CN111044722A - 一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒,由胚胎漂洗液、胚胎固定液、透膜液、封闭液、阴性对照、初级抗体、二级抗体、细胞核染色液及制片液9种试剂组成。属于细胞学、生物技术领域。通过荧光染色检测小鼠囊胚细胞总数和内细胞团细胞数，以评估辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology,ART）用耗材、试剂、仪器设备以及环境的质量。为辅助生殖技术的质量控制提供了一种敏感和有效的检测手段，也为辅助生殖技术及生殖研究提供了参考标准。
Description
技术领域
本发明涉及细胞学、生物技术领域，具体地说涉及一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒。
背景技术
辅助生殖技术的基本概念是通过配子的体外受精及胚胎体外培养，获得优质胚胎移植于母体子宫，从而怀孕的全部过程。从获取配子到胚胎移植的全部过程发生在体外，因此需要模拟体内的外部环境及营养条件。这些外部因素包括了处理配子及胚胎的各种耗材、培养液、仪器设备甚至空气环境等，并且必需符合辅助生殖技术整个流程的质量要求，以获得高质量的胚胎。目前常规的检测手段是鼠胚试验(Mouse embryo assay，MEA)，其基本指标是囊胚形成率。然而这些指标已不能完全符合辅助生殖技术质量标准的要求。例如，小鼠受精卵在低氧浓度(5％)的条件下培养能获得更好的胚胎发育力，但是小鼠受精卵在5％和20％氧浓度的条件下培养96小时都能获得相同的囊胚形成率。这种传统的标准也不能鉴别不同培养条件、培养液种类、器械耗材、操作流程等因素对胚胎发育的影响。因此，需要进一步改良完善MEA，检测从配子到胚胎移植的外部因素，以保证配子正常受精和胚胎体外发育，获得优质胚胎用于胚胎移植。基于这个要求，本发明一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒充分优化了各个试剂，合理搭配，是一种有效实用的检测手段，用于评估辅助生殖技术整个流程中外部因素的质量控制。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种检测试剂盒，具体地说涉及一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒，为评估辅助生殖技术整个流程中外部因素的质量控制提供一种有效敏感的检测手段。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒，由9种试剂组成。
优选地，所述9种试剂中的胚胎漂洗液由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、0.01％(体积/体积)TWEEN-20和水组成，其pH是7.4。
具体配制方法如下：根据需要胚胎漂洗液的体积，计数出各成分的体积或重量。按以下顺序配制：
1)称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾粉末，加相应体积的水，室温下采用磁力或其它搅拌方式下使粉末充分溶解；
2)按体积比加TWEEN-20按计数出的其它成分的或重量，加入并充分混匀；
3)酸碱滴定，调整pH值至7.4，过滤去杂质；
4)分装，2-8℃储存，待用。
优选地，所述9种特殊的试剂中的胚胎固定液由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、加2％多聚甲醛组成(pH值为7.4)；
具体配制方法如下：
根据需要胚胎固定液的体积，计数出各成分的体积或重量，按以下顺序配制；
1)称量多聚甲醛粉末，加相应体积的水，及1：1000体积的1毫摩尔氢氧化钠(NaOH)，加温在50-70℃，采用磁力或其它搅拌方式下使多聚甲醛粉末充分溶解；
2)按计数出的重量，称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾粉末，加入并充分混匀；
3)酸碱滴定，调整pH值至7.4，过滤去杂质；
4)分装，2-8℃储存，待用。
优选地，所述9种试剂中的透膜液由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、2％多聚甲醛组成、0.3％TWEEN-20和0.2％TRITON x100组成。
具体配制方法如下：
根据需要胚胎固定液的体积，计数出各成分的体积或重量。按以下顺序配制；
1)称量多聚甲醛粉末，加水及1：1000体积的1毫摩尔氢氧化钠,加温在50-70℃，采用磁力或其它搅拌方式下使多聚甲醛粉末充分溶解；
2)按计数出的重量，称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾粉末，加入并充分混匀；
3)酸碱滴定，调整pH值至7.4，滤过去杂质；
4)按体积比，加入TWEEN-20和TRITON X 100；
