 다양한 세포 유형에의 결합을 제한하였으나, 대식세포, 림프구, 및 섬유아세포를 침윤하는 결합을 가졌음을 나타내었다. BU75 항체는 유사한 염색 패턴을 나타내었다. 그러나, 한 가지 이상의 차이점이 있었는데 ; 림프구 염색은 H460-16-2 와 비교해 BU75 에서 더욱 짙었다.
H460-16-2 항원의 위치화 및 군집, 예를 들어 유방암 환자 중에서의 그의 퍼짐 (prevalence) 을 측정하는 것은 H460-16-2 의 치료 용도를 평가하고 효과적인 임상 시도를 디자인하는데 중요하다. 암 환자의 유방 종양에서의 H460-16-2 항원 발현을 어드레스 (H460-16-2 항원 발현) 하기 위해, 50 명의 개별 유방암 환자의 종양 조직 샘플을 이미 H460-16-2 항원의 발현에 대해 스크리닝하고 (S.N. 10/603,000), L178 (S.N. 10/647,818, 현재 미국 특허 제 7,189,397 호), BU75 (S.N. 10/810,165) 및 항-Her2 항체 c-erbB-2 (S.N. 10/810,165) 와 비교하였다. 이들 연구의 결과는 유사하였고, 조직 샘플의 62% 는 H460-16-2 항원에 대해 양성으로 염색되었고, 한편 유방 종양 조직의 73% 는 BU75 에피토프에 대해 양성이었다. 환자 샘플 내에서의 H460-16-2 의 발현은 암세포에 특이적인 것으로 나타났는데, 이는 염색이 악성 세포에 제한되었기 때문이었다. H460-16-2 는 유방암 환자의 정상 조직의 10 개의 샘플 중 4 개에 염색된 한편, BU75 는 8 개에 염색되었다. H460-16-2 및 BU75 항원 둘 다의 유방 종양 발현은 악성 세포의 세포막에 주로 위치하는 것으로 보였고, 이는 CD44 를 치료를 위한 매력적인 표적이 되게 하였다. 유방 종양의 발달, 치료 및 진단에 있어서 중요한 역할을 하는 호르몬 에스트로겐 및 프로게스테론에 대한 수용체의 유방 종양 발현을 바탕으로 H460-16-2 발현을 추가로 평가하였다. H460-16-2 항원의 발현 및 에스트로겐 또는 프로게스테론의 수용체의 발현 사이에는 관계가 분명히 나타나지 않았다. 종양이 그의 단계, 또는 암이 진행되는 정도를 바탕으로 분석되었을 때, 다시 H460-16-2 항원 발현 및 종양 단계 간에 뚜렷한 관계가 없었다. BU75 를 사용해 유사한 결과를 수득하였다. c-erbB-2 와 비교해, H460-16-2 는 완전히 상이한 염색 프로파일을 나타내었는데, 여기서, H460-16-2 항원에 대해 양성이었던 유방 종양 조직 샘플 중 52% 가 Her2 발현에 대해서는 음성이었고, 이는 아직까지 충족되지 못한 표적화된 치료가 유방암 환자에 필요함을 지시한다. 또한, H460-16-2 및 Her2 둘 다에 대해 양성이었던 유방 종양 조직 섹션 간에 염색의 강도에 차이가 있었다. c-erbB-2 항체는 또한, 정상 유방 조직 섹션 중 하나를 양성으로 염색시켰다.
H460-16-2 항원의 추가의 위치화 및 그의 군집 내에서의 예컨대 전립선 암 환자에서의 퍼짐의 측정을 S.N. 11/364,013 에서 개시하였다. 53 개의 인간 전립선 종양 및 3 개의 정상 전립선 조직에의 항체 결합을 인간, 전립선 정상 및 종양 조직 마이크로어레이 (Imgenex, San Diego, CA) 를 사용해 수행하였다. S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같이, 19/53 (36%) 의 테스트된 종양이 H460-16-2 에 대해 양성이었다. H460-16-2 는 종양 세포 및 기질 섬유아세포에 대해 특이적이었다. 세포 위치화는 대부분 루멘 위치화가 있거나 또는 없이 막성 또는 세포질 막성이었다. 양성 세포의 % 는 10% 미만 내지 50% 초과의 범위였으며, 이는 항체가 종양 세포에 비균질하게 결합함을 가리킨다. 종양 단계와 항체 결합 간의 관계는 상이한 종양 단계 중에서 종양의 수의 불일치로 인해 적절하게 평가될 수 없었는데, I, II, III 및 IV 기 종양 각각에 대해 1/1 (100%), 4/12 (33%), 0/2 (0%) 및 11/33 (33%) 였다. G1 ~ G2 (25%) 보다 Gleason 스코어 G3 ~ G4 (36%) 에의 결합이 더 높았다. 모든 3 개의 정상 전립선 조직 섹션은 항체에 대해 양성이었다. 그러나, 조직 특이성은 근상피 및 기질 섬유아세포에 대해서였고, 샘상피를 스페어하였다 (glandular epithelium). H460-16-2 의 테스트된 전립선 종양에의 결합의 불균일성이 있었는데 : 10/53, 6/53, 3/53 양성 종양은 각각 < 10 ~ 10%, < 50 ~ 50% 및 > 50% 의 범주에 있었다. 전립선 암세포에의 결합 결과, H460-16-2 의 치료 이점은 잠재적으로 전립선 암의 치료에까지 확장될 수 있다.
H460-16-2 항원의 추가의 위치화 및 그의 군집 내에서의 예컨대 간암 환자에서의 퍼짐의 측정을 S.N. 11/364,013 에 개시하였다. H460-16-2 항체는 테스트된 간암의 21/49 (43%) 에의 결합을 나타내었고, 이에는 11/37 (30%) 의 1 차, 7/8 (88%) 의 전이성 간세포 암종, 1/2 (50%) 의 1 차 및 2/2 (100%) 의 전이성 담관암종이 포함되었다. 항체는 I 및 II 기보다 III 및 IV 기의 발전된 종양에 대해 유의하게 더 높은 결합을 나타내었다 (p = 0.03) [I 기, 0/2 (0%) ; II 기, 2/17 (12%) ; III 기, 8/16 (50%) 및 IV 기, 6/8 (75%)]. H460-16-2 는 종양 세포 및 침윤하는 염증 세포에 대해 특이적이었다. 세포 위치화는 주로 막성이었다. 일부 종양은 또한 산란성 세포질 염색 패턴을 나타내었다. 항체는 비-신생물성 간 조직의 9/9 에 결합하였다. 그러나, 상기 결합은 동모양혈관 세포 및 침윤하는 림프구에 제한되었다. H460-16-2 항원은 발전된 간 종양 조직상에서 특이적으로 발현되는 것으로 보인다. 따라서, H460-16-2 는 간암 치료에 있어서 치료 약물로서 잠재성을 가진다.
H460-16-2 의 잠재적 치료 이점을 추가로 확장시키기 위해, 다양한 인간 암 조직 내 항원의 빈도 및 위치화를 또한 이미 측정하였고 (S.N. 10/603,000), 클론 L178 과 비교하였다 (S.N. 10/647,818, 현재 미국 특허 제 7,189,397 호). 이들 종양 유형의 대다수가 또한 L178 항원에 대해 양성이었다. 인간 유방 종양 조직과 함께, H460-16-2 및 L178 위치화는 종양 세포의 막 상에서 발생하였다. 그러나, H460-16-2 항체와 비교해 L178 을 사용한 막 위치화가 실질적으로 더 많았다. 또한, H460-16-2 및 L178 둘 다에 의해 염색되었던 종양 유형 중에서, 43%의 조직이 L178 항체를 사용했을 때 더 높은 염색 강도를 나타내었다.
문헌의 IHC 데이타와의 비교를 바탕으로 본원에서 제시되는 IHC 데이타와 정확히 일치하는 CD44 의 형태는 없는 것으로 보인다. CD44 의 표준 형태는 정상적으로는 인간 뇌에서 발현되는데 ; H460-16-2 항원은 아니다. 팬(pan)-CD44 아이소폼에 대한 항체는 간을 염색하지 않고 (쿠퍼 (Kuppfer) 세포 포함), 재생 주기의 모든 단계에 있는 자궁내막샘을 양성으로 염색한다. H460-16-2 항원은 쿠퍼 세포 상에 뚜렷이 존재하고, 재생 주기의 분비성 자궁내막샘 상에만 존재한다. H460-16-2 항원은 조직 대식세포 상에 뚜렷이 존재하고, 변이체 형태 V4/5 및 V8/9 만이 간헐적인 대식세포 염색을 나타낸다. 항-CD44 L178 및 현재의 BU75 와 비교한 H460-16-2 를 사용한 유사한 그러나 별개의 결합 패턴은 H460-16-2 항원이 CD44 의 독특한 에피토프임을 지시한다.
이전에 개시된 바와 같이 (S.N. 10/647,818, 현재 미국 특허 제 7,189,397 호), 추가의 생화학 데이타는 또한, H460-16-2 에 의해 인지되는 항원이 CD44 의 형태 중 하나라는 것을 지시한다. 이는 CD44 에 대한 모노클로날 항체 (L178) 반응성이 면역침전에 의해 H460-16-2 에 결합된 단백질을 규명한다는 것을 보여주는 연구에 의해 지지된다. 웨스턴 블로팅 연구는 또한, H460-16-2 에 의해 인지되는 CD44 의 에피토프가 v6 또는 v10 상에 존재하지 않음을 제시한다. H460-16-2 에피토프는 또한 탄수화물이고 형태 의존성이라는 점에 의해서 구별되고, 여기서, 많은 항-CD44 항체는 CD44 의 펩티드 부위에 대한 것이다. 이들 IHC 및 생화학 결과는 H460-16-2 가 CD44 항원의 변이체에 결합한다는 것을 보여준다. 다라서, 다수의 증거는 H460-16-2 가 CD44 의 변이체 상에 존재하는 독특한 탄수화물 의존성 형태 에피토프의 연결을 통해 항-암 효과를 매개한다는 것을 보여준다. 본 발명의 목적을 위해, 상기 에피토프는 "CD44 항원성 부분" 이라고 정의되며, 하이브리도마 세포주 H460-16-2 에 의해 암호화되는 모노클로날 항체, 그의 항원성 결합 절편, 그의 항원성 결합 리간드 또는 그의 항체 컨쥬게이트와 결합하는 능력을 특징으로 한다.
H460-16-2 의 항-암 효과를 넘어서는 기작을 추가로 설명하기 위해, 히알루론산 (HA) 결합 어세이를 수행하였다 (S.N. 10/810,165 에 개시된 바와 같음). MDA-MB-231 세포가 HA 에 부착하는 것을 50% 만큼 억제시키기 위해서는 평균 농도 1.87 (+/- 1.01) ㎍/mL 의 H460-16-2 이 필요하였음이 측정되었다. 이러한 결과는, H460-16-2 가 적어도 부분적으로, HA 에의 결합에 관여하는 CD44 상의 영역(들) 과 상호작용하고, 결과적으로 ECM 을 통한 혈관신생 또는 종양 침윤성의 하향 조절을 통해 그의 항-암 효과를 매개할 수 있음을 지시한다.
HA 결합 어세이 외에도, 세포 주기 실험을 수행하여, H460-16-2 시험관 내 및 생체 내 항-암 효과가 세포 주기의 조절로 인한 것인지 확인하였다 (S.N. 10/810,165 에서 개시된 바와 같음). 24 시간 및 H460-16-2 의 20 ㎍/mL 를 사용한 후에, 아이소타입 대조군과 비교해 MDA-MB-231 세포자살 세포의 수에서 증가가 있었다. 상기 효과는 또한 투여량 의존적인 것으로 나타났다. 따라서, H460-16-2 의 효능은 전체적으로 또는 부분적으로, 그의 세포자살 유도능력에 의한 것일 것이다.
H460-16-2 에 대한 작용 기작을 추가로 설명하기 위해, 유방암 이종 이식 모델에서 생체 내 성장한 MDA-MB-231 종양에서의 세포자살에 대한 H460-16-2 치료 효과를 수행하였다 (S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같음). ApoTag 염색된 종양의 단계 섹션을 이어서, H & E 염색하고, 염색사가 빡빡하게 응축 (compaction) 되는 것과 같은 형태학적 기준을 사용하여 이를 세포자살 세포에 대해 시험하였다. 상기 기준을 충족시키는 세포의 계수를 상기 섹션에서 기술된 바와 같이 수행하여, 치료균에 대한 평균 계수를 수득하였다. 완충액 대조군은 평균 총 스코어가 17 개의 세포 (± 5.29) 로 수득되었으며, 한편, H460-16-2 치료군은 평균 총 스코어가 22.5 세포 (± 4.20) 로 수득되었다. 따라서, 세포 형태학을 사용하여 측정된 바와 같이, H460-16-2 치료를 사용해 세포자살이 증가되는 경향이 있다.
항체 키메라의 제조를 유용하게 하기 위해, 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역을 암호화하는 유전자를 따로 클로닝하고 서열화하였다 (S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같음). 다음, 인간 IgG1 및 IgG2 아이소타입의 H460-16-2 키메라 경쇄 및 중쇄를 구축하고 발현시켰다 (S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같음).
키메라 항체 대 쥣과 항체의 상대적인 효능을 측정하기 위해, 인간 유방암 생체 내 모델을 수행하였다 (S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같음). 쥣과 H460-16-2 및 (ch)ARH460-16-2-IgG1 둘 다 구축된 인간 유방암MDA-MB-231 생체 내 모델에서 종양 성장을 감소시켰다. 62 일째에, 마지막 투여 후 5 일째에, H460-16-2 를 사용한 치료는 39% (평균 T/C = 57%) 의 종양 성장 억제를 초래하였다. 이러한 종양 성장의 감소는 대조군과는 유의하게 상이하였다 (p = 0.0037). 키메라 항체 (ch)ARH460-16-2-IgG1 은 64% 라는 증가된 종양 성장 억제를 초래하였다 (평균 T/C = 26.9%; p < 0.0001). 반대로, 키메라 항체의 IgG2 버전인 (ch)ARH460-16-2-IgG2 는 완충액 대조군과 비교해 종양 성장 억제를 나타내지 않았다 (종양 성장 억제 = 0%; 평균 T/C = 122%; p=0.7264). 연구 동안에 독성의 임상학적 증후는 없었다. 요약하자면, (ch)ARH460-16-2-IgG1 은 MDA-MB-231 유방암 모델에서 쥣과 항체에 비해 동일하거나 또는 더 큰 효능을 나타내었다.
아넥신-V (Annexin-V) 염색을 이전에 수행하여 (S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같음), H460-16-2 의 키메라 버전이 MDA-MB-231 인간 유방암세포주 상의 쥣과 대응물과 동일한 방식으로 세포자살을 유도할 수 있었는지를 알아보았다. 3 가지 항체 모두 그의 예상되는 아이소타입 대조군보다 세포괴사 및 세포괴사/세포자살 집단 % 에서 투여량-의존성 증가를 나타내었다. 세포괴사 및 세포괴사/세포자살 집단 % 의 가장 큰 증가는 (ch)ARH460-16-2-IgG2 를 사용했을 때 관찰되었고, 그 다음으로는 (ch)ARH460-16-2-IgG1 을 사용했을 때, 그 다음은 H460-16-2 를 사용했을 때 관찰되었다.
전체적으로, 상기 데이타는 H460-16-2 항원이 암 연관 항원이고, 인간에서 발현되고, 병리학적으로 관련있는 암 표적임을 나타낸다. 추가로, 상기 데이타는 또한, H460-16-2 항체가 인간 암 조직에 결합하는 것을 나타내고, 진단, 치료 예측, 또는 진단일 수 있는 어세이를 위해 적절히 사용될 수 있다. 또한, 상기 항원의 세포막 위치화는 대부분의 비악성 세포에서의 항원 발현의 결핍으로 인한 세포의 암 상태의 지표이고, 상기 관찰은 상기 항원, 그의 유전자 또는 유도체, 그의 단백질 또는 그의 변이체를 진단, 치료 예측 또는 예후일 수 있는 어세이에 사용되는 것을 허용한다.
항-CD44 항체의 사용을 포함하는 다른 연구는 H460-16-2 에 의해 나타나지 않는 치료 잠재성의 제한을 갖는다. H460-16-2 는 시험관 내 및 생체 내 항-종양 활성 둘 다를 갖는다. MAK<CD44>M-1.1.12, MAK<CD44>M-2.42.3 및 MAK<CD44>M-4.3.16 과 같은 이미 기술된 항체는 그들에 대해 기술된 시험관 내 또는 생체 내 세포독성을 갖고 있지 않으며, VFF-18 및 Mab U36 은 내인성 종양 세포독성을 나타내지 않는다. 또한, 생체 내 종양 효과를 나타내는 다른 항-CD44 항체도 H460-16-2 를 사용해서 분명히 나타나지 않는 특정 제한을 갖는다. 예를 들어, ASML1.1, K926, 항-CD44s 및 IM-78.1 은 각각 이종 이식 모델에서 성장한 래트, 쥣과, 래트 및 쥣과 종양에 대하여 생체 내 항-종양 활성을 갖는다. H460-16-2 는 인간 암 모델에서 항-종양 활성을 나타낸다. H460-16-2 는 또한, 인간 CD44 에 대한 것인 한편, ASML1.1 과 같은 항체는 래트 CD44 만을 인지한다. 클론 515 항-CD44 항체는 인간 난소 세포주의 복막 종양 이식을 억제하지 않으나, 종양 성장을 예방 또는 억제하지 않는다. H460-16-2 는 SCID 마우스 이종 이식 모델에서 인간 유방 종양 성장을 억제시킬 수 있다. GKW.A3 는 구축된 모델이 아닌 예방 모델에서 마우스에서 성장한 인간 전이성 골수종의 종양 성장을 억제시킬 수 있는 항-인간 CD44 모노클로날 항체를 기술한다. H460-16-2 는 인간 유방암의 예방 및 구축 쥣과 이종 이식 모델 둘 다에서 유의한 항-종양 활성을 나타내었다. 결과적으로는, H460-16-2 는 이미 기술된 항-CD44 항체와 비교해 탁월한 항-종양 특성을 가진다는 것이 꽤 분명하다. 이는 SCID 마우스에서의 인간 유방 종양에 대한 시험관 내 및 생체 내 항-종양 활성 둘 다를 나타내었고, 인간 CD44 에 관한 것이다. 또한, 인간 유방암의 예방 및 구축 (더욱 임상학적으로 관계있는) 모델에서 활성을 나타내고, 인간 전립선 암의 구축 모델에서 시스플라틴을 사용한 활성을 나타낸다.
