JP5363464B2 - 癌細胞傷害性を介在するキメラ及びヒト化抗−ｃｄ４４抗体 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、癌性疾患の診断及び治療、具体的には、腫瘍細胞の細胞傷害性の介在に関し；及び最も具体的には、細胞傷害性応答を開始する手段としての、場合により、1以上のCDMAB/化学療法剤と組み合わせた、癌性疾患修飾抗体（CDMAB）の使用に関する。本発明は、本発明のCDMABを利用する、結合アッセイにも関する。
発明の背景
癌におけるCD44：ヒト白血球に対するモノクローナル抗体の産生は、CD44抗原の発見をもたらした；単一鎖ヒアルロン酸（HA）結合糖タンパク質は、幅広い正常組織において発現し、すべての種類の造血細胞において発現した。それはもともと、リンパ球活性化及びホーミングに関連した。現在、その推定上の生理学的役割も、炎症遺伝子の活性化、細胞周期の調整、細胞増殖の誘導、分化及び発達の誘導、細胞骨格再組織化及び細胞転移及びアポトーシスに対する細胞生存/耐性の誘導を含む。
ヒトにおいて、CD44の単一遺伝子コピーは、染色体の11、11p13の短アームに位置している。該遺伝子は19エキソンを含む；最初の５つのエキソンは定常であり、次の９つのエキソンは変異体であり、次の３つは定常であり、及び最後の２つは変異体である。差スプライシングは、1000個超の異なったアイソフォームを導くことができる。しかしながら、現在、数ダーズの天然変異体のみが同定されているにすぎない。
CD44標準糖タンパク質は、N-末端細胞外ドメイン（20 a.a.リーダー配列及び膜近辺領域（85 a.a.））（270 a.a.）、膜貫通型領域（21 a.a.）及び細胞テイル（72 a.a.）からなる。細胞外領域はまた、N-末端に連結モデュールを含む。この部位は、92 a.a.長であり、他のHA結合連結タンパク質とホモロジーを示す。マウスとヒトのCD44形態とには高いホモロジーが存在する。該タンパク質の変異体は、エキソン５のカルボキシ末端に挿入され、発現される時に細胞外に位置する。
CD44の血清溶解形態も、天然由来であり、ストップコドン（可変領域内の）又はタンパク質分解活性のいずれかから生じ得る。TNF-αを含む様々な刺激由来の細胞の活性化は、CD44受容体の排出を起こす。受容体の排出も腫瘍細胞でみられ、最大10-倍のCD44のヒト血清濃度の増加をもたらし得る。高いCD44血清濃度は、悪性を示唆する（卵巣は除外する）。
CD44の標準形態は、約37 kDの分子量で存在する。翻訳後修飾は、分子量を80〜90 kDに増加する。これらの修飾は、アスパラギン残基でのアミノ末端細胞外ドメインN-連結グルコシル化、細胞外ドメインのカルボキシ末端でのセリン/スレオニン残基でのO-連結グリコシル化、及びグルコサミノグルカン付加を含む。スプライス変異体は、80〜250 kDのサイズの範囲にあり得る。
HAは、哺乳動物の細胞外マトリックス（ECM）上に存在する多糖であり、主要なCD44リガンドであると考えられる。しかしながら、CD44は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミン等のタンパク質に結合することも見出されている。HA結合とグリコシル化との関係があるように思われる。不活性CD44（HAに結合しない）は、グルコシル化の最も高いレベルを有し、活性CD44（HAに結合する）は、最も低いレベルを有するが、誘導性CD44（サイトカイン、モノクローナル抗体、成長因子等によって活性化されない限り、HAに結合しないか又は弱く結合する）は活性形態と不活性形態との間にいくらかのグルコシル化レベルを有する。
CD44は、細胞の相互作用、刺激及び環境に依拠する、シグナル形質導入経路によってその機能の一部を介在することができる。これらの経路には、NFκBシグナルカスケード（炎症応答に関連する）、Ras-MAPKシグナル形質導入経路（細胞周期及び増殖を活性化することに関連する）、タンパク質のRhoファミリー（細胞骨格再構成及び細胞転移に関連する）及びPI3-K-関連シグナル経路（細胞生存に関連する）を含む。上記の機能のすべては、腫瘍疾患の開始及び進行に密接に関連する。CD44はまた、様々な追加のメカニズムを介して癌において役割を果たすことに関連してきた。これらは、悪性腫瘍に関連する受容体に対する、CD44の細胞表面上に存在する細胞表面プロテオグリカンによる成長因子、ケモカイン及びサイトカインの提示を含む。また、CD44-HA複合体の内在化後のリソソームヒアルロニダーゼによるHAの細胞内分解は、腫瘍侵襲性の可能性及びECMを介する脈管形成の誘導を潜在的に増加することができる。更に、生存又はアポトーシスシグナルの伝達は、標準的又は可変性CD44受容体のいずれかを介して起こることがわかっている。CD44は、細胞分化及び転移に関連することも示唆されている。これらのメカニズムの多くは、すべてではないが、環境であり、細胞依存的であり、いくつかは変動する発見を生じる。そのため、結論を導く前により多くの研究が要求される。癌におけるCD44の可能性のある機能的役割を評価するために、受容体の差発現が疾患進行と関連するか否かを決定するためにCD44の発現研究が行われた。しかしながら、主な腫瘍の種類において不一致の発見が観察され、これは、おそらく、試薬、技術、病的状態のスコアリング及び研究間の細胞種の相違の組み合わせに起因するのだろう。腎臓細胞腫瘍及び非-ホジキンリンパ腫は、高CD44発現腫瘍を有する患者が、一貫して、その低又は非-CD44発現相当物よりも数倍短く生存した、という点で例外であるようである。
癌とのその関連のために、CD44は、抗-癌療法の開発の標的となっている。CD44の標準形態又は変異体が腫瘍進行に必要とされるか否かについて依然として議論になっている。これら両方を支持するインビボ動物データがあり、それは、腫瘍の種類依存的でよく、細胞種依存的さえもよい。様々な治療的アプローチは、溶解性CD44タンパク質、ヒアルロン酸シンターゼcDNA、ヒアルロンニダーゼの注入、CD44アンチセンス及びCD44特異的抗体の使用を含む。各々のアプローチは、ある程度の成功をもたらし、それによって抗-CD44癌療法の支持を提供する。
変異体及び標準的CD44特異的モノクローナル抗体はいずれも、実験的に作成されたが、ほとんどの部分については、これらの抗体は、本質的な生物学的活性を有さず、むしろ、それらが認識するCD44の種類に特異的に結合する。しかしながら、インビトロ又はインビボのいずれかで活性であるが、一般的にその両方において活性でないものがある。いくつかの抗体-CD44抗体は、細胞事象を介在することがわかっている。例えば、ヒト赤血球ルター抗原CD44標準形態に対するネズミ抗体A3D8は、CD2（9-1抗体）及びCD3（OKT3抗体）介在T細胞活性化を亢進することがわかった；別の抗-CD44抗体は、同様の効果を有した。A3D8はまた、単球からのIL-1放出及びTリンパ球からのIL-2放出を誘導した。興味深いことに、ダウノルビシン、マイトキサントロン及びエトポシドのような薬物と併せたA3D8の使用は、第二メッセンジャセラミドの発生を排除することによってHL60及びNB4 AML細胞におけるアポトーシス誘導を阻害した。本質的な活性を有さずかつCD44の類似のエピトープに対する、J173抗体は、薬物-誘導アポトーシスを阻害しなかった。また、A3D8及び別の抗-CD44モノクローナル抗体、H90、並びにヒアルロナンは、急性骨髄性白血病（AML）患者からの白血病芽細胞の分化を誘導した。しかしながら、同一の試験では、CD44の標準形態にも結合するJ173抗体は、同一細胞の分化を誘導しなかった。興味深いことに、H90は、AML細胞がJ173によって結合されている患者のサブグループ由来のAML細胞に結合しなかった、このことは、これらの抗体が異なったエピトープを認識することを示している。別個の試験において、A3D8及びH90の両方は、いくつかのAMLから得られた細胞株の終分化を誘導した。CD44の85〜110 kD及び200 kD形態に対するNIH44-1抗体は、CD44の架橋又は凝集のいずれかとして著者が考える経路を介するT-細胞増殖を増強した。これらを考えると、癌療法としての使用に適しているような抗体が癌（例えばリンパ球を活性化する）に対するものでないので、癌療法としての使用に適しているような抗体が細胞増殖を誘発したり、あるいは細胞傷害物質と共に使用される時に癌細胞の薬物-誘発死を阻害した、との証拠は存在しない。
インビボでの抗腫瘍効果を証明するいくつかの抗-CD44抗体が記載されている。抗体H90は、ヒト赤血球（RBC）を用いるマウスの免疫によって作製され、CD44のすべてのアイソフォームに結合するとされている、マウスモノクローナル抗体である。ヒトAML細胞によって接種されている照射されたNOD-SCIDマウスへの、４週間に３回の、この抗体の投与は、これらの細胞による再増殖化を抑制した。加えて、これらの動物由来のAML細胞の連続継代は、細胞がH90抗体を用いる処置を経験した動物から得られた時に、レシピエントマウスを再増殖しなかった。この抗体の効果は、白血病性幹細胞の分化、AML細胞と好適な位置との関係を妨害することによって介在されると考えられる。加えて、ヒト臍帯血幹細胞による照射されたNOD-SCID動物の再増殖が該処置によって弱められなかった、このことは、抗体の選択的効果、及びAMLと正常造血幹細胞との重要な表現型差異を示すものである。
抗体1.1ASML、すなわちCD44のv6変異体に対するマウスIgG1は、ラット膵臓腺癌BSp73ASMLのリンパ節及び肺転移を減少させることがわかっている。付随して処置動物の生存が増加した。該抗体は、リンパ節コロニー形成前に投与される場合に効果的であるにすぎず、リンパ節での細胞増殖を妨害しないことを前提とした。インビトロでの腫瘍細胞に対する該抗体の直接的な細胞傷害性がなく、補体-介在細胞傷害性又は免疫エフェクタ細胞機能を亢進しなかった。ヒト細胞に対する抗体の利用性は記載されなかった。Breyer他は、垂直向性-移植ラットグリア芽細胞の進行を邪魔するための、CD44に対する商業的に利用可能な抗体を記載した。ラットグリア芽細胞株C6を前頭葉に移植し、１週間後に、ラットは、大脳内注入によって抗体による３つの処置を受けた。処置ラットは、減少した腫瘍成長、及びバッファー又はアイソタイプ対照処置ラットよりも重い体重を証明した。該抗体は、細胞外マトリックス成分でコートされたカバースリップに対するインビトロでの細胞接着を阻害することができたが、細胞に対する直接的な細胞傷害効果を有しなかった。この抗体は、ヒト細胞に対して試験されなかった。
CD44（IM-7.8.1）に対する抗体の有効性の、CD44v1O（K926）に対する抗体の有効性を比較した試験を行った。２つのD44アイソフォームを発現する高い転移性のネズミ黒色腫株B16F10を腹腔内でマウスに移植した。２日後に、試験期間の毎３日目に抗体を与えた。２つの抗体は、肺転移数において50パーセントよりも有意に高い減少を引き起こした：２つの抗体間の有効性に有意差はなかった。該抗体は、インビトロでの増殖に影響を与えなかった、そして、著者Zawadzki他は、腫瘍成長の阻害がCD44のそのリガンドとの相互作用をブロックする抗体に起因すると推測した。IM-7.8.1を用いる別の試験では、Zahalka他は、該抗体及びF（ab'）2フラグメントが、ネズミT-細胞リンパ腫LBによってリンパ節侵潤をブロックすることができたことを証明した。このことは、マウスに顕著な生存利益を与えた。Wallach-Dayan他は、自発的に腫瘍を形成しないLB-TRリンパ腫のトランスフェクションが、CD44v4-v10と腫瘍を形成する能力を与えた、ことを証明した。IM-7.8.1投与は、アイソタイプ対照抗体と比較して移植されたトランスフェクト細胞の腫瘍サイズを減少させた。これらの試験はいずれも、この抗体のヒト利用性を証明しなかった。
GKW. A3、すなわちマウスIgG2aは、ヒトCD44に特異的であり、SCIDマウスにおけるヒト悪性異種移植の形成及び転移を抑制する。該抗体は、転移性ヒト細胞株SMMU-2と混合し、次いで皮下的に注入した。処置は、次の３週間継続した。４週間後、10匹のネズミの内の１匹のみが、処置動物の100パーセントと比べて、照射部位で腫瘍を発症した。該抗体のF（ab'）2フラグメントは、腫瘍形成の同一の阻害を証明し、これは、作用のメカニズムは補体又は抗体-依存的細胞性細胞傷害性に依存しなかったことを示唆する。腫瘍細胞が第一の抗体注入の前１週間に注入される場合には、動物の80パーセントは、主要部位で腫瘍を発症した。しかしながら、生存期間がなお顕著に増加したことに注目した。遅れた抗体投与は主要な腫瘍形成に影響を与えなかったが、非処置動物に存在する、肺、腎臓、副腎、肝臓及び腹膜への転移を完全に抑制した。該抗体は、インビトロでの細胞への直接的な細胞傷害性を有さず、またSMMU-2細胞の増殖を妨害せず、転移又は成長に影響を与えることによって腫瘍形成に対してその主な影響を有すると考えられる。該抗体の１つの顕著な特徴は、CD44のすべてのアイソフォームを認識することであり、それは治療的使用のための制限された可能性を示唆する。
Strobel他は、マウス異種移植モデルにおけるヒト卵巣癌細胞の腹膜移植を阻害するための抗-CD44抗体（クローン）の使用を開示する。ヒト卵巣細胞株36M2は、対照抗体の抗-CD44抗体の存在下でマウスに腹腔内に移植され、次いで、処置は、次の20日に渡って行われた。５週間後、抗体処置群において腹腔内に有意な小瘤はほとんど存在しなかった。抗-CD44及び処置群由来の小瘤は同一のサイズであり、それは、細胞が一旦投与されると抗体は腫瘍成長に影響を及ぼさなかったことを示唆する。細胞が皮下的に移植されると腫瘍成長には何の影響を有さず、このことは、該抗体自体が抗-増殖的又は細胞傷害的効果を有さないことを示す。加えて、該抗体はインビトロでの細胞増殖に対して何の効果もなかった。
VFF-18はBIWA 1とも記載されるが、ポリペプチドの360〜370領域に特異的なCD44のv6変異体に対する高い親和性抗体である。この抗体は、12患者の第１相臨床試験において99mテウネチウム-標識複合体として使用されている。該抗体は、頭及び首の扁平上皮癌を有する患者における安全かつ標的可能性のために試験された。注入後４時間、注入された投薬量の14パーセントは腫瘍に取られ、腎臓、脾臓及び骨髄を含む他の臓器において最小の蓄積であった。本抗体の例外なく高い親和性は腫瘍のより深層部へに透過を抑制するが、高い選択的腫瘍結合は、放射線免疫療法における本抗体の役割を示唆する。BIWA 1の適用を更に限定することは、ネズミ抗体の免疫原性（12人の患者の内11人がヒト抗-マウス抗体（HAMA）を発症した）、腫瘍全体に渡る外因性蓄積、及び抗体-溶解性CD44複合体の形成である。WO 02/094879は、HAMA応答を解消するために設計されたVFF-18のヒト化体、すなわち設計されたBIWA 4を開示する。BIWA 4は、親のVFF 18抗体よりも顕著に低い抗原結合親和性を有することが見出された。驚くべきことに、低い親和性BIWA 4抗体は、より高い親和性BIWA 8ヒト化VFF-18抗体よりも優れた腫瘍取り込み特性を有した。99mテウネチウム-標識及び186レニウム-標識BIWA 4抗体はいずれも、186再-標識BIWA 4の場合に、安全性、寛容性、腫瘍蓄積及び最大寛容投薬量を決定するために、33患者の第Ｉ相臨床試験において評価された。99mTc-標識BIWA 4の腫瘍関連取り込みであるように見えた。番号は安定な疾患を有するが、186再-標識BIWA 4のすべての投薬について腫瘍応答は見られなかった；投薬限定傷害性は60 mCi/m2で起こった。33患者の内12患者についての逆事象の50〜65パーセントは、重度の逆事象（血小板減少、白血球減少及び発熱）を有するようであった、患者の６人はすべて再標識BIWA 4で処置され、治療の過程で又は追加の治療において疾患の進行のために死亡した。２患者は、ヒト抗-ヒト抗体（HAHA）を発症した。186再-標識BIWA 4の第Ｉ相試験の投薬の段階的拡大は20人の患者において行われた。経口粘液分泌抑制、投薬-限定血小板減少及び白血球減少が観察された；１患者はHAHA応答を発症した。安定な疾患は、60 mCi/mの最大投薬量で処置した５患者において見られた。これらの試験は達成される効率について安全性及び寛容性の点で許容されるが、臨床試験における他の非-放射性同位体複合化生物学的治療法に比べてより高い割合の逆事象を有する。米国特許出願第US 2003/0103985号は、腫瘍療法において使用するためのBIWI 1と称されるマイタンシノイドに複合化されるVFF-18のヒト化体を開示する。ヒト化VFF 18抗体、BIWA 4は、毒素すなわちBIWI 1に複合化される時に、ヒトの陰門の扁平上皮癌、咽頭の扁平上皮癌又は乳癌のマウスモデルにおいて、顕著な抗-腫瘍効果を有することが見出された。非複合化体、BIWA 4は、抗-腫瘍効果を有さなかった。難治の頭頸部癌に罹患した患者について、BIWI 1の１つの第Ｉ相試験では、大きな皮膚傷害性の結果として患者の１人の死に因る臨床試験の早すぎる中断のために、寛容される最大投薬量を決定することができなかった。BIWI 1の並行した２回目の試験でも、頭頸部癌の患者について、MTDが決定され、皮膚傷害性の結果であった。BIWI 1の３回目の試験では、先に化学療法を経験した転移性乳癌患者について、最も一般的な傷害性は中程度の一次的な皮膚疾患であった。本試験において、有効性の客観的指標は存在しないが、処置患者の50パーセントは、用量−非依存的な安定疾患を見せた。すべての試験の評価としての全体的な負のリスク対有効性は、致命的事象の予測性の欠如のために、本薬物の更なる開発の中断を招いた。
Mab U36は、UM-SCC-22Bヒト下咽頭癌細胞免疫、及び癌及び組織特異性の選択によって作製されたネズミモノクローナルIgG1抗体である。cDNAクローニング及び配列分析による抗原の特徴付けは、Mab U36の標的として、ケラチノサイト-特異的CD44スプライス変異体エピカンのv6ドメインを同定した。免疫組織化学的研究は、エピトープが細胞膜に限定されることを示している。更に、Mab U36は、頭頸部細胞癌（HNCCS）の94パーセントを強く標識し、これらの腫瘍のでは細胞染色において統一性があった。10患者での99mTc-標識Mab U36試験は、HNSCC癌に対する抗体の選択的蓄積を示した（２日目での20.4±12.4パーセント注射量/kg）；２患者がHAMAを発症した以外は逆効果は報告されなかった。放射性ヨウ化ネズミMab U36の試験において、18患者においてHAMAの３ケースが存在し、HNSCCでの選択的な均一な取り込みが存在した。Mab U36の抗原性を減少させ、HAMAの割合を減少させるために、キメラ抗体を構築した。キメラ抗体も元のネズミMab U36もADCC活性を有さない。Mab U36の天然の機能的活性の証拠は存在しない。186再-標識キメラMab U36は、治療剤としてのMab U36の有用性を決定するために使用した。この第Ｉ相の段階的に投薬量を増やしていく試験において、13患者は、99mTc-標識キメラMab U36の偵察（scouting）投薬を受け、次いで186再-標識キメラMab U36を受けた。３患者の中の２患者において、処置投薬限定骨髄傷害性（1.5 GBq/m2）に従う以外は急性の逆事象は報告されなかった、そして最大寛容投薬量（1.0 GBq/m2）で処置された１患者における血小板減少が観察された。腫瘍サイズに対する効果があるが、これらの効果は、処置への客観的な応答の基準を満たすものではなかった。顆粒球コロニー刺激因子を用いる方法を採用する186再-標識キメラMab U36の更なる試験は、最大-寛容活性を2.8 Gyに２倍にするように全血再注入を刺激した。頭頸部の様々な腫瘍を有する９患者のこの試験では、３患者が薬物関連貧血のための輸液を必要とした。他の傷害性は、グレード３の骨髄傷害性、及びグレード２の粘膜炎を含む。安定疾患が５患者において３〜５ケ月間に達成されたが、客観的な腫瘍応答は報告されなかった。従って、Mab U36は高度に特異的抗体であるが、抗-癌効果を達成するために放射性免疫複合体を必要とする不利益が、達成される臨床効果に関連して治療に関連した傷害性のために、その有用性を制限する、ことが見られる。