5)分装，2-8℃储存，待用。
优选地，所述9种试剂中的封闭液由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、2％BSA、30％与二级抗体同源的动物血清和水组成。
具体配制方法如下：根据需要封闭液液的体积，计数出各成分的体积或重量。按以下顺序配制：
1)称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、BSA粉末和水，室温下采用磁力或其它搅拌方式下使粉末充分溶解；过滤去杂质；
2)按体积比加与二级抗体同源的动物血清，并充分混匀；
3)分装，2-8℃储存，待用。
优选地，所述9种试剂中的阴性对照由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、2％BSA、2微克/毫升的与初级抗体同源的免疫球蛋白和水组成。
具体配制方法如下：根据初级抗体的体积，计数出各成分的体积或重量，按以下顺序配制：
1)称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、BSA粉末和水，室温下采用磁力或其它搅拌方式下使粉末充分溶解；滤过去杂质；
2)按重量/体积比加与初级抗体同源的免疫球蛋白，充分混匀；
3)分装，2-8℃储存，待用。
优选地，所述9种试剂中的初级抗体由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、2％BSA、2微克/毫升的特征性识别小鼠囊胚内细胞团生物标记的初级抗体和水组成。
具体配制方法如下：根据初级抗体的体积，计数出各成分的体积或重量。按以下顺序配制：
1)称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、BSA粉末和水，室温下采用磁力或其它搅拌方式下使粉末充分溶解，滤过去杂质；
2)按重量/体积比加识别小鼠囊胚内细胞团生物标记蛋白的初级抗体，如抗NANOG、抗UTF1，充分混匀；
3)分装，2-8℃储存，待用。
优选地，所述9种试剂中的二级抗体由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、2％BSA、1：100抗初级抗体的二级抗体和水组成。
具体配制方法如下：根据二级抗体的体积，计数出各成分的体积或重量，按以下顺序配制：
1)称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、BSA粉末和水，室温下采用磁力或其它搅拌方式下使粉末充分溶解，滤过去杂质。
2)按1：100体积比加抗初级抗体、偶接荧光素的二级抗体，充分混匀；
3)分装，2-8℃避光储存，待用。
优选地，所述9种试剂中的胚胎细胞核染色液由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、水和与二级抗体不同荧光素的DNA染色剂组成。
具体配制方法如下：根据二级抗体的体积，计数出各成分的体积或重量，按以下顺序配制：
1)称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和水，室温下采用磁力或其它搅拌方式下使粉末充分溶解，滤过去杂质。
2)按重量/体积比加与水和与二级抗体不同荧光素的DNA染色剂，充分混匀。如：10微克/毫升的Hoechst 33342、0.5微克/毫升的Propidium Iodine组成和10微克/毫升的DAPI；
3)分装，2-8℃避光储存，待用。
优选地，所述9种试剂中的封片液由137毫摩尔氯化钠、2.7毫摩尔氯化钾、10毫摩尔磷酸氢二钠、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、水和荧光淬灭剂组成。
具体配制方法如下：根据封片液的体积，计数出各成分的体积或重量，按以下顺序配制：
1)称量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和水，室温下采用磁力或其它搅拌方式下使粉末充分溶解，滤过去杂质；
2)按1：1体积比加荧光淬灭剂，加入并充分混匀；
3)分装，2-8℃避光储存，待用。
有益效果：本发明是一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒，用于辅助生殖技术中体外受精及胚胎培养系统所用的耗材、液体、仪器设备及环境的质量控制，包括9种试剂。通过鼠胚试验的囊胚免疫荧光染色和细胞核DNA染色，进行内细胞团细胞数及囊胚总细胞数计数，以检测辅助生殖技术所用的耗材、液体、仪器设备及环境等对囊胚质量的影响；评估及优化体外受精及胚胎体外培养系统，为辅助生殖技术流程的标准化提供了一种敏感的检测手段。
附图说明
图1用本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测目前临床常用的3种胚胎培养液对胚胎体外培养的影响，比较不同培养液的质量。