본 발명은 H460-16-2, 그의 상응하는 키메라 항체, (ch)ARH460-16-2-IgG1 및 (ch)ARH460-16-2 (VK0VH0), 및 그의 상응하는 인간화된 항체 변이체, (hu)ARH460-16-2 의 발달 및 사용을 기술한다. H460-16-2 는 그의 효과, 세포독성 어세이, 종양 성장 모델 및 암성 질환을 겪는 포유류에서의 생존 시간 연장에 의해 규명되었다. 본 발명은 암 치료 분야에서 진보를 나타내고, 여기서, 우선 표적 분자인 CD44 상에 존재하는 에피토프 또는 에피토프들에 특이적으로 결합하고 또한 네이키드 항체로서 정상 세포가 아닌 악성 종양 세포에 대해 시험관 내 세포독성을 가지며, 또한, 네이키드 항체로서 인간 암 생체 내 모델에서 종양 성장 억제 및 생존 연장 증대를 직접 매개하기도 하는 시약을 기술한다. 이는 임의의 다른 이미 기술된 항-CD44 항체와 관련한 진보로서, 다른 어떤 것도 유사한 특성을 가진 것으로 보이지 않았기 때문이다. 또한, 이는 분야 발전을 제공하기도 하는데, 그 이유는 무엇보다도 특정 유형의 종양의 성장 및 발달과 관련된 사건에서 CD44 의 직접적인 관여를 분명하게 기술하기 때문이다. 이는 또한 암 치료법에서의 진보를 나타내는데, 그 이유는 인간 환자에서 유사한 항암 특성을 나타내는 잠재력을 갖고 있기 때문이다. 추가의 진보는, 항-암 항체의 라이브러리에 이들 항체를 포함하는 것이 상이한 항-암 항체의 적절한 병용의 측정에 의해, 상이한 항원 마커를 발현하는 종양을 표적화하는 가능성을 증대시켜, 종양의 표적화 및 성장 및 발달의 억제에 가장 효과적일 것임을 발견한 것이다.
종합하면, 본 발명은 치료제를 위한 표적으로서, 투여된 경우 포유류에서 항원 발현 암의 종양 덩어리를 감소시킬 수 있고, 또한, 치료되는 포유류의 생존을 연장시킬 수 있는 H460-16-2 항원의 사용을 교시한다. 본 발명은 또한, 포유류에서 항원 발현 암의 종양 덩어리를 감소시킬 수 있고, 또한, 치료되는 포유류의 생존을 연장시킬 수 있는 CDMAB (H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG1, (ch)ARH460-16-2 (VK0VH0) 및 (hu)ARH460-16-2 의 변이체), 및 그의 유도체, 및 그의 항원 결합 절편, 및 그의 세포 세포독성 유도 리간드의 사용을 교시한다. 더욱이, 본 발명은 또한, H460-16-2 항원을 발현하는 종양을 가진 포유류의 진단, 치료 예측, 및 예후에 사용될 수 있는 암성 세포 내 H460-16-2 항원의 검출 사용을 교시한다.
따라서, 하이브리도마 세포주 및 그의 상응하는 단리된 모노클로날 항체 및 상기 하이브리도마 세포주가 암호화되는 항원 결합 절편을 단리하기 위해, 특정 개인, 또는 하나 이상의 특정 암세포주로부터 유래되는 암성 세포에 대해 키워진 암성 질환 개질 항체 (CDMAB) 의 제조 방법을 유용하게 하는 것이 본 발명의 목적이며, CDMAB 는 암세포에 대해서는 세포독성이나 비-암성 세포에 대해 상대적으로 비독성이다.
본 발명의 추가의 목적은 암성 질환 개질 항체, 리간드 및 그의 항원 결합 절편을 교시하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 세포독성이 항체 의존성 세포 독성을 통해 매개되는 암성 질환 개질 항체를 제조하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 세포독성이 보체 의존성 세포 독성을 통해 매개되는 암성 질환 개질 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 세포독성이 세포 화학 결합의 가수분해를 촉매하는 능력의 기능인 암성 질환 개질 항체를 제조하는 것이다.
본 발명의 더욱 추가의 목적은 암의 진단, 예후, 및 모니터링을 위한 결합 어세이에 유용한 암성 질환 개질 항체를 제조하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 분명히 나타날 것이며, 여기서, 본 발명의 예시 및 실시예, 특정 구현예에 의해 나타난다.
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도 1 은 구축된 인간 유방암 MDA-MB-468 암 모델에서의 종양 성장에 대한 H460-16-2 의 효과를 나타낸 것이다. 수직의 점선은 항체를 복막 내 투여한 동안의 기간을 지시한다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 를 나타낸다.
도 2 는 구축된 MDA-MB-468 유방암 모델에서의 마우스 체중에 대한 H460-16- 2 의 효과를 나타낸 것이다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 를 나타낸다.
도 3 은 구축된 인간 PC-3 전립선 암 모델에서의 종양 성장에 대한 H460-16-2 의 효과를 나타낸 것이다. 수직의 점선은 항체를 복막 내 투여한 동안의 기간을 지시한다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 를 나타낸다.
도 4 는 구축된 PC-3 전립선 암 모델에서의 마우스 체중에 대한 H460-16-2 의 효과를 나타낸 것이다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 를 나타낸다.
도 5 는 구축된 인간 유방암 (MDA-MB-231) 모델에서의 종양 성장에 대한 투여량-의존성 방식으로 (ch)ARH460-16-2-IgG1 의 효과를 나타낸다. 수직의 점선은 항체를 복막 내 투여한 동안의 기간을 지시한다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 를 나타낸다.
도 6 은 구축된 MDA-MB-231 유방암 모델에서의 마우스 체중에 대한 (ch)ARH460-16-2-IgG1 의 효과를 나타낸 것이다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 를 나타낸다.
도 7 은 인간 결장 종양 조직 마이크로어레이에 대한 H460-16-2 결합의 요약이다.
도 8 은 H460-16-2 (A) 또는 아이소타입 대조군 항체 (B) 를 사용해 수득된 결장 종양 조직에 대한 결합 패턴을 나타내는 대표적인 현미경 사진이다. 배율은 200 배이다.
도 9 는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 조직 마이크로어레이에 대한 (ch)ARH460-16-2-IgG1 결합의 요약이다.
도 10 은 인간 비장 (백색 덩어리) (A) 및 사이노몰구스 원숭이 비장 (백색 덩어리) (B) 에 대한 (ch)ARH460-16-2-IgG1 을 사용한 결합 패턴을 보여주는 대표적인 현미경 사진이다. 염색은 2 가지 종을 사용해 관찰하였다. 배율은 40 배이다.
도 11 은 상이한 1 차 항체 용액을 사용해 프로브된 500 ㎍ 의 MDA-MB-231 막 단백질의 웨스턴 블롯이다. 레인 1 ~ 5 는 각각 2 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 또는 1000 ㎍/mL 의 비-비오틴화된 H460-16-2 와 혼합된 비오틴화된 H460-16-2 로 프로브되었다. 레인 6 ~ 10 은 각각 2 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 또는 1000 ㎍/mL 의 비-비오틴화된 AR37A335.8 과 혼합된 비오틴화된 H460-16-2 로 프로브되었다. 레인 11 ~ 15 는 각각 2 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 또는 1000 ㎍/mL 의 비-비오틴화된 1B7.11 과 혼합된 비오틴화된 H460-16-2 로 프로브되었다.
도 12 는 상이한 1 차 항체 용액으로 프로브된 500 ㎍ 의 MDA-MB-231 막 단백질의 웨스턴 블롯이다. 레인 1 ~ 5 는 각각 2 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 또는 1000 ㎍/mL 의 비-비오틴화된 H460-16-2 와 혼합된 비오틴화된 AR37A335.8 로 프로브되었다. 레인 6 ~ 10 은 각각 2 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 또는 1000 ㎍/mL 의 비-비오틴화된 AR37A335.8 과 혼합된 비오틴화된 AR37A335.8 로 프로브되었다. 레인 11 ~ 15 는 각각 2 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 또는 1000 ㎍/mL 의 비-비오틴화된 8B1B.1 과 혼합된 비오틴화된 AR37A335.8 로 프로브되었다.
도 13 은 AR37A335.8 의 결합 친화성을 나타낸 것이다. 정제된 재조합 인간 CD44 에 대한 항체의 결합에 대한 해리 상수를 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다.
도 14 는 인산화가 (ch)ARH460-16-2-IgG1 를 사용한 MDA-MB-231 세포의 처리 및 이어서 혈청 및 보충제 자극에 의해 영향을 받은 RTK 의 목록이다.
도 15 는 경쇄의 PCR 증폭에 사용된 프라이머이다.
도 16 은 중쇄의 PCR 증폭에 사용된 프라이머이다.
도 17 은 마우스 H460-16-2 VH 서열이다.
도 18 은 마우스 H460-16-2 VL 서열이다.
도 19 는 키메라 및 변이체 인간화된 H460-16-2 VH 서열의 생성에 사용되는 올리고뉴클레오타이드이다.
도 20 은 키메라 및 변이체 인간화된 H460-16-2 VL 서열의 생성에 사용되는 올리고뉴클레오타이드이다.
도 21 은 pANT18 발현 벡터이다.
도 22 는 인간화된 H460-16-2 VH 변이체이다. CDR 은 밑줄 그어져 있다.
도 23 은 인간화된 H460-16-2 VL 변이체이다. CDR 은 밑줄 그어져 있다.
도 24 는 H460-16-2 의 키메라 및 인간화된 변이체에 대한 결합 데이타이다.
도 25 는 쥣과 H460-16-2, 및 인간화된 변이체, (hu)ARH460-16-2 변이체 HV1/KV1 및 (hu)ARH460-16-2 변이체 HV2/KV1 의 결합 친화성이다. 항체의 정제된 재조합 인간 CD44 에의 결합에 대한 해리 상수는 표면 플라즈몬 공명에 의해 평 가하였다.
발명의 상세한 설명
일반적으로, 하기 단어 또는 구는 요약, 상세한 설명, 실시예 및 청구항에서 사용되는 경우 지시된 정의를 갖는다.
용어 "항체" 는 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는 예를 들어, 단일 모노클로날 항체 (아고니스트, 안타고니스트, 및 중성화 항체, 탈면역화된, 쥣과, 키메라 또는 인간화된 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 단일-사슬 항체, 다이아바디 (diabody), 트리아바디 (트리아바디), 면역컨쥬게이트 및 항체 절편을 포함한다 (하기 참조).
본원에 사용된 바와 같이 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종성 항체의 군집으로부터 수득된 항체, 즉, 군집을 포함하는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 항체를 말한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원성 부위에 대한 것이다. 더욱이, 상이한 결정소 (에피토프) 에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정소에 대한 것이다. 그의 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않도록 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 개질제 "모노클로날" 은 항체가 실질적으로 동종성 군집에서 수득되기 때문에 항체의 특징을 지시하고, 특정 방법에 의해 항체의 제조를 요구하는 것으로 간주되는 것이 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 먼저 [Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)] 에서 기술 된 하이브리도마 (쥣과 또는 인간) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호 참조) 에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체" 는 또한, 예를 들어, [Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)] 에서 기술된 기술을 사용해 상 (phase) 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
"항체 절편" 은 본래의 항체의 일부를 포함하며, 바람직하게는 그의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 절편의 예는 전장 항체보다 더 짧은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편 ; 다이아바디 ; 선형 항체 ; 단일-사슬 항체 분자 ; 단일-사슬 항체, 단일 도메인 항체 분자, 융합 단백질, 재조합 단백질 및 항체 절편(들) 로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"본래의" 항체는 항원-결합 가변 영역, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인인 CH1, CH2 및 CH3 을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 자연 서열 불변 도메인 (예를 들어 인간 자연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 본래의 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 가진다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 본래의 항체는 상이한 "부류" 로 지정될 수 있다. 본래의 항체의 5 가지 주요 부류가 있으며 : IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이 중 다수는 "하위부류" (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2 로 추가로 구분될 수 있다. 상이한 부류의 항 체에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 라고 부른다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3 차 형태는 잘 알려져 있다.
항체 "효과기 기능" 은 항체의 Fc 영역 (자연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역) 으로 인한 생물학적 활성을 말한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 ; 보체 의존성 세포독성 ; Fc 수용체 결합 ; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) ; 식세포 작용 ; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체 ; BCR) 의 하향 조절 등을 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC" 는 Fc 수용체 (FcR) 를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어 자연 살해 (NK) 세포, 중성구, 및 대식세포) 가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하고, 이어서 상기 표적 세포를 파쇄시키는 세포-매개 반응을 말한다. ADCC 를 매개하는 1 차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하며, 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 [Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)] 의 464 쪽 표 3 에 요약되어 있다. 흥미있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제 5,500,362 호 또는 제 5,821,337 호에서 기술된 바와 같은 시험관 내 ADCC 어세이를 수행할 수 있다. 상기 어세이를 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 흥미있는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, [Clynes 등 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)] 에서 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체 내에서 평가될 수 있다.
"효과기 세포" 는 하나 이상의 FcR 를 발현하는 백혈구이고, 및 효과기 기능을 수행한다. 바람직하게는, 상기 세포는 적어도 FcγRIII 을 발현하고, ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC 를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구를 포함하고 ; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 본원에 기술된 바와 같이, 그의 자연 공급원, 예를 들어 혈액 또는 PBMC 에서 단리될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR" 는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하는데 사용된다. 바람직한 FcR 는 자연 서열 인간 FcR 이다. 더욱이, 바람직한 FcR 는 IgG 항체 (감마 수용체) 에 결합하는 것이고, 이에는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRRIII 하위부류의 수용체가 포함되며, 이들 수용체의 대립 변이체 및 대안적으로는 스플라이싱된 형태도 포함된다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체") 를 포함하며, 이는 그의 세포질 도메인에서 본래 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA 는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 타이로신-기재 활성화 모티프 (ITAM) 를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB 는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 타이로신-기재 억제 모티프 (ITIM) 를 함유한다 ([M. in Daon, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 를 리뷰). FcR 는 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel 등, Immunomoehtods 4:25-34 (1994); 및 de Haas 등, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)] 에 기술되어 있다. 미래에 규명될 것을 포함하여 다른 FcR 는 본원에서 용어 "FcR" 로서 포함된다. 상기 용어는 또한, 신생 수용체인 FcRn 을 포함하는데, 이는 모계의 IgG 을 태아에 옮기는데 관여한다 (Guyer 등, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim 등, Eur. J. Immunol. 24:2429 (1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC" 는 보체의 존재 하에 표적을 파쇄시키는 분자의 능력을 말한다. 보체 활성화 경로는 보체계 (C1q) 의 제 1 성분이 동족 항원과 복합체화된 분자 (예를 들어 항체) 에 결합함으로서 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 [Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)] 에서 기술된 바와 같은 CDC 어세이를 수행할 수 있다.
용어 "가변" 은 가변 도메인의 특정 부위가 항체 중에서 서열이 광범위하게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는 사실을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인을 통틀어서 고르게 분포되어 있지 않다. 상기 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에 있는 초가변 영역이라고 하는 3 가지 분절에 밀집되어 있다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부위를 골격 영역 (FR) 이라고 한다. 자연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4 개의 FR 을 포함하고, 대체로 β 병풍 구조를 채택하고, 3 개의 초가변 영역에 연결되어 있으며, 루프 연결을 형성하고, 어떤 경우에는 β 병풍 구조의 일부를 형성한다. 각각의 사슬 내 초가변 영역은 FR 에 의해 함께 밀접하게 고정되어 있고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 ([Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 관여하지 않으나, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
용어 "초가변 영역" 은 본원에서 사용된 경우, 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 의 아미노산 잔기 (예를 들어 경쇄 가변 도메인 내 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) ; Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프" 의 잔기를 포함한다 (예를 들어 경쇄 가변 도메인 내 잔기 2632 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) ; Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기이다. 항체의 파파인 분해는 2 개의 동일한 항원-결합 절편, 소위 Fab" 절편이라고 하는 절편을 생성하며, 각각은 단일 항원-결합 부위, 및 잔여 Fc 절편을 가지며, 이의 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다. 펩신 처리는 F(ab')2 절편을 생성하고, 이 절편은 2 개의 항원-결합 부위를 가지며, 여전히 항원을 교차-연결할 수 있다.
"Fv" 는 완전한 항원-인지 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소의 항체 절편 이다. 상기 영역은 타이트하고 비공유 결합에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어져 있다. 상기 구조에서, 각각의 가변 도메인의 3 개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상의 항원-결합 부위를 정의한다. 수합하면, 6 개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3 개의 초가변 영역을 포함하는 Fv 의 절반) 조차 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화성으로 항원을 인지하고 결합하는 능력을 가진다. Fab 절편은 또한, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH I) 을 함유한다. Fab' 절편은 항체 힌지 영역의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab 절편과 상이하다. Fab'-SH 는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들) 가 하나 이상의 자유 티올기를 갖는 Fab' 에 대한 정의이다. F(ab')2 항체 절편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 절편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 절편의 다른 화학 커플링이 또한 알려져 있다.
임의의 척추동물 종의 항체의 "경쇄" 를 2 개의 분명하게 별개인 유형 중 하나로 지정할 수 있으며, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 바탕으로 이를 카파(κ) 및 람다 (λ) 라고 부른다.
"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 절편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 연결자를 추가로 포함하며, 이는 scFv 가 항원 결합을 위해 필요한 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv 의 리뷰를 위해, [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Anitbodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 를 참조한다.
용어 "다이아바디" 는 2 개의 항원-결합 부위가 있는 작은 항체 절편을 말하며, 상기 절편은 동일한 폴리펩타이드 사슬 (VH-VL) 에서 가변 경쇄 도메인 (VL) 에 연결된 가변 중쇄 도메인 (VH) 을 포함한다. 동일 사슬 상의 2 개의 도메인 사이에 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 억지로 또다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루고 항원-결합 부위를 만들게 된다. 다이아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161 ; 및 [Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 에 더욱 자세히 기술되어 있다.