纏めると、CD44v6（1.1ASML）及びCD44v1O（K926）モノクローナル抗体は、それぞれ、転移性膵臓腺癌を注射されたラット、又は悪性黒色腫を注射されたマウスにおいて、転移活性を減少することが分かった。別の抗-CD44v6抗体（VFF-18及びその誘導体）は、マイタンシノイド又は放射性同位体に複合化される時に、抗-腫瘍効果を有することが分かった。抗-標準CD44モノクローナル抗体は、ラット神経膠芽腫（抗-CD44）による脳内進行、マウスT細胞リンパ腫（IM-7.8.1）によるリンパ節侵襲を抑制し、ヌードマウスにおけるヒト卵巣癌細胞株（クローン515）の移植、マウスメラノーマ細胞株株（IM-7.8.1）の肺転移及びSCIDマウス（GKW.A3）でのヒトメラノーマ細胞株の転移を阻害する、ことも分かっている。放射性同位体複合化Mab U36抗-CD44v6抗体及びその誘導体は、顕著な傷害性を伴う臨床試験において抗-腫瘍活性を有した。これらの結果は、有望であり、可能性のある癌療法としての抗-CD44モノクローナル抗体の開発を支持するが、ヒト癌への制限された効果、安全性又は適用性を証明した。
従って、該細胞上のCD44の細胞表面発現に対するその誘引の一機能として、癌性細胞細胞傷害性を介在した抗体成分が単離される場合に、有益な診断的及び治療的手法が実現されるだろう。
癌療法としてのモノクローナル抗体：癌を示す各個体は、独特であり、人の個性として、他の癌と異なった癌を有する。このことにもかかわらず、現在の治療は、同一の方法で同一のステージにある同一種の癌を有するすべての患者を治療する。これらの患者の少なくとも30パーセントは、第一選択治療に失敗し、それによって、治療の更なる段階、並びに治療上の失敗、転移及び究極的には死の高い可能性を招く。治療への優れたアプローチは、特定の個体のための治療法のオーダーメイドであろう。それ自体をオーダーメイドに導く唯一の現在の治療法は、外科手術である。化学療法及び放射線治療は、患者に合せることができず、外科手術自体はほとんど場合、治療となるには不充分である。
モノクローナル抗体の出現に伴い、各抗体が単一エピトープに関し得るので、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性はより現実的になる。更に、特定の個体の腫瘍を独自に定義するエピトープの配列に関する抗体の組合せをつくる可能性がある。
癌性細胞と正常細胞との顕著な差は、癌性細胞が、形質転換された細胞に特異的である抗原を含むことであると理解しているので、モノクローナル抗体が、これらの癌性抗原に特異的に結合することによって形質転換された細胞を特異的に標的するように設計され得、従って、癌細胞を除去するためにモノクローナル抗体が「マジックブレット」として役立つことができるという信念を生み出す、ことを科学界は長く維持してきた。しかしながら、単一モノクローナル抗体は癌のすべての場合に役立ち得ず、モノクローナル抗体が１つの分野として、標的癌療法として配置され得る、ことが現在では広く理解されている。本発明に開示されている技術に従って単離されたモノクローナル抗体は、患者に有益である方法において、例えば腫瘍負荷を減少させることによって、癌性疾患プロセスを改変することが分かっており、そして、癌性疾患修飾抗体（CDMAB）又は「抗癌」抗体として本明細書で様々に言及される。
現時点では、癌患者は、通常、治療のいくつかの選択肢を有する。癌療法への組織化された方法は、世界的な生存率及び疾病率において改善を生み出している。しかしながら、特定の個体について、これらの改善された統計は、その個体の状況における改善と必ずしも相関していない。
従って、同一の集団における他の患者には無関係に実務者に各腫瘍を治療させることができる方法論が提案された場合には、このことは、目的に合った治療の独特な方法を１個人に適合させるだろう。かかる治療計画は、理想的には、治療率を上げ、より優れた結果を生み出し、それによって長い間の要求を満足させるだろう。
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用は、ヒト癌の治療において限定された成功をもって使用されてきた。リンパ腫及び白血病はヒト血漿で治療されてきたが、長期の回復又は応答はほとんどなかった。更に、再現性が欠如し、化学療法と比べて更なる利益はなかった。乳癌、黒色腫及び腎細胞癌のような固形癌も、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿及びウマ血清で治療されてきたが、これに相当する結果は、予測不可能な効果の低い結果であった。
固形癌のためのモノクローナル抗体の多くの臨床試験がある。1980年代では、特定の抗原に対する抗体を用いて又は組織選択性に基く少なくとも47患者からの１つの応答者のみを得たヒト乳癌用の少なくとも４臨床試験が存在した。1998年まで、シスプラチンと組み合わせてヒト化抗-Her2/neu抗体（ハーセプチン（登録商標））を用いる成功的な臨床試験は存在しなかった。この試験において、37患者は、その約４分の１が部分的応答を有し、更に４分の１がより少ない又は安定な疾患進行を有した、応答について評価された。応答者の内で進行の平均期間は8.4ケ月であり、5.3ケ月の平均応答期間であった。
ハープセチン（登録商標）は、タキソール（登録商標）と組み合わせて第一選択治療での使用のために1998年に承認された。臨床試験結果は、タキソール（登録商標）のみを与えた群（3.0ケ月）と比べて、抗体療法に加えてタキソール（登録商標）を与えた群（6.9ケ月）では、疾患進行に対する平均期間の増加を示した。平均生存のわずかな増加も見られた；ハープセチン（登録商標）及びタキソール（登録商標）治療群、対、タキソール（登録商標）治療単独群について、22ケ月対18ケ月。加えて、タキソール（登録商標）単独と比べた抗体及びタキソール（登録商標）の組合せ群において、完全応答者の数（８対２パーセント）及び部分的応答者の数（34対15パーセント）が増加した。しかしながら、ハープセチン（登録商標）及びタキソール（登録商標）での治療は、タキソール（登録商標）治療単独と比べて、高い心臓毒性をもたらした（それぞれ、13対1パーセント）。また、ハープセチン（登録商標）治療は、ヒト表皮成長因子受容体2（Her2/neu）、すなわち、現在、公知の機能又は生物学的に需要なリガンドを有さない受容体、を過剰に発現する患者、すなわち転移性乳癌を有する約25パーセントの患者、に対してのみ効果的であった（免疫組織学化学的（IHC）分析を通して決定される）。そのため、乳癌患者には大きな未だ対処されていない必要性が依然として存在する。ハープセチン（登録商標）治療から利益を受け得る人でさえも、化学療法を依然として必要とし、その結果、少なくともある程度、この種の治療の副作用を依然として対処しなければならないだろう。
結腸直腸癌を試験する臨床試験は、糖タンパク質及び糖脂質の標的に対する抗体を含む。腺癌に対する特異性を有する17-1Aのような抗体は、部分的応答を有するたった１患者を含む、60患者超において第２相臨床試験を受けた。他の試験では、17-1Aの使用は、追加のシクロホスファミドを用いるプロトコルにおいて52患者の内たった１つの完全な応答、及び２つの比較的小さな応答を生み出した。従来、17-1Aの第III相臨床試験は、ステージIIIの直腸結腸癌のアジュバント治療として改善された有効性を立証しなかった。画像化のために最初に承認されたヒト化ネズミモノクローナル抗体の使用もまた、腫瘍退縮をもたらさなかった。
近年になってやっと、モノクローナル抗体を使用する、結腸直腸癌の臨床試験からの陽性の結果がある。2004年、エルビタックス（登録商標）は、イリノテカン-型化学療法に難治性であるEGFR-発現転移性結腸直腸癌を有する患者の第二選択治療のために承認された。２つのアーム第II相臨床試験及び単一アーム試験からの結果は、イリノテカンと組み合わせたエルビタックス（登録商標）が、それぞれ4.1及び6.5ケ月の疾患進行までの平均時間で、それぞれ23及び15パーセントの応答率を有した、ことを示した。２つのアーム第II相臨床試験及び別の単一アーム試験からの結果は、エルビタックス（登録商標）単独による治療が、それぞれ1.5及び4.2ケ月の疾患進行までの平均時間で、それぞれ11及び9パーセントの応答率をもたらした、ことを示した。
結果的に、スイス及び米国では、イリノテカンと組み合わせたエルビタックス治療、及び米国では、エルビタックス単独による治療は、第一選択治療のイリノテカン治療に失敗した結腸直腸癌患者の第二選択治療として承認された。従って、ハープセチン（登録商標）のように、スイスでの治療は、モノクローナル抗体及び化学療法の組合せとして承認されているにすぎない。加えて、スイス及び米国での治療は、第二選択療法として患者のために承認されているにすぎない。また、2004年、アバスタチン（登録商標）は、転移性結腸直腸癌の第一選択療法として静脈内5-フルオロウラシル-型化学療法と組み合わせての使用が承認された。第III相臨床試験結果は、5-フルオロウラシル単独で治療された患者に比べて、アバスタチン（登録商標）及び5-フルオロウラシルで治療された患者の平均的生存が伸びたことを証明した（それぞれ、20ケ月対16ケ月）。しかし、この場合も同様に、ハープセチン（登録商標）及びエルビタックス（登録商標）のように、治療は、モノクローナル抗体及び化学療法の組合せとして承認されたにすぎない。
肺、脳、卵巣、膵臓、前立腺、及び胃癌については成績不良であり続けた。非-小細胞肺癌についての最も有望な近年の結果は、治療が、化学療法剤タキソテレ（登録商標）と組み合わせて細胞殺傷薬ドキソルビシンに複合化されたモノクローナル抗体を含む第II相臨床試験から得られた。タキソテレ（登録商標）は、肺癌の第二選択療法のためのFDAが承認した唯一の化学療法である。初期のデータは、タキソテレ（登録商標）単独と比べて改良された全体的な生存を示した。試験のために集められた62患者の内、３分の２はタキソテレ（登録商標）との組み合わせでSGN-15を受け、一方、残りの３分の１はタキソテレ（登録商標）単独を受けた。タキソテレ（登録商標）との組み合わせでSGN-15を受けた患者のために、平均の全体的な生存は、タキソテレ（登録商標）単独を受けた患者についての5.9ケ月と比べて7.3ケ月であった。１年及び18ケ月での全体的な生存は、SNG-15及びタキソテレ（登録商標）を受けた患者について、それぞれ、29及び18パーセントであり、タキソテレ（登録商標）単独を受けた患者について、それぞれ、24及び8パーセントであった。更なる臨床試験が計画されている。
前臨床的には、黒色腫に対するモノクローナル抗体の使用において限定された成功があった。これらの抗体の極少数は臨床試験に到達しているが、今日まで第III相臨床試験での好ましい結果を承認又は証明している抗体はない。
疾患を治療するための新規医薬の発見は、疾患の原因であり得る30,000の公知の遺伝子産物の内の関連する標的の同定の欠如によって邪魔されている。癌の研究において、潜在的な薬物標的は、通常、腫瘍細胞中でそれらが過剰発現するという事実に因ってのみ選択される。このようにして同定された標的は、次いで、多数の化合物との相互作用について選別される。潜在的な抗体療法の場合には、これらの候補化合物は、通常、Kohler及びMilsteinによって提案された基本的な原則に従うモノクローナル抗体産生の典型的方法から得られる（1975, Nature, 256, 495-497, Kohler and Milstein）。脾臓細胞は、抗原で免疫されたマウスから回収され（例えば、全細胞、細胞フラクション、精製された抗原）、不死化ハイブリドーマパートナーと融合される。得られたハイブリドーマは、標的に最も強く結合する抗体の分泌のために選別され、そして選択される。ハープセチン（登録商標）及びリタキシマブを含む癌細胞に対する多くの治療的及び診断的抗体は、これらの方法を用いて産生され、そしてそれらの親和性に基づいて選択されている。この方法の欠点は２倍である。第一に、治療的又は診断的な抗体結合のための好適な標的の選択は、組織特異的癌化プロセスの周辺の知識、及びこれらの標的がそれによって同定される過剰発現による選択のような得られた単純化された方法、の不足によって限定されている。第二に、最も大きな親和性を有する受容体に結合する薬物分子が、通常、シグナルを開始又は阻害する最も高い可能性を有するという推測は、必ずしも当てはまらない。
乳癌及び結腸癌の治療に伴う進歩にもかかわらず、効率的な抗体療法の同定及び開発は、単一薬又は同時療法のいずれかとして、すべての種類の癌に十分ではなかった。
先行特許：
米国特許第5,750,102号明細書は、患者の腫瘍が患者由来の細胞又は組織からクローン化され得るMHC遺伝子でトランスフェクトされる、プロセスを開示している。これらのトランスフェクトされた細胞は、次いで、患者をワクチン化するために使用される。
米国特許第4,861,581号明細書は、哺乳動物の新生物及び正常細胞の外部成分にではなく、内部細胞成分に特異的であるモノクローナル抗体を取得し、新生物細胞を殺傷する療法を受けている哺乳動物の組織で抗体を標識し、及び新生物細胞を退縮する内部細胞成分への標識された抗体の結合を測定することによって治療法の有効性を決定するステップ、を含む方法を開示する。ヒト細胞内抗原に関する抗体を調製するときに、悪性細胞がかかる抗原の従来の起源を示すことを特許権者は認識している。
米国特許第5,171,665号明細書は、新規抗体及びその産生のための方法を提供する。具体的には、特許は、ヒト腫瘍、例えば、直腸結腸及び肺のヒト腫瘍、に関連したタンパク質抗原に強力に結合し、同時により低度で正常細胞に結合する性質を有するモノクローナル抗体の形成を教示する。
米国特許第5,484,596号明細書は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に取り除き、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処理し、生細胞であるが、非-発癌性のある腫瘍細胞を照射し、及び一次腫瘍の再発を阻害することができる患者用ワクチンを調製するためにこれらの細胞を使用し、同時に転移を阻害すること、を含む癌療法の方法を提供する。該特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応性のあるモノクローナル抗体の開発を教示する。第４欄第45行、以下参照に記載されているように、特許権者は、ヒト腫瘍形成において活性な特定の免疫療法を発現するモノクローナル抗体の開発において自発性腫瘍細胞を利用する。
米国特許第5,693,763号明細書は、ヒト癌を特徴付ける糖タンパク質抗原を教示しており、起源の上皮組織に依拠しない。
米国特許第5,783,186号明細書は、Her2発現細胞においてアポトーシスを誘導する抗-Her2抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、該抗体を利用する癌の治療方法、及び該抗体を含む医薬組成物に関する。
米国特許第5,849,876号明細書は、腫瘍及び非-腫瘍組織源から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体の産生のための新規なハイブリドーマ細胞株を記載する。
米国特許第5,869,268号明細書は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球、モノクローナル抗体を産生するための方法、及び該方法によって産生されるモノクローナル抗体に関する。該特許は、特に、癌の診断及び治療のために有用な抗-HDヒトモノクローナル抗体の産生に関する。
米国特許第5,869,045号明細書は、ヒト癌細胞と反応する、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体及び単一-鎖抗毒素に関する。ヒト癌の表面上に存在する細胞膜抗原と反応性であり、更に、該抗体が癌細胞内で吸収し次いで結合する点で、これらの抗体の機能が２倍であるメカニズムは、該抗体を、抗体-薬物及び抗体-毒素複合体を形成させるために特に有用にする。その非修飾形態において、抗体はまた、特定の濃度において細胞傷害性を明らかにする。
米国特許第5,780,033号明細書は、腫瘍治療及び予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、加齢の哺乳動物由来の抗核自己抗体である。この場合において、自己抗体は、免疫系において見出された自然抗体の１種であると言われる。自己抗体は「加齢哺乳動物」由来であるので、自己抗体が実際に治療されるべき患者から得られる必要性はない。加えて、該特許は、加齢哺乳動物由来の自然及びモノクローナル抗核自己抗体、及びモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示している。
米国特許第5,916,561号明細書は、特定の抗体であるVFF-18、及びCD44遺伝子の変異体エキソンv6に対するその変異体を開示する。この抗体は、それがラットCD44 v6変異体よりもむしろヒトCD44 v6変異体を認識する点で、コンパレータ抗体を超える改善である。加えて、この抗体は、CD44 v6発現のための診断的アッセイを開示する。この抗体のために開示されたインビトロ又はインビボ機能はない。
米国特許第5,616,468号明細書は、CD44遺伝子のヒトエキソン6Aによってコードされる配列を含む合成ペプチドに対するモノクローナル抗体であるVar3.1を開示する。具体的には、この方法は、ヒトCD44の90 kD形態に結合せず、ヘルメス-3抗体とは識別される。CD44のv6変異体の検出方法、及びこの抗原に基づく悪性変形のスクリーニング及びアッセイ方法。血清中の抗原を検出することに基づく炎症性疾患のスクリーニング法も提供される。
米国特許第5,879,898号明細書は、43個のアミノ酸ペプチドを産生するヒトCD44変異体6の129 bpエキソンに結合する特定の抗体を開示する。モノクローナル抗体は、多数のハイブリドーマ細胞株：MAK<CD44>M-1.1.12、MAK<CD44>M-2.42.3、MAK<CD44>M-4.3.16によって産生される。該抗体は、少なくとも新規なCD44 v6アミノ酸配列のヘキサペプチドを含む融合タンパク質から作製される。更に、癌診断薬として使用され得るエキソン6変異体の検出のための免疫アッセイの開示がある。注目すべきことは、この抗体のインビトロ又はインビボ機能は開示されていない。
米国特許第5,942,417号明細書は、CD44様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチド及びその変異体を用いる組換えタンパク質の製造法を開示する。抗体は、これらのポリペプチドについて言うが、具体的な例がなく、かかる抗体を分泌する寄託されたクローンはない。ノーザンブロットは、いくつか種類の組織中のポリヌクレオチドの様子を証明するが、このポリヌクレオチドの翻訳及び発現があることの証拠はない。従って、このポリヌクレオチドの遺伝子産物について作製される抗体が存在し、これらの抗体がインビトロ又はインビ機能のいずれかを有し、そしてヒト癌性疾患に関連するか否かの証拠はない。
米国特許第5,885,575号明細書は、CD44の変異体エピトープと反応する抗体、及び該抗体の使用によって変異体を同定する方法を開示する。この変異体をCコードする単離されたポリヌクレオチドはラット細胞から単離され、そして、この変異体に対する抗体mAb1.1ASMLは、分子量120 kD、150 kD、180 kD及び200 kDのタンパク質を認識する。モノクローナル抗体1.1ASMLの投与は、同系ラットのラットBSp73ASMLの成長及び転移を遅らせた。注目すべきことに、1.1ASMLは、LCLC97ヒト大細胞肺癌に対する反応性の欠如によって証明されるようにヒト腫瘍を認識しない。ヒトホモログは、LCLC97から単離されたが、このホモログを認識する等価な抗体は産生されなかった。従って、ラットCD44の変異体に特異的な抗体が産生され、ラット腫瘍の成長及び転移に影響を与えることがわかったが、ヒト腫瘍に対するこの抗体の影響の証拠は存在しない。より具体的には、本発明者らは、この抗体がヒト腫瘍を認識しないことを指摘している。