图1A所示囊胚形成率、囊胚总细胞数和内细胞团细胞数；图1B所示囊胚内细胞团细胞的免疫荧光染色，封闭液含30％山羊血清，初级抗体为2微克/毫升兔抗NANOG多克隆IgG，二级抗体为1:100偶联FITC荧光素的山羊抗兔IgG。细胞核染色液中含10微克/毫升Hoechst33342。*P<0.01，比较其它两种培养液的相应结果。
图2利用本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测新开发的辅助生殖技术用胚胎移植导管的胚胎毒性，以确定其是否符合辅助生殖技术用耗材的质量要求。
图2A胚胎移植导管示意图，分导管柄(A)，体(B)和软管部(C)。图2B所示囊胚形成率、囊胚总细胞数和内细胞团细胞数；图2C所示囊胚内细胞团细胞的免疫荧光染色，封闭液含30％山羊血清，初级抗体为2微克/毫升兔抗UTF1多克隆IgG，二级抗体为1:100偶联TexasRed荧光素的山羊抗兔IgG。细胞核染色液中含10微克/毫升Hoechst33342。
图3用本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测氨基酸对胚胎发育的影响，以确定其是否符合辅助生殖技术用培养液的质量要求，开发新的辅助生殖技术用胚胎培养液。
对比试验结果如图3。图3A所示囊胚形成率、囊胚总细胞数和内细胞团细胞数；图3B所示囊胚内细胞团细胞的免疫荧光染色，封闭液含30％山羊血清，初级抗体为2微克/毫升兔抗NANOG多克隆IgG，二级抗体为1:100偶联FITC荧光素的山羊抗兔IgG。细胞核染色液中含0.5微克/毫升Propidium Iodine。*P<0.01,比较无氨基酸培养液的相应结果。
图4用本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测环境(氧浓度)对胚胎发育的影响，以优化辅助生殖技术培养体系的氧浓度，改善胚胎发育。
对比试验结果如图4。图4A所示囊胚形成率、囊胚总细胞数和内细胞团细胞数；图4B所示囊胚内细胞团细胞的免疫荧光染色，封闭液含30％山羊血清，初级抗体为2微克/毫升兔抗OCT3/4多克隆IgG，二级抗体为1:100偶联FITC荧光素的山羊抗兔IgG。细胞核染色液中含10微克/毫升DAPI。*P<0.01,比较20％氧浓度的相应结果。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1
用本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测目前临床常用的几种胚胎培养液对胚胎体外培养的影响，并比较不同培养液的质量。
1.检测的培养液是目前市场上常用的三种辅助生殖技术用的胚胎培养液是：(1)M16培养液；(2)瑞利芙(Vitrolife，www.vitrolife.com)培养液，(G-1TMPLUS，G-2TMPLUS)和(3)库克(COOK，www.cookmedical.com)培养液(K-SICM,K-SIBM)。
2.检测流程：
1)小鼠受精卵收集：注射hCG后20小时断颈处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集受精卵。将收集到的絮状受精卵团放置到透明质酸酶(150μg/mL)中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即取出。用卵母细胞缓冲液清洗3次后，挑选出正常形态的胚胎，转移到培养液微滴中。
2)体外培养：采用微滴法培养，将收集到的鼠胚，置于预平衡的微滴中，于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。以鼠胚数为10个，在10微升大小的液体微滴培养的密度为标准。
3)试验结果及基本指标观察：小鼠受精卵在37℃恒温、5％CO2保湿培养箱中培养共96小时。受精卵在M16培养液中连续培养96小时；在Vitrolife和Cook培养液中分程培养，前48小时在第一个培养液(分别是G-1TMPLUS，K-SICM)中,而后转移至第二个培养液(分别是G-2TMPLUS，K-SIBM)培养48小时。通过胚胎的形态学特点，记录并计算出受精卵培养96小时后囊胚形成率。
3.利用本发明的囊胚细胞染色和计数试剂盒进行进一步检测。
1)利用本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液在室温下漂洗胚胎3次，以去除胚胎培养液成分；
2)将胚胎移至本试剂盒的第二个试剂胚胎固定液中，室温下固定胚胎30分钟；
3)将胚胎移至本试剂盒的第三个试剂透膜液中，在室温下30分钟使细胞膜通透化；
4)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
5)将胚胎移至本试剂盒的第四个试剂封闭液，在室温下孵化2小时以封闭非特异性的抗体结合位点；
6)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