용어 "트리아바디" 또는 "3 가 삼량체" 는 3 개의 단일 사슬 항체의 조합을 말한다. 트리아바디는 VL 또는 VH 도메인의 아미노산 말단으로, 즉, 임의의 링커 서열 없이 구축된다. 트리아바디는 환형, 헤드-투-테일 (head-to-tail) 형태로 배열된 폴리펩타이드가 있는 3 개의 Fv 헤드를 갖는다. 트리아바디의 가능한 구조는 서로 120 도의 각에서 평면 내에 위치한 3 개의 결합 부위를 갖는 평면형이다. 트리아바디는 1특이적, 2특이적 또는 3특이적일 수 있다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 규명 및 분리 및/또는 회복된 것이다. 그의 자연 환경의 오염원 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도 를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 항체는 재조합 세포 내 제자리에서 항체를 포함하는데, 그 이유는 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 본래는, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
흥미있는 항원, 예를 들어 CD44 항원에 "결합하는" 항체는 항원을 발현하는 세포를 표적으로 하는데 있어서 항체가 치료 또는 진단 제제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 항원에 결합할 수 있는 항체이다. 항체가 CD44 에 결합하는 것인 경우, 이는 보통 다른 수용체와는 반대로 CD44 에 선호할만하게 결합할 것이고, 비-특이적 Fc 접촉과 같은 부차적인 결합, 또는 다른 항원에는 흔한 번역후 개질에의 결합을 포함하지 않고, 다른 단백질과 유의하게 교차반응하지 않는 것일 수 있다. 흥미있는 항원에 결합하는 ㅎ아체의 검출을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, FACS, 세포 ELISA 및 웨스턴 블롯과 같은 어세이가 포함될 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 은 상호교환적으로 사용되고, 모든 그러한 지정은 자손을 포함한다. 또한, 모든 자손은 계획적인 또는 우연의 돌연변이로 인해, DNA 함량이 정확하게 동일하지는 않을 수 있음을 이해한다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 이는 별개의 지정이 의도되는 맥락에서 분명해 질 것이다.
"치료" 또는 "치료하기" 는 치료 및 예방 또는 예방 수단 둘 다를 말하는 것으로, 여기서, 대상은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애를 예방 또는 저속화 (감소) 시키는 것이다. 치료가 필요한 대상에는 이미 장애를 가지고 있는 대상, 뿐만 아니라, 장애를 가지기 쉬운 대상 또는 장애를 예방해야 할 대상이 포함된다. 그러나, 본원에서 치료될 포유류는 장애를 갖고 있는 것으로 진단된 것일 수 있거나 또는 장애가 걸리기 쉽거나 또는 장애를 가지기 쉬울 수 있다.
용어 "암" 및 "암성" 은 전형적으로 비조절되는 세포 성장 또는 사멸을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 말하거나 또는 기술한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프성 악성종이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 암의 더욱 구체적인 예에는 편평상피 세포암 (예를 들어 외피 편평상피 세포암), 소세포 폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포암종을 포함한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함한 소화성 또는 위암, 췌장암, 신경교세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장 암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암종 또는 자궁암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문암종, 음경암종, 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.
"화학치료제" 는 암 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학치료제에는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN™ ; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판 ; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보퀀, 메투레도파 및 우레도파 ; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미 드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하여 에틸렌이민 및 메틸아멜아민 ; 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 클로르포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드 ; 니트로수레아 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴 ; 항생제 예컨대 아클라시노미신, 액티노마이신, 아루트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리세아미신, 카라비신, 카르노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 마이토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신 ; 항-대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU) ; 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트 ; 류핀 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌 ; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카로푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로수리딘, 5-FU ; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤 ; 항-아드레날 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄 ; 폴산 레플레니셔 예컨대 프로린산 ; 아세갈라톤 ; 알도포스파미드 글리코사이드 ; 아미노레불르산 ; 암사크린 ; 베 스트라부실 ; 비스안트렌 ; 에다트락세이트 ; 에포프아민 ; 데메콜신 ; 디아지퀀 ; 엘포르미틴 ; 엘리프티늄 아세테이트 ; 에토글루시드 ; 갈륨 니트레이트 ; 히드록시우레아 ; 렌티난 ; 로니다민 ; 미토구아존 ; 미톡산트론 ; 모피다몰 ; 니트라크린 ; 펜토스타틴 ; 페나메트 ; 피라루비신 ; 포도필린산 ; 2-에틸히드라지드 ; 프로카바진 ; PSK
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; 라족산 ; 시조피란 ; 스피로게르마늄 ; 테누아존산 ; 트리아지퀀 ; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민 ; 우레탄 ; 빈데신 ; 다카르바진 ; 마노무스틴 ; 미토브로니톨 ; 미토락톨 ; 피포브로만 ; 가시토신 ; 아라비노사이드 ("Ara-C") ; 사이클로포스파미드 ; 티오테파 ; 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 (택솔
Figure 112009073347197-pct00035
, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (TAXOTERE
Figure 112009073347197-pct00036
, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) ; 클로람부실 ; 겜시타빈 ; 6-티오구아닌 ; 머캅토퓨린 ; 메토트렉세이트 ; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴 ; 빈블라스틴 ; 백금 ; 에토포사이드 (VP-16) ; 이포스파미드 ; 미토마이신 C ; 미톡산트론 ; 빈크리스틴 ; 비노렐빈 ; 나벨빈 ; 노반트론 ; 테니포사이드 ; 다우노마이신 ; 아미노프테린 ; 젤로다 ; 이반드로네이트 ; CPT-11 ; 토포아이소머레이즈 억제제 RFS 2000 ; 디플루오로메틸로니틴 (DMFO) ; 레틴산 ; 에스페라미신 ; 카페시타빈 ; 및 상기 중 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 또한, 예를 들어 타목시펜, 랄로시펜, 아로마테이즈 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시텐, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston) 을 포함하여 항-에스트로겐 ; 및 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린 ; 및 상기 중 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체와 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하도록 작용하는 항-호르몬제가 본 정의에 포함된다.
치료를 위한 "포유류" 는 인간, 마우스, SCID 또는 누드 마우스 또는 마우스 계통, 가정 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 양, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함한 포류유로서 분류되는 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 본원에서 포유류는 인간이다.
"올리고뉴클레오타이드" 는 공지된 방법 (예컨대 1988 년 5 월 4 일에 공개된 EP 266,032 에서 기술된 바와 같은 고체상 기술을 사용한, 또는 [Froehler 등, Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986] 에서 기술된 바와 같은 데옥시뉴클레오타이드 H-포스포네이트 중간체를 통한 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포르아미다이트 화학) 에 의해 화학적으로 합성되는 짧은 길이의, 단일- 또는 이중-가닥 폴리데옥시뉴클레오타이드를 말한다. 다음, 이들은 폴리아크릴아마이드 젤 상에서 정제된다.
본 발명에 따르면, 비-인간 (예를 들어 쥣과) 면역글로불린의 "인간화된" 및/또는 "키메라" 형태는 본래 항체와 비교해 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA) 또는 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응을 감소시키는 특이적 키메라 면역글로불린, 그의 면역글로불린 사슬 또는 절편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열) 을 함유하고, 상기 비-인간 면역글 로불린과 유사한 결합 특징을 동시에 유지하면서도 목적하는 효과를 재생하는데 필요한 상기 비-인간 면역글로불린로부터 유래한 필요 부위 (예를 들어 CDR(들), 항원 결합 영역(들), 가변 도메인(들) 등) 를 함유하는 항체를 말한다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수여자 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체) 의 CDR 의 잔기로 대체한 인간 면역글로불린 (수여자 항체) 을 말한다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 FR 잔기로 대체한다. 더욱이, 인간화된 항체는 수여자 항체에서나 이식된 CDR 또는 FR 서열 어디에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 개질은 항체 성능을 추가로 개질 또는 최적화하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상의 및 전형적으로는 2 개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 모두 또는 실질적으로 모두의 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 모두 또는 실질적으로 모두의 FR 잔기는 인간 면역글로불린 칸센서스 서열의 FR 잔기이다. 인간화된 항체는 최적으로는 또한, 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 의 하나 이상의 부위, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다.
"탈-면역화된" 항체는 주어진 종에 대해 비-면역원성, 또는 덜 면역원성인 면역글로불린을 말한다. 탈-면역화는 항체에 대한 구조적 변형을 통해 달성될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 탈-면역화 기술이 적용될 수 있다. 탈-면역화 항체를 위한 하나의 적합한 기술은 예를 들어, 2000 년 6 월 15 일에 공개 된 WO 00/34317 에 기술되어 있다.
"세포자살" 을 유도하는 항체는 아넥신 V 의 결합, 캐스페이즈 활성, DNA 의 절편화, 세포 수축, 소포체의 확장, 세포 절편화 및/또는 막 소낭 (세포자살체라고 함) 의 형성에 의해 나타나나 이에 제한되지 않는, 임의의 수단에 의해 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 것을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항체 유도 세포독성" 은 수탁 번호 PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 하이브리도마 상청액 또는 항체, 수탁 번호 PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체의 인간화된 항체, 수탁 번호 PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체의 키메라 항체, 그의 항원 결합 절편, 또는 항체 리간드로부터 유도되는 세포독성 효과를 의미하는 것이고, 상기 효과는 본질적으로 결합 정도와 관계 있지 않다.
본 발명을 통틀어서, 하이브리도마 세포주, 뿐만 아니라 그로부터 생성되는 단리된 모노클로날 항체는 대안적으로 그의 내부 지정, H460-16-2 (쥣과), (ch)ARH460-16-2-IgG1, (ch)ARH460-16-2 (VK0VH0), (hu)ARH460-16-2 또는 수탁 지정, ATCC PTA-4621 에 의해 일컬어진다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항체-리간드" 는 표적 항원의 하나 이상의 에피토프에 대한 결합 특이성을 나타내고, ATCC PTA-4621 (ATCC PTA-4621 항원) 로서 지정되는 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체, 수탁 번호 PTA-4621 로서 지정되는 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단리된 모노클로 날 항체의 인간화된 항체, 수탁 번호 PTA-4621 로서 지정되는 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체의 키메라 항체, 및 항원 결합 절편에 의해 결합되는 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인지 및 결합하는 본래의 항체 분자, 항체 절편, 및 그의 하나 이상의 항원-결합 영역 또는 부위 (즉, 항체 분자의 가변 부위) 를 갖는 임의의 분자, 예를 들어, Fv 분자, Fab 분자, Fab' 분자, F(ab').sub.2 분자, 2특이적 항체, 융합 단백질, 또는 임의의 유전적으로 조작된 분자일 수 있는 부분을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "암성 질환 개질 항체 (CDMAB)" 는 환자, 예를 들어 종양 덩어리를 감소시키거나 또는 종양을 갖고 있는 개체의 생존을 연장시킴으로써 환자에 유리한 방식으로 암성 질환 과정을 개질하는 모노클로날 항체, 및 그의 항체-리간드를 말한다.
"CDMAB 관련 결합제" 는 광범위한 의미에서, 임의의 형태의 인간 또는 비-인간 항체, 항체 절편, 항체 리간드 등이 포함되나 이에 제한되지 않는 것으로 이해되며, 이는 하나 이상의 CDMAB 표적 에피토프에 경쟁적으로 결합한다.
"경쟁적 결합제" 는 하나 이상의 CDMAB 표적 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 임의의 형태의 인간 또는 비-인간 항체, 항체 절편, 항체 리간드 등을 포함하는 것이다.
치료될 종양에는 1 차 종양 및 전이성 종양, 뿐만 아니라 불응성인 종양이 포함된다. 불응성인 종양은 화학치료제 단독, 항체 단독, 방사선 단독 또는 그의 병용을 사용한 치료에 반응하지 않거나 또는 내성인 종양을 포함한다. 불응 성인 종양은 또한, 상기 제제를 사용한 치료에 의해 억제되는 것으로 보이나, 치료 중단 후 5 년 이하, 때로는 10 년 이하 때에 재발하는 종양을 포함한다.
치료될 수 있는 종양은 혈관형성되지 않은 종양, 또는 아직까지는 실질적으로 혈관형성되지 않은 종양, 뿐만 아니라 혈관형성된 종양을 포함한다. 따라서 치료될 수 있는 고형 종양의 예에는 유방암종, 폐암종, 결장직장암종, 췌장 암종, 신경교종 및 림프종이 포함된다. 상기 종양의 일부 예에는 유표피 종양, 편평 종양, 예컨대 두경부 종양, 결장직장 종양, 전립선 종양, 유방 종양, 소세포 및 비소세포 폐 종양을 포함한 폐 종양, 췌장 종양, 갑상선 종양, 난소 종양, 및 간 종양이 포함된다. 다른 예에는 카포시 육종, CNS 신생물, 신경아세포종, 모세혈관아세포종, 뇌수막종 및 대뇌 전이, 골수종, 위장관암종 및 신암종 및 육종, 횡문근육종, 신경교세포종, 바람직하게는 신경교세포종 멀티폼, 및 평활근육종이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원-결합 영역" 은 표적 항원을 인지하는 분자의 부위를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "경쟁적으로 억제시킨다" 는 통상의 상호간 항체 경쟁 어세이를 사용해, 결정소 부위를 인지 및 결합할 수 있는 것을 의미하고, 상기 부위에 ATCC PTA-4621 로서 지정되는 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 모노클로날 항체 (ATCC PTA-4621 항체), 수탁 번호 PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체의 인간화된 항체, 수탁 번호 PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 모노클로 날 항체의 키메라 항체, 그의 항원 결합 절편, 또는 항체 리간드가 관여한다 (Belanger L., Sylvestre C. 및 Dufour D. (1973), 경쟁적 및 샌드위치 과정에 의한 알파 페토단백질에 대한 효소 연결 면역어세이. Clinica Chimica Acta 48, 15).
본원에 사용되는 바와 같이, "표적 항원" 은 ATCC PTA-4621 항원 또는 그의 부위를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역컨쥬게이트" 는 세포독소, 방사성제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분, 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 임의의 분자 또는 CDMAB, 예컨대 항체를 의미한다. 항체 또는 CDMAB 는 그의 표적에 결합할 수 있는 한, 분자를 따라 임의의 위치에서 세포독소, 방사성 제제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분, 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제에 연결될 수 있다. 면역컨쥬게이트의 예에는 항체 독소 화학 컨쥬게이트 및 항체-독소 융합 단백질이 포함된다.
항-종양 제제로서 사용하기에 적합한 방사성제는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 131I 또는 211At 가 사용된다. 이들 동위원소는 통상의 기술을 사용해 항체에 부착된다 (예를 들어 Pedley 등, Br. J. Cancer 68, 69-73 (1993)). 대안적으로, 항체에 부착되는 항-종양 제제는 전구약물을 활성화시키는 효소이다. 전구약물은 그것이 종양 부위에 도달할 때까지 그의 불활성 형태로 머물러 있으면서 투여될 수 있고, 그러다가 일단 항체 복합체가 투여되면 종양 부위에서 그의 세포독소 형태로 전환된다. 실제로, 항체-효소 컨쥬게이트는 환자에 투여되고 치료될 조직의 영역에서 위치화될 수 있다. 다음, 전구약물을 환자에 투 여하여, 세포독성 약물로의 전환이 치료될 조직의 영역에서 발생한다. 대안적으로, 항체에 접합된 항-종양 제제는 사이토카인 예컨대 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-4 (IL-4) 또는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 이다. 항체는 사이토카인을 종양에 표적화하여, 사이토카인은 다른 조직에 영향을 미치지 않으면서, 종양에 손상을 주거나 또는 이의 파괴를 매개하게 된다. 사이토카인은 통상의 재조합 DNA 기술을 사용해 DNA 수준에서 항체에 융합된다. 인터페론이 또한 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "융합 단백질" 은 임의의 키메라 단백질을 의미하며, 여기서, 항원 결합 영역은 생물학적으로 활성 분자, 예를 들어, 독소, 효소, 형광 단백질, 발광 마커, 폴리펩타이드 태그, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 또는 단백질 약물에 연결된다.
본 발명은 추가로, 표적 또는 리포터 부분이 연결된 본 발명의 CDMAB 를 고려한다. 표적 부분은 결합쌍의 처음 구성원이다. 예를 들어, 항-종양제는 상기 쌍의 두번째 구성원에 접합되어, 항원-결합 단백질이 결합되는 부위로 향하게 된다. 상기 결합쌍의 흔한 예는 아비딘 및 비오틴이다. 바람직한 구현예에서, 비오틴은 본 발명의 CDMAB 의 표적 항원에 접합되어, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합되는 항-종양제 또는 다른 부분을 위한 표적을 제공한다. 대안적으로, 비오틴 또는 또다른 상기 부분은 본 발명의 CDMAB 의 표적 항원에 연결되고, 예를 들어 검출가능한 신호-생성 제제는 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합되는 진단 시스템에서 리포터로서 사용된다.
검출가능한 신호-생성 제제는 진단 목적을 위해 생체 내 및 시험관 내에서 유용하다. 신호 생성 제제는 외부 수단, 보통 전자기 방사선의 측정에 의해 검출가능한 측정가능한 신호를 생성한다. 대부분의 경우, 신호 생성 제제는 효소 또는 발색단이거나, 또는 형광, 인광 또는 화학발광에 의해 빛을 방출한다. 발색단은 자외선 또는 가시광선 영역에서 빛을 흡수하는 염료를 포함하고, 효소 촉매화된 반응의 분해 생성물 또는 기질일 수 있다.
더욱이, 조사 또는 진단 방법을 위한 생체 내 및 시험관 내에서의 본 발명의 CDMAB 의 사용이 본 발명의 범주 내에 포함되며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에서 고려되는 바와 같은 진단 방법을 수행하기 위해서는, 본 발명은 본 발명의 CDMAB 를 함유하는 키트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 개인의 세포 상에서의 CDMAB 의 표적 항원의 과발현을 검출함으로써 특정 유형의 암에 대한 위험도에 있는 개인을 규명하는데 유용할 것이다.
진단 어세이 키트
종양의 존재를 측정하기 위한 진단 어세이 키트의 형태에서 본 발명의 CDMAB 를 사용하는 것이 고려된다. 상기 종양은 일반적으로 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 혈청, 소변 및/또는 종양 생검에서 하나 이상의 종양-특이적 항원, 예를 들어 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 바탕으로 환자에서 검출될 것이며, 상기 샘플은 환자에서 수득될 것이다.
단백질은 특정 종양, 예를 들어 결장, 유방, 폐 또는 전립선 종양의 존재 또는 부재를 지시하는 마커로서 작용한다. 추가로, 항원이 다른 암성 종양의 검 출을 위한 유용성을 가질 것임을 고려한다. 본 발명의 CDMAB 로 이루어진 결합제, 또는 CDMAB 관련 결합제의 진단 어세이 키트에 포함되는 것은 생물학적 샘플에서 상기 제제에 결합하는 항원의 수준을 검출할 수 있게 한다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브는 종양 단백질을 암호화하는 mRNA 의 수준을 검출하는데 사용될 수 있으며, 이는 또한, 암의 존재 또는 부재의 지표이다. 진단되는 결합 어세이에서, 데이타는 정상 조직에서의 존재와 관련하여 통계학적으로 유의한 수준의 항원과 관련 있도록 생성될 것이고, 그리하여 결합의 인지가 암성 종양의 존재에 대해 정의학적으로 진단하게 될 것이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 샘플 내 폴리펩타이드 마커를 검출하기 위해 결합제를 사용하는 것에 대해 다수의 포맷이 본 발명의 진단 어세이에 유용할 것으로 생각된다. 예를 들어, [Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 에 기술된 바와 같다. 상기 진단 어세이 포맷의 임의의 그리고 모든 병용, 교환 또는 개질이 추가로 고려된다.