発明の概要
本願は、癌性疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するための、米国特許第6,180,357号明細書に教示された患者特異的抗-癌抗体を産生するための方法論を利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍に対して特異的に作製され、よって癌療法のカスタマイズを可能にする。本願の記載の範囲内で、細胞-殺傷（細胞傷害性）性又は細胞-増殖阻害（細胞増殖抑制）性のいずれかを有する抗-癌抗体は、以下の明細書において細胞傷害性と称する。これらの抗体は、癌のステージ区分及び診断の目的で使用され、腫瘍転移を治療するために使用され得る。これらの抗体は、予防的治療によって癌の抑制ためにも使用され得る。典型的な薬物発見の実例に従って作製された抗体とは異なり、このような方法で作製された抗体は、悪性組織の増殖及び/又は生存に不可欠であると以前は分かっていなかった分子及び経路を標的することがある。更に、これらの抗体の結合親和性は、より強い親和性相互作用を受けにくいかもしれない細胞傷害性事象の開始のための要件に適している。また、標準的な化学療法的様式、例えば放射性核種を、本願のCDMABと複合化し、それによって該化学療法の使用に焦点を当てることは、本発明の範囲内にある。CDMABは、毒素、細胞傷害性部分、酵素、例えばビオチン複合化酵素、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポータ部分又は血液原性細胞に複合化され、それによって抗体複合体を形成することができる。CDMABは、単独で又は１以上のCDMAB/化学療法剤と組み合わせて使用されてよい。
個人に合わせた抗-癌治療の予想は、患者が管理される方法において変化をもたらすだろう。可能性のある臨床的シナリオは、腫瘍試料が発表の際に得られ、そして積み上げられることである。この試料から、腫瘍は、予め存在する癌性疾患修飾抗体のパネルから分類され得る。患者は、慣習的にステージ区分されるが、入手できる抗体は患者を更にステージ区分する点で使用され得る。患者は、現存する抗体で直ちに治療され、そして、腫瘍に特異的な抗体のパネルは、本明細書に概略した方法を用いるか、又は本明細書に開示されたスクリーニング方法と組み合わせてファージディスプレイ・ライブラリの使用のいずれかによって産生され得る。他の腫瘍が治療されるエピトープと同一のエピトープのいくつかを有すルことができる可能性があるので、作製されたすべての抗体は、抗-癌抗体のライブラリに加えられるだろう。この方法に従って産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有するかなり多数の患者における癌性疾患を治療するために有用であり得る。
抗-癌抗体に加えて、患者は、治療の多数-モデルレジメの一部として、現在推奨されている治療法を受けることを選択できる。本方法論によって単離された抗体が、非-癌性細胞に対して比較的に非-毒性であるという事実は、単独又は従来の治療法と組み合わせて使用される高用量の抗体の組合せを可能にする。高い治療的指数は、治療耐性細胞の発現の可能性を減少させる短期間での再-治療をも可能にするだろう。
患者が治療又は転移進行の最初のコースに難治性である場合には、腫瘍に特異的な抗体を作製する方法が再治療のために繰り返され得る。更に、抗-癌抗体が患者から得られた赤血球に複合化され、転移の治療のために再注入され得る。転移性癌のための効果的な治療法はほとんどなく、転移は通常、死を招く不幸な結果の前兆となる。しかしながら、転移性癌は、通常、よく視覚化され、赤血球による抗-癌抗体の送達は、腫瘍部位に該抗体を濃縮する効果を有し得る。転移前ですら、ほとんどの癌細胞は、その生存のために宿主の血液供給に依拠し、そして赤血球に複合化された抗-癌抗体は、インサイチュの腫瘍に対しても効果的である。あるいは、該抗体は、他の血液原性細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞等に複合化され得る。
抗体には５つのクラスがあり、各々は、その重鎖によって付与される機能と関連する。一般的に、ネイキド抗体による癌細胞致死は、抗体依存的細胞傷害性（ADCC)又は補体依存的細胞傷害性（CDC）のいずれかによって仲介される。例えば、ネズミIgM及びIgG2a抗体は、補体系のC-1成分との結合によってヒト補体を活性化することができ、それによって腫瘍溶解を導く補体活性化の典型的な経路を活性化する。ヒト抗体について、最も効果的な補体活性化抗体は、一般的に、IgM及びIgG1である。IgG2a及びIgG3アイソタイプのネズミ抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球及びあるリンパ球による細胞致死を招くFc受容体を有する細胞傷害性細胞を補強する点で効果的である。IgG1及びIgG3アイソタイプのヒト抗体は、ADCCを仲介する。
Fc領域によって介在される細胞傷害性は、エフェクタ細胞、その対応する受容体、又はタンパク質、例えばNK細胞、T-細胞及び補体の存在を必要とする。これらのエフェクタメカニズムの非存在下で、抗体のFc部分は不活性である。抗体のFc部分は、抗体の薬物動力学にインビボで影響を与えるが、インビトロではこれは活性がないという性質を与えることがある。
抗体-仲介癌殺傷の別の可能性のあるメカニズムは、細胞膜及びその関連した糖タンパク質又は糖脂質における様々な化学結合の加水分解を触媒するために機能する抗体、いわゆる触媒抗体、の利用によるものでもよい。
抗体-仲介癌細胞殺傷の３つの更なるメカニズムがある。第１は、身体に、癌細胞に存在する仮想的抗原に対する免疫応答を産生するようにさせるワクチンとしての抗体の利用である。第２は、成長受容体を標的し及び抗体の機能を干渉し、又はその機能が効率的に失われるようにその受容体をダウンレギュレートする、抗体の利用である。第３は、TRAIL R1もしくはTRAIL R2のような死受容体又はアルファVベータ3等のようなインテグリン分子のライゲーションのような直接的細胞死を導くことがある、細胞表面部分の直接的ライゲーションに対するこのような抗体の効果である。
癌薬の臨床的有用性は、患者に許容される危険プロファイルの下での該薬物の利益に基づく。癌療法では、生存は、一般的に利益の次に最も追求されてきたが、伸びた寿命に加えて多数の他のよく理解されている利益がある。治療が生存に逆に影響を与えないこれらの他の利益は、症状の苦痛緩和、逆事象に対する保護、行く行くは再発又は疾患のない生存への延長、及び行く行くは進行への延長を含む。これらの基準は、一般的に受け入れられ、米国の食品医薬品局（FDA）のような規制機関は、これらの利益を生じる薬物を承認している（Hirschfeld他, Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42: 137-143 200）。これらの基準に加えて、これらの種類の利益を予測することができる他の評価項目があることは十分に認識される。一つには、米国のFDAによって認可された加速された承認プロセスは、患者利益を予測することができるだろう代用評価項目があることを認知している。2003年末の時点において、このプロセス下で16種の医薬が承認され、これらの内で４種が完全承認に進んだ、すなわち追加の試験が、代用評価項目によって予測される直接的な患者の利益を証明した。固形腫瘍における薬物効果を決定するための１つの重要な評価項目は、治療に対する応答を測定することによる腫瘍負荷の評価である（Therasse他, Journal of the National Cancer Institute 92（3）: 205-216, 2000）。かかる評価のための臨床的基準（RECIST基準）は、癌の国際的な専門家集団である、固形癌ワーキング・グループにおける応答評価基準によって普及されてきた。好適な対照群と比べてRECIST基準に従った客観的応答によって示される、腫瘍負荷に対する証明された効果を有する薬物は、究極的には、直接的な患者利益を生み出す傾向にある。前臨床状況では、腫瘍負荷は、一般的に、評価及び立証がより簡単である。前臨床試験が臨床的状況に解釈され得るという理由で、前臨床モデルでの延長された生存を生み出す薬物は、最も大きな予測された臨床的有用性を有する。臨床的治療に対する陽性応答を生み出すアナログ、すなわち前臨床状況における腫瘍負荷を減少させる薬物は、疾患に対する重要かつ直接的な影響を有することもある。生存の延長は癌薬物治療からの臨床的成果後に最も追求されるものであるが、臨床的有用性を有する他の利益が存在し、そして、疾患の進行の遅延、延長した生存又はそれらの両方に関連するかもしれない腫瘍負荷減少が、直接的な利益を導き及び臨床的影響をも有し得ることは明らかである（Eckhardt他, Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 第39版 Annual Meeting, 2003, 第209-219頁）。
米国特許第6,180,357号明細書の方法を実質的に用いて、患者肺腫瘍生検及びNCI-H460肺癌細胞株由来の細胞でマウスの免疫をすることによって、マウスモノクローナル抗体H460-16-2を得た。H460-16-2抗原は、様々な組織起源由来の幅広い範囲のヒト細胞株の細胞表面上に発現した。乳癌細胞株MDA-MB-231及び皮膚癌細胞株A2058は、インビトロでのH460-16-2の細胞傷害性効果を受けやすい。
培養物でのMDA-MB-231細胞に対するH460-16-2細胞傷害性の結果は、（S.N. 10/603,000に開示されているように）マウスに移植した時にこれらの癌細胞に対するその抗-腫瘍活性によって更に拡大された。前臨床異種移植腫瘍モデルは、治療効率の有効な予測者であると考えられる。
代表的なヒト乳癌のインビトロモデルでは、H460-16-2処置は、アイソタイプ対照抗体よりも処置期間中の腫瘍成長の抑制において有意により効果的であった（p<0.0001）。処置期間の終わりに、H460-16-2を与えられたマウスは、対照群の1.3パーセントのみ成長した腫瘍を有した。処置後の追跡期間中、H460-16-2の処置効果は持続し、処置群における平均腫瘍体積は測定期間の終わりまでに対照よりも顕著に小さいままであった。抗体有効性の指標として生存を用いて、H460-16-2処置群での死亡リスクは処置後70日での抗体バッファー対照群（p=0.028）の約71パーセントであった。これらのデータは、H40-16-2処置が、対照-処置群に比べて生存利益を与えたことを証明した。減少した体重及び臨床的苦痛を含む傷害性の兆候を誘導しなかったので、H460-16-2処置は安全であると考えられた。従って、H460-16-2処置は、ヒト乳癌の十分に確立されたモデルにおける対照-処置群に比腫瘍成長を遅らせかつ生存を亢進したので、有効であった。
加えて、H460-16-2は、確立されたインビボ腫瘍モデルにおいてMDA-MB-231細胞に対する抗-腫瘍活性を証明した（S.N. 10/603,000に開示されている）。H460-16-2による処置を、標準的な化学療法剤であるシスプラチンと比較し、シスプラチン及びH460-16-2処置群は、抗体希釈バッファー又は同位体対照抗体のいずれかで処置した群と比較して有意に（pO.001）小さい平均腫瘍体積を有したことが分かった。H460-16-2処置は、顕著な（19.2パーセント）体重減少（p<0.003）及びシスプラチン処置で観察された２つの処置関連死を含む臨床的苦痛のないシスプラチン化学療法の腫瘍抑制の約2/3倍である腫瘍抑制を介在した。H460-16-2の抗-腫瘍活性及びその最小傷害性は、魅力的な抗癌療法剤をつくる。
加えて、処置後期間においては、H460-16-2群における死の危険性が処置後>70日での同位体対照抗体群における危険性の約半分であったので、H460-16-2は、顕著な生存利益を示した（p<0.02）。観察された生存利益は、処置後120日継続した。そこでは、同位体対照及びシスプラチン処置マウスの100パーセントがH460-16-2処置群の67パーセントと比べて死亡した。H460-16-2は、同位体対照抗体群比べて、腫瘍成長を26パーセント遅らせることによって腫瘍抑制を維持した。処置後31日目では、H460-16-2は、同位体対照群と比べて48パーセント腫瘍成長を減少させることによって腫瘍サイズを制限した。それは、処置の最後に観察された49パーセント減少に匹敵した。確立された乳癌の腫瘍モデルでは、これらの結果は、治療期間を超えて腫瘍抑制を維持するH460-16-2の可能性を示し、そして、哺乳動物における腫瘍負荷を減少し生存を亢進する抗体の能力を証明した。
確立されたインビボでの乳癌腫瘍モデルにおける有利な効果に加えて、化学療法剤（シスプラチン）と組み合わせたH460-16-2処置は、確立されたインビボでの前立腺癌モデルにおいてPC-3細胞に対して抗-腫瘍活性を有した（S.N. 10/810,165に開示されている）。対応あるt-検定を用いて、H460-16-2及びシスプラチン処置は、バッファー対照（pO.OOOl）、シスプラチン処置のみ（p=0.004）又はH460-16-2処置のみ（pO.OOOl）よりも、処置期間後直ちに腫瘍成長を抑制する点で有意により効果的であった。処置期間の最後に、H460-16-2及びシスプラチンを与えたマウスは、バッファー対照群のわずか28.5パーセントまで成長した腫瘍を有した。PC-3 SCID異種移植片モデルについて、体重は疾患進行の代わりの指標として使用され得る。すべての群のマウスは、重大な体重減少を経験した。この試験では、すべての群のマウスは、処置期間の最後までに約23〜35パーセントの体重減少を示した。H460-16-2で処置した群は、最小の体重減少度を示した（21.7パーセント）。処置後、48日では、バッファー対照と比べて、H460-16-2及びシスプラチン処置に関連した体重減少の有意な増加はなかった（p=0.5042）。従って、H460-16-2及びシスプラチン処置は、十分に確立したヒト前立腺癌モデルにおける同位体対照処置群に比べて腫瘍成長を遅らせたので、効率的であった。
薬物標的としてのH460-16-2エピトープを評価するために、正常ヒト組織におけるH460-16-2抗原の発現は先に記載した（S.N. 10/603,000）。この仕事は、抗-CD44抗体；クローンL 178（S.N. 10/647,818に開示、現在は米国特許第7,189,397号明細書に開示）及びクローンBU75（S.N. 10/810,165に開示）と比べることによって拡張した。H460-16-2を用いるIHC染色によって、肝臓、腎臓（管状上皮細胞のわずかな染色を除いて）、心臓及び肺のような生臓器の細胞を含む組織のほとんどは、H460-16-2抗原を発現しなかった。組織染色からの結果は、H460-16-2が様々な細胞種に対する限定された結合を示したが、マクロファージ、リンパ球及び繊維芽細胞を浸透するための結合を有した、ことを示した。BU75抗体は、同様の染色パターンを示した。しかしながら、少なくとも１の注目すべき差異があった；リンパ球の染色は、H460-16-2と比べてBU75では強かった。
H460-16-2抗原の更なる局在化及び乳癌患者のような集団内のその罹患率の決定は、H460-16-2の治療的使用を評価する点で及び効果的な臨床試験を設計する点で重要である。癌患者由来の乳癌中のH460-16-2抗原発現を解決するために、50人の乳癌患者由来の腫瘍組織試料がH460-16-2抗原の発現についてこれまでスクリーニングされ（S.N. 10/603,000）、そしてL178（S.N. 10/647,818、現在米国特許第7,189,397号明細書）、BU75（S.N. 10/810,165）及び抗-Her2抗体c-erbB-2（S.N. 10/810,165）に匹敵した。これらの試験の結果は類似しており、組織試料の62パーセントがH460-16-2抗原について陽性であると染色され、一方、乳癌組織の73パーセントがBU75エピトープについて陽性であった。染色が悪性細胞に限定されるので、患者試料内のH460-16-2の発現は、癌細胞に特異的であるようであった。H460-16-2は、乳癌患者由来の正常組織の10試料の中の４試料を染色し、一方、BU75は８試料を染色した。H460-16-2及びBU75抗原の乳癌発現は、悪性細胞の細胞膜に主に局在化されるようであった、このことはCD44を治療の魅力的な標的にした。H460-16-2発現は、乳癌の発症、処置及び予後において重要な役割を果たすホルモンのエストロゲン及びプロゲステロンのための受容体の乳癌発現に基づいて更に評価された。H460-16-2抗原の発現と、エストロゲン又はプロゲステロンのいずれかについての受容体の発言との相関関係は明らかではなかった。腫瘍がそのステージ又は癌が進行した程度に基づいて分析されるときもやはり、H460-16-2抗原発現と腫瘍ステージとの明確な相関関係は存在しなかった。同様な結果はBU75で得られた。c-erbB-2と比べて、H460-16-2は、完全に異なった染色プロファイルを示した。そこでは、H460-16-2抗原に陽性であった乳癌組織試料の52パーセントが、乳癌患者のための未だ満足されていない標的治療的要求を示すHer2発現に陰性であった。H460-16-2及びHer2に陽性であった乳癌組織フラグメント間の染色強度にも差異があった。c-erbB-2抗体も、正常の乳癌組織フラグメントの１つを陽性に染色した。
H460-16-2抗原の更なる局在化及び前立腺癌患者のような集団内のその罹患率の決定は、S.N. 11/364,013に開示された。53つのヒト前立腺癌及び３つの正常前立腺組織への抗体の結合は、ヒト前立腺の正常及び腫瘍組織のマイクロアッセイ（Imgenex, San Diego, CA）を用いて行った。S.N. 11/364,013に開示されているように、試験した腫瘍のS.N. 11/364,013, 19/53（36 パーセント）はH460-16-2に陽性であった。H460-16-2は、腫瘍細胞及び間質繊維芽細胞に特異的であった。細胞の局在化は、ほとんど、膜性及び細胞の膜性であり、管腔の局在化があるか又はなかった。陽性細胞のパーセンテージは、<10パーセント〜>50パーセントの範囲であり、これは腫瘍細胞への抗体の外因性結合を示した。腫瘍ステージに対する抗体結合の関係は、様々な腫瘍ステージの中の腫瘍数の不一致に起因して正確に評価されなかった。腫瘍ステージI、II、III及びIVに対して、それぞれ、1/1 100パーセント）、4/12（33パーセント）、0/2（0パーセント）及び11/33（33パーセント）であった。G1-G2（25パーセント）に比べてグリーソンスコアG3-G4（36パーセント）に対する高い結合が存在した。すべての３つの前立腺組織フラグメントは、該抗体について陽性であった。しかしながら。組織特異性は、筋上皮及び間質性繊維芽細胞についてのものであり、腺上皮を残した。試験した前立腺癌に対するH460-16-2の結合の異質性が存在した：10/53、6/53、3/53陽性腫瘍は、それぞれ、<10〜10パーセント、<50〜50パーセント及び>50パーセントのカテゴリーであった。前立腺癌細胞へのその結合の結果として、H460-16-2の治療的利益は、前立腺癌の治療に拡大され得る。
H460-16-2抗原の更なる局在化及び前立腺癌患者のような集団内のその罹患率の決定は、S.N. 11/364,013に開示された。H460-16-2抗体は、原発性の11/37（30パーセント）を含む試験された肝癌の21/49（43パーセント）、原発性の1/2（50パーセント）を含む転移性肝細胞癌の7/8（88パーセント）、及び転移性胆管細胞癌の2/2（100パーセント）、への結合を示した。該抗体は、初期段階I及びIIと比べて、進行癌のステージIII及びIVへの有意に高い結合を示した（p = 0.03）[ステージI、0/2（0パーセント）；ステージII、2/17（12パーセント）; ステージIII、8/16（50パーセント）及びステージIV、6/8（75パーセント）]。H460-16-2は、腫瘍細胞及び侵潤する炎症性細胞に特異的でああった。細胞局在化は、主に膜性であった。腫瘍の中には、拡散性の細胞染色パターンを示すものもあった。該抗体は、非-新生物肝臓組織の9/9に結合した。しかしながら、結合は、類洞壁細胞及び侵潤しているリンパ球に限定された。H460-16-2抗原は、進行した肝癌組織において特異的に発現されるようである。従って、H460-16-2は、肝癌の処置における治療薬としての可能性を有する。