7)将5个胚胎移至本试剂盒的第五个试剂阴性对照中，在4℃环境下与阴性对照结合12小时；
8)将胚胎移至本试剂盒的第六个试剂初级抗体中，在4℃环境下与初级抗体结合12小时；
9)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
10)将胚胎移至本试剂盒的第七个试剂二级抗体中，在室温并避光的条件下与二级抗体结合1小时；
11)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
12)将胚胎移至本试剂盒的第八个试剂细胞核染色液中，在室温并避光的条件下染色20分钟，以确定细胞核的位置和细胞数。
13)将胚胎移至本试剂盒的第九个试剂制片液，制片；置于室温避光条件下10分钟；采用荧光显微镜技术检查表达内细胞团细胞生物标记蛋白的细胞数和细胞核DNA染色的囊胚总细胞数。
对比试验结果如图1。图1A所示囊胚形成率，所示的细胞总数和内细胞团细胞数；图1B所示囊胚内细胞团细胞的免疫荧光染色，封闭液含30％山羊血清，初级抗体为2微克/毫升兔抗NANOG多克隆IgG，二级抗体为1:100偶联FITC荧光素的山羊抗兔IgG。细胞核染色液中含10微克/毫升Hoechst33342。从图1可见，按照传统鼠胚试验的要求，受精卵在三种不同培养液中培养96小时后都到达了80％以上的囊胚形成率，符合了目前辅助生殖技术标准。然而每个囊胚的总细胞数和内细胞团细胞数在统计学上是不同的。在M16培养液中形成的囊胚有较低的细胞数及内细胞团细胞数。这说明三种不同培养液存在质量差异，也说明本发明的试剂盒通过囊胚细胞总数和内细胞团细胞数的检测是一个更敏感的检测手段，更能正确反映胚胎的质量。
实施例2
利用本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测新开发的辅助生殖技术用胚胎移植导管的胚胎毒性，以确定其是否符合辅助生殖技术用耗材的质量要求。
检测耗材为胚胎移植导管，可以由几个不同的部件组成。这些部件的原材料也可能不同。检测流程如下：
1.按不同的部件，作浸提液制备。
按照中国国家标准(YYT1434-2016)，在无菌条件下，用无菌器具将导管剪段，并分别剪碎，分别置于培养瓶内称量；按0.2克/毫升比例加入M16胚胎培养液，在37℃避光条件下，在摇床上72小时,把可能的物质浸提出来。
2.鼠胚试验:测试组为不同的胚胎移植导管部件的浸提液及不同部件浸提液的混合；对照组为无导管材料浸提的培养液(M16胚胎培养液作为对照)。
1)小鼠受精卵收集：注射hCG后20小时断颈处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集受精卵。将收集到的絮状受精卵团放置到透明质酸酶(150μg/mL)中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即取出。用缓冲液清洗3次后，挑选出正常形态的胚胎，转移到培养微滴中。
2)体外培养：采用微滴法培养，将收集到的鼠胚，置于预平衡的微滴中，于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。以鼠胚数为10个，在10微升大小的液体微滴培养的密度为标准。
3)试验结果及基本指标观察：小鼠受精卵培养在37℃恒温、5％CO2保湿培养箱中培养共96小时。通过胚胎的形态学特点记录并计算出受精卵培养96小时后囊胚形成率。
3.利用本发明的囊胚细胞染色和计数试剂盒进行进一步检测。
1)利用本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液在室温下漂洗胚胎3次，以去除胚胎培养液成分；
2)将胚胎移至本试剂盒的第二个试剂胚胎固定液中，室温下固定胚胎30分钟；
3)将胚胎移至本试剂盒的第三个试剂透膜液中，在室温下30分钟使细胞膜通透化；
4)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
5)将胚胎移至本试剂盒的第四个试剂封闭液，在室温下孵化2小时以封闭非特异性的抗体结合位点；
6)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
7)将5个胚胎移至本试剂盒的第五个试剂阴性对照中，在4℃环境下与阴性对照结合12小时；
8)将胚胎移至本试剂盒的第六个试剂初级抗体中，在4℃环境下与初级抗体结合12小时；
9)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
10)将胚胎移至本试剂盒的第七个试剂二级抗体中，在室温并避光的条件下与二级抗体结合1小时；
11)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
12)将胚胎移至本试剂盒的第八个试剂细胞核染色液中，在室温并避光的条件下染色20分钟，以确定细胞核的位置和细胞数。