환자에서의 암의 존재 또는 부재는 전형적으로는 하기 단계에 의해 측정될 것이다 : (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 결합제와 접촉시키는 단계 ; (b) 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 수준을 상기 샘플 내에서 검출하는 단계 ; 및 (c) 폴리펩타이드의 수준을 미리결정된 컷-오프 값과 비교하는 단계.
예시적 구현예에서, 샘플의 나머지의 폴리펩타이드에 결합하고 이를 제거하기 위해, 고체 지지체 상에 고정된 CDMAB 기재 결합제를 사용하는 것을 포함할 것으로 생각된다. 다음, 결합된 폴리펩타이드는 리포터기를 함유하고 결합제/폴 리펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 검출 시약을 사용해 검출될 수 있다. 예시적 검출 시약은 결합제에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 또는 항체 또는 다른 제제, 예컨대 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴에 특이적으로 결합하는 CDMAB 기재 결합제를 포함할 수 있다. 대안의 구현예에서, 경쟁적 어세이가 사용될 수 있고, 여기서, 폴리펩타이드는 리포터기로 표지되고 샘플로 결합제를 인큐베이션한 후 고정된 결합제에 결합하게 될 수 있는 것으로 고려된다. 고정된 결합제에 대한 샘플의 반응성의 지표는 샘플 성분이 표지된 폴리펩타이드가 결합제에 결합하는 것을 억제시키는 범위이다. 상기 어세이 내 사용하기 위한 적합한 폴리펩타이드는 전장 종양-특이적 단백질 및/또는 그의 부분을 포함하며, 결합제는 결합 친화성을 갖는다.
진단 키트에는 단백질이 부착될 수 있는 당업자에게 알려진 임의의 물질의 형태 내에 있을 수 있는 고체 지지체가 제공될 것이다. 적합한 예는 마이크로타이터 플레이트 또는 니트로셀룰로스 또는 다른 적합한 막에 테스트 웰을 포함할 수 있다. 대안적으로, 지지체는 비드 또는 디스크, 예컨대 유리, 섬유유리, 라텍스 또는 플라스틱 물질 예컨대 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 지지체는 또한, 자기 입자 또는 섬유 광학 센서, 예컨대 미국 특허 제 5,359,681 호에 개시된 것들일 수 있다.
결합제는 특허 및 과학 문헌에 상세히 기술된 당업자에게 알려진 다양한 기술을 사용하여 고체 지지체 상에 고정될 것으로 고려된다. 용어 "고정화" 는 흡착과 같은 비공유 결합 및 공유 부착 둘 다를 말하며, 이는 본 발명의 내용에서 제제와 지지체 상 작용기 간의 직접적인 연결일 수 있거나, 또는 교차연결제를 사용한 연결일 수 있다. 바람직한, 즉 비-제한적 구현예에서, 마이크로타이터 플레이트 내 웰 또는 막에의 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 흡착은 적합한 완충액 내에서 결합제를 고체 지지체와 적당 시간 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양할 수 있고, 일반적으로 약 1 시간 내지 약 1 일의 범위 내에 있을 것이다.
결합제의 고체 지지체에의 공유 부착은 통상 우선, 결합제 상에서 지지체 및 히드록실 또는 아미노기와 같은 작용기 둘 다와 반응할 이작용성 시약과 상기 지지체를 반응시킴으로써 달성될 것이다. 예를 들어, 결합제는 벤조퀴논을 사용하여, 또는 결합 파트너 상의 아민 및 활성 수소를 사용해 지지체 상의 알데하이드기를 축합함으로써, 적절한 중합체 코팅을 갖는 지지체에 공유 부착될 수 있다 (예를 들어, [Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12 A13] 참조).
추가로, 진단 어세이 키트는 2-항체 샌드위치 어세이 형태를 취할 것으로 생각된다. 상기 어세이는 우선, 항체, 예를 들어 고체 지지체 상에, 보통은 마이크로타이터 플레이트의 웰에 고정되었던 본 발명에서 개시된 CDMAB 를 샘플과 접촉시킴으로써, 샘플 내 폴리펩타이드가 고정된 항체에 결합되게 할 수 있도록 수행될 수 있다. 다음, 비결합된 샘플을 고정된 폴리펩타이드-항체 복합체로부터 제거하고 리포터기를 함유하는 검출 시약 (바람직하게는 폴리펩타이드 상의 상이한 부위에 결합할 수 있는 제 2 항체) 을 첨가한다. 다음, 고체 지지체에 결합되어서 남아 있는 검출 시약의 양은 특정 리포터기에 대한 적절한 방법을 사용해 측정 한다.
구체적인 구현예에서, 일단 항체는 상기 기술된 바와 같이 지지체 상에 고정되고, 지지체 상의 남은 단백질 결합 부위는 당업자에게 알려진 적합한 차단제, 예를 들어, 소 혈청 알부민 Tween 20TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) 을 사용해 차단될 것으로 생각된다. 다음, 고정된 항체는 샘플과 함께 인큐베이션될 것이고, 폴리펩타이드는 항체에 결합되게 될 수 있을 것이다. 인큐베이션 전에, 샘플을 적합한 희석제, 예컨대 인산염-완충 식염수 (PBS) 로 희석할 수 있다. 일반적으로, 적절한 접촉 시간 (즉, 인큐베이션 시간) 은 특이적으로 선택된 종양을 가진 개체에서 수득한 샘플 내에서 폴리펩타이드의 존재를 검출하기에 충분한 시간에 상응하도록 선택될 것이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합 및 비결합 폴리펩타이드 간의 평형에서 달성되는 약 95% 이상인 결합 수준을 달성하기에 충분할 것이다. 당업자는 평형을 달성하는데 필요한 시간은 시간 경과에 따라 발생하는 결합 수준을 어세이함으로써 쉽게 측정될 수 있음을 알게 될 것이다.
추가로, 다음, 비결합 샘플은 고체 지지체를 적절한 완충액으로 세정함으로써 제거될 것으로 생각된다. 다음, 리포터기를 함유하는 제 2 항체는 고체 지지체에 첨가될 것이다. 다음, 검출 시약과 고정된 항체-폴리펩타이드 복합체와의 인큐베이션은 결합된 폴리펩타이드를 검출하기에 충분한 시간 동안 수행될 것이다. 다음, 이어서, 비결합 검출 시약은 제거될 것이고, 결합된 검출 시약은 리포터기를 사용해 검출될 것이다. 리포터기의 검출에 적용되는 방법은 본질적 으로, 예를 들어 방사성기, 섬광 계수 또는 오토레이디오그래픽 (autoradiographic) 방법에 대해 선택된 리포터기의 유형에 특이적이며, 일반적으로 적절하다. 분광학적 방법은 염료, 발광기 및 형광기를 검출하는데 사용될 수 있다. 비오틴은 상이한 리포터기 (보통 방사성 또는 형광기 또는 효소) 에 커플링된 아비딘을 사용해 검출될 수 있다. 효소 리포터기는 일반적으로 기질의 첨가 (일반적으로 특정 시간 동안), 이어서 반응 생성물의 분광학적 또는 다른 분석에 의해 검출될 수 있다.
전립선암과 같은 암의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 본 발명의 진단 어세이 키트를 사용하기 위해, 고체 지지체에 결합된 채로 남아 있는 리포터기로부터 검출되는 신호는 일반적으로 미리결정된 컷-오프 값에 상응하는 신호에 비교될 것이다. 예를 들어, 암의 검출을 위한 실례의 컷-오프 값은 고정된 항체가 암이 없는 환자 샘플과 함께 인큐베이션되는 경우 수득되는 평균 신호일 수 있다. 일반적으로, 미리결정된 컷-오프 값 초과의 약 3 개의 표준 편차인 신호를 생성하는 샘플은 암에 대해 양성적인 것으로 간주될 것이다. 대안적인 구현예에서, 컷-오프 값은 [Sackett 등, Clinical Epidemiology A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7] 의 방법에 따라 Receiver Operator Curve 를 사용해 측정될 것이다. 그러한 구현예에서, 컷-오프 값은 진단 테스트 결과에 대한 각각의 가능한 컷-오프 값에 상응하는 참 양성 비율 (즉, 민감도) 및 거짓 양성 비율 (100%-특이성) 의 쌍의 플롯으로부터 측정될 수 있다. 상부 좌측 코너에 가장 가까운 플롯 상의 컷-오프 값 (즉, 가장 넓은 영역을 둘 러싸는 값) 은 가장 정확한 컷-오프 값이고, 상기 방법에 의해 측정되는 컷-오프 값보다 더 높은 샘플 생성 신호는 양성인 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 컷-오프 값은 플롯을 따라 좌측으로 이동되어 거짓 양성 비율을 최소화하거나, 또는 우측으로 이동되어 거짓 음성 비율을 최소화할 수 있다. 일반적으로, 상기 방법에 의해 측정되는 컷-오프 값보다 더 높은 샘플 생성 신호는 암에 대해 양성인 것으로 간주된다.
키트에 의해 가능할 수 있는 진단 어세이는 플로우-스루 (flow-through) 또는 스트립 테스트 (strip test) 포맷에서 수행될 것으로 생각되며, 여기서, 결합제는 니트로셀룰로스와 같은 막 상에 고정된다. 플로우-스루 테스트에서, 샘플 내 폴리펩타이드는 고정된 결합제에 결합하는데, 이는 샘플이 막을 통과하기 때문이다. 다음, 제 2 의 표지된 결합제는 막을 통한 제 2 결합제 흐름을 함유하는 용액으로서 결합제-폴리펩타이드 복합체에 결합한다. 다음, 결합된 제 2 결합제의 검출은 상기 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 스트립 테스트 포맷에서, 결합제가 결합되는 막 중 하나의 말단은 샘플을 함유하는 용액 내에서 침지될 것이다. 샘플은 제 2 결합제를 함유하는 영역을 통해 막을 따라 이동하고 고정된 결합제로 이동할 것이다. 고정된 항체의 영역에 있는 제 2 결합제의 농도는 암의 존재를 지시한다. 가시적으로 판독될 수 있는 결합 부위에 있는 선 (line) 과 같은 패턴의 생성은 양성 테스트의 지표일 것이다. 상기 패턴의 부재는 음성 결과를 지시한다. 일반적으로, 막 상에 고정된 결합제의 양은 생물학적 샘플이 상기 논의된 포맷에서 2-항체 샌드위치 어세이에서 양성 신호를 생성하기에 충분할 수준의 폴리펩타이드를 함유하는 경우 가시적으로 분리되는 패턴을 생성하도록 선택된다. 본 발명의 진단 어세이에서 사용하기에 바람직한 결합제는 본 발명에서 개시된 항체, 그의 항원-결합 절편, 및 본원에서 기술된 바와 같은 CDMAB 관련 결합제이다. 막 상에 고정된 항체의 양은 진단 어세이를 제조하기에 효과적인 양일 것이고, 약 25 ng 내지 약 1 ㎍ 범위일 수 있다. 전형적으로는 상기 테스트는 매우 소량의 생물학적 샘플을 사용해 수행될 수 있다.
추가로, 본 발명의 CDMAB 는 그의 표적 항원을 규명하는 능력으로 인해 연구 실험실에서 사용될 수 있다.
본원에서 기술된 본 발명을 더욱 상세히 이해될 수 있게 하기 위해, 하기 설명이 기술된다.
본 발명은 ATCC PTA-4621 항원을 특이적으로 인지 및 결합하는 CDMAB (즉, ATCC PTA-4621 CDMAB, 수탁 번호 PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체의 인간화된 항체, 수탁 번호 PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체의 키메라 항체, 그의 항원 결합 절편, 또는 항체 리간드) 를 제공한다.
수탁 번호 PTA-4621 로서 ATCC 에 수탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체의 CDMAB 는 그것이 하이브리도마 ATCC PTA-4621 에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체가 항원에 면역특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제시키는 항원-결합 영역을 갖는 한 임의의 형태일 수 있다. 따라서, ATCC PTA-4621 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 임의의 재조합 단백질 (예를 들 어, 항체가 단백질 예컨대 림포카인 또는 종양 억제 성장 인자와 같은 제 2 단백질과 병용되는 융합 단백질) 은 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명의 한 구현예에서, CDMAB 는 ATCC PTA-4621 항체이다.
다른 구현예에서, CDMAB 는 ATCC PTA-4621 항체의 항원-결합 영역을 갖는 Fv 분자 (예컨대 단일-사슬 Fv 분자), Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 융합 단백질, 2특이적 항체, 헤테로항체 또는 임의의 재조합 분자일 수 있는 항원 결합 절편이다. 본 발명의 CDMAB 는 ATCC PTA-4621 모노클로날 항체가 향하게 되는 에피토프로 향한다.
본 발명의 CDMAB 는 즉, 분자 내 아미노산 개질에 의해 개질되어, 유도체 분자를 생성할 수 있다. 화학적 개질이 또한 가능할 수 있다. 직접 돌연변이, 친화성 숙성의 방법, 파지 디스플레이 또는 사슬 셔플링에 의한 개질이 또한 가능할 수 있다.
친화성 및 특이성은 CDR 및/또는 페닐알라닌 트립토판 (FW) 잔기를 돌연변이시키고 목적하는 특징을 갖는 항원 결합 부위에 대해 스크리닝함으로써 개질 또는 향상될 수 있다 (예를 들어, Yang 등, J. Mol. Biol., (1995) 254: 392-403). 하나의 방법은 개별 잔기를 랜덤화하거나 또는 잔기를 병용하여, 2 내지 20 개의 아미노산의 서브셋인 동일한 항원 결합 부위의 집단이 특정 위치에서 발견되게 하는 것이다. 대안적으로, 실수 유발 (error prone) PCR 방법에 의해 잔기의 범위에 걸쳐서 돌연변이를 유도할 수 있다 (예를 들어, Hawkins 등, J. Mol. Biol., (1992) 226: 889-96). 또다른 실시예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 함유하는 파지 디스플레이 벡터가 이. 콜라이의 돌연변이 계통에서 조장될 수 있다 (예를 들어, Low 등, J. Mol. Biol., (1996) 250: 359-68). 이들 돌연변이 방법은 당업자에게 알려진 많은 방법의 예시이다.
본 발명의 항체의 친화성을 증가시키는 또다른 방법은 사슬 셔플링을 수행하는 것으로서, 여기서, 중쇄 또는 경쇄는 다른 중쇄 또는 경쇄와 무작위로 쌍을 이루어, 더 높은 친화성을 갖는 항체를 생성한다. 항체의 다양한 CDR 이 또한, 다른 항체 내 상응하는 CDR 과 함께 셔플링될 수 있다.
유도체 분자는 폴리펩타이드의 기능성을 유지할 것인데, 즉 상기 치환을 갖는 분자는 폴리펩타이드가 ATCC PTA-4621 항원 또는 그의 부분에 결합하는 것을 여전히 허용할 것이다.
이들 아미노산 치환에는 "보존적" 이라고 당업계에 알려진 아미노산이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, "보존적 아미노산 치환" 이라고 명칭되는 특정 아미노산 치환은 단백질의 구조 또는 기능을 변형시키지 않으면서 단백질에서 빈번히 이루어질 수 있다는 것은 단백질 화학의 잘-구축된 원리이다.
상기 변화에는 소수성 아미노산 중 임의의 것을 이소루신 (I), 발린 (V), 및 루신 (L) 중 임의의 것으로 치환하는 것 ; 글루탐산 (E) 을 아스파르트산 (D) 으로, 및 반대로 ; 아스파라긴 (N) 을 글루타민 (Q) 으로, 및 반대로 ; 및 트레오닌 (T) 을 세린 (들) 으로 치환하는 것을 포함한다. 다른 치환은 또한, 특정 아미노산의 환경, 및 단백질의 3 차 구조에서의 그의 역할에 따라 보존적으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G) 및 알라닌 (A) 은 빈번히 상호교환가능할 수 있는데, 알라닌 및 발린 (V) 이 그럴 수 있다. 상대적으로 소수성인 메티오닌 (M) 은 빈번히 루신 및 이소루신으로 상호교환될 수 있고, 및 때로는 발린으로 상호교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R) 은 위치에서 빈번히 상호교환가능할 수 있으며, 여기서, 아미노산 잔기의 유의한 특징은 그의 전하이고, 이들 2 개의 아미노산 잔기의 상이한 pK 값은 유의하지 않다. 더욱 다른 변화는 특정 환경에서 "보존적" 으로 간주될 수 있다.
실시예 1
인간 MDA-MB-468 유방암세포를 사용한 생체 내 종양 실험
H460-16-2 는 이미 MDA-MB-231 인간 유방암 이종 이식 모델에 대한 효능을 피력하였다 (S.N. 10/603,000 에서 개시된 바와 같음). 상기 발견을 확장시키기 위해, H460-16-2 를 MDA-MB-468 인간 유방암 이종 이식 모델에서 테스트하였다. 도 1 및 2 를 참조로, 8 내지 10 주령의 암컷 무흉선 누드 마우스에 5 x 106 인간 유방암세포 (MDA-MB-468) 를 100 ㎕ 의 PBS 용액에서 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 상기 마우스를 10 마리로 된 2 개의 치료군으로 무작위로 나누었다. 마우스의 평균 종양 부피가 대략 83 mm3 가 되는 이식 후 35 일째에, 20 mg/kg 의 H460-16-2 테스트 항체 또는 완충액 대조군을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4 를 함유하는 희석제를 사용해 스탁 농도를 희석한 후 300 ㎕ 의 부피로 각각의 코호트에 복강내로 투여하였다. 다음, 항체 및 대조군 샘플을 약 3 주 동안 매주 3 회 투여하였다. 종양 성장을 대략 3 ~ 10 일마다 칼리퍼로 측정하였다. 8 번의 투여량의 항체 투여 후 치료를 완료하였다. 동물의 체중을 종양 측정시와 동일한 시간에 기록하였다. 일단 연구가 종점에 도달했을 때 연구의 종점에서 모든 동물을 CCAC 가이드라인에 따라 안락사시켰다.