H460-16-2の可能な治療的利点を更に拡大するために、様々なヒト癌組織内の抗原の頻度及び局在化も以前に決定されており（S.N. 10/603,000）、クローンL178に匹敵した（S.N. 10/647,818、現在米国特許第7,189,397号明細書）。これらの腫瘍種のほとんどはまた、L178抗原について陽性であった。ヒト乳癌組織について、H460-16-2及びL178局在化は、腫瘍細胞の膜上で起こった。しかしながら、H460-16-2抗体と比べて、L178について実質的により膜局在化があった。また、H460-16-2及びL178によって染色された腫瘍種の中で、組織の43パーセントは、L178抗体によるより高い染色強度を示した。
文献からのIHCデータとの比較に基づいて本明細書で提供されたIHCデータと正確に一致するCD44の形態はないようである。CD44の標準的形態は、ヒト脳において通常発現される；H460-16-2抗原は発現されない。pan-CD44アイソフォームに対する抗体は、肝臓（クッパー細胞を含む）を染色せず、再生細胞のすべての相における子宮内膜腺を陽性に染色する。H460-16-2抗原は、クッパー細胞上に明確に存在し、再生細胞の分泌子宮内膜腺上に存在するにすぎない。H460-16-2抗原は、組織マクロファージ上に明確に存在し、変異形態4/5及びV8/9のみが時折のマクロファージ染色を示す。抗-CD44 L178及びBU75と比べてH460-16-2について見られる類似だが異なった結合パターンは、H460-16-2抗原がCD44の独特のエピトープであることを示す。
以前に開示されているように（S.N. 10/647,818、現在米国特許第7,189,397号明細書）、更なる生物化学的データは、H460-16-2によって認識される抗原がCD44の形態の１つであることも示している。このことは、CD44に対して反応するモノクローナル抗体（L178）が免疫沈澱によってH460-16-2に結合されたタンパク質を識別することを示した研究によって支持される。ウェスタンブロッティングは、H460-16-2によって認識されるCD44のエピトープはv6又はv1O上に存在しないことも示唆する。H460-16-2エピトープはまた、糖類-及び構造-依存的（carbohydrate and conformation dependent）であることによって識別されるが、多くの抗-CD44はCD44のペプチド部分に対するものである。これらのIHC及び生化学的な結果は、H460-16-2がCD44抗原の変異体に結合することを証明する。従って、証拠の優勢は、H460-16-2がCD44の変異体上に存在する特有の糖類依存的構造のエピトープのライゲーションによる抗-癌効果を介在する、ことを示している。本発明の目的のために、前記エピトープは、ハイブリドーマ細胞株H460-16-2によってコードされるモノクローナル抗体、その抗原性結合フラグメント、その抗原性結合リガンド又はその抗体複合体と結合するその能力によって特徴付けられる、「CD44抗原性部分」と定義される。
H460-16-2の抗-癌効果の根底にあるメカニズムを更に解明するために、ヒアルロン酸（HA）結合アッセイを行った（S.N. 10/810,165に開示されている）。H460-16-2の1.87（±1.01）μg/mLの平均濃度が、MDA-MB-231細胞のHAへの接着を50パーセント阻害するために必要とされた。これらの結果は、H460-16-2が、HAへの結合の原因となりそして結果的にECMによる脈管形成又は腫瘍侵襲性のダウンレギュレーションによるその抗-癌効果を介在する、少なくとも１部のCD44上の部位（複数）と、相互作用することを示している。
HA結合アッセイに加えて、インビトロ又はインビボでのH460-16-2抗-癌効果が細胞周期の調節に起因しているかどうかを決定するために、細胞周期実験を行った（S.N. 10/810,165に開示されている）。24時間後及び20 μg/mLのH460-16-2を用いて、同位体対照と比べてMDA-MB-231アポトーシス細胞の数が増加した。この効果も用量依存的であるようであった。従って、H460-16-2の有効性、全体的又は部分的にそのアポトーシス誘導能に起因していることもある。
H460-16-2に対する作用のメカニズムを更に解明するために、乳癌の異種移植モデルにおいてインビボで成長したMDA-MB-231腫瘍のアポトーシスに対するH460-16-2処置の効果を実行した（S.N. 11/364,013に開示されている）。ApoTag染色腫瘍の連続切片は、その後、H & E染色され、そして単一細胞の欠如、細胞収縮及びクロマチンの密集団への圧縮のような形態学的基準を用いて、アポトーシス細胞について試験された。これらの基準を満たす細胞の計数は、上記のセクションに記載したようにして行い、処置群についての平均数を得た。バッファー対照群は、17細胞（±5.29）の平均総スコアを与え、一方、H460-16-2処置群は22.5細胞（±4.20）の平均総スコアを与えた。そのため、細胞形態学を用いて決定されるように、H460-16-2処置では増加したアポトーシスの傾向がある。
抗体キメラの産生を促進するために、重さ及び軽鎖の両方の可変領域をコードする遺伝子は、別個にクローン化され、配列決定された（S.N. 11/364,013に開示されている）。ヒトIgGl及びIgG2同位体のH460-16-2キメラの軽鎖及び重鎖は、次いで、構築され発現された（S.N. 11/364,013に開示されている）。
キメラ抗体対ネズミ抗体の相対的有効性を決定するために、ヒト乳癌のインビボモデルが実行された（S.N. 11/364,013に開示されている）。ネズミH460-16-2及び（ch）ARH460-16-2-IgG1は、確立されたヒト乳癌のMDA-MB-231インビボモデルにおいて腫瘍成長を減少させた。最終投薬が投与された５日後である62日目に、H460-16-2による処置は、39パーセントの腫瘍成長阻害をもたらした（平均T/C = 57パーセント）。腫瘍成長のこの減少は、対照とは有意に異なった（p=0.0037）。キメラ抗体（ch）ARH460-16-2-IgG1は、64パーセントの増大した腫瘍成長阻害をもたらした（T/C = 26.9パーセント; pO.0001）。対照的に、キメラ抗体のIgG2体である（ch）ARH460-16-2-IgG2は、バッファー対照と比べた時に腫瘍成長の阻害を示さなかった（腫瘍成長阻害 = 0パーセント; 平均T/C = 122パーセント; p=0.7264）。この試験全体について傷害性の臨床的兆候はなかった。纏めると、（ch）ARH460-16-2-IgG1は、MDA-MB-231乳癌モデルにおけるネズミ抗体に比較して同等以上の有効性を証明する。
アネキシン-V染色は、H460-16-2のキメラ体が、MDA-MB-231乳癌細胞株上のネズミ対応物と同様にしてアポトーシスを誘導することができるか否かを決定するために、（S.N. 11/364,013に開示されているように）先に実行した。３つの抗体はすべて、その予想されるの同位体対照に渡って、ネクローシス及びネクローシス/アポトーシス集団の割合の用量-依存的増加を示した。ネクローシス及びネクローシス/アポトーシス集団の割合の最大の増加は、（ch）ARH460-16-2-IgG2、次いで（ch）ARH460-16-2-IgG1、及び次いでH460-16-2で見られた。
全体として、データは、H460-16-2抗原が癌関連抗原であり、ヒトで発現され、病的に関連する癌標的である、ことを証明している。更に、このデータはまた、H460-16-2抗体のヒト癌組織への結合を証明しており、診断、治療の予測又は予後でよいアッセイのために好適に用いられる。加えて、この抗原の細胞膜局在化は、ほとんどの非-悪性細胞中の抗原の発現の欠如に起因する細胞の癌状態の指標であり、そして、この観察は、この抗原、その遺伝子もしくは誘導体、そのタンパク質もしくはその誘導体を、診断、治療の予測又は予後でよいアッセイのために使用することを許容する。
抗-CD44抗体の使用を含む他の試験は、H460-16-2によって奏される治療的可能性の制限を有する。H460-16-2は、インビトロ及びインビボでの抗-腫瘍活性を証明する。先に記載したMAK<CD44>M-1.1.12、AK<CD44>M-2.42.3及びMAK<CD44>M-4.3.16のような抗体は、それらに起因するインビトロ又はインビボでの細胞傷害性を有さず、VFF-18及びMab U36は本質的な腫瘍細胞傷害性を示す。加えて、インビボで腫瘍効果を示している他の抗-CD44抗体も、H460-16-2についてはっきりしていないある制限を有する。例えばASML1.1、K926、抗-CD44及びIM-78.1は、それぞれ、異種移植モデルで成長したラット、ネズミ、ラット及びネズミの腫瘍に対するインビボでの抗-腫瘍活性を示す。H460-16-2は、ヒト癌モデルでの抗-腫瘍活性を証明する。H460-16-2はヒトCD44にも対するものであるが、ASML1.1のような抗体はラットCD44のみを認識する。クローン515抗-CD44抗体は、ヒト卵巣細胞の腹膜腫瘍移植を阻害しないが、腫瘍成長を抑制又は阻害しない。H460-16-2は、SCIDマウス異種移植モデルにおけるヒト乳癌成長を阻害することができる。GKW.A3は、予防的であるが確立されていないモデルにおける、マウスで成長するヒト転移性黒色腫の腫瘍成長を阻害することができる抗-ヒトCD44モノクローナル抗体である。H460-16-2は、ヒト乳癌の予防的かつ確立されたネズミ異種移植モデルにおいて顕著な抗腫瘍活性を証明した。従って、H460-16-2は、先に記載された抗-CD44抗体と比べて、優れた抗腫瘍性を有することはまったく明らかである。SCIDマウスにおけるヒト乳癌に対するインビトロ及びインビボでの抗腫瘍活性がヒトCD44に対するものであることが証明されている。それは、また、ヒト乳癌の予防的かつ確立された（より臨床的に関連する）モデルにおける活性を示し、ヒト前立腺癌の確立されたモデルにおいてシスプラチンによる活性を示す。
本発明は、H460-16-2、その対応するキメラ抗体、（ch）ARH460-16-2-IgG1及び（ch）ARH460-16-2（VKOVHO）、及びその対応するヒト化抗体変異体、（hu）ARH460-16-2の開発、並びに使用を記載する。H460-16-2は、腫瘍成長モデルにおける細胞傷害性アッセイでのその効果、及び癌性疾患に罹患した哺乳動物における延長した生存時間におけるその効果によって特定された。本発明は、初めて、標的分子であるCD44上に存在するエピトープ又はエピトープ（複数）に特異的に結合し、そして悪性腫瘍細胞に対するが正常細胞に対するものではないネイキド抗体としてインビトロでの細胞傷害性を有し、ネイキド抗体として、ヒト癌のインビボモデルにおいて腫瘍成長の阻害及び生存延長を直接的に介在もする、試薬を記載している点で、癌処置の分野における進歩を示す。このことは、類似の性質を有することが分かっていないので、任意の他の先に記載して抗-CD44抗体に関連する進歩である。それはまた、ある種類の腫瘍の成長及び発症に関連した事象においてCD44の直接的な関連を明確に証明し、またそれは初めてであるので、当該分野における進歩を提供する。それはまた、ヒト患者において類似の抗癌性を示す可能性を有するので、癌療法における進歩を示す。更なる進歩は、抗癌抗体のライブラリにこれらの抗体を含めることが、異なった抗癌抗体の好適な組合せの決定によって異なった抗原マーカーを発現する腫瘍を標的する可能性を増大して、腫瘍の成長及び発症を標的し及び阻害する点で最も効果的であることを発見するだろう、ことである。
結局、本発明は、H460-16-2抗原が投与された時に、哺乳動物においてH460-16-2抗原を発現する癌の腫瘍負荷を減少することができ、及び処置動物の長期生存もたすことができる、治療剤のための標的としてのH460-16-2抗原の使用を教示する。本発明はまた、CDMAB（H460-16-2、（ch）ARH460-16-2-IgG1、（ch）ARH460-16-2 （VKOVHO）及び（hu）ARH460-16-2の変異体）及びその誘導体、及びその抗原結合フラグメント、並びに哺乳動物において抗原を発現する癌の腫瘍負荷を減少させ、処置動物の長期生存をもたらすためにその抗原を標的するための、その細胞性細胞傷害性誘導リガンド、の使用を教示する。更に、本発明はまた、この抗原を発現する腫瘍を担持する哺乳動物の診断、治療の予測及び予後のために有用であり得る、癌性細胞中のH460-16-2抗原の検出の使用を教示する。
従って、ハイブリドーマ細胞株、対応する単離されたモノクローナル抗体及び該ハイブリドーマ細胞株がコードされるその抗原得k都合フラグメントを単離するために、特定の個体から得られた癌性細胞又は１以上の特定の癌細胞株に対する癌性疾患修飾抗体（CDMAB）を産生する方法であって、CDMABが癌細胞に関して細胞傷害性せあり、同時に非-癌性細胞に対して相対的に非毒性である、前記方法を利用することは本発明の目的である。
癌性疾患修飾抗体、そのリガンド及びその抗原結合フラグメントを教示するのは、本発明の更なる目的である。
細胞傷害性が抗体依存性細胞性傷害性によって介在される癌性疾患修飾抗体を産生することは、本発明の更なる目的である。
細胞傷害性が補体依存的細胞性障害性によって介在される癌性疾患修飾抗体を産生することは、本発明のなお更なる目的である。
細胞傷害性が、細胞性化学結合の加水分解を触媒するその能力の一機能である、癌性疾患修飾抗体を産生することは、本発明のなお更なる目的である。
本発明のなお更なる目的は、癌の診断、予後診断及びモニタリングのための結合アッセイにおいて有用である癌性疾患修飾抗体を産生することである。
本発明の他の目的及び利点は、例証及び例として本発明のある態様を記載している以下の記載から明らかになるだろう。
特許及び出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数）を有するこの特許又は特許出願刊行物の複写は、必要な料金の要求及び支払いのうえで特許庁によって提供されるだろう。
図１は、確立されたヒト乳癌MDA-MB-468モデルにおける腫瘍成長に対するH460-16-2の効果を証明する。縦の破線は、抗体は腹腔内に投与された期間を示す。データ点は平均±SEMを示す。 図２は、確立されたMDA-MB-468乳癌モデルにおけるマウス体重に対するH460-16-2の効果を証明する。データ点は平均±SEMを示す。 図３は、確立されたヒトPC-3前立腺癌モデルにおける腫瘍成長に対するH460-16-2の効果を証明する。縦の破線は、抗体は腹腔内に投与された期間を示す。データ点は平均±SEMを示す。 図４は、確立されたPC-3前立腺癌モデルにおけるマウス体重に対するH460-16-2の効果を証明する。データ点は平均±SEMを示す。 図５は、確立されたヒト乳癌（MDA-MB-231）モデルにおける腫瘍成長に対する用量依存的方法での（ch）ARH460-16-2-IgG1の効果を証明する。縦の破線は、抗体は腹腔内に投与された期間を示す。データ点は平均±SEMを示す。 図６は、確立されたMDA-MB-231乳癌モデルにおけるマウス体重に対する（ch）ARH460-16-2-IgG1の効果を証明する。データ点は平均±SEMを示す。 図７は、ヒト結腸癌組織マイクロアレイ上でのH460-16-2結合の概要である。 図８は、H460-16-2（A）又は同位体対照抗体（B）を用いて得られた結腸癌組織上の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。拡大率は200Xである。 図９は、ヒト及びカニクイザル組織マイクロアレイ上での（ch）ARH460-16-2-IgG1の結合の概要である。 図１０は、ヒト脾臓（白色髄）（A）及びカニクイザル脾臓（白色髄）（B）上の（ch）ARH460-16-2-IgG1との結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。拡大率は40Xである。 図１１は、異なった一次抗体溶液を用いて処理されたMDA-MB-231膜タンパク質の500 μgのウェスタンブロットである。レーン1〜5は、それぞれ、非-ビオチン化H460-16-2の2 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL又は1000 μg/mLと混合されたビオチン化H460-16-2で処理された。レーン6〜10は、それぞれ、非-ビオチン化AR37A335.8の2 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL又は1000 μg/mLと混合されたビオチン化H460-16-2で処理された。レーン11〜15は、それぞれ、非-ビオチン化1B7.11の2 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL又は1000 μg/mLと混合されたビオチン化H460-16-2で処理された。 図１２は、異なった一次抗体溶液を用いて処理されたMDA-MB-231膜タンパク質の500 μgのウェスタンブロットである。レーン1〜5は、それぞれ、非-ビオチン化H460-16-2の2 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL又は1000 μg/mLと混合されたビオチン化AR37A335.8で処理された。レーン6〜10は、それぞれ、非-ビオチン化AR37A335.8の2 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL又は1000 μg/mLと混合されたビオチン化AR37A335.8で処理された。レーン11〜15は、それぞれ、非-ビオチン化8B1B.1の2 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL又は1000 μg/mLと混合されたビオチン化AR37A335.8で処理された。 図１３は、AR37 A335.8の結合親和性である。精製組換えヒトCD44への該抗体の結合の解離定数は、表面プラズモン共鳴によって評価した。 図１４は、リン酸化が、（ch）ARH460-16-2-IgG1によるMDA-MB-231細胞の処置によって影響され、次いで血清及び補足刺激による。PTKのリストである。 図１５は、軽鎖（それぞれ、順に配列番号10〜28）のPCR増幅において使用されるプライマーである。 図１６は、重鎖（それぞれ、順に配列番号29〜44）のPCR増幅において使用されるプライマーである。 図１７は、マウスH460-16-2 VH配列（配列番号45）を示す。 図１８は、マウスH460-16-2 VL配列（配列番号46）を示す。 図１９は、キメラ及び変異ヒト化H460-16-2 VH配列の作製のために使用されたオリゴヌクレオチド（順にそれぞれ配列番号47〜58）を示す。 図２０は、キメラ及び変異ヒト化H460-16-2 VL配列の作製のために使用されたオリゴヌクレオチド（順にそれぞれ配列番号59〜68）を示す。 図２１は、pANT18発現ベクターを示す。 図２２は、ヒト化H460-16-2 VH変異体（順にそれぞれ配列番号7及び9）。CDRは下線を引いた。 図２３は、ヒト化H460-16-2 VL変異体（配列番号8）を示す。CDRは下線を引いた。 図２４は、H460-16-2のキメラ及びヒト化変異体の結合データを示す。 図２５は、ネズミH460-16-2の、及びヒト化変異体、（hu）ARH460-16-2変異体HV1/KV1及び（hu）ARH460-16-2変異体HV2/KV1の結合親和性である。精製組換えヒトCD44への該抗体の結合の解離定数は、表面プラズモン共鳴によって評価した。
発明の詳細な説明
一般的に、以下の用語又は語句は、概要、説明、実施例及びクレームで使用される場合に、所定の定義を有する。