13)将胚胎移至本试剂盒的第九个试剂制片液，制片；置于室温避光条件下10分钟；采用荧光显微镜技术检查表达内细胞团细胞生物标记蛋白的细胞数和细胞核DNA染色的囊胚总细胞数。
试验结果如图2所示。图2A胚胎移植导管示意图，分导管柄、体和软管部。图2A所示囊胚形成率、囊胚总细胞数和内细胞团细胞数；图2C所示囊胚内细胞团细胞的免疫荧光染色，封闭液含30％山羊血清，初级抗体为2微克/毫升兔抗UTF1多克隆IgG，二级抗体为1:100偶联Texas Red荧光素的山羊抗兔IgG。细胞核染色液中含10微克/毫升Hoechst33342。从图2所示，按照传统鼠胚试验的要求，受精卵在对照组培养液、三种胚胎移植导管部件的浸提液和中培养96小时后都到达了80％以上的囊胚形成率，符合了目前辅助生殖技术标准。而囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数在统计学上与对照组(M16培养液)相比无显著差异。这说明三种胚胎移植导管部件和整个导管都符合本实验检测要求，对胚胎无毒性作用。
实施例3
用本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测某种特定胚胎培养液成分对胚胎发育的影响，以确定其是否符合辅助生殖技术用培养液的质量要求，开发新的辅助生殖技术用胚胎培养液。
检测的胚胎培养液成分为氨基酸。以传统的KSOM培养液为基础，比较KSOM培养液中加入全部必需氨基酸和非必需氨基酸后胚胎发育的影响，以确定是否氨基酸可以作为胚胎培养液的一个组份，改善辅助生殖技术的胚胎培养体系。检测流程如下：
1.受检产品为KSOM培养液加必需氨基酸和非必需氨基酸；对照组为KSOM培养液。
2.鼠胚试验:
1)小鼠受精卵收集：注射hCG后20小时断颈处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集受精卵。将收集到的絮状受精卵团放置到透明质酸酶(150μg/mL)中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即取出。用缓冲液清洗3次后，挑选出正常形态的胚胎，转移到培养微滴中。
2)体外培养：采用微滴法培养，将收集到的鼠胚，置于预平衡的微滴中，于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。以鼠胚数为10个，在10微升大小的液体微滴培养的密度为标准。
3)试验结果及基本指标观察：小鼠受精卵培养在37℃恒温、5％CO2保湿培养箱中培养共96小时。通过胚胎的形态学特点记录并计算出受精卵培养96小时后囊胚形成率。
3.利用本发明的囊胚细胞染色和计数试剂盒进行进一步检测。
1)利用本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液在室温下漂洗胚胎3次，以去除胚胎培养液成分；
2)将胚胎移至本试剂盒的第二个试剂胚胎固定液中，室温下固定胚胎30分钟；
3)将胚胎移至本试剂盒的第三个试剂透膜液中，在室温下30分钟使细胞膜通透化；
4)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
5)将胚胎移至本试剂盒的第四个试剂封闭液，在室温下孵化2小时以封闭非特异性的抗体结合位点；
6)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
7)将5个胚胎移至本试剂盒的第五个试剂阴性对照中，在4℃环境下与阴性对照结合12小时；
8)将胚胎移至本试剂盒的第六个试剂初级抗体中，在4℃环境下与初级抗体结合12小时；
9)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
10)将胚胎移至本试剂盒的第七个试剂二级抗体中，在室温并避光的条件下与二级抗体结合1小时；
11)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
12)将胚胎移至本试剂盒的第八个试剂细胞核染色液中，在室温并避光的条件下染色20分钟，以确定细胞核的位置和细胞数。
13)将胚胎移至本试剂盒的第九个试剂制片液，制片；置于室温避光条件下10分钟；采用荧光显微镜技术检查表达内细胞团细胞生物标记蛋白的细胞数和细胞核DNA染色的囊胚总细胞数。
对比试验结果如图3。图3A所示囊胚形成率，所示的细胞总数和内细胞团细胞数；图3B所示囊胚内细胞团细胞的免疫荧光染色，封闭液含30％山羊血清，初级抗体为2微克/毫升兔抗NANOG多克隆IgG，二级抗体为1:100偶联FITC荧光素的山羊抗兔IgG。细胞核染色液中含0.5微克/毫升Propidium Iodine。从图3可见，受精卵在不含氨基酸的KSOM培养液与含氨基酸的KSOM培养液的培养96小时后囊胚形成率都达到80％，符合鼠胚试验的要求，符合了目前辅助生殖技术标准。然而每个囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数在统计学上是不同的。受精卵在不含氨基酸的KSOM生成的囊胚有较低的细胞数及内细胞团细胞数。这说明氨基酸可以改善胚胎发育，是胚胎培养液的优选成分。