H460-16-2 는 인간 유방암세포의 MDA-MB-468 생체 내 구축된 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제시켰다. ARIUS 항체 H460-16-2 를 사용한 치료는, 79 일째, 즉 항체 마지막 투여 후 26 일째에 측정된 바와 같이, MDA-MB-468 종양의 성장을 완충액 처리군에 비해 62.8% (p=0.005506, t-테스트) 만큼 감소시켰다 (도 1). 대조군 및 치료군 모두에 대한 초기 종양 부피를 감함으로써 종양 성장 억제를 계산하였다.
연구를 통틀어서 뚜렷한 독성 임상 증후는 없었다. 주 간격으로 측정된 체중은 건강함 (well-being) 및 튼튼하지 못함에 대한 대리지표이다. 체중은 연구 기간에 걸쳐서 모든 군에서 증가되었다 (도 2). 35 일 내지 79 일 간의 평균 체중 증가는 대조군에서는 1.82 g (7.2%) 이었고, H460-16-2-치료군에서는 2.30 g (9.9%) 이었다. 치료 기간 동안에 군 간에 유의한 차이는 없었다.
요약하자면, H460-16-2 는 잘 내성이었고, 인간 유방암 이종 이식 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제시켰다.
실시예 2
인간 PC-3 전립선 암세포를 사용한 생체 내 종양 실험
H460-16-2 는 이미 화학치료 약물인 시스플라틴과 병용해서 PC-3 인간 전립선 암 이종 이식 모델에 대한 효능을 피력하였다 (S.N. 10/810,165 에서 개시된 바와 같음). 약물의 부재 시에 효능이 나타날 수 있는지 알아보기 위해, H460-16-2 를 상이한 마우스 계통 이종 이식 모델에서 단독으로 테스트하였다. 도 3 및 4 를 참조로 하여, 8 내지 10 주령의 수컷 무흉선 누드 마우스에 5 x 106 인간 전립선 암세포 (PC-3) 를 100 ㎕ 의 PBS 용액에서 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 상기 마우스를 10 마리로 된 2 개의 치료군으로 무작위로 나누었다. 마우스의 평균 종양 부피가 대략 95 mm3 가 되는 이식 후 6 일째에, 20 mg/kg 의 H460-16-2 테스트 항체 또는 완충액 대조군을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4 를 함유하는 희석제를 사용해 스탁 농도를 희석한 후 300 ㎕ 의 부피로 각각의 코호트에 복강내로 투여하였다. 다음, 항체 및 대조군 샘플을 약 3 주 동안 매주 3 회 투여하였다. 종양 성장을 대략 4 ~ 10 일마다 칼리퍼로 측정하였다. 10 번의 투여량의 항체 투여 후 치료를 완료하였다. 동물의 체중을 종양 측정시와 동일한 시간에 기록하였다. 일단 연구가 종점에 도달했을 때 연구의 종점에서 모든 동물을 CCAC 가이드라인에 따라 안락사시켰다.
H460-16-2 는 인간 전립선 암의 PC-3 생체 내 구축된 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제시켰다. ARIUS 항체 H460-16-2 를 사용한 치료는, 71 일째, 즉 항체 마지막 투여 후 44 일째에 측정된 바와 같이, PC-3 종양의 성장을 완충액 처리군에 비해 61.9% (p=0.002414, t-테스트) 만큼 감소시켰다 (도 3). 대조군 및 치료군 모두에 대한 초기 종양 부피를 감함으로써 종양 성장 억제를 계산하였다.
연구를 통틀어서 뚜렷한 독성 임상 증후는 없었다. 주 간격으로 측정된 체중은 건강함 및 튼튼하지 못함에 대한 대리지표이다. 체중은 연구 기간에 걸쳐서 모든 군에서 증가되었다 (도 4). 6 일 내지 71 일 간의 평균 체중 증가는 대조군에서는 3.47 g (14.3%) 이었고, H460-16-2-치료군에서는 3.86 g (15.1%) 이었다. 치료 기간 동안에 군 간에 유의한 차이는 없었다.
요약하자면, H460-16-2 는 잘 내성이었고, 인간 전립선 암 이종 이식 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제시켰다.
실시예 3
인간 MDA-MB-231 유방암세포를 사용한 생체 내 종양 실험
H460-16-2 는 이미 MDA-MB-231 인간 유방암 이종 이식 모델에 대한 효능을 피력하였다 (S.N. 10/603,000 에서 개시된 바와 같음). 효과적인 투여량 수준을 알아보기 위해, (ch)ARH460-16-2-IgG1 을 구축된 MDA-MB-231 인간 유방암 이종 이식 모델에서 다양한 투여량에서 테스트하였다. 도 5 및 6 을 참조로 하여, 8 내지 10 주령의 암컷 SCID 마우스에 5 x 106 인간 유방암세포 (MDA-MB-231) 를 100 ㎕ 의 PBS 용액에서 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 마우 스의 평균 종양 부피가 대략 100 mm3 가 된 때에 상기 마우스를 10 마리로 된 5 개의 치료군으로 무작위로 나누었다. 이식 후 11 일째에, 20, 10, 2 또는 0.2 mg/kg 의 (ch)ARH460-16-2-IgG1 테스트 항체 또는 완충액 대조군을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4 를 함유하는 희석제를 사용해 스탁 농도를 희석한 후 300 ㎕ 의 부피로 각각의 코호트에 복강내로 투여하였다. 다음, 항체 및 대조군 샘플을 약 3 주 동안 매주 3 회 투여하였다. 종양 성장을 대략 4 ~ 7 일마다 칼리퍼로 측정하였다. 10 번의 투여량의 항체 투여 후 치료를 완료하였다. 동물의 체중을 종양 측정시와 동일한 시간에 기록하였다. 일단 연구가 종점에 도달했을 때 연구의 종점에서 모든 동물을 CCAC 가이드라인에 따라 안락사시켰다.
(ch)ARH460-16-2-IgG1 는 11 일째 내지 32 일째의 치료 기간 동안 0.2 mg/kg 의 최하 투여량에서 인간 유방암의 MDA-MB-231 생체 내 구축된 모델에서 투여량-의존성 억제 및 종양 성장 저하를 나타내었고, 투여 후 종양 성장 억제를 여전히 계속해서 유지하였다. 20, 10, 2 또는 0.2 mg/kg 의 투여량에서의 ARIUS 항체 (ch)ARH460-16-2-IgG1 을 사용한 치료는 55 일째, 즉 항체 마지막 투여일인 23 일째에 측정된 바와 같이, 완충액-치료군에 비해, MDA-MB-231 종양의 성장을 91.3, 89.0, 86.1 또는 63.5% (p < 0.00001, t-테스트) 만큼 감소시켰다 (도 5).
대조군 및 치료군 모두에 대한 초기 종양 부피를 감함으로써 종양 성장 억제를 계산하였다. 연구를 통틀어서 뚜렷한 독성 임상 증후는 없었다. 주 간 격으로 측정된 체중은 건강함 및 튼튼하지 못함에 대한 대리지표이다. 체중은 연구 기간에 걸쳐서 모든 군에서 증가되었다 (도 6). 0 일 내지 55 일 간의 평균 체중 증가는 대조군에서는 2.33 g (11.9%) 이었고, H460-16-2-치료군에서는 각각 2.44 g (12.8%), 2.0 g (10.0%), 2.0 g (10.5%), 및 2.0 g (10.5%) 이었다. 치료 기간 동안에 군 간에 유의한 차이는 없었다.
요약하자면, (ch)ARH460-16-2-IgG1 은 잘 내성이었고, 모든 테스트된 투여량에서 투여량-의존성 방식으로 상기 인간 유방 선암종 이종 이식 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제시켰고, 종양 크기의 저하를 초래하였다.
실시예 4
인간 결장 종양 조직 염색
인간 결장 종양 조직에 대한 IHC 연구는 H460-16-2 가 인간 암에 결합하는 것을 추가로 평가하기 위해 수행하였다. IHC 최적화 연구를 수행하여, 추가 실험을 위한 조건을 알아보았다.
H460-16-2 의 59 개의 인간 결장 종양 조직에의 결합을 인간, 결장 종양 조직 마이크로어레이 (Imgenex, San Diego, CA) 를 사용해 수행하였다. 조직 섹션을 58℃ 오븐에서 1 시간 동안 건조시켜 탈파라핀화하고, 코플린 자 (Coplin jars) 에서 각각 4 분 동안 5 회 자일렌에 담가서 탈왁스시켰다. 일련의 등급화된 에탄올 (100% 내지 75%) 세정을 통한 처리로, 섹션을 물에서 재수화시켰다. 슬라이드를 pH 6 (Dako, Toronto, Ontario) 의 10 mM 시트레이트 완충액에 담군 다음, 고력, 중간력 및 저력 세팅에서 각각 5 분 동안 마이크로웨이브시키고, 마지 막으로 차가운 PBS 에 담갔다. 다음, 슬라이드를 3% 수소 퍼옥시드 용액에 6 분 동안 담그고, 각각 5 분 동안 3 회 PBS 로 세정하고, 건조시키고, Universal 블라킹 용액 (Dako, Toronto, Ontario) 을 사용해 실온에서 5 분 동안 인큐베이션시켰다. H460-16-2, 항-인간 근육 액틴 (Clone HHF35, Dako, Toronto, Ontario) 또는 아이소타입 대조군 항체 (포유류 조직에서 존재하지도 않고 유도되지도 않는 효소인 아스퍼길러스 니거 (Aspergillus niger) 글루코스 옥시다아제에 대한 항체 ; Dako, Toronto, Ontario) 를 항체 희석 완충액 (Dako, Toronto, Ontario) 에서 희석시켜, 그의 작업 농도로 되게 하고 (0.5 ㎍/mL 으로 희석된 항-액틴을 제외하고, 모든 항체에 대해 5 ㎍/mL), 습도가 유지되는 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 다음, 슬라이드를 각각 5 분 동안 PBS 로 3 회 세정하였다. 1 차 항체의 면역반응성을 공급된 바와 같이 HRP 접합된 2 차 항체를 사용해 실온에서 30 분 동안 검출/가시화하였다 (Dako Envision System, Toronto, Ontario). 상기 단계 후, 슬라이드를 각각 5 분 동안 PBS 로 3 회 세정하고, 면역퍼옥시다제 염색용 DAB (3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드라클로라이드, Dako, Toronto, Ontario) 크로모겐 기질 용액을 실온에서 10 분 동안 첨가하여 색상 반응을 발색시켰다. 슬라이드를 흐르는 물에서 세정함으로써 크로모겐 반응을 종료시켰다. Meyer's 헤마톡실린 (Sigma Diagnosis, Oakville, ON) 을 사용한 카운터염색 후에, 슬라이드를 등급화된 에탄올 (75% 내지 100%) 을 사용해 탈수시키고, 자일렌으로 투명하게 하였다. 마운팅 매질 (Dako Faramount, Toronto, Ontario) 을 사용해 슬라이드를 커버슬립하였다. 슬라이드를 Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON) 을 사용해 현미경 검사하였고, 디지탈 이미지를 수득하고, Northern Eclipse Imaging Software (Mississauga, ON) 를 사용해 저장하였다. 결과를 판독하고, 스코어링하고, 조직학자가 해석하였다.
도 7 은 인간 결장 종양 조직의 어레이의 H460-16-2 염색 결과의 요약을 나타낸 것이다. 표에서, 36/59 (61%) 의 테스트된 종양은 H460-16-2 에 대해 양성이었다. H460-16-2 는 종양 세포 및 기질 섬유아세포에 특이적이었다 (도 8). 세포 위치화는 대부분 막성 및 세포질막성이었다. 양성 세포의 % 는 < 10% 내지 > 50% 이었고, 이는 항체가 종양 세포에 비균질하게 결합한다는 것을 지시한다. 종양 기에 대한 항체의 결합 관계 (American Joint Committee on Cancer, AJCC staging) 는 상이한 종양 기 간에 종양의 수의 불일치로 인해 적절하게 평가될 수 없었는데, 각각 I, II, III 및 IV 기에 대해 0/0, 19/29 (66%), 14/25 (56%) 및 3/5 (60%) 였다. 양성 항체 대조군으로서 항-액틴은 근육 조직에의 예상된 양성 결합을 나타내었다. IgG 아이소타입 음성 대조군은 테스트된 조직에의 음성 결합을 나타내었다.
결장 암세포에의 결합 결과, H460-16-2 의 치료 이점이 결장암 치료에까지 확장될 수 있다.
실시예 5
정상 인간 & 사이노몰구스 원숭이 교차 반응성
IHC 연구는 사이노몰구스 원숭이의 정상 조직 상에서의 H460-16-2 항원을 특징화하기 위해 수행되었다. 항체 적정 실험을 항체 (ch)ARH460-16-2-IgG1 (LifeSpan, Seattle, WA, USA 에 의해 FITC 표지) 및 아이소타입 대조군 항체 (Sigma, LifeSpan, Seattle, WA, USA 에 의해 표지) 를 사용해 수행하여, 최소의 배경 및 최대의 신호 검출을 초래하는 농도를 구축하였다. 최적화를 위해, 포르말린-고정, 파라핀-포매 및 동결-건조 조직 상에서 20 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 및 2.5 ㎍/mL 에서 단계 희석을 수행하였다. 항체 (ch)ARH460-16-2-IgG1 및 아이소타입 대조군 항체를 1 차 항체로서 사용하였고, 2 차 항체는 토끼에서 제조한 항-FITC 항체였다 (DAKO, Mississauga, ON, Canada). 원칙적인 검출 시스템은 DAKO Envision 퍼옥시다제 표지 중합체 (DAKO, Mississauga, ON, Canada) 와 함께 크로모겐으로서 DAB 로 이루어졌고, 이는 갈색 침전물을 생성하는데 사용되었다. 음성 대조군은 1 차 항체의 부재 시 인접 섹션 상에서 전체 면역조직화학법 과정을 수행하는 것으로 이루어졌다. 슬라이드의 고력 (High powered) 이미지를 Nikon 현미경과 연결된 DVC 1310C 디지털 카메라를 사용해 캡처하였다. 전체 섹션의 이미지를 Leica DMLA 현미경이 장착된 LifeSpan proprietary 이미징 장치 (ALIAS system) 를 사용해 캡처하였다. 이미지를 Adobe Photoshop 을 사용해 TIFF 파일로서 저장하였다.
항체 (ch)ARH460-16-2-IgG1 은 showed strong 염색 of positive s at 2.5 ㎍/mL 에서 양성 인간 대조군 조직의 강한 염색을 보여주었고, 더 높은 농도의 항체에서 더 높은 배경을 나타내었다. 따라서, 2.5 ㎍/mL 의 농도가 추가의 면역조직화학법 연구에서 사용되었다. 마찬가지로, 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직은 동결 섹션보다 더 적은 배경 염색을 나타내었으며 ; 따라서, 고정된 조직을 추 가의 IHC 연구에서 사용하였다. 요약하자면, 제한된 수의 샘플 상에서의 최적화 연구를 통해, 인간 피부가 영장류 피부 조직보다 더 양성으로 염색되었지만, 신호는 포르말린-고정 조직의 영장류 및 인간 샘플 둘 다에 존재하였다.
16 가지 정상 인간 및 사이노몰구스 원숭이 (혈액, 골수, 뇌, 결장, 눈, 심장, 신장, 간, 폐, 골격근, 난소, 췌장, 피부, 비장, 정소 및 갑상선) 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 상에서 확장된 IHC 를 수행하였다 (도 9 및 10).
인간 샘플 내에서, (ch)ARH460-16-2-IgG1 은 하기 세포 유형에서 흐릿한 내지 중간 정도의 세포질 또는 막 염색을 나타내었다 : 중성구, 대식세포 및 림프구의 하위셋, 골수의 골수성 시리즈, 형질 세포의 하위셋, 유형 II 허파세포, 상피 케라틴세포 및 피부 부속지. 백질 트랙은 또한 희미하게 양성이었다. 희미한 핵 염색은 뉴런 및 신경교, 장 신경절 세포, 및 정소 및 호흡기 상피의 하나의 샘플 각각에서 나타났다. 다른 세포 유형 및 조직은 음성이었고, 이에는 적혈구 시리즈 및 거대핵세포, 뉴런 및 신경교, 결장 상피, 평활근, 내피, 섬유아세포, 대식세포 제외한 눈, 심장, 간, 난소, 췌장, 골격근, 림프구 및 비장의 내피, 및 갑상선을 포함하여 세포 유형 및 조직이 포함된다. IgG 아이소타입 대조군 항체는 테스트된 모든 인간 조직에서 음성이었다.
원숭이 조직에서, 인간 샘플과 비교해 많은 조직에 걸쳐서 핵 염색이 높은 수준으로 나타났다. 흐릿한 내지 중간 정도의 세포질 염색이 또한 중성구, 뉴런의 하위셋, 결장 외피 세포의 하위셋, 림프구 및 대식세포의 하위셋, 임시 집합관 (occasional collecting duct), 난소 및 눈의 다중 세포 유형, 및 정자세포에서 관찰되었다. 핵 염색은 세포질 염색에 대해서도 양성이었던 대부분의 세포 유형에서 나타났다. 하기 세포 유형은 세포질 또는 막 염색의 부재 시에 핵 염색을 나타내었다 : 신경교, 뇌막 세포, 심근 세포, 신 사구체 및 신 세뇨관 및 관 (duct) 에 있는 세포의 하위셋, 담즙관 상피, 호흡기 상피 및 허파세포, 및 랑게르한스 이자. 사이노몰구스 원숭이 조직에서의 IgG 아이소타입 대조군은 뉴런에서 흐릿한 핵 염색, 및 결장 및 백질관의 신경내분비 세포에서의 흐릿한 세포질 염색을 나타내었다.
2 개의 종 간의 염색 패턴을 비교할 경우, 사이노몰구스 원숭이 샘플의 증가된 핵 염색은 뉴런, 심근 세포, 신 세뇨관 외피, 및 담즙관을 포함한 다수의 세포 유형에 걸쳐서 분명하였다. 세포질 또는 막 염색을 사용해, 하기 차이가 관찰되었다 : 약하게 증가된 염색이 사이노몰구스 원숭이 결장 외피 세포, 뉴런, 난모세포 및 난소의 난모 상피, 및 정자세포에서 관찰되었다. 인간 골수 골수구 전구체는 사이노몰구스 원숭이 샘플에서의 초기 전구체보다 더 양성이었다. 말초 혈액 샘플, 폐, 골격근, 췌장, 피부, 비장, 및 갑상선을 포함한 다른 조직은 사이노몰구스 원숭이 및 인간 샘플 간에 유사한 염색을 나타내었다.