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には例えば（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体、脱-免疫されたネズミ、キメラ、又はヒト化抗体（複数）を含む）単一のモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、単一-鎖抗体、免疫複合体及び抗体フラグメントを包含する（以下、参照）。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在することがある可能性のある自然突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対して高度に特異的である。更に、異なった決定因子（エピトープ）に対する異なった抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されることなく合成され得る点で、有利である。修飾語の「モノクローナル」は、実質的に同質の抗体集団から得られた抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler他, Nature, 256: 495 （1975）によって最初に記載されたハイブリドーマ法（ネズミ又はヒト）によって作製されても、あるいは組換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号明細書参照）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson他, Nature, 352: 624-628 （1991）、及びMarks他, J. Mol. Biol, 222: 581-597 （1991）によって記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
「抗体フラグメント」は、好ましくは抗原結合又はその可変領域を含む無傷の抗体の一部分を含む。抗体フラグメントの例は、完全長抗体未満、すなわちFab、Fab'、F（ab'）2及びFvフラグメント；ダイアボディー；線状抗体；単一-鎖抗体分子；単一-鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質及び抗体フラグメント（複数）から形成された多重特異的抗体、を含む。
「無傷」の抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン（CL）及び重鎖定常ドメイン、CH1、CH2及びCH3を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸変形体でよい。好ましくは、無傷の抗体は、１以上のエフェクタ機能を有する。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、無傷の抗体は、異なった「クラス」に帰属され得る。無傷の抗体の５つの主なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、これらの数種類は、更に「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に更に分けられる。抗体の異なったクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なったクラスのサブユニット構造及び3次元構造はよく知られている。
抗体「エフェクタ機能」は、抗体のFc領域（天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域）に帰因するその生物学的活性を言う。抗体のエフェクタ機能の例は、C1q結合：補体依存的細胞傷害性；Fc受容体結合：抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性（ADCC）；食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、B細胞受容体：BCR）等を含む。
「抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性」及び「ADCC」は、Fc受容体（FcR）（例えば、Natural Killer（NK）細胞、好中球及びマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合された抗体を認識し、次いで該標的細胞の溶解を引き起こす、細胞仲介反応を言う。ADCC、NK細胞を仲介するための一次細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92（1991）の第４頁第３表に纏められている。対象の分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号明細書又は同第5,821,337号明細書に記載されているようなインビトロでのADCCアッセイが行われ得る。かかるアッセイのための有用なエフェクタ細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）及びナチュラルキラー（NK）細胞を含む。あるいは又は追加的に、対象の分子のADCC活性は、インビボ、例えばClynes他, PNAS（USA） 95: 652-656（1998）に開示された動物モデルにおいて評価され得る。
「エフェクタ細胞」は、１以上のFcRを発現し、エフェクタ機能を果たす白血球である。好ましくは、該細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクタ機能を果たす。ADCCを仲介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単核、細胞傷害性T細胞及び好中球を含む；PBMC及びNK細胞が好ましい。該エフェクタ細胞は、その天然源、例えば本明細書に記載の血液又はPBMCから単離され得る。
用語「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を記載するために使用される。好ましいFcRは、天然配列ヒトFcRである。更に、好ましいFcRは、IgG抗体（ガンマ受容体）に結合し、そしてアレル変異体及びこれらの受容体の代替的にスプライスされた形態を含む、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含む、ものである。FcγRII受容体は、その細胞ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、FcγRIIA（「活性化受容体」）及びFcγRIIB（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞ドメイン中に免疫受容体チロシン型モチーフ（ITAM）を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞ドメイン中に、免疫受容体チロシン型阻害モチーフ（ITAM）を含む（M. in Dagron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234（1997）参照）。FcRは、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 1991）; Capel等, Immunomethods 4: 25-34（1994）; 並びにde Haas他, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41（1995）を参照されたい。将来同定されるものを含む他のFcRは、本明細書に記載の用語「FcR」によって包含される。該用語は、胎児への母親IgGの移動の原因となる、新生児受容体、すなわちFcRnも含む（Guyer他, J. Immunol. 117: 587（1976）及びKim他, Eur. J. Immunol. 24: 2429 （1994））。
「補体依存的細胞傷害性」又は「CDC」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を言う。補体活性化経路は、補体系（C1q）の第１成分の、同系抗原と複合化された分子（例えば、抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ、例えばGazzano-Santoro他, J. Immunol. Methods 202: 163 （1996）に記載されたものを行ってもよい。
用語「可変」は、可変ドメインのある部分は抗体間の配列において大きく異なり、そしてその特定の抗原のためのそれぞれの特定の抗体の結合性及び特異性において使用される、事実を言う。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインに渡って等しく分布されない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域と呼ばれる３つのフラグメントに濃縮されている。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、ループ結合を形成する３つの超可変領域によって結合されたβ-シート構造を主に採用し、そして場合によっては該β-シート構造の一部を形成する、４つのFRを含む。各鎖中の超可変領域は、FRによって互いに近接して及び他の鎖由来の超可変領域と共に維持され、抗体の抗原-結合部位の形成をもたらす（Kabat他, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. （1991）参照）。定常領域は、抗原に対する抗体の結合に直接的に関連しないが、抗体依存的細胞傷害性（ADCC）における抗体の関与のような様々なエフェクタ機能を示す。
本明細書で使用される用語「超可変領域」は、抗原-結合の原因となっている抗体のアミノ酸残基を言う。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基24-34 （L1）、50-56 （L2）及び89-97 （L3）、及び重鎖可変ドメイン中の残基31-35 （H1）、50-65 （H2）及び95-102 （H3）；Kabat他, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. （1991））及び/又は「超可変ループ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基2632 （L1）、50-52 （L2）及び91-96 （L3）、及び重鎖可変ドメイン中の残基26-32 （H1）、53-55 （H2）及び96-101（H3）；Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 （1987））を含む。「フレームワーク領域」又は「FR」は、本明細書で定義された超可変領域以外の可変ドメイン残基である。抗体のパパイン消化は、「Fab」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原-結合フラグメントを生じ、各々は、単一の抗原-結合部位及び残りの「Fc」フラグメントを有し、その名称は容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理は、２つの抗原-結合を有し、依然として架橋抗原であり得るF（ab'）2フラグメントを生じる。
「Fv」は、完全な抗原-認識及び抗原-結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、固く非-共有結合での、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとのダイマーからなる。それは、各可変ドメインの３つの超可変領域がVH-VLダイマーの表面上の抗原-結合部位を特徴付けるために相互作用するというこの構造にある。共同して、３つの超可変領域は、抗体に対する抗原-結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むFvの半分）さえも、全体的な結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識し及び抗原と結合する能力を有する。Fabフラグメントも、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（CH I）を含む。Fab'フラグメントは、抗体のヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加によって、Fabフラグメントとは異なる。Fab'-SHは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数）が少なくとも１つの遊離のチオール基を有するFab'の消化である。F（ab'）2抗体フラグメントは、元々は、F（ab'）2フラグメント間でヒンジシステインを有するFab'フラグメントの対として作られた。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なった種類、カッパ（κ）及びラムダ（λ）、の１つに帰属され得る。
「単一-鎖Fv」又は「scFv」抗体フラグメントは、単一のポリペプチド鎖に存在する、抗体のVH及びVLドメインを含む。好ましくは、Fvポリペプチドは、scFvに抗原結合のための所望の構造を形成させるVHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーを更に含む。scFvの総説に関しては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113巻, Rosenburg and Moore著, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 （1994）参照。
用語「ダイアボディー」は、２つの抗原-結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、同一のポリペプチド鎖（VH-VL）中の可変軽鎖ドメイン（VL）に結合された可変重鎖ドメイン（VH）を含む該フラグメントを言う。同一鎖上の２つのドメイン間でペアリングを可能にするには短いリンカーを用いることによって、ドメインは、他の鎖の相補的ドメインと強制的にペアをつくり、２つの抗原-結合部位をつくる。ダイアボディーは、例えば欧州特許第EP 404,097号明細書; WO 93/11161; 及びHollinger他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 （1993）により詳細に記載されている。
用語「トリアボディー」又は「三価トリマー」は、３つの単一鎖抗体の組合せを言う。トリアボディーは、すなわち、リンカー配列無しにVL又はVHドメインのアミノ酸末端で構築される。トリアボディーは、環状のヘッドトゥーテール形式に並んだポリペプチドと共に３つのFvヘッドを有する。トリアボディーの可能な構造は、互いに120度の角度で平面に位置した３つの結合部位を有する二次元である。トリアボディーは、単一特異的、二重特異的、又は三重特異的でよい。
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定及び分離され、及び/又は回復されたものである。その天然環境の汚染成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含むことがある。単離された抗体は、該抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、組換え細胞内でインサイチュで該抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製ステップによって調製されるだろう。
対象の抗原に「結合する」抗体は、抗体が、抗原を発現する細胞を標的することにおいて治療剤又は診断剤として有用であるような十分な親和性を有する抗原と結合することができる抗体である。該抗体が抗原部分と結合するものである場合に、それは、通常、好ましくは、他の受容体とは反対の抗原部分と結合するだろう、そして、非-特異的Fc定常のような付随的な結合、又は他の抗原に共通する転写後修飾への結合を含まず、他のタンパク質とほとんど交差反応しないものでよい。対象の抗原に結合する抗体の検出のための方法は、当該分野でよく知られており、FACS、細胞ELISA及びウェスタンブロットのようなアッセイを含み、これらに限定されない。
本明細書で用いる表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」は、交換的に使用され、すべてのかかる意味は子孫を含む。すべての子孫は、故意又は不注意の変異に因ってDNA含量が正確に同一ではないことがあることも理解されたい。最初に形質転換された細胞中で選別された同一の機能又は生物学的活性を有する変異子孫も含まれる。明確な意味が意図される文脈から明らかであろう。
「治療又は治療すること」は、治療的な処置及び予防的又は抑制的手段の両方を言う。その目的は、標的された病状又は疾患を予防し又は衰えさせる（減少させる）ことである。治療の必要のある者は、疾患を既に有する者、及び疾患を有する傾向にある者又は疾患が予防されるべき者である。従って、本明細書で治療されるべき哺乳動物は、疾患を有すると診断されているかもしれないし、又は疾患にかかりやすい又は疾患の影響を受けやすいかもしれない。
用語「癌」及び「癌性」は、非制御された細胞増殖又は死によって典型的に特徴付けられる哺乳動物の生理学的症状を言うか又は説明する。癌の例は、悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例は、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非-小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌又は胃がん、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、及び頭頸部癌を含む。