实施例4
用本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测环境(氧浓度)对胚胎发育的影响，以确定符合辅助生殖技术用培养液的质量要求的优化氧浓度，改善胚胎发育的环境。
受检的氧浓度为5％和20％。以传统的KSOM培养液为基础，以KSOM培养液为基础，小时受精卵在5％和20％两种不同的氧浓度中培养96小时，通过本试剂盒检测，以确定是哪一种氧浓度有利于改善胚胎体外培养，以获得更好的胚胎质量。检测流程如下：
1.受检的氧浓度为5％和20％。
2.鼠胚试验:
1)小鼠受精卵收集：注射hCG后20小时断颈处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集受精卵。将收集到的絮状受精卵团放置到透明质酸酶(150μg/mL)中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即取出。用缓冲液清洗3次后，挑选出正常形态的胚胎，转移到培养微滴中。
2)体外培养：采用微滴法培养，将收集到的受精卵胚，置于预平衡的两组KSOM微滴中，一组于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养；另一组于5％O2、饱和湿度的三气培养箱中培养。
3)以鼠胚数为10个，在10微升大小的液体微滴培养的密度为标准。
4)试验结果及基本指标观察：小鼠受精卵在两种氧浓度的37℃恒温、5％CO2保湿培养箱中培养共96小时。通过胚胎的形态学特点记录并计算出受精卵培养96小时后囊胚形成率。
3.利用本发明的囊胚细胞染色和计数试剂盒进行进一步检测。
1)利用本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液在室温下漂洗胚胎3次，以去除胚胎培养液成分；
2)将胚胎移至本试剂盒的第二个试剂胚胎固定液中，室温下固定胚胎30分钟；
3)将胚胎移至本试剂盒的第三个试剂透膜液中，在室温下30分钟使细胞膜通透化；
4)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
5)将胚胎移至本试剂盒的第四个试剂封闭液，在室温下孵化2小时以封闭非特异性的抗体结合位点；
6)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
7)将5个胚胎移至本试剂盒的第五个试剂阴性对照中，在4℃环境下与阴性对照结合12小时；
8)将胚胎移至本试剂盒的第六个试剂初级抗体中，在4℃环境下与初级抗体结合12小时；
9)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
10)将胚胎移至本试剂盒的第七个试剂二级抗体中，在室温并避光的条件下与二级抗体结合1小时；
11)将胚胎移至本试剂盒的第一个试剂胚胎漂洗液中，在室温下漂洗胚胎3次，每次10分钟；
12)将胚胎移至本试剂盒的第八个试剂细胞核染色液中，在室温并避光的条件下染色20分钟，以确定细胞核的位置和细胞数。
13)将胚胎移至本试剂盒的第九个试剂制片液，制片；置于室温避光条件下10分钟；采用荧光显微镜技术检查表达内细胞团细胞生物标记蛋白的细胞数和细胞核DNA染色的囊胚总细胞数。
对比试验结果如图4。图4A所示囊胚形成率，所示的细胞总数和内细胞团细胞数；图4B所示囊胚内细胞团细胞的免疫荧光染色，封闭液含30％山羊血清，初级抗体为2微克/毫升兔抗OCT3/4多克隆IgG，二级抗体为1:100偶联FITC荧光素的山羊抗兔IgG。细胞核染色液中含10微克/毫升DAPI。从图4可见，受精卵在20％与5％氧浓度的条件下，在KSOM培养液内培养96小时后囊胚形成率都达到80％，符合鼠胚试验的要求，符合了目前辅助生殖技术标准。然而每个囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数在统计学上是不同的。在较低(5％)氧浓度的条件下，受精卵在KSOM形成的囊胚有较高的细胞数及内细胞团细胞数。这说明低氧环境有利于改善胚胎发育，是胚胎体外培养的优选条件。也说明本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒检测环境(氧浓度)对胚胎发育的影响，以确定符合辅助生殖技术用培养液的质量要求的优化氧浓度，改善胚胎发育的环境。
本发明的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒可以用于检测辅助生殖技术用耗材、培养液及仪器设备、环境的质量，为辅助生殖技术的质量控制包括优化体外培养条件和体外培养液提供了较敏感而有效的手段。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒，其特征在于试剂盒由胚胎漂洗液、胚胎固定液、透膜液、封闭液、阴性对照、初级抗体、二级抗体、细胞核染色液及制片液9种特殊试剂组成，是辅助生殖技术质量控制的重要评估手段。