섹션 중 일부에서 관찰되는 핵 염색, 특히 사이노몰구스 원숭이 조직에서의 핵 염색을 알아보기 위해, 동결 섹션을 인간 및 사이노몰구스 원숭이 폐, 피부, 및 심장 조직 상에서 2.5, 1.25, 0.6, 0.3, 0.15, 0.08, 및 0.04 ㎍/mL 의 (ch)ARH460-16-2-IgG1 농도로 사용하여, 콜라겐 및 결합 조직에서의 배경을 감소시키면서 1 차 신호를 유지할 농도를 측정하고, 또한, 일부 포르말린-고정 조직에서 존재하는 핵 염색을 평가하였다. 다음, 상기 농도의 슬라이드를 상기 2 가지 종의 동일 기관의 포르말린-고정 조직 상에서의 이전 연구와 비교하였다.
1.5 ㎍/mL 의 농도에서, 핵 염색은 실질적으로 인간 및 영장류 포르말린-고정 조직 샘플 둘 다에서 감소되었고, 동결 샘플에서, 핵 염색은 대체로 없었고, 이는 포르말린-고정 조직에서는 널리 퍼져 있는 핵 염색이 방법 또는 고정화 인공물로 인해 인위적이었음을 강하게 제시하였다. 결론적으로, 키메라 항체 (ch)ARH460-16-2-IgG1 은 사이노몰구스 원숭이 정상 조직과 교차 반응한다.
실시예 6
교차 경쟁 연구
H460-16-2 및 AR37A335.8 (S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같음) 의 결합 특성을 추가로 특징화하기 위해, 항체 경쟁 실험을 웨스턴 블롯에 의해 수행하여, CD44 의 H460-16-2 및 AR37A335.8 이 유사한 또는 별개의 에피토프를 인지하는지 알아보았다. 500 ㎍ 의 MDA-MB-231 총 막 제제를, 2 개의 10% 폴리아크릴아마이드 젤의 각각의 전체 길이를 스패닝하는 (spanning) 제조 웰 콤 (comb) 을 사용하여 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE 를 하였다. 젤의 단백질을 4℃ 에서 2 시간 동안 150 V 에서 PVDF 막으로 옮겼다. 상기 막을 회전 플랫폼 상, 4℃ 에서 대략 17 시간 동안 TBST 중 5% 스킴 밀크를 사용해 블라킹하였다. 막을 대략 20 mL 의 TBST 로 2 회 세정하고, 상이한 프로빙 용액을 적용한 20 개의 개별 채널을 생성하는 웨스턴 멀티스크린 장치에 두었다. 이전에, 비오틴화된 H460-16-2 및 AR37A335.8 을 EZ-연결 NHS-PEO 고체상 비오틴화 키트 (Pierce, Rockford, IL) 를 사용해 제조하였다. 비오틴화된 H460-16-2 또는 비오틴화된 AR37A335.8 을 다양한 농도의 비-비오틴화된 항체와 혼합하여 1 차 항체 용액을 제조하였다. 구체적으로는, TBST 중 3% 스킴 밀크 내에 1 ㎍/mL 의 비오틴화된 H460-16-2 + 2 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 또는 1000 ㎍/mL 의 비-비오틴화된 항체를 함유하도록 용액을 제조하였다. 사용된 비-비오틴화된 항체는 H460-16-2, AR37A335.8 및 대조군 항체 1B7.11 (아이소타입 대조군, 항-TNP 쥣과 IgG1, 정제된 인-하우스 (in-house)) 이었다. 1 ㎍/mL 의 비오틴화된 AR37A335.8 을 함유하는 용액을 상기 열거된 동일 농도의 비-비오틴화된 항체 AR37A335.8, H460-16-2 및 대조군 항체 8B1B.1 (아이소타입 대조군, 항-블루텅 바이러스 (anti-bluetongue virus) 쥣과 IgG2b, 정제된 인-하우스) 와 함께 제조하였다.
1 차 항체 용액을 락킹 플랫폼 (rocking platform) 상, 실온에서 2 시간 동안 막 상의 개별 채널에서 인큐베이션하였다. 각각의 채널을 락킹 플랫폼 상에서 10 분 동안 TBST 로 3 회 세정하였다. TBST 내 3% 스킴 밀크 중 0.01 ㎍/mL 퍼옥시다제 접합된 스트렙타비딘 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 의 2 차 용액을 막 상의 각각의 채널에 적용하였다. 막을 락킹 플랫폼 상, 실온에서 1 시간 동안 2 차 용액 내에서 인큐베이션하였다. 각각의 채널을 락킹 플랫폼 상에서 10 분 동안 TBST 로 3 회 세정하였다. 막을 멀티스크린 장치에서 제거하고, 제조업자의 지시에 따라 향상된 화학발광 검출 용액 (GE Healthcare, Life Sciences 이전에는 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 과 함께 인큐베이션하였다. 다음, 막을 필름에 노출시키고 발색시켰다.
도 11 및 12 는 항체 경쟁 실험 결과를 나타낸다. 비오틴화된 H460-16-2 의 결합은 100 ㎍/mL 이상의 농도에서 비-비오틴화된 H460-16-2 와 혼합된 경우 경쟁적으로 억제되었으며 (100 X 초과 ; 도 11, 패널 A, 레인 1 ~ 5), 한편 비오틴화된 AR37A335.8 의 결합은 10 ㎍/mL 이상의 농도에서 비-비오틴화된 AR37A335.8 과 혼합된 경우 경쟁적으로 억제되었다 (10 X 초과 ; 도 12, 패널 B, 레인 6 ~ 10 은). 비오틴화된 H460-16-2 의 결합은 IgG1 아이소타입 대조군 항체를 함유하는 샘플 중 임의에서 억제되지 않았고 (도 11, 패널 C, 레인 11 ~ 15 는), 비오틴화된 AR37A335.8 의 결합은 IgG2b 아이소타입 대조군 항체를 함유하는 샘플 중 임의에서 억제되지 않았다 (도 12, 패널 C, 레인 11 ~ 15). 이는 동일한 비-비오틴화된 항체와 혼합된 비오틴화된 항체를 사용해 관찰된 결합 억제가 비-비오틴화된 항체에 의한 항원 결합 부위 점유로 인한 것이고, 과량의 항체 단독의 비-특이적 상호작용으로 인한 것은 아니라는 것을 지시한다. 비오틴화된 AR37A335.8 의 결합은 500 ㎍/mL 이상의 농도에서 비-비오틴화된 H460-16-2 와 혼합된 경우 경쟁적으로 억제되었고 (500 X 과량 ; 도 12, 패널 A, 레인 1 ~ 5), 비오틴화된 H460-16-2 의 결합은 테스트된 모든 농도에서 비-비오틴화된 AR37A335.8 과 함께 혼합된 경우 경쟁적으로 억제되었다 (도 11, 패널 B, 레인 6 ~ 10). 이들 결과는, H460-16-2 의 결합이 AR37A335.8 의 결합을 방지하고 또 반대로도 그러함을 지시한다. 전체적으로, 경쟁 웨스턴 블롯의 결과는 H460-16-2 및 AR37A335.8 에 의해 인지되는 CD44 분자의 에피토프가 서로 동일하거나 또는 공간적으로 매우 가까워서, 하나의 항체의 결합이 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 차단할 수 있음을 제시한다.
실시예 7
AR37A335.8 의 rhCD44 에의 결합 친화성의 측정
AR37A335.8 의 재조합 CD44 (rhCD44) 에의 결합 친화성을 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 에 의해 측정하였다.
재조합 인간 CD44/Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 를 표준 아민 커플링 과정을 사용해 고정하였다. CM5 센서 칩 (GE Healthcare, Piscataway, NJ USA 전에는 Biacore) 의 표면을 0.4 M EDC 및 0.1 M NHS 의 1:1 혼합물 104 ㎕ 을 주사하여 (유속 10 ㎕/분) 활성화시켰다. rhCD44 를 20 ㎍/mL (10 mM 나트륨 아세테이트에서 희석, pH 5.5) 농도에서 주사하여, 대략 500 RU 가 되게 하였다. 마지막으로, 119 ㎕ 의 1.0 M 에탄올아민-HCl pH 8.5 를 표면에 걸쳐서 주사하여, 센서 칩 표면 상의 비점유 활성화된 부위를 차단하였다. 다양한 농도의 AR37A335.8 항체를 주사하였다. 후속하는 주사를 위한 센서 칩 표면의 재생을 50 ㎕/분의 유속에서 70 초 동안 10 mM 글리신-HCl pH 2.0 을 주사하여 수행하였다. 항체를 러닝 완충액 (HBS-EP+, GE Healthcare, Piscataway, NJ USA 전에는 Biacore) 중에서 희석하고, 0.67 내지 667 nM 범위의 농도에서 단계 주사하고, 표면을 각각의 주기 사이에 재생하였다. 대조군으로서, 각각의 항체 농도를 또한, 표면상에 rhCD44 가 고정되지 않은 대조군 표면에 걸쳐서 주사하였다. Biacore T100 Evaluation Software 버전 1.1 을 사용하여, 동역학 분석을 수득된 센서그램 상에서 간단한 1:1 상호작용 모델을 사용하여 수행하였다. 결합 및 해리 상수를 사용하여, 항체의 KD 를 계산하였다. 실험을 Biacore T100 시스템 (GE Healthcare, Piscataway, NJ USA 전에는 Biacore) 을 사용해 수행하였다. 상기 실험 결과, AR37A335.8. 에 대해 0.09425 nM 의 KD 가 수득되었다 (도 13). 이들 결과는 AR37A335.8 이 하위-나노몰 범위에서 KD 값을 가지고, AR37A335.8 의 친화성이 H460-16-2 의 것보다 더 높음을 지시한다 (하기 실시예 10 참조). 결합 상수 (Ka) 및 해리 상수 (Kd) 를 또한 표로 나타내었다 (도 13).
실시예 8
포스포-RTK (수용체 타이로신 키나아제) 프로테옴 프로파일러 블롯
키메라 (ch)ARH460-16-2-IgG1 치료에 의해 영향을 받는 세포내 신호 경로를 규명하기 위해, (ch)ARH460-16-2-IgG1 로 처리된 세포의 파쇄물을 프로테옴 프로파일러 인간 포스포-RTK 항체 어레이 (ARY001, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) 를 사용해 스크리닝하였다.
세포의 처리 및 제조
이전의 연구 (S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같음) 는 중증의 조합된 면역결핍 (SCID) 마우스에서 성장한 MDA-MB-231 유방암세포를 사용한 유방암 이종 이식 모델에서 (ch)ARH460-16-2-IgG1 의 생체 내 효능을 나타내었다. 따라서, 세포내 신호 분자의 활성화를 위한 스크리닝을 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 수행하였다. MDA-MB-231 세포를 거의 풍부해질 정도로 배양하고, 인산염 완충 식염수 (PBS) 로 세정한 다음, 혈청 및 보충물-없는 배지에서 37℃ 에서 밤새 결핍시켰다 (starved). 이 후, (ch)ARH460-16-2-IgG1 (20 ㎍/mL) 또는 인간 IgG1 (Sigma- Aldrich, St. Louis, MI) (20 ㎍/mL) 을 세포에 첨가하고, 4℃ 에서 20 분 동안 결합되게 놔두었다. 다음, 태아 소 혈청 (FBS), L-글루타민 및 나트륨 피루베이트를 세포에 첨가하여 세포를 자극시키고, 그리하여, 10% FBS, 1% L-글루타민, 및 1% 나트륨 피루베이트의 최종 농도를 수득하도록 하였다. 세포를 37℃ 에서 인큐베이터에 넣고, 세포 파쇄물을 자극 후 1 시간째에 수합하였다. PBS 로 세포를 2 회 세정하고 NP-40 파쇄 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM EDTA, 1 mM 나트륨 오르토바나데이트, 10 ㎍/mL 아프로티닌, 10 ㎍/mL 루펩틴 (Leupeptin), 1% NP-40 (Igepal
Figure 112009073347197-pct00037
CA-630, Sigma-Aldrich, St. Louis, MI)) 에서 배양함으로써 파쇄물을 수합하였다. 상기 세포를 파이페팅에 의해 재현탁시키고, 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브에 옮기고, 4℃ 에서 30 분 동안 회전하면서 혼합하였다. 파쇄물을 14000 x g 에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 깨끗한 튜브에 옮겼다. 단백질 농도를 비신코닌산 (bicinchoninic acid, BCA) 단백질 어세이 (Pierce, Rockford, IL) 에 의해 측정하였다.
인간 포스포-RTK 항체 어레이
제조업자의 프로토콜에 따라 MDA-MB-231 세포 파쇄물을 사용해 인간 포스포-RTK 항체 어레이를 스크리닝하였다 (Third Revision, November 2005, R&D Systems 항체 어레이 ARY001). 간략하게는, 락킹 플랫폼 쉐이커 상에서 1 시간 동안 1.5 mL 의 어레이완충액 1 (Part no. 895477: R&D Systems 항체 어레이ARY001) 을 인큐베이션함으로써 각각의 인간 포스포-RTK 프로파일러 막을 제조하였다. 각각의 처리를 위해, 150 ㎍ 의 총 단백질을 어레이완충액 1 로 희석하여, 총 부피가 1.5 mL 이 되게 하였다. 상기 혼합물을 제조된 프로파일러 막으로 옮기고, 락킹 플랫폼 쉐이커 상에서 4℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음, 각각의 막을 1 X 세정 완충액 (25 X 스탁으로부터의 정제된 증류수에서 희석시킴, (Part no. 895003: R&D Systems 항체 어레이ARY001)) 에서 3 회 세정하고, 1 X 어레이완충액 2 (5X 어레이 완충액 2, Part no. 895478: R&D Systems 항체 어레이ARY001) 에서 희석시킨 1.5 mL 의 항-포스포-타이로신-HRP 검출 항체 혼합물 (Part no. 841403: R&D Systems 항체 어레이ARY001) 과 함께 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 1 X 세정 완충액으로 3 회 세정하고, 발색을 위해 ECL + 웨스턴 검출 시약 (GE Healthcare, Life Sciences, Piscataway, NJ) 에 노출시켰다. 막을 화학발광 필름 (Kodak, Cedex, France) 에 노출시키고, X-선 의료 프로세서를 사용해 발색시켰다. 발색된 X-선 필름 상의 포스포-RTK 어레이 데이타를 전달-모드 스캐너 상에서 필름을 스캐닝하고, 이미지 J 분석 소프트웨어 (Image J 1.37v, NIH) 를 사용하여 어레이이미지 파일을 분석함으로써 정량화하였다. 각각의 RTK 에 대해, 상응하는 이중 스폿에 대한 평균 픽셀 밀도를 계산하고, 막 상의 깨끗한 영역의 픽셀 밀도를 사용하여 배경 신호로부터 감하였다. (ch)ARH460-16-2-IgG1-처리 샘플의 평균 정상화된 픽셀 밀도를 각각의 상응하는 포스포-단백질 표적에 대한 인간 IgG1-처리 샘플인 아이소타입 대조군의 평균 정상화된 픽셀 밀도에 의해 나누어서, 상대적인 변화의 비율을 수득하였다. 포스포-단백질 신호 감소 % 를 1 로부터 상대적인 비율을 빼고, 100 을 곱하여 계산하였다.
(ch)ARH460-16-2-IgG1 과 함께 인큐베이션시킨 포스포-RTK 어레이의 결과를 도 14 에 나타내었다. 아이소타입 대조군과 비교하여, (ch)ARH460-16-2-IgG1 치료는 면역글로불린-형 및 EGF-형 도메인 1 (타이-1) 이 있는 RTK 타이로신 키나아제의 인산화의 감소를 유도하였다 (대략 51%). 타이-1 (Tie-1) 은 타이-2 와 함께, 혈관신생을 촉진시키는 성장 인자인 앤지오포이에틴에 대한 수용체를 형성한다. 앤지오포이에틴이 그의 수용체에 결합하면, 타이-1 및 타이-2 의 인산화, 및 세포 성장을 촉진하는 세포 신호의 개시를 유도한다. (ch)ARH460-16-2-IgG1 이 혈청 및 보충물에 의한 자극 시 타이-1 의 인산화를 유도한다는 사실은 (ch)ARH460-16-2-IgG1 이 앤지오포이에틴/타이-1/2 수용체 리간드 복합체의 활성화를 통한 세포 분화 및 종양 진행의 성장 인자 유도를 차단할 수 있음을 제시한다.
실시예 9
H460-16-2 의 인간화
당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 그리고 적절하다면 상기 방법에서 사용되는 효소의 사용에 대한 공급업자의 지시를 사용하여 재조합 DNA 기술을 수행하였다. 상세한 실험 방법이 또한 하기에 기술된다.
제조업자의 지시에 따라, Poly A Tract System 1000 mRNA 추출 키트 : (Promega Corp., Madison, WI) 를 사용하여 하이브리도마 H460-16-2 1 세포로부터 mRNA 를 추출하였다. mRNA 를 하기와 같이 역전사시켰다. 카파 경쇄에 대해, 5.0 ㎕ 의 mRNA 를 1.0 ㎕ 의 20 pmol/㎕ MuIgGVL-3' 프라이머 OL040 (도 15) 및 5.5 ㎕ 뉴클레아제 없는 물 (Promega Corp., Madison, WI) 과 혼합하였다. 람다 경쇄에 대해, 5.0 ㎕ 의 mRNA 를 1.0 ㎕ 의 20 pmol/㎕ MuIgGVL-3' 프라이머 OL042 (도 15) 및 5.5 ㎕ 뉴클레아제 없는 물 (Promega Corp., Madison, WI) 과 혼합하였다. 감마 중쇄에 대해, 5.0 ㎕ 의 mRNA 를 1.0 ㎕ 의 20 pmol/㎕ MuIgGVH-3' 프라이머 OL023 (도 16) 및 5.5 ㎕ 뉴클레아제 없는 물 (Promega Corp., Madison, WI) 과 혼합하였다. 모든 3 가지 반응 혼합물을 70℃ 의 열 사이클러 세트의 예열된 블록에서 5 분 동안 놔두었다. 이들을, 각각 4.0 ㎕ ImPromII 5 x 반응 완충액 (Promega Corp., Madison, WI), 0.5 ㎕ RNasin 리보뉴클레아제 억제제 (Promega Corp., Madison, WI), 2.0 ㎕ 25 mM MgCl2 (Promega Corp., Madison, WI), 1.0 ㎕ 10 mM dNTP 믹스 (Invitrogen, Paisley, UK) 및 1.0 ㎕ Improm II 역전사효소 (Promega Corp., Madison, WI) 에 첨가하기 전에 5 분 동안 얼음 상에서 차갑게 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5 분 동안 인큐베이션한 후, 1 시간 동안 42℃ 의 예열된 PCR 블록 세트에 옮겼다. 상기 후, 70℃ 에서 PCR 블록에서 15 분 동안 인큐베이션함으로써, 역전사효소를 가열 불활성화시켰다.