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（サイトキサン（商標））；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチルエニミン及びメチルアメラミン；ナイトロジェン・マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマウスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガカマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗-代謝物質、例えばメトトレキサート及び5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトトレキサート；プリンアナログ、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシタビン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、5-FU；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗-副腎剤、例えばアミノグルテチミド、マイトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラクトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォミチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイトグアゾン；マイトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；マイトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（タキソール（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.）及びドセタキセル（タキソテラ（登録商標）、Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル；ゲンシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；マイトマイシンC；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；CPT-11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイル酸；エスペラマイシン；カペシタビン；及び上記の任意の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。この定義には、腫瘍に対してホルモン作用を制御又は阻害するように働く抗-ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4（5）-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン及びトレミフェン（ファレストン）を含む抗-エストロゲン剤；及び抗-アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；及び上記の任意の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体も含まれる。
治療目的のための「哺乳動物」は、ヒト、マウス、SCIDもしくはヌードマウス又はマウス種族、家畜（domestic animals）及び家畜（farm animals）、及び動物園動物、娯楽動物、あるいはペット動物を含む哺乳動物として分類される任意の動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を言う。本明細書では、好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法（例えば、1988年5月4日に公開されたEP 266,032に記載されたような固相法を用いる、あるいは、Froehler他, Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407, 1986によって記載されたデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を経る、ホスホトリエステル、ホスファイト、又はホスホラミデート化学）によって化学的に合成される、短鎖、単一-又は二重鎖のポリデオキシヌクレオチドである。それらは、次いで、ポリアクリルアミドゲル上で精製される。
本発明に従って、非-ヒト（例えば、ネズミ）免疫グロブリンの「ヒト化」及び/又は「キメラ」形態は、元の抗体と比べて、ヒト抗-マウス抗体（HAMA）、ヒト抗-キメラ抗体（HACA）又はヒト抗-ヒト抗体（HAHA）応答の減少をもたらす、特定のキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又はフラグメント（例えば、Fv、Fab、Fab'、F（ab'）2、又は抗体の他の抗原-結合サブシーケンス）を含み、そして所望の効果を再現し、同時に前記の非-ヒト免疫グロブリンに匹敵する結合特性を維持するために必要である、前記の非-ヒト免疫グロブリンから得られる不可欠な部分（例えば、CDR（複数）、抗原結合領域（複数）、可変ドメイン（複数）等）を含む、抗体を言う。たいていは、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そこでは、レシピエント抗体の相補性決定領域（CDR）由来の残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット又はウサギのような非-ヒト種（ドナー抗体）のCDR由来の残基によって置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非-ヒトFR残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、移入されたCDR又はFR配列においても見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の能力を更に洗練し及び最適化するためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの及び典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含むことになる。そこでは、CDR領域のすべて又は実質的にすべては、非-ヒト免疫グロブリンのCDR領域に該当し、FR残基のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR残基である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも１部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも１部を含むだろう。
「脱-免疫」抗体は、所定の種に対して、非-免疫原性であるか又はほとんど免疫原性でない、免疫グロブリンである。脱-免疫は、抗体への構造的変化によって達成され得る。当業者に公知の任意の脱-免疫法が採用され得る。例えば2000年6月15日に公開されたWO 00/34317には、脱-免疫抗体の１つの好適な技術が記載されている。
「アポトーシス」を誘導する抗体は、任意の手段によってプログラムされた細胞死を誘導する抗体であり、アネキシンVの結合、カスパーゼ活性、DNAのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞フラグメント化、及び/又は膜小胞の形成（アポトーシス細胞と呼ばれる）によって説明されるがこれらに限定されない。
本明細書で用いる「抗体誘導細胞傷害性」は、受入番号PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されたハイブリドーマ上清又は抗体、受入番号PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離されたモノクローナル抗体のヒト化抗体、受入番号PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離されたモノクローナル抗体のキメラ抗体、その抗原結合フラグメント、あるいはその抗体リガンド、から得られる細胞傷害性効果を意味するものと理解される。但し、その効果は結合の程度に必ずしも関連しない。
本明細書において、ハイブリドーマ細胞株、及びそこから産生される単離されたモノクローナル抗体は、代わりに、内部表記、H460-16-2（ネズミ）、(ch)ARH460-16-2IgG1、(ch)ARH460-16-2(VK0VH0)、(hu)ARH460-16-2、又は寄託表記ATCC PTA-461によって言及される。
本明細書で使用される「抗体-リガンド」は、標的抗原の少なくとも１つのエピトープの結合特異性を示す部分を含み、そして、無傷の抗体分子、抗体フラグメント及び少なくとも抗原-結合領域又はその部分（すなわち、抗体分子の可変部分）を有する任意の分子、例えばFv分子、Fab分子、Fab'分子、F（ab'）2分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、あるいはATCC PTA-4621（ATCC PTA-4621抗原）として指定されたハイブリドーマ細胞株によって産生された単離モノクローナル抗体によって結合された抗原の少なくとも１つのエピトープを特異的に認識及びそれに結合する任意の遺伝子工学によって作製された分子でよい。
本明細書で使用される「癌疾患修飾抗体」（CDMAB）は、患者に有益である方法、例えば、腫瘍を担持する個体の腫瘍負荷又は延長された生存を減少させることによる、で癌性疾患プロセスを修飾するモノクローナル抗体、及びその抗体-リガンドを言う。
「CDMAB関連結合物質」は、その広い意味で、少なくとも１つのCDMAB標的エピトープに競争的に結合する、ヒト又は非-ヒト抗体、抗体フラグメント、抗体リガンド等の任意の形態を含むがこれらに限定されない。
「競争結合物質」は、少なくとも１つのCDMAB標的エピトープに結合親和性を有する、ヒト又は非-ヒト抗体、抗体フラグメント、抗体リガンド等の任意の形態を含むものと理解される。
処置される腫瘍は、原発性腫瘍及び転移性腫瘍、並びに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独、又はそれらの組合せによる処置に反応しないか又は抵抗性である腫瘍を含む。難治性腫瘍はまた、かかる物質による処置によって阻害されるが、処置後、５年まで、時には１０年まで又はそれ以上まで再発しないと思われる腫瘍を含む。
処置される腫瘍は、血管新生化しない又は実質的に血管新生しない腫瘍、及び血管新生した腫瘍を含む。従って処置され得る固形腫瘍の例は、乳癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、グリオーマ及びリンパ腫を含む。かかる腫瘍の例には、扁平上皮癌、扁平上皮乳頭腫、例えば頭頸部癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌及び非-小細胞肺癌を含む肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、及び肝臓癌を含む。他の例は、カポジ肉腫、CNS腫瘍、神経芽細胞腫、毛細血管腫、髄膜腫及び脳転移、黒色腫、胃腸及び腎臓癌及び肉腫、横紋筋肉腫、グリア芽腫、好ましくは多形性膠芽腫、並びに平滑筋肉腫を含む。
本明細書で使用される「抗原-結合領域」は、標的抗原を認識する分子の１部分を意味する。
本明細書で使用される「競争的阻害」は、ATCC PTA-4621（ATCC PTA-4621抗体）として指定されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体、受入番号PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離されたモノクローナル抗体のヒト化抗体、受入番号PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離されたモノクローナル抗体のキメラ抗体、その抗原結合フラグメント、あるいはその抗体リガンドが、慣用的な相反抗体競合アッセイを用いて方向付けられる決定部位を認識し及びこれに結合することができることを意味する（Belanger L., Sylvestre C.及びDufour D. （1973）, Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15）。
本明細書で用いる「標的抗原」は、ATCC PTA-4621抗原又はその部分である。
本明細書で用いる「免疫複合体」は、任意の分子又はCDMAB、例えば、細胞毒、放射活性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポータ部分、酵素、毒素、抗-腫瘍剤もしくは治療剤に化学的又は生物学的に結合された抗体、を意味する。抗体又はCDMABは、その標的に結合することができる限り、分子の任意の位置で、細胞毒、放射活性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポータ部分、酵素、毒素、抗-腫瘍剤もしくは治療剤に結合されてもよい。免疫複合体の例は、抗体毒素化学複合体、及び抗体-毒素融合タンパク質を含む。
抗-腫瘍物質として使用するために好適な放射活性物質は、当業者に知られている。例えば、1311又は211Atが使用される。これらの放射性同位体は、慣用的技術を用いて抗体に結合される（例えば、Pedley他, Br. J. Cancer 68, 69-73 （1993））。あるいは、抗体に結合されている抗-腫瘍性物質は、プロドラッグを活性化する酵素である。一旦抗体複合体が投与されるとその細胞傷害性形態に変換される腫瘍部位に到達するまで、その不活性形態のままでいるプロドラッグが投与されてよい。実際に、抗体-酵素複合体が患者に投与され、処置される組織の部位に局在化され得る。次いで、プロドラッグは、細胞傷害性物質への変換が処置される組織部位で起こるように患者に投与される。あるいは、抗体に複合化された抗-腫瘍物質は、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）又はα腫瘍壊死因子（TNF-α）のようなサイトカインである。抗体は、他の組織に影響を与えることなく、サイトカインが腫瘍への損傷又は腫瘍の破壊を介在するように、腫瘍にサイトカインを標的化する。サイトカインは、慣用的な組換えDNA技術を用いてDNAレベルで抗体に融合される。インターフェロンを使用してもよい。
本明細書で使用される「融合タンパク質」は、抗原結合部位が生物学的に活性な分子、例えば、毒素、酵素、蛍光タンパク質、発光マーカー、ポリペプチドタグ、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポータ部分又はタンパク質薬、に結合される任意のキメラタンパク質を意味する。
本発明は、標的又はレポータ部分が連結される本発明のCDMABを更に画する。標的部分は結合ペアの第一メンバーである。抗-腫瘍剤は、例えば、かかるペアの第二メンバーに複合化され、それによって抗原-結合タンパク質が結合される部位に指向される。かかる結合ペアの一般的な例は、アビジン及びビオチンである。好ましい実施態様では、ビオチンは、本発明のCDMABの標的抗原に複合化され、それによってアビジン又はストレプトアビジンに複合化される抗-腫瘍剤又は他の部分のための標的を提供する。あるいは、ビオチン又は他のかかる部分は、本発明のCDMABの標的抗原に連結され、レポータとして、例えば検出可能なシグナル-産生物質がアビジン又はストレプトアビジンに複合化される診断系において使用される。
検出可能なシグナル-産生物質は、診断目的でインビボ及びインビトロで有用である。シグナル-産生物質は、外的手段、通常電場放射線の測定、によって検出できる測定可能なシグナルを産生する。たいてい、シグナル-産生物質は、酵素又はクロモフォアであり、蛍光、りん光又は化学ルミネッセンスによって光を放出する。クロモフォアは、紫外又は可視領域の光を吸収する色素を含み、酵素触媒反応の基質又は分解生産物でよい。
更に、当業者に周知である研究又は診断方法のためのインビボ及びインビトロでの本発明のCDMABの使用は、本発明の範囲内に含まれる。本明細書で画される診断的方法を実行するために、本発明は、本発明のCDMABを含むキットを更に含む。かかるキットは、ある種類の癌のリスクにある個体の細胞に対するCDMABの標的抗原の過発現を検出することによって、該個体の同定のために有用であろう。
診断アッセイキット
腫瘍の存在を決定するための診断アッセイキットの形態で本発明のCDMABを利用することが画される。腫瘍は、一般的に、１以上の腫瘍-特異的抗原、例えば、タンパク質及び/又は試料が患者から得られる血清、尿及び/又は腫瘍生検のような生物学的試料中のこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド、の存在に基いて患者において検出されことになる。
該タンパク質は、例えば結腸癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌のような特定の腫瘍の存在又は非存在を示すマーカーとして機能する。抗原は、他の癌性腫瘍の検出のための有用性を有するだろうことが更に画される。本発明のCDMAB又はCDMAB関連結合物質から成る結合物質の診断アッセイキットに含めることは、生物学的試料中の物質に結合物質に結合する抗原レベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマー及びプローブは、癌の存在又は非存在の指標でもある腫瘍タンパク質をコードするmRNAのレベルを検出するために使用されてよい。結合アッセイを診断用にするためには、結合認識に確実に癌性腫瘍の存在のための診断を与えるように、正常組織に存在するものに関連して、統計的に有意なレベルの抗原と相関するデータが作成されるだろう。多数の形式が、試料中のポリペプチドマーカーを検出するための結合物質を使用するための、当業者に公知の、本発明の診断アッセイに有用であろう、ことが画される。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に説明されている。更に、上記の診断アッセイ形式の任意及びすべての組合せ、順列又は修飾が画される。
患者における癌の存在又は非存在は、典型的に、（a）患者から得られた生物学的試料を結合物質と接触させ；（b）結合物質に結合するポリペプチドのレベルを試料中で検出し；及び（c）ポリペプチドのレベルを、所定のカットオフ値と比較すること、によって決定されるだろう。
例証的な実施態様では、アッセイは、試料の残余からのポリペプチドに結合しかつ試料の残余からポリペプチドを除くための固体支持体上に固定されたCDMAB型結合物質の使用を含むだろうことが画される。結合されたポリペプチドは、次いで、レポータ基を含み、結合物質及び/又はポリペプチド複合体に特異的に結合する、検出試薬を用いて検出されることがある。例証的な検出試薬は、ポリペプチド又は抗体に特異的に結合するCDMAB型結合物質、あるいは抗免疫グロブリン、プロテインG、プロテインA又はレクチンのような結合物質に特異的に結合する他の物質を含んでよい。別の実施態様では、競争的アッセイが利用されてよいことが画される。そこでは、ポリペプチドが、レポータ基で標識され、試料による結合物質のインキュベーション後に固定された結合物質に結合される。試料と固定された結合物質との反応性の指標は、試料の成分が結合物質への標識されたポリペプチドの結合を阻害する程度である。かかるアッセイ内で使用するための好適なポリペプチドは、結合物質が結合親和性を有する、完全長腫瘍-特異的タンパク質及び/又はその部分を含む。
診断キットは、タンパク質が固定され得る当業者に公知の任意の材料の形態であってよい固体支持体と共に提供されるだろう。好適な例は、マイクロタイタプレート又はニトロセルロースあるいは他の好適な膜中に試験ウェルを含んでよい。あるいは、支持体は、ビーズ又はディスク、例えばガラス、ファイバーガラス、ラテックス、又はプラスチック材料、例えばポリスチレン又はポリビニルクロリドでよい。支持体は、磁気粒子又は光ファイバセンサ、例えば米国特許第5,359,681号明細書に開示されたものでもよい。
特許及び科学文献に十分記載されている当業者に公知の様々な技術を用いて、結合物質が固体支持体上に固定されるだろうことが画される。用語「固定」は、吸着のような非共有結合、及び共有結合を意味する。それは、本発明の文脈において、結合物質と支持体上の官能基との直接的結合でも、又は架橋剤による結合でもよい。好ましい非限定的な実施態様では、マイクロタイタプレート中のウェル又は膜への吸着による固定が好ましい。吸着は、好適なバッファー中の結合物質を固体支持体と好適な時間、接触させることによって達成される。接触時間は、温度と共に変動し、一般的に約１時間〜約１日の範囲内であろう。
固体支持体への結合物質の共有結合は、まず、支持体を、支持基及びヒドロキシル又はアミノ基のような官能基の両方と反応する二官能性試薬と、結合物質上で反応させることによって通常達成される。例えば、結合物質は、ベンゾキノンを用いることにより、あるいは支持体上のアルデヒド基の、結合パートナー上のアミン及び活性水素との縮合によって、好適なポリマーコーティングを有する支持体に共有結合的に結合されてよい（例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12 A13参照）。