2.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，其中的胚胎漂洗液的组份是：125-145毫摩尔氯化钠（NaCl）、2.0-3.0 毫摩尔氯化钾（KCl）、8-12 毫摩尔磷酸氢二钠（Na2HPO4）、1.0-2.0 毫摩尔磷酸二氢钾（KH2PO4）、0.01-0.04%(体积/体积)聚山梨酯（TWEEN-20）和水;其pH值（酸碱度）为6.8–7.8。
3.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，其中的胚胎固定液的组份是：125-145毫摩尔氯化钠、2.0-3.0毫摩尔氯化钾、8-12毫摩尔磷酸氢二钠、1.0-2.0 毫摩尔磷酸二氢钾、1-5 %（重量/体积）多聚甲醛(Paraformaldehyde, PFA）和水; pH值为 7.0-7.8。
4.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，其中的透膜液的组份是：125-145毫摩尔氯化钠、2.0-3.0 毫摩尔氯化钾、8-12毫摩尔磷酸氢二钠、1.0-2.0 毫摩尔磷酸二氢钾、1-5 %（重量/体积）多聚甲醛Paraformaldehyde, PFA）、0.1-0.5%(体积/体积)TWEEN-20和0.1-0.4%(体积/体积)聚乙二醇对-（1,1,3,3-四甲基丁基）-苯基醚（TRITON X100）和水。
5.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，其中的封闭液是125-145毫摩尔氯化钠、2.0-3.0毫摩尔氯化钾、8-12毫摩尔磷酸氢二钠、1.0-2.0毫摩尔磷酸二氢钾、1-4 % (重量/体积)牛血清白蛋白(BSA)，10-40%（体积/体积)与二级抗体同源的血清和水组成。
6.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，其中的阴性对照的组份是：125-145毫摩尔氯化钠、2.0-3.0 毫摩尔氯化钾、8-12毫摩尔磷酸氢二钠、1.0-2.0 毫摩尔磷酸二氢钾、1-4% (重量/体积)牛血清白蛋白 (BSA)、与初级抗体同源同浓度的免疫球蛋白和水。
7.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，其中所述的的初级抗体组份是125-145毫摩尔氯化钠、2.0-3.0毫摩尔氯化钾、8-12毫摩尔磷酸氢二钠、1.0-2.0毫摩尔磷酸二氢钾、1-4%(重量/体积) 牛血清白蛋白(BSA)和水，加上1-10微克/毫升的初级抗体。
8.根据权利要求7所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂,其中所述的的初级抗体所含的初级抗体可以是任何一种特异性识别囊胚内细胞团细胞的抗体；如：1）抗NANOG；2)抗UTF1和3）抗OCT3/4等。
9.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，所述的二级抗体组份是125-145毫摩尔氯化钠、2.0-3.0 毫摩尔氯化钾、8-12毫摩尔磷酸氢二钠、1.0-2.0 毫摩尔磷酸二氢钾、1-4%(重量/体积)牛血清白蛋白(BSA)和水，加上1：100 - 1：500偶联荧光标记的抗初级抗体的二级抗体。
10.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，其中的细胞核染色液的组份是：125-145毫摩尔氯化钠、2.0-3.0 毫摩尔氯化钾、8-12毫摩尔磷酸氢二钠、1.0-2.0 毫摩尔磷酸二氢钾、DNA染色剂和水。
11.根据权利要求10所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂中的细胞核染色液所含的DNA染色剂，可以是任何一种DNA染色剂，如：1）1-50微克/毫升的双苯甲亚胺（Hoechst 33342 bis-Benzimide）；2）0.01-10.0微克/毫升的碘化丙啶（Propidium Iodine）；3）1-50微克/毫升的4'，6 -二脒-2 -苯基吲哚（DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole）。
12.根据权利要求1所述的一种辅助生殖技术用鼠胚试验囊胚细胞染色和计数试剂盒所述的9种试剂；其特征在于，其中的制片液组份是125-145毫摩尔氯化钠、2.0-3.0 毫摩尔氯化钾、8-12毫摩尔磷酸氢二钠、1.0-2.0 毫摩尔磷酸二氢钾、DNA染色剂和水，加抗淬灭剂，如DABCO。
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