중쇄 및 경쇄 서열을 하기와 같이 cDNA 로부터 증폭시켰다. 37.5 ㎕ 10 x Hi-Fi Expand PCR 완충액 (Roche, Mannheim, Germany), 7.5 ㎕ 10 mM dNTP 믹스 (Invitrogen, Paisley, UK) 및 3.75 ㎕ Hi-Fi Expand DNA 중합효소 (Roche, Mannheim, Germany) 를 273.75 ㎕ 뉴클레아제 없는 물에 첨가하여, PCR 마스터 믹스를 제조하였다. 얼음 상에서 15 개의 얇은 벽의 PCR 반응 튜브에 상기 마스터 믹스를 21.5 ㎕ 분획에서 디스펜스하였다 (dispensed). 이들 튜브 중 6 개 에 2.5 ㎕ 의 MuIgVH-3' 역전사 반응 믹스 및 1.0 ㎕ 의 중쇄 5' 프라이머 풀 HA 내지 HF 를 첨가하였다 (프라이머 서열 및 프라이머 풀 구성원에 대해서는 도 16 참조). 또다른 7 개의 튜브에 2.5 ㎕ 의 MuIgKVL-3' 역전사 반응 및 1.0 ㎕ 의 경쇄 5' 프라이머 풀 LA 내지 LG 를 첨가하였다 (도 15). 마지막 튜브에 2.5 ㎕ 의 MuIgKVL-3' 역전사 반응물 및 1.0 ㎕ 의 람다 경쇄 프라이머 MuIgλL5'-LI 를 첨가하였다. 반응물을 열 사이클러의 블록에 놔두고, 95℃ 로 2 분 동안 가열하였다. 중합효소 사슬 반응 (PCR) 을 94℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 1 분, 및 72℃ 에서 30 초의 40 주기 동안 수행하였다. 마지막으로, PCR 산물을 72℃ 에서 5 분 동안 가열한 다음, 4℃ 에서 유지시켰다.
증폭 산물을 pGEM-T 이지 (easy) 벡터 시스템 I (Promega Corp., Madison, WI) 키트를 사용해 pGEM-T 이지 벡터로 클로닝하고, 서열화하였다. 생성 VH 및 VL 서열을 각각 도 17 및 18 에 나타내었다.
키메라 항체 제조를 위해, VH 영역 유전자를 프라이머 OL437 및 OL438 을 사용한 PCR 에 의해 증폭하고 (도 19) ; 주형으로서 cDNA 클론 중 하나의 플라스미드 DNA 를 사용하여 5' MluI 및 3' HindIII 제한 효소 부위에서 조작하도록 이들을 디자인하였다. 0.5 mL PCR 튜브에, 5 ㎕ 10 X Hi-Fi Expand PCR 완충액 (Roche, Mannheim, Germany), 1.0 ㎕ 10 mM dNTP 믹스 (Invitrogen, Paisley, UK), 0.5 ㎕ 의 프라이머 OL437, 0.5 ㎕ 의 프라이머 OL438, 1.0 ㎕ 주형 DNA 및 0.5 ㎕ Hi-Fi Expand DNA 중합효소 (Roche, Mannheim, Germany) 를 41.5 ㎕ 뉴클레아제 없는 물에 넣어서 첨가하였다.
올리고뉴클레오타이드 OL439 및 OL090 (도 20) 을 사용하여 VL 영역을 유사한 방법으로 증폭시켜, BssHII 및 BamHI 제한 효소 부위애서 조작하였다. 반응물을 열 사이클러의 블록에 두고, 95℃ 로 2 분 동안 가열하였다. 중합효소 사슬 반응 (PCR) 반응을 94℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 1 분, 및 72℃ 에서 30 초의 30 주기 동안 수행하였다. 마지막으로, PCR 산물을 72℃ 에서 5 분 동안 가열한 다음, 4℃ 에서 유지시켰다. 다음, VH 및 VL 영역 PCR 산물을 각각 MluI/HindIII 및 BssHII/BamHI 부위에서 이중 벡터 pANT18 로 클로닝하였다 (도 21).
pANT18 은 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 발현 카세트 및 dhfr 선택 유전자를 함유하는 pAT153-기재 플라스미드이다. 중쇄 카세트는 하류 인간 IgG polyA 영역이 있는 hCMVie 프로모터에 의해 구동되는 인간 게놈 IgG1 불변 영역 유전자로 이루어진다. 경쇄 카세트는 하류 경쇄 폴리A 영역이 있는 hCMVie 프로모터에 의해 구동되는 게놈 인간 카파 불변 영역으로 이루어진다. 인간 Ig 리더 서열 및 불변 영역 간의 클로닝 부위는 가변 영역 유전자의 삽입을 허용한다. pANT18 은 또한, 하류 SV40 폴리A 영역과 함께 SV40 프로모터로 구동되는 햄스터 dhfr 유전자를 함유한다.
긴 오버래핑 (overlapping) 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR 용 마우스 H460-16-2 VH 및 VL 주형을 사용해, 동종 인간 VH 및 VL 서열로부터 아미노산을 도입하도록 인간화된 V 영역 유전자를 구축하였다. 변이체 인간화된 VH 및 VL 서열의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 각각 표 19 및 20 에 나타나 있다. 인간화된 변이체를 또한, 발현 벡터 pANT18 에 바로 클로닝하였다. 인간화된 VH 및 VL 변이체용 서열을 각각 도 22 및 23 에 나타낸다.
생성 키메라 (ch)ARH460-16-2 (VK0VH0), 및 인간화된 구축물을 전기천공에 의해 CHO/dhfr- 세포 (ECACC, 94060607) 에 트랜스펙션하고 매질에서 선별하였다 (L-글루타민 및 Na 피루베이트가 있는 높은 글루코스 DMEM (Invitrogen, Paisley, UK) + 5% 투석된 FBS (Cat No. 26400-044 Invitrogen, Paisley, UK), 프롤린 (Sigma, Poole, UK) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Paisley, UK), 하이폭산틴 및 티미딘은 없음). 하기 기술된 인간 IgG1/카파 캡처 ELISA 에 의해 측정되는 매질에서 분비되는 인간 IgG 의 수준을 바탕으로 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 확장시키고, 제조업자 권고 조건에 따라 항체를 1 mL HiTrap MabSelect SuRe 칼럼 (GE Healthcare, Amersham, UK) 을 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. + 4℃ 에서의 보관 전에 (PBS pH 7.4), 정제된 항체를 필터 멸균여과하였다.
표준으로서 정제된 인간 IgG1/카파 (Sigma, Poole, UK) 를 사용하여 hIgG1/카파 캡처 ELISA 에 의해 항체의 농도를 계산하였다. Immunosorb 96 웰 플레이트 (Nalge nunc, Hereford, UK) 를 1 X PBS (pH 7.4) 에서 1:1500 으로 희석시킨 마우스 항-인간 IgG Fc-특이적 항체 (I6260 Sigma, Poole, UK) 로 37℃ 에서 1 시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS + 0.05% Tween 20 에서 3 회 세정한 다음, 2% BSA/PBS 에서 희석시킨 샘플 및 표준을 첨가하엿다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBS/Tween 에서 3 회 세정하고, 2% BSA/PBS 에 서 1:1000 으로 희석시킨 100 ㎕/well 의 검출 항체 염소 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다제 컨쥬게이트 (A7164 Sigma, Poole, UK) 를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBS/Tween 에서 5 회 세정하고, 결합된 항체를 OPD 기질 (Sigma, Poole, UK) 을 사용해 검출하였다. 어세이를 암실에서 5 분 동안 발색시킨 후, 3 M HCl 을 첨가하여 중지시켰다. 다음, 어세이 플레이트를 MRX TCII 플레이트 판독기 (Dynex Technologies, Worthing, UK) 에서 490 nm 에서 판독하였다.
키메라 (ch)ARH460-16-2 (VK0VH0), 및 인간화된 변이체 항체를 H460-16-2 마우스 항체를 사용한 ELISA-기재 경쟁 어세이에서 테스트하고, 비오틴태그 마이크로 비오틴화 키트 (Sigma, Poole, UK) 를 사용해 비오틴화하였다. 비오틴화된 마우스 H460-16-2 를 사용하여, 다양한 농도의 경쟁 항체의 존재 하에 재조합 인간 CD44 (R&D systems, Abingdon, UK) 에 결합시켰다. 재조합 인간 CD44 를 Immunosorb 96 웰 마이크로타이터 플레이트 (Nalge nunc, Hereford, UK) 상에서 0.05 M 탄산염 완충액 pH9.0 (Sigma, Poole, UK) 중 5 ㎍/mL 에서 +4 ℃ 에서 밤새 고정시켰다. 비오틴화된 마우스 H460-16-2 항체를 0.2 ㎍/mL 로 희석시키고, 0 ~ 20 ㎍/mL 범위의 농도의 동일 부피의 경쟁 항체와 혼합하였다. CD44 플레이트를 PBS + 0.05% Tween 20 내에서 3 회 세정하였다. 100 ㎕ 의 항체 혼합물을 CD44 코팅된 플레이트의 웰에 옮기고, 이를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정하고, 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트 (Sigma, Poole, UK) (1:500 에서 희석) 및 TMB 기질 (Sigma, Poole, UK) 을 첨가하여 결합된 비오틴화 된 마우스 H460-16-2 를 검출하였다. 어세이를 암실에서 5 분 동안 발색시킨 후, 3 M HCl 을 첨가하여 정지시켰다. 다음, 어세이 플레이트를 MRX TCII 플레이트 판독기 (Dynex Technologies, Worthing, UK) 에서 450 nm 흡광도에서 판독하였다. 흡광도를 테스트 항체 농도에 대하여 플롯팅화하여, 도 24 에 나타낸 차트를 수득하였다. 키메라 (ch)ARH460-16-2 (VK0VH0) 항체 및 2 개의 인간화된 변이체는 재조합 CD44 에의 결합에 대한 비오틴화된 H460-16-2 항체와 경쟁하는데 있어서 마우스 H460-16-2 항체에 상응하는 것으로 나타났다.
실시예 10
쥣과 H460-16-2 및 (hu)ARH460-16-2 변이체의 rhCD44 에의 결합 친화성의 측정
H460-16-2, (hu)ARH460-16-2 변이체 1 및 (hu)ARH460-16-2 변이체 2 의 결합 친화성을 재조합 CD44 (rhCD44) 에의 결합 후의 각각의 해리 상수의 측정에 의해 비교하였다.
재조합 인간 CD44/Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 를 표준 아민 커플링 과정을 사용해 고정시켰다. CM5 센서 칩 (GE Healthcare, Piscataway, NJ USA 전에는 Biacore) 의 표면을 0.4 M EDC 및 0.1 M NHS 의 1:1 혼합물 104 ㎕ 를 주사하여 (유속 10 ㎕/분) 활성화시켰다. rhCD44 를 20 ㎍/mL (10 mM 나트륨 아세테이트 pH 5.5 에서 희석시킴) 의 농도에서 주사하여, 대략 500 RU 가 되게 하였다. 마지막으로, 119 ㎕ 의 1.0 M 에탄올아민-HCl pH 8.5 를 표면에 걸쳐서 주사하여, 센서 칩 표면상의 비점유 활성화된 부위를 차단하였다. 다양한 농도 의 H460-16-2, (hu)ARH460-16-2 변이체 1 또는 (hu)ARH460-16-2 변이체 2 를 주사하였다. 후속한 주사 후의 센서 칩 표면의 재생은, 50 ㎕/분의 유속에서 70 초 동안 10 mM 글리신-HCl pH 2.0 을 주사함으로써 수행하였다. 항체를 러닝 완충액 (HBS-EP+, GE Healthcare, Piscataway, NJ USA 전에는 Biacore) 에서 희석하고, 0.67 내지 667 nM 의 다양한 농도에서 단계 주사하고, 표면을 각각의 주기 사이에서 재생하였다. 대조군으로서, 각각의 항체 농도를 또한 rhCD44 가 표면상에 고정되지 않은 대조군 표면에 걸쳐서 주사하였다. Biacore T100 Evaluation Software 버전 1.1 을 사용하여, 동역학 분석을 간단한 1:1 상호작용 모델을 사용한 수득한 센서그램 상에서 수행하였다. 결합 및 해리 상수를 사용하여, 항체의 KD 를 계산하였다. Biacore T100 시스템 (GE Healthcare, Piscataway, NJ USA 전에는 Biacore) 을 사용해 실험을 수행하였다. 이들 실험 결과는 쥣과 H460-16-2 에 대해 4.19 nM 의 값을 수득한 한편, (hu)ARH460-16-2 변이체 HV1/KV1 및 (hu)ARH460-16-2 변이체 HV2/KV1 에 대한 KD 는 각각 6.32 및 3.17 nM 인 것으로 나타났다 (도 25). 이들 결과는, 모든 항체가 나노몰 범위에서 KD 를 가지며, 인간화된 항체의 친화성은 모 쥣과 H460-16-2 의 친화성과 유사함을 지시한다. 결합 상수 (Ka) 및 해리 상수 (Kd) 를 또한 표로 나타내었다 (도 25).
실시예 11
경쟁적 결합제의 단리
항체가 주어지면, 당업자는 경쟁적으로 억제성인 CDMAB, 예를 들어 동일한 에피토프를 인지하는 경쟁적 항체를 제조할 수 있다 (Belanger L 등 Clinica Chimica Acta 48:15-18 (1973)). 한 방법은 항체에 의해 인지되는 항원을 발현하는 면역원을 사용한 면역화를 수반한다. 샘플에는 조직, 단리된 단백질(들) 또는 세포주(들) 가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 생성 하이브리도마는 경쟁 어세이를 사용해 스크리닝될 수 있으며, 이는 테스트 항체의 결합을 억제시키는 항체를 규명하는 어세이, 예컨대 ELISA, FACS 또는 웨스턴 블롯팅이다. 또다른 방법은 파지 디스플레이 항체 라이브러리를 사용할 수 있고, 상기 항원의 하나 이상의 에피토프를 인지하는 항체를 패닝할 수 있다 (Rubinstein JL 등 Anal Biochem 314:294-300 (2003)). 어떤 경우에도, 항체는 그의 표적 항원의 하나 이상의 에피토프에 본래 표지된 항체가 결합하는 것을 대체하는 능력을 바탕으로 선택된다. 따라서, 상기 항체는 본래 항체로서 항원의 하나 이상의 에피토프를 인지하는 특징을 가질 것이다.
실시예 12
H460-16-2 모노클로날 항체의 가변 영역의 클로닝
H460-16-2 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 의 가변 영역의 서열을 이미 측정하였다 (S.N. 11/364,013 에서 개시된 바와 같음). 키메라 및 인간화된 IgG 를 제조하기 위해, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 발현용 적절한 벡터로 하위클로닝할 수 있다 (상기 실시예 9 에서 개시된 바와 같음).
또다른 구현예에서, H460-16-2 또는 그의 탈면역화된, 키메라 또는 인간화된 버전은 유전자도입된 동물에서 항체를 암호화하는 핵산을 발현시킴으로써 제조되어, 상기 항체는 발현 및 회복될 수 있다. 예를 들어, 항체는 회복 및 정제를 유용하게 하는 조직 특이적 방식으로 발현될 수 있다. 한 상기 구현예에서, 본 발명의 항체는 락테이션 (lactation) 동안에 분비용 포유류 선 (gland) 에서 발현된다. 유전자도입 동물에는 마우스, 염소 및 토끼가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
(i) 모노클로날 항체
모노클로날 항체를 암호화하는 DNA (상기 실시예 9 에서 개시된 바와 같음) 는 통상의 과정을 사용해 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리 및 서열화된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA 는 발현 벡터로 위치할 수 있고, 그런 다음 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 (simian) COS 세포, 차이니즈 햄스터 (Chinese hamster) 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 (트랜스펙션되지 않는다면 면역글로불린 단백질을 생성하지 않음) 로 트랜스펙션되어, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득할 수 있다. DNA 는 또한, 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인용 암호화 서열을 동종 쥣과 서열 대신에 치환함으로써 개질될 수 있다. 키메라 또는 하이브리드 항체는 또한, 가교 연결제를 수반하는 방법을 포함하여, 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 사용해 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 이황화 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 상기 목적을 위한 적합한 시약의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트가 포함된다.
(ii) 인간화된 항체
인간화된 항체는 비-인간 공급원의 것에 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기를 종종 "임포트 (import)" 잔기라고 하며, 이들은 전형적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 가져온 것이다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신에 치환함으로써 Winter 및 동료의 방법으로 수행될 수 있다 (Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science 239:1534-1536 (1988); Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000) 에서 리뷰).
인간화된 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 3차 모델을 사용한 모 서열 및 다양한 개념상의 인간화된 산물의 분석에 의해 제조될 수 있다. 3 차 면역글로불린 모델이 보통 이용가능하고, 당업자에게 친숙하다. 컴퓨터 프로그램은 이용하여, 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3 차 배열 구조를 예시하고 나타낸다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열이 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이로써, FR 잔기가 칸센서스 및 임포트 서열로부터 선택 및 조합되어, 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들) 에 대한 증가된 친화성이 달성될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접 및 가장 실질적으로 관여한다.
(iii) 항체 절편
항체 절편의 제조를 위해 다양한 기술이 개발되었다. 이들 절편은 제조합 숙주 세포에 의해 제조될 수 있다 (Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999); Little 등, Immunol. Today 21:364-370 (2000) 에서 리뷰). 예를 들어, Fab'-SH 절편은 이. 콜라이로부터 직접 회수될 수 있고, 화학적으로 커플링되어, F(ab')2 절편을 형성할 수 있다 (Carter 등, Biotechnology 10:163-167 (1992)). 또다른 구현예에서, F(ab')2 는 루신 지퍼 GCN4 를 사용해 형성되어, F(ab')2 분자의 조립을 촉진한다. 또다른 연구에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab') 2 절편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다.
실시예 13
본 발명의 항체를 포함하는 조성물
본 발명의 항체는 암 예방/치료용 조성물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는 암 예방/치료용 조성물은 액체 제제의 형태로 있는 그대로 투여되거나, 또는 적합한 제제의 약학적 조성물로서 인간 또는 포유류 (예를 들어, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 경구로 또는 비경구로 (예를 들어, 혈관내로, 복강내로, 피하로 등) 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 그 자체로 투여될 수 있거나, 적절한 조성물로서 투여될 수 있다. 투여에 사용되는 조성물은 약물학적으로 허용가능한 담체를 본 발명의 항체 또는 그의 염, 희 석제 또는 부형제와 함께 함유할 수 있다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 약학적 제제의 형태로 제공된다.