診断アッセイキットは、２つの抗体のサンドウィッチアッセイの形態をとることが更に画される。このアッセイは、試料内のポリペプチドが固定された抗体に結合され得るように、抗体、例えば通常マイクロタイタプレートのウェルである支持体上に固定されている本明細書に開示されたCDMABと、試料とをまず接触させることによって達成されてよい。次いで、非結合試料は、固定されたポリペプチド-抗体複合体から除かれ、そしてレポータ基を含む検出試薬（好ましくは、ポリペプチド上の異なった部位に結合することができる第二抗体）が添加される。次いで、固定支持体に結合されたままである検出試薬の量は、特定のレポータ基に好適な方法を用いて決定される。
具体的な実施態様では、抗体が上記の支持体上に一旦固定されると、ウシ血清アルブミン又はツィーン20（商標）（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）のような当業者に公知の任意に好適なブロッキング物質の使用によって、支持体上の残りのタンパク質結合部位がブロックされることが画される。次いで、固定された抗体は、試料でインキュベートされ、ポリペプチドは抗体に結合され得るだろう。試料は、インキュベーション前に、好適な希釈剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈される。一般的に、好適な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、具体的に選択された腫瘍を有する固体から得られた試料内のポリペプチドの存在を検出するために十分な時間に対応するように選択される。好ましくは、接触時間は、結合されたポリペプチドと非結合ポリペプチドとの平衡に達す得る結合レベルの少なくとも約95パーセントである結合レベルを達成するために十分である。当業者は、平衡に達するために必要な時間がある時間を超えて起こる結合レベルをアッセイすることによって容易に決定されることがある、ことを認識するだろう。
非結合試料は、次いで好適なバッファーで固体支持体を洗浄することによって除去されるだろう。レポータ基を含む第二抗体は、次いで固体支持体に添加されるだろう。固体化抗体-ポリペプチド複合体による検出試薬のインキュベーションは、次いで非結合ポリペプチドを検出するために十分な時間実行されるだろう。続いて、非結合検出試薬は次いで除かれ、結合検出試薬がレポータ基を用いて検出されるだろう。レポータ基を検出するために採用される方法は、必ず、選択されるレポータ基、例えば放射活性基の種類に特異的であり、シンチレーションカウンタ又はオートラジオグラフィ法は一般的に好適である。分光学的方法は、色素、発光基及び蛍光基を検出するために使用されてよい。ビオチンは、異なったレポータ基（一般的に放射活性もしくは蛍光基又は酵素）に結合されたアビジンを用いて検出される得る。酵素レポータ基は、一般的に、基質の添加（一般的に、特定の時間）、続いて反応生成物の光学的又は他の分析によって検出されることがある。
前立腺癌のような癌の存在又は非存在を決定するための本発明の診断アッセイキットを利用するために、固体支持体に結合されたままであるレポータ基から検出されたシグナルは、一般的に、所定のカットオフ値に対応するシグナルに匹敵するだろう。例えば、癌の検出のための例証的なカットオフ値は、固定化抗体が癌に罹患していない患者由来の試料でインキュベートされるときに得られる平均シグナルでよい。一般的に、所定のカットオフ値を超える約３つの標準偏差であるシグナルを発生する試料は、癌に陽性であると考えられるだろう。代わりの実施態様では、カットオフ値は、Sackett他, Clinical Epidemiologyの方法に従って、受診者動作曲線を用いて決定してよい。Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, 第106-7頁。かかる実施態様では、カットオフ値は、診断試験結果のための各可能なカットオフ値に相当する、真の陽性率（すなわち、感度）及び偽陽性率（100パーセント-特異性）のペアのプロットから決定される。左手上コーナーに最も近い該プロット上のカットオフ値（すなわち、最も大きい面積を含む値）は、最も正確なカットオフ値であり、この方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを発生する試料は、陽性と考えら得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性率を最小化するためにプロットに沿って左にシフトしてよく、あるいは偽陰性率を最小化するためにプロットに沿って右にシフトしてよい。一般的に、この方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを発生する試料は、癌について陽性と考えられる。
上記キットによって可能になる診断アッセイは、結合物質がニトロセルロースのような膜上に固定されるフロースルー又はストリップ試験形式のいずれかで達成されることが画される。フロースルー試験では、試料が膜を通過するので、試料内のポリペプチドは固定された結合物質に結合する。第二に、第二結合物質を含む溶液が膜を流れるので、標識された結合物質は、結合物質-ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合された第二結合物質の検出は、上記のようにして達成されてよい。ストップ試験形式では、結合物質が結合する膜の一方の末端は、試料を含む溶液中に浸漬されるだろう。試料は膜にそって移動し、第二結合物質を含む領域を通り抜け、固定された結合物質の領域に移る。固定化抗体の領域での第二結合物質の濃度は、癌の存在を示す。視覚的に読める結合部位でのラインのようなパターンの作成は、陽性試験の指標であろう。かかるパターンの不存在は陰性の結果を示す。一般的に、生物学的試料が、２つの抗体のサンドウィッチアッセイにおいて陽性シグナルを形成するために十分であろうポリペプチドのレベルを上記の形式で含む場合に、膜上に固定された結合物質の量は、視覚的に認識し得るパターンを作成するために選択される。本診断アッセイにおいて使用するために好適な結合物質は、本明細書に開示された抗体、その抗原-結合フラグメント、及び本明細書に開示された任意のCDMAB関連結合物質である。膜上に固定された抗体の量は、診断アッセイを作成するために効果的な任意の量であり、約25ナノグラム〜約１マイクログラムの範囲でよい。典型的に、かかる試験は、生物学的試料の非常に少ない量で達成される。
更に、本発明のCDMABは、その標的抗原を同定するその能力のために研究室において使用されることがある。
本明細書に記載された発明をより十分に理解できるように、以下の記載をする。
本発明は、CDMAB（すなわち、ATCC PTA-4621 CDMAB、受入番号PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離されたモノクローナル抗体のヒト化抗体、受入番号PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離されたモノクローナル抗体のキメラ抗体、ATCC PTA-4621抗原を特異的に認識及び結合する抗原結合フラグメント又はその抗体リガンド）を提供する。
受入番号PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離されたモノクローナル抗体のCDMABは、それがハイブリドーマATCC PTA-4621によって産生された単離されたモノクローナル抗体のその標的抗原への免疫特異的結合を競走的に阻害する、抗原結合部位を有する限り、任意の形態でよい。従って、ATCC PTA-4621抗体と同一の結合特異性を有する任意の組換えタンパク質（例えば、該抗体がリンホカイン又は腫瘍阻害成長因子のような第二タンパク質と混合される、融合タンパク質）がATCC PTA-4621抗体は、本発明の範囲内にある。
本発明の１つの実施態様では、CDMABはATCC PTA-4621抗体である。
他の実施態様では、CDMABは、Fv分子（例えば、単一-鎖Fv分子）、Fab分子、Fab'分子、F（ab'）2分子、融合タンパク質、二重特異的抗体、ヘテロ抗体又はATCC PTA-4621抗体の抗原結合部位を有する任意の組換え分子でよい、抗原結合フラグメントである。本発明のCDMABは、ATCC PTA-4621モノクローナル抗体が指向するエピトープに対するものである。
本発明のCDMABは修飾してよい、すなわち、誘導分子を製造するように分子内のアミノ酸修飾によって修飾してよい。化学修飾も可能である。直接的変異による修飾、親和性変異の方法、ファージディスプレイ又は鎖シャッフリングも可能である。
親和性及び特異性は、CDR及び/又はフェニルアラニントリプトファン（FW）を変異させることによって、及び所望の特徴を有する抗体結合部位をスクリーニングすることによって、修飾又は改善することができる（例えば、Yang et al, J. Mol. Biol., （1995） 254: 392-403）。１つの方法は、他の同一の抗原結合部位の集団において２〜20アミノ酸のサブセットが特定の位置で見出されるように、個々の残基又は残基の組合せをランダム化することである。あるいは、突然変異は、エラープローンPCR法によってある範囲の残基に渡って誘導される（例えば、Hawkins et al, J. Mol. Biol, （1992） 226: 889-96）。別の例では、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、E.コリの突然変異誘発遺伝子株において増殖される （例えば、Low他, J. Mol. Biol., （1996） 250: 359-68）。これらの突然変異誘発の方法は、当業者に公知の多くの方法を説明する。
本発明の抗体の親和性を増加するための別の方法は、鎖シャッフリングを実行することである。そこでは、重鎖又は軽鎖は、より高い親和性を有する抗体を調製するための他の重鎖又は軽鎖でランダムに一組にされる。抗体の様々なCDRは、他の抗体における対応するCDRでシャッフルしてもよい。
誘導化分子は、ポリペプチドの機能的特性を保持するだろう、すなわち、かかる置換を有する分子は、ATCC PTA-4621抗原へのポリペプチド又はその部分の結合を依然として可能にするだろう。
これらのアミノ酸置換は、「保存的」として当該分野で知られているアミノ酸置換を含むが、これに必ずしも限られない。
例えば、「保存的アミノ酸置換」と称されるあるアミノ酸置換が、タンパク質の構造又は機能のいずれかを変更することなく、該タンパク質において頻繁に行われることは、タンパク質化学の充分に確立された原則である。
かかる変化は、イソロイシン（I）、バリン（V）及びロイシン（L）と、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸との置換；アスパラギン酸（D）とグルタミン酸（E）との置換、及びその逆；グルタミン（Q）とアスパラギン（N）との置換、及びその逆；並びに、セリン（S）とスレオニン（T）との置換、及びその逆を含む。他の置換は、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の３次元構造におけるその役割に依拠して、保存的であるとも考えられる。例えば、グリシン（G）及びアラニン（A）は、アラニン及びバリン（V）と同様に、頻繁に交換され得る。メチオニン（M）は、比較的に疎水性であり、ロイシン及びイソロイシンと、時にはバリンと、頻繁に交換され得る。リジン（K）及びアルギニン（R）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその変化であり、そしてこれら２つのアミノ酸残基のpKの差が重要でない、位置で頻繁に交換可能である。更に他の変化も、特定の環境において「保存的」であると考慮され得る。
実施例１
ヒトMDA-MB-468乳癌細胞を用いるインビトロ腫瘍実験
H460-16-2は、MDA-MB-231ヒト乳癌異種移植モデルに対する効果を（S.N. 10/603,000に開示されているように）先に証明している。この発見を拡張するために、MDA-MB-468ヒト乳癌異種移植モデルにおいてH460-16-2を試験した。図１及び２に関連して、８〜10週齢雌性胸腺欠損ヌードマウスに、各々のマウスの右脇腹に皮下的に注射された100μlのPBS溶液中の500万個のヒト乳癌細胞（MDA-MB-468）を移植した。マウスは、無作為に、10ずつの２処理群に分けた。マウスの平均腫瘍体積が約83 mm3に近づいた移植後25日目に、20 mg/kgのH460-16-2試験抗体又はバッファー対照を、2.7 mM KCl、1 mM KH2PO4、137 mM NaCl及び20 mM Na2HPO4を含む希釈剤を用いてストック濃度から希釈した後に、300 μlの体積で各集団に腹腔内に投与した。次いで、該抗体及び対照試料を約３週間、週に２回投与した。キャリパで約３〜10日ごとに腫瘍成長を測定した。処置は抗体の８投薬後に完了した。腫瘍測定と同時に動物の体重を記録した。すべての動物は、エンドポイントに達したら直ちに試験の最後にCCACガイドラインに従って安楽死させた。
H460-16-2は、ヒト乳癌細胞のインビボでの確立されたモデルにおいて、MDA-MB-468の腫瘍成長を顕著に阻害した。ARIUS抗体H460-16-2による処置は、抗体の最終投与後26日目である79日目に測定されたように、バッファー処置群に比べて、MDA-MB-468腫瘍の成長を62.8パーセント減少させた（p=0.005506、t-検定）（図１）。腫瘍成長阻害は、対照及び処置群の両方について最初の腫瘍体積を除くことによって計算した。
試験全体において傷害性の明らかな臨床的兆候はなかった。１週間間隔で測定された体重は、成功及び成功のための失敗の代替物であった。平均体重は、試験期間中すべての群において増加した（図２）。35日目と79日目との間の平均体重増加は、対照群では1.82 g（7.2パーセント）、H460-16-2処置群では2.30 g（9.9パーセント）であった。処置期間中、群間の有意差はなかった。纏めると、H460-16-2は、ヒト乳癌異種移植モデルにおいてよく寛容され腫瘍成長を顕著に阻害した。
実施例２
ヒトPC-3前立腺癌H460-16-2を用いるインビボ腫瘍実験は、化学療法薬であるシスプラチンを組み合わせたPC-3ヒト前立腺癌異種移植モデルに対する効果を（S.N. 10/810, 165に開示されているように）以前に証明している。その効果が薬物の非存在下で証明され得たか否かを決定するために、H460-16-2を異なったマウス株異種移植モデルにおいて単独で試験した。図３及び４と関連して、８〜10週齢雄性胸腺欠損ヌードマウスに、各マウスの右脇腹に皮下的に注射された100 μlのPBS溶液中の500万個のヒト前立腺癌細胞（PC-3）を移植した。マウスは、無作為に、10ずつの２処理群に分けた。マウスの平均腫瘍体積が約95 mm3に近づいた移植後６日目に、20 mg/kgのH460-16-2試験抗体又はバッファー対照を、2.7 mM KCl、1 mM KH2PO4、137 mM NaCl及び20 mM Na2HPO4を含む希釈剤を用いてストック濃度から希釈した後に、300μlの体積で各集団に腹腔内に投与した。次いで、該抗体及び対照試料を約３週間、週に２回投与した。キャリパで約４〜10日ごとに腫瘍成長を測定した。処置は抗体の10投薬後に完了した。腫瘍測定と同時に動物の体重を記録した。すべての動物は、エンドポイントに達したら直ちに試験の最後にCCACガイドラインに従って安楽死させた。
H460-16-2は、ヒト前立腺癌のインビボでの確立されたモデルにおいて、PC-3の腫瘍成長を顕著に阻害した。ARIUS抗体H460-16-2による処置は、抗体の最終投与後44日目である71日目に測定されたように、バッファー処置群に比べて、PC-3腫瘍の成長を61.9パーセント減少させた（p=0.002414、t-検定）（図３）。腫瘍成長阻害は、対照及び処置群の両方について最初の腫瘍体積を除くことによって計算した。
試験全体において傷害性の明らかな臨床的兆候はなかった。１週間間隔で測定された体重は、成功及び成功のための失敗の代替物であった。平均体重は、試験期間中すべての群において増加した（図４）。６日目と71日目との間の平均体重増加は、対照群では3.47 g（14.3パーセント）、H460-16-2処置群では3.86 g（15.1パーセント）であった。処置期間中、群間の有意差はなかった。
纏めると、H460-16-2は、ヒト前立腺癌異種移植モデルにおいてよく寛容され腫瘍成長を顕著に阻害した。
実施例３
ヒトMDA-MB-231乳癌細胞を用いるインビボ腫瘍実験
H460-16-2は、MDA-MB-231ヒト乳癌異種移植モデルに対する効果を（S.N. 10/603,000に開示されているように）以前に証明している。効果的な投薬レベルを決定するために、（ch）ARH460-16-2-IgG1を、確立されたMDA-MB-231ヒト乳癌異種移植モデルにおける様々な投薬量において試験した。図５及び６に関連して、８〜10週齢の雌性SCIDマウスに、各マウスの右脇腹に皮下的に注射された100 μlのPBS溶液中の500万個のヒト乳癌細胞（MDA-MB-231）を移植した。マウスの平均腫瘍体積が約100 mm3に近づいた時に、マウスは、無作為に、10ずつの５処理群に分けた。移植後11日目に、20、10、2又は0.2 mg/kgの（ch）ARH460-16-2-IgG1試験抗体又はバッファー対照を、2.7 mM KCl、1 mM KH2PO4、137 mM NaCl及び20 mM Na2HPO4を含む希釈剤を用いてストック濃度から希釈した後に、300μlの体積で各集団に腹腔内に投与した。次いで、該抗体及び対照試料を約３週間、週に３回投与した。キャリパで約４〜７日ごとに腫瘍成長を測定した。処置は抗体の10投薬後に完了した。腫瘍測定と同時に動物の体重を記録した。すべての動物は、エンドポイントに達したら直ちに試験の最後にCCACガイドラインに従って安楽死させた。
（ch）ARH460-16-2-IgG1は、ヒト乳癌のインビボでの確立されたモデルにおいて、11日目〜32日目の処置期間中に0.2 mg/kgの最低投薬量で、MDA-MB-231の腫瘍成長の阻害及び縮退を証明し、投薬後の腫瘍成長阻害を持続させた。20、10、2又は0.2 mg/kgの投薬量でのARIUS抗体（ch）ARH460-16-2-IgG1による処置は、抗体の最終投与後23日目である55日目に測定されたように、バッファー処置群に比べて、MDA-MB-231腫瘍の成長を91.3、89.0、86.1又は63.5パーセント減少させた（pO.OOOOl、t-検定）（図５）。
試験全体において傷害性の明らかな臨床的兆候はなかった。１週間間隔で測定された体重は、成功及び成功のための失敗の代替物であった。平均体重は、試験期間中すべての群において増加した（図６）。０日目と55日目との間の平均体重増加は、対照群では2.33 g（11.9パーセント）、H460-16-2処置群では、20、10、2及び0.2 mg/kgの投薬量において、それぞれ、2.44 g（12.8パーセント）、2.0 g（10.0パーセント）、2.0 g（10.5パーセント）及び2.0 g（10.5パーセント）であった。処置期間中、群間の有意差はなかった。
纏めると、（ch）ARH460-16-2-IgG1は、ヒト乳腺癌異種移植モデルにおいて、よく寛容され、そして、すべての試験された投薬量において用量-依存的に腫瘍成長を顕著に阻害し、腫瘍サイズの縮退をもたらした。
実施例４
ヒト結腸癌組織染色
ヒト癌へのH460-16-2の結合を更に評価するために、ヒト結腸癌組織対するIHC試験を行った。IHC最適化試験は、更なる実験の条件を決定するために行った。