비경구 투여용 조성물의 예는 주사 제제, 좌제 등이다. 주사 제제는 투여량 형태, 예컨대 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 드립 인퓨전, 관절내 주사 등을 포함할 수 있다. 이러한 주사가능한 제제는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사가능한 제제는 주사에 통상 사용되는 본 발명의 항체 또는 그의 염을 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서, 예를 들어, 생리학적 식염수, 글루코스 및 기타 보조제를 함유하는 등장성액 등이 있으며, 이는 적절한 용해제 예컨대 알콜 (예를 들어, 에탄올), 다가알콜 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 수소화된 캐스터 오일의 HCO-50 (폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가물, 폴리소르베이트 80)) 등과 함께 사용될 수 있다. 오일 매질로서, 예를 들어, 참기름, 대두유 등이 사용되고, 이는 벤질 벤조에이트, 벤질 알콜 등과 같은 용해제와 함께 사용될 수 있다. 그렇게 해서 제조된 주사액은 보통 적절한 앰플에 채워진다. 직장 투여에 사용되는 좌제는 본 발명의 항체 또는 그의 염을 통상의 좌제용 베이스와 함께 혼화하여 제조될 수 있다. 경구 투여용 조성물은 고체 또는 액체 제제, 구체적으로, 정제 (당의정 및 필름코팅 정제), 알약, 과립, 분말 제제, 캡슐 (연질 캡슐 포함), 시럽, 유화제, 현탁액 등을 포함한다. 상기 조성물은 알려진 방법에 의해 제조되고, 약학적 제제 분야에서 통상 사용되는 비히클, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 정제용 비히클 또는 부형제의 예는 락토스, 전분, 수크로스, 마그네슘 스테아레이트 등이다.
유리하게는, 상기 기술된 경구 또는 비경구 용도용 조성물은 활성 성분의 투여량을 맞추도록 된 단위 투여량으로 약학적 제제로 제조된다. 상기 단위 투여량 제제는 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사액 (앰플), 좌제 등을 포함한다. 함유되는 상기 화합물의 양은 투여량 단위 형태 당 일반적으로 5 내지 500 mg 이고 ; 상기 기술된 항체가 약 5 내지 약 100 mg 으로 특히 주사 형태로 함유되고, 다른 형태로는 10 내지 250 mg 으로 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체를 포함하는 상기 예방/치료제 또는 조절제의 투여량은 투여되는 대상, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 치료/예방 목적으로 예를 들어, 유방암 성인 환자에서 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 mg/kg 체중 및 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5 mg/kg 체중, 약 1 내지 5 회/일, 바람직하게는 약 1 내지 3 회/일의 투여량으로 정맥내로 투여하는 것이 유리하다. 다른 비경구 및 경구 투여에서, 제제는 상기 주어진 투여량에 상응하는 투여량으로 투여될 수 있다. 상태가 특히 심각한 경우, 투여량은 상태에 따라 증가될 수 있다.
본 발명의 항체는 그대로, 또는 적절한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 투여에 사용되는 조성물은 약물학적으로 허용가능한 담체를 상기 항체 또는 그의 염, 희석제 또는 부형제와 함께 함유할 수 있다. 상기 조성물은 경구 또는 비 경구 투여에 적합한 약학적 제제의 형태로 제공된다 (예를 들어, 정맥내 주사, 피하 주사 등). 상기 기술된 각각의 조성물은 다른 활성 성분을 추가로 함유할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 다른 약물과 병용해서 사용될 수 있으며, 이의 예는 알킬화제 (예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드 등), 대사성 안타고니스트 (예를 들어, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 등), 항-종양 항생제 (예를 들어, 마이토마이신, 아드라마이신 등), 식물-유래 항-종양제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈데신, 택솔 등), 시스플라틴, 카르보플라틴, 에토포사이드, 이리노테칸 등이다. 상기 기술된 본 발명의 항체 및 약물은 환자에 동시에 또는 시간 간격을 두고 투여될 수 있다.
본원에서 기술된 치료 방법, 특히 암 치료 방법은 또한 다른 항체 또는 화학치료제의 투여와 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, EGFR 에 대한 항체, 예컨대 ERBITUX
Figure 112009073347197-pct00038
(세툭시마브) 는 특히 결장 암의 치료 시 투여될 수 있다. ERBITUX
Figure 112009073347197-pct00039
는 또한, 건선의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 병용을 위한 다른 항체에는 특히 유방암 치료 시 허셉틴
Figure 112009073347197-pct00040
(트라스투주마브), 특히 결장암 치료 시 AVASTIN
Figure 112009073347197-pct00041
, 및 특히 비소세포폐암 치료 시 SGN-15 가 포함된다. 본 발명의 항체를 다른 항체/화학치료제와 함께 투여하는 것은 동일 또는 상이한 경로를 통해 동시에 또는 따로 발생할 수 있다.
유용한 화학치료제/다른 항체 섭생은 환자의 상태의 치료에 최적으로 적합하다고 생각되는 섭생을 포함한다. 상이한 악성물은 특정 항-종양 항체 및 특이 적 화학치료제의 사용을 필요로 할 수 있고, 이는 환자 대 환자 기준에 따라 결정될 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 화학치료는 항체 치료법과 함께 동시에, 또는 더욱 바람직하게는 이어서 투여된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 방법 또는 투여 경로에 제한되지 않음을 강조해야 할 것이다.
증거의 우세함은, H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG2 및 (ch)ARH460-16-2-IgG1 이 CD44 상에 존재하는 에피토프의 연결을 통해 항-암 효과를 매개한다는 것을 보여준다. H460-16-2 항체가 발현 세포, 예컨대 MDA-MB-231 세포로부터의 동종 (cognate) 항원을 면역침전시키는데 사용될 수 있다는 것은 이미 나타나 있다 (S.N. 10/647,818, 현재 미국 특허 제 7,189,397 호에서 개시된 바와 같음). 추가로, FACS, 세포 ELISA 또는 IHC 에 의해 예시되는 기술 (그러나 이에 제한되지 않음) 을 사용한, H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG2, (ch)ARH460-16-2-IgG1, (ch)ARH460-16-2 (VK0VH0) 또는 인간화된 변이체, (hu)ARH460-16-2 는 그에 특이적으로 결합하는 CD44 항원성 부분을 발현하는 세포 및/또는 조직의 검출에 사용될 수 있음을 보여줄 수 있다.
H460-16-2 항체와 함께, 다른 항-CD44 항체는 CD44 항원의 다른 형태를 면역침전 및 단리하는데 사용될 수 있고, 상기 항원은 또한, 동일 유형의 어세이를 사용하여 항원을 발현하는 세포 또는 조직에의 상기 항체의 결합을 억제시키는데 사용될 수 있다.
Figure 112009073347197-pct00042
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속한 기술분야의 당업자의 수준의 지표이다. 모든 특허 및 공개물은 본원에서, 각각의 개별 공개물이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로써 삽입된 것과 동일한 범위로 참조로써 삽입된다.
본 발명의 특정 형태는 예시되는 한편, 본원에서 기술되고 나타난 부분의 특정 형태 및 배열에 제한되지 않음을 이해한다. 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 본 발명이 명세서에서 나타나고 기술된 것에 제한되는 것이 아님을 알게 될 것이다. 당업자는 본 발명이 언급 된 목적 및 이점, 뿐만 아니라 그에 본래부터 타고난 것들을 수득하고 목적을 수행하는데 잘 적응됨을 쉽게 알게 될 것이다. 본원에서 기술된 임의의 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 폴리펩타이드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 과정 및 기술은 현재 바람직한 구현예의 대표이고, 실례인 것으로 생각되며, 범주에 제한을 두려는 것은 아니다. 그에 관한 변화 및 다른 용도는 당업자에게 일어날 것이고, 이는 본 발명의 취지에 포함되고, 첨부된 청구항의 범주에 의해 정의된다. 본 발명이 구체적인 바람직한 구현예와 함께 기술되었더라도, 청구된 본 발명은 그러한 구체적인 구현예에 과도하게 제한되지 않아야 함을 이해해야 할 것이다. 실제로, 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식에 대한 다양한 변형은 하기 청구항의 범주 내에 있는 것이다.
<110> YOUNG, DAVID S. F. FINDLAY, HELEN P. HAHN, SUSAN E. CECHETTO, LISA M. MCCONKEY, FORTUNATA <120> CYTOTOXICITY MEDIATION OF CELLS EVIDENCING SURFACE EXPRESSION OF CD44 <130> 2056.091 <140> 11/807,887 <141> 2007-05-30 <150> 11/364,013 <151> 2006-02-28 <150> 10/810,165 <151> 2004-03-26 <150> 10/647,818 <151> 2003-08-22 <150> 10/603,000 <151> 2003-06-23 <150> 09/727,361 <151> 2000-11-29 <150> 09/415,278 <151> 1999-10-08 <160> 68 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Glu Val Asn Pro Asp Ser Thr Ser Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Pro Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Gly Glu Val Asn Pro Asp Ser Thr Ser Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Pro Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr His Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (27) <223> Inosine <400> 13 atgaggrccc ctgctcagwt tyttggnwtc tt 32 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 atgggcwtca agatgragtc acakwyycwg g 31 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 atgagtgtgc ycactcaggt cctggsgtt 29 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 atgtggggay cgktttyamm cttttcaatt g 31 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (6) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (12) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (18) <223> Inosine <400> 18 atgagnmmkt cnmttcantt cytggg 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (12) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (24) <223> Inosine <400> 19 atgakgthcy cngctcagyt yctnrg 26 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 20 atggtrtccw casctcagtt ccttg 25 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 21 atgtatatat gtttgttgtc tatttct 27 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 22 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 29 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 atggatttwc argtgcagat twtcagctt 29 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 atggtyctya tvtccttgct gttctgg 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 atggtyctya tvttrctgct gctatgg 27 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 actggatggt gggaagatgg a 21 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 atggcctgga ytycwctywt mytct 25 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (15) <223> Inosine <400> 28 agctcytcwg wgganggygg raa 23 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 atgrasttsk ggytmarctk grttt 25 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 atgraatgsa sctgggtywt yctctt 26 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 atggactcca ggctcaattt agttttcct 29 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 atggctgtcy trgbgctgyt cytctg 26 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 atggvttggs tgtggamctt gcyattcct 29 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 atgatggtgt taagtcttct gtacct 26 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 atgaagwtgt ggbtraactg grt 23 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (15) <223> Inosine <400> 39 atggratgga sckknrtctt tmtct 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 atgaacttyg ggytsagmtt grttt 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 atgtacttgg gactgagctg tgtat 25 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 atgagagtgc tgattctttt gtg 23 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 atggattttg ggctgatttt ttttattg 28 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (21) <223> Inosine <400> 44 ccagggrcca rkggatarac ngrtgg 26 <210> 45 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Val Asn Pro Asp Ser Thr Ser Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Gln Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Asp 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Ser Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Pro Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr His Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Lys 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 gttgctacgc gtgtccactc cgaggtgaag ctgctcgagt ctggaggtgg cctggtgcag 60 cctggaggct ccctg 75 <210> 48 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 cccagaaagc ttacctgagg aaacggtgac tgagg 35 <210> 49 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 gttgctacgc gtgtccactc cgaggtgcag cttgtcgagt ctggaggtgg cctggtgc 58 <210> 50 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 ctggaggtgg cctggtgcag cctggaggct ccctgagact ctcctgtgca gcctcagg 58 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 gggaaagggc tagtgtgggt tggagaagt 29 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 ccacactagc cctttccctg gagcc 25 <210> 53 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 tacgctgtac ctgcaaatga acagcctgag agctgaagac acagccgtgt attactg 57 <210> 54 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 atttgcaggt acagcgtatt tttggcgttg tctctggaga tggtgaatct atcctt 56 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 cccagaaagc ttacctgagg aaacggtgac cagggttcct tg 42 <210> 56 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 ctggaggtgg cctggtgcag cctggaggct ccctgagact ctcc 44 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 gggaaagggc tagtgtggat tggagaagt 29 <210> 58 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 atttgcaggt acagcgtatt tttggcgttg tctctggaga tggtgaattg 50 <210> 59 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 tcccaggcgc gcgatgtgat atccagatga cacagac 37 <210> 60 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 ctgccaggat ccaactgagg aagcaaagtt taaattctac tcacgtttta tttccaactt 60 tgtccccg 68 <210> 61 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 tcccaggcgc gcgatgtgat atccagatga cacagtctcc atcctccctg tctg 54 <210> 62 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 ctccatcctc cctgtctgcc tctgtgggag acagagtcac catcacttgc ag 52 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cagaaaccag gtaaagctcc taaactcctg 30 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 caggagttta ggagctttac ctggtttctg 30 <210> 65 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 cagcctgcag cctgaagata ttgccactta ctattgccaa c 41 <210> 66 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 tcttcaggct gcaggctgct aatggtgaaa gtaaaatctg ttc 43 <210> 67 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 gtttaaattc tactcacgtt ttatttccaa ctttgtcccc tggccgaacg 50 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 taagctcctg atctataatg c 21

Claims (58)

  1. 하기를 포함하는, ATCC 수탁 번호 PTA-4621 을 갖는 하이브리도마 세포주 H460-16-2 에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체와 동일한 인간 CD44 의 에피토프 또는 에피토프들에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체, 또는 그의 인간 CD44 결합 절편:
    SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 및 SEQ ID NO:3 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO:6 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 하기를 포함하는, ATCC 수탁 번호 PTA-4621 을 갖는 하이브리도마 세포주 H460-16-2 에 의해 생성되는 단리된 모노클로날 항체와 동일한 인간 CD44 의 에피토프 또는 에피토프들에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체, 또는 그의 인간 CD44 결합 절편 :
    SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 및 SEQ ID NO:3 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO:6 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    인간 항체 또는 인간 항체 칸센서스 골격 (consensus framework) 의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 골격 영역.
  3. 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:9 의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 SEQ ID NO:8 로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD44 에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체, 또는 그의 인간 CD44 결합 절편.
  4. 하기를 병용해서 포함하는, 인간 췌장, 전립선, 난소, 유방 또는 결장 종양의 치료에 효과적인 조성물:
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 CDMAB;
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 절편과 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 조혈성 세포으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원과의 컨쥬게이트; 및
    필요한 양의 약물학적으로 허용가능한 담체.
  5. 하기를 병용해서 포함하는, 인간 유방 또는 전립선 종양의 치료에 효과적인 조성물 :
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 CDMAB; 및
    필요한 양의 약물학적으로 허용가능한 담체.
  6. 하기를 병용해서 포함하는, 인간 유방 또는 전립선 종양의 치료에 효과적인 조성물:
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체, 항원 결합 절편, 또는 CDMAB 와 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 조혈성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원과의 컨쥬게이트 ; 및
    필요한 양의 약물학적으로 허용가능한 담체.
  7. 인간 암성 종양의 존재를 검출하기 위한 어세이 키트로서,
    여기서, 상기 인간 암성 종양은 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하고,
    상기 CDMAB 는 상기 항체가 그의 표적 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제시키는 능력에 의해 특징지어지며,
    상기 키트는 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 CDMAB, 및 상기 항체 또는 그의 CDMAB가 폴리펩타이드에 결합하는지 검출하기 위한 수단을 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 특정 컷-오프 수준에서의 존재가 상기 인간 암성 종양 존재의 진단이 되는 것인 키트.
  8. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체에 의해 특이적으로 결합되는, 인간 종양에서 선택된 조직 샘플 내 암성 세포의 존재를 측정하기 위한 결합 어세이:
    상기 인간 종양의 조직 샘플을 제공하는 단계 ;
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 중 하나 이상을 제공하는 단계;
    하나 이상의 상기 항체 또는 그의 CDMAB 를 상기 조직 샘플과 접촉시키는 단계 ; 및
    상기 하나 이상의 항체 또는 그의 CDMAB 와 상기 조직 샘플과의 결합을 측정하고,
    그로 인해, 상기 조직 샘플 내 상기 암성 세포의 존재가 지시되는 단계.
  9. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체에 의해 특이적으로 인지되는 CD44 를 발현하는 세포의 존재를 측정하기 위한 결합 어세이:
    세포 샘플을 제공하는 단계 ;
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체를 제공하는 단계 ;
    상기 항체를 상기 세포 샘플과 접촉시키는 단계 ; 및
    상기 항체 또는 그의 CDMAB와 상기 세포 샘플과의 결합을 측정하고,
    그로 인해, 상기 항체 또는 그의 CDMAB에 의해 특이적으로 결합되는 CD44 의 항원을 발현하는 세포의 존재를 측정하는 단계.
  10. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체에 의해 특이적으로 결합되는 영장류 조직 샘플 내에서의 세포의 존재를 측정하기 위한 결합 어세이:
    상기 영장류의 조직 샘플을 제공하는 단계 ;
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체의 하나 이상을 제공하는 단계 ;
    하나 이상의 상기 항체 또는 그의 CDMAB를 상기 조직 샘플과 접촉시키는 단계 ; 및
    상기 하나 이상의 항체 또는 그의 CDMAB와 상기 조직 샘플과의 결합을 측정하고,
    그로 인해, 상기 조직 샘플 내 상기 암성 세포의 존재가 지시되는 단계.
  11. 하기 단계를 포함하는, 세포의 표면상에서 CD44 의 하나 이상의 에피토프를 발현하고, 하나 이상의 에피토프가 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 상기 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편에 의해 결합되는 경우 세포 세포독성을 초래하는, 암성 세포의 성장 및 생존을 감소시키는 생체외 방법:
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 상기 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편을 제공하는 단계 ; 및
    상기 암성 세포를 상기 항체 또는 상기 항원 결합 절편과 접촉시키고,
    그로 인해, 상기 항체 또는 상기 항원 결합 절편과 상기 CD44 의 하나 이상의 에피토프와의 결합 결과 세포독성이 발생하는 단계.
  12. 하기 단계를 포함하는, 세포의 표면상에 CD44 의 하나 이상의 에피토프를 발현하고, 하나 이상의 에피토프가 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 상기 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편에 의해 결합되는 경우 세포 세포독성을 초래하는, 암성 세포의 성장 및 생존을 감소시키는 생체외 방법 :
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 상기 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편의 결합을 경쟁적으로 억제시키고, CD44 의 상기 하나 이상의 에피토프에 의해 결합되는 경우 세포 세포독성을 초래하는 항체를 제공하는 단계 ; 및
    상기 암성 세포를 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 상기 항원 결합 절편과 접촉시키고,
    그로 인해, 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체 또는 상기 항원 결합 절편과 CD44 의 상기 하나 이상의 에피토프와의 결합 결과 세포독성이 발생하는 단계.
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