59個のヒト結腸癌組織へのH460-16-2の結合は、ヒト結腸癌組織マイクロアッセイ（Imgenex, San Diego, CA）を用いて行った。組織フラグメントは、58℃で１時間、オーブンで乾燥することによって脱パラフィン処理し、コプリンジャー中で各４分間、５回、キシレンに浸漬することによって脱ろうした。一連の段階的エタノール洗浄（100パーセント〜75パーセント）による処置に従って、該フラグメントを水に再-水和させた。スライドをpH 6の10 mMクエン酸バッファー（Dako, Toronto, Ontario）に浸漬し、高、中及び低電力設定で各５分間電子レンジにかけ、最後に冷PBSに浸漬した。次いで、スライドを３パーセント過酸化水素溶液に６分間浸漬し、PBSで３回、各５分間洗浄し、乾燥し、そしてユニバーサルブロッキング溶液（Dako, Toronto, Ontario）で室温で５分間インキュベートした。H460-16-2、抗-ヒト筋アクチ（クローンHHF35, Dako, Toronto, Ontario）又は同位体対照抗体（哺乳動物組織中に存在せず又誘導されない酵素であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコースオキシダーゼに対する; Dako, Toronto, Ontario）を抗体希釈バッファー（Dako, Toronto, Ontario）で、その使用濃度（0.5 μg/mLに希釈された抗-アクチンを除いて各抗体について5 μg/mL）に希釈し、加湿チャンバで室温で１時間インキュベートした。次いで、スライドをPBSで３回、各５分間洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、（Dako Envision System, Toronto, Ontarioから供給された）HRP複合化二次抗体で室温で30分間検出/視覚化した。このステップに従って、スライドをPBSで３回各５分間洗浄し、着色反応は、免疫ペルオキシダーゼ染色用に、DAB（3,3'-ジアミノベンジリデンテトラヒドラクロリド, Dako, Toronto, Ontario）色原体基質溶液を室温で10分間加えることによって行った。スライドの水道水での洗浄は、色原体反応を収量させた。マイヤー・ヘマトキシリン（Sigma Diagnostics, Oakville, ON）による対比染色に従って、スライドを段階的エタノール（75パーセント〜100パーセント）で脱水し、キシレンで洗浄した。開始媒体（Dako Faramount, Toronto, Ontario）を用いて、スライドにカバーグラスをかけた。スライドをAxiovert 200（Ziess Canada, Toronto, ON）を用いて顕微鏡的に試験し、デジタル画像を得、ノーザン・エクリプス・イメージング・ソフトウエア（Mississauga, ON）を用いて保存した。結果を読み、スコアし、組織病理学者によって解釈した。
図７は、ヒト結腸癌組織のアレイのH460-16-2染色の結果の概要を示す。表から、試験した腫瘍の36/59（61パーセント）はH460-16-2に陽性であった。H460-16-2は、腫瘍細胞及び間質繊維芽細胞に特異的であった（図８）。細胞局在化は、ほとんど膜的でかつ細胞性膜的であった。陽性細胞のパーセンテージは、<10パーセント〜>50パーセントの範囲であった。これは、腫瘍細胞への抗体の外来結合を示している。腫瘍ステージに対する抗体結合の関係（American Joint Committee on Cancer, AJCC染色）は、様々な腫瘍ステージの中の腫瘍数の不一致に起因して正確に評価されなかった。腫瘍ステージI、II、III及びIVに対して、それぞれ、1/1（100パーセント）、4/12（33パーセント）、0/2（0パーセント）及び0/0、19/29（66パーセント）、19/29（66パーセント）、14/25（56パーセント）及び3/5（60パーセント）であった。陽性抗体対照としての抗-アクチンは、予測された筋組織への陽性結合を示した。IgG同位体陰性対照は、試験された組織への陰性結合を示した。
結腸癌細胞へのその結合の結果として、H460-16-2の治療的利益は、結腸癌の処置において拡張され得る。
実施例５
正常ヒト及びカニクイザルの交差反応性
カニクイザルの正常組織上のH460-16-2抗原を特徴付けるためにIHC試験を行った。抗体（ch）ARH460-16-2-IgG1（LifeSpan, Seattle, WA, USAによってFITC標識された）及び同位体対照抗体（Sigma, labeled by LifeSpan, Seattle, WA, USA）を用いて抗体力価実験を行い、最小バックグラウンド及びシグナル最大検出をもたらす濃度を確立した。最適化のために、ホルマリン固定組織、パラフィン包埋組織及び新鮮冷凍組織で、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL及び2.5 μg/mLで段階的希釈を行った。一次抗体として抗体（ch）ARH460-16-2-IgG1及び同位体対照抗体を使用し、二次抗体はウサギで作製された抗-FITC抗体であった（DAKO, Mississauga, ON, Canada）。主な検出系は、色原体としてDABを有するDAKO Envisionペルオキシダーゼ標識ポリマー（DAKO, Mississauga, ON, Canada）から成った。これは、茶色の沈殿物を生成するために使用した。陰性対照は、一次抗体の非存在下で隣接するフラグメント上で完全に免疫組織化学的方法を行うことから成った。Nikon顕微鏡に取り付けられたDVC 131OCデジタルカメラで、スライドの高電力画像を取得した。Leica DMLA顕微鏡を備えたLifeSpan所有の画像化装置（ALIASシステム）で、完全なフラグメントの画像を取得した。画像をAdobe PhotoshopでTIFFファイルとして保存した。
抗体（ch）ARH460-16-2-IgG1は、2.5 μg/mLで陽性ヒト対照組織の強力な染色を示した。より高い抗体濃度ではより高いバックグラウンドを有した。従って、2.5 μg/mLの濃度は、更なる免疫組織化学的試験のために使用した。同様に、ホルマリン固定の、パラフィン包埋組織は、冷凍フラグメントよりも低いバックグラウンド染色を示した；そのため、固定組織を更なるIHC試験のために使用した。纏めると、限定数の試料についての最適化試験から、シグナルはホルマリン固定組織のヒト及び霊長類試料の両方に存在した。但し、ヒト皮膚は霊長類皮膚組織よりもより陽性に染色された。
16個のヒト及びカニクイザル（血液、骨髄、脳、結腸、眼、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、卵巣、膵臓、皮膚、脾臓、精巣、及び甲状腺）ホルマリン固定パラフィン包埋組織で拡大されたIHCを行った（図９及び１０）。
ヒト試料において、（ch）ARH460-16-2-IgG1は、以下の細胞種において、弱い程度から中程度の細胞染色又は膜染色を証明した：好中球、マクロファージ及びリンパ球のサブセット、骨髄中の骨髄性系、血漿細胞のサブセット、II型肺細胞、表皮性セラチノサイト及び皮膚付属物。大脳白質領域も弱く陽性であった。弱い核染色は、ニューロン及びグリア、腸溶性ガングリオン細胞、並びに精巣及び気道上皮の各々１試料において見られた。マクロファージ、心臓、肝臓、卵巣、膵臓、骨格筋、リンパ球及び脾臓内皮、及び甲状腺を除く、赤血球系及び巨核球、ニューロン及びグリア、結腸上皮、平滑筋、内皮、繊維芽細胞、眼を含む他の細胞種及び組織は陰性であった。IgG同位体対照抗体は、試験したすべてのヒト組織において陰性であった。
モンキー組織において、ヒト試料に比べて多くの組織に高レベルの核染色があった。弱い程度から中程度の細胞染色も、好中球、ニューロンのサブセット、直腸上皮細胞のサブセット、リンパ球のサブセット及びマクロフファージ、予備的集合管、卵巣及び眼における多細胞種、並びに精母細胞において観察された。細胞染色に陽性であったほとんどの細胞種において核染色が見られた。以下の細胞種は、細胞染色又は膜染色の非存在下で核染色を示した：グリア、髄膜細胞、心臓ミオサイト、腎臓糸球体及び細尿管及び導管における細胞のサブセット、胆管上皮、気道上皮及び肺細胞、並びにランゲルハンス島。カニクイザル組織のIgG同位体対照は、ニューロンにおいて弱い核染色を示し、結腸及び大脳白質領域の神経内分泌細胞において弱い細胞染色を示した。
２種の染色パターンを比較すると、カニクイザル試料の増加した核染色は、ニューロン、心臓ミオサイト、細尿管上皮、及び胆管を含むいくつかの細胞種に明らかであった。細胞染色又は膜染色と共に、以下の差異が観察された：僅かに増加した染色が、カニクイザルの結腸上皮細胞、ニューロン、卵母細胞及び卵巣の濾胞上皮、及び精母細胞においてっ見られた。ヒト骨髄の骨髄前駆体は、カニクイザル試料において見られた初期前駆体よりも陽性であった。末梢血試料、肺、骨格筋、膵臓、皮膚、脾臓、及び甲状腺を含む他の組織は、カニクイザルとヒト試料とで類似の染色を示した。
フラグメントのいくつか、特にカニクイザル組織のフラグメント、で観察された核染色を解決するために、冷凍フラグメントを、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15、0.08及び0.04 μg/mLの（ch）ARH460-16-2-IgG1濃度で、ヒト及びカニクイザルの肺、皮膚及び心臓組織において使用して、主なシグナルを保持するがコラーゲン及び結合組織におけるバックグラウンドを減少させる濃度を決定し、そして、ホルマリン-固定組織中に存在する核染色を評価した。次いで、その濃度でのスライドを、これらの２つの種類における同一臓器のホルマリン固定組織についての先の試験と比較した。
1.5 μg/mLの濃度で、核染色は、ヒト及び霊長類のホルマリン固定組織試料の両方において実質的に減少した。冷凍試料において、核染色はほとんどなく、これは、ホルマリン固定組織中で行渡った核染色が人工的であり、方法又は固定人工物に起因するものであることを強く示唆している。結論として、キメラ抗体（ch）ARH460-16-2-IgG1は、カニクイザルの正常組織と交差反応する。
実施例６
交差競争試験
H460-16-2及びAR37A335.8の結合性を更に特徴付けるために（S.N. 11/364,013に開示されているように）、H460-16-2及びAR37A335.8がCD44の類似又は異なったエピトープを認識するかどうかについて決定するためにウェスタンブロットによって抗体競争実験を行った。500 μgのMDA-MB-231総膜調製物を、２つの10パーセントポリアクリルアミドゲルの各々の長さ全体を補うプレパラティブウェルコンボを用いて、非-還元条件下でSDS-PAGEに供した。４℃で２時間150Vでゲル由来のタンパク質をPVDF膜に移した。回転プラットフォーム上で４℃で約７時間、５パーセントミルクのTBST溶液で該膜をブロックした。該膜を約20 mLのTBSTで２回洗浄し、異なった処理溶液が適用されている20個の別々の溝を生じるウェスタンマルチスクリーン器具中に置いた。先に、ビオチン化H460-16-2及びAR37A335.8は、EZ-Link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation Kit（Pierce, Rockford, IL）を用いて調製した。一次抗体溶液は、ビオチン化H460-16-2又はビオチン化AR37A335.8を様々な濃度の非-ビオチン化抗体と混合することによって調製した。具体的には、３パーセントのスキムミルクTBST溶液に1 μg/mLのビオチン化H460-16-2、及び2 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL又は1000 μg/mLの非-ビオチン化抗体を含む溶液を調製した。使用した非-ビオチン化抗体は、H460-16-2、AR37A335.8及び対照抗体1B7.11（アイソトープ対照、すなわち会社内で精製した抗-TNPネズミIgG1）であった。上で挙げた同一濃度の非-ビオチン化抗体AR37A335.8、H460-16-2及び対照抗体8B1B.1（同位体対照、すなわち会社内で精製した抗-ブルータングウイルス・ネズミIgG2b）で、1 μg/mLのビオチン化AR37A335.8を含む溶液を調製した。
ロッキング・プラットフォーム上で室温で２時間、膜上の別個の溝中で、一次抗体溶液をインキュベートした。ロッキング・プラットフォーム上で、10分間、TBSTで各溝を３回洗浄した。３パーセントスキムミルクを含むTBST中の0.01 μg/mLペルオキシダーゼ複合化ストレプトアビジンの二次溶液を該膜上の各溝に適用した。ロッキング・プラットフォーム上で室温で１時間、該膜を二次溶液中でインキュベートした。ロッキング・プラットフォーム上で10分間、TBSTで３回各溝を洗浄した。該幕をマルチスクリーン器具から除き、製造者の教示に従って増加した化学発光検出溶液（GE Healthcare, Life Sciences formerly Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）でインキュベートした。次いで、該膜をフィルムに露光し、現像した。
図11及び12は、抗体競争実験の結果を示す。ビオチン化H460-16-2の結合は、100 μg/mL以上の濃度の非-ビオチン化H460-16-2と混合した時に完全に阻害されたが（100X超; 図11、パネルＡ、レーン１〜５）、ビオチン化AR37A335.8の結合は、10 μg/mL以上の濃度の非-ビオチン化AR37A335.8と混合した時に完全に阻害された（10X超; 図12、パネルＢ、レーン６〜10）。ビオチン化H460-16-2の結合は、IgG1同位体対照抗体を含む試料のいずれかにおいて阻害され（図11、パネルパＣ、レーン11〜15）、ビオチン化AR37A335.8の結合はIgG2b同位体対照抗体を含む試料のいずれかにおいても阻害されなかった（図12、パネルＣ、レーン11〜15）。このことは、同一の非-ビオチン化抗体と混合されたビオチン化抗体で観察された結合の阻害は、過剰な抗体のみの非特異的相互作用によるのではなく、非-ビオチン化抗体による抗原結合部位の占有に起因したことを示している。ビオチン化AR37A335.8の結合は、500 μg/mL以上の濃度の非-ビオチン化H460-16-2と混合した時に完全に阻害され（500X超; 図12、パネルＡ、レーン１〜５）、ビオチン化H460-16-2の結合は、試験したすべての非-ビオチン化AR37A335.8と混合した時に完全に阻害された（図11、パネルＢ、レーン６〜10）。これらの結果は、H460-16-2の結合がAR37A335.8の結合を抑制することを示し、またその反対を示している。結局、競争ウェスタンブロットの結果は、H460-16-2及びAR37A335.8によって認識されるCD44分子のエピトープが、１つの抗体の結合が他の抗体の結合を完全にブロックすることができるように互いに同一であるか又は空間的に非常に近い、ことを示唆している。
実施例７
rhCD44へのAR37A335.8の結合親和性の決定
組換えCD44（rhCD44）へのAR37A335.8の結合親和性は、表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定した。
組換えヒトCD44/Fc（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を標準的なアミン結合手段用いて固定した。CM5センサチップ（GE Healthcare, Piscataway, NJ USA、それ以前はBiacore）の表面を、104 μlの、0.4 M EDCと0.1 M NHSとの1:1混合物の注入によって活性化した（流速10 μl/分）。約500 RUに達するように、rhCD44を20 μg/mL（10 mM酢酸ナトリウム、pH 5.5で希釈）の濃度で注入した。最後に、119 μlの1.0 Mエタノールアミン-HCl pH 8.5を該センサチップ表面上の任意の非占有活性化部位をブロックするように表面全体に注入した。様々な濃度のAR37A335.8抗体を注入した。次の注入のためのセンサチップ表面の再生は、50 μl/分の流速で70秒間、10 mMグリシン-HCl pH 2.0の注入によって行った。抗体をランニングバッファー（HBS-EP+, GE Healthcare, Piscataway, NJ USA、それ以前はBiacore）で希釈し、0.67〜667 nMの範囲の濃度で段階的に注入し、表面を各サイクル間で再生した。対照として、各抗体濃度はまた、表面に固定されたrhCD44を有しない参照表面上に注入した。Biacore T1OO Evaluation Software Version 1.1を用いて、単一の1:1相互作用モデルを用いて、得られたセンソグラムについて速度論的分析を行った。抗体のKDを計算するために会合定数及び解離定数を使用した。実験は、Biacore T1OOシステム（GE Healthcare, Piscataway, NJ USA、それ以前はBiacore）を用いて行った。この実験の結果は、AR37A335.8について0.09425 nMのKDを与えた（図13）。この結果は、AR37A335.8がサブナノモーラーのKDを有し、AR37A335.8の親和性がH460-16-2のそれよりも高い、ことを示している（以下の実施例10参照）。会合定数（Ka）及び解離定数（Kd）を表にした（図13）。
実施例８
ホスホ-RTK（受容体チロシンキナーゼ）プロテオーム・プロファイラ・プロット
キメラ（ch）ARH460-16-2-IgG1処理によって影響された細胞内シグナル伝達経路を同定するために、プロテオーム・プロファイラ・プロット・ヒトホスホ-RTK抗体アレイ（ARYOO1, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN）を用いて、（ch）ARH460-16-2-IgG1によって処理した細胞由来の溶解物を選別した。
細胞の処理及び調製
先の実験（S.N. 11/364,013の開示されている）は、重度の複合免疫不全（SCID）マウスで成長したMDA-MB-231乳癌細胞を用いて、乳癌異種移植モデルでの（ch）ARH460-16-2-IgG1のインビボでの効果を証明した。従って、細胞内シグナル伝達分子の活性化のためのスクリーニングをMDA-MB-231細胞株を用いて行った。MDA-MB-231細胞はコンフルエンス近くに成長し、リン酸緩衝整理食塩水（PBS）で洗浄し、次いで37℃で終夜、血清及び栄養物-欠損媒体中で飢えさせた。この後、（ch）ARH460-16-2-IgG1（20 μg/mL）又はヒトIgG1（Sigma-Aldrich, St. Louis, MI）（20 μg/mL） を細胞に加え、４℃で20分間結合させた。次いで、ウシ胎児血清 （FBS）、L-グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを細胞に加えることによって細胞を刺激して、10パーセントFBS、1パーセントL-グルタミン及び1パーセントピルビン酸ナトリウムの終濃度とした。該細胞を37℃のインキュベータに置き、細胞溶解物を刺激後１時間に回収した。溶解物は細胞をPBSで２回洗浄し、及びNP-40溶解バッファー（20 mM Tris-HCl （pH 8.0）、137 mM塩化ナトリウム, 10パーセントグリセロール, 2 mM EDTA, 1 mMオルトバナジウム酸ナトリウム, 10 μg/mLアプロチニン, 10 μg/mLロイペプチン, 1パーセントNP-40 （Igepal（登録商標）CA-630, Sigma-Aldrich, St. Louis, MI））で採取することによって回収した。該細胞はピペッティングによって懸濁し、1.5 mLの微量遠心管に移し、４℃で30分間回転することによって混合した。溶解物は、14000xgで５分間遠心し、上清を透明チューブに移した。ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, IL）によってタンパク質濃度を決定した。
ヒトホスホ-RTK抗体アレイ
製造者（Third Revision, November 2005, R&D Systems antibody array ARYOO1）によって記されたプロトコルに従ってMDA-MB-231細胞溶解物で、ヒトホスホ-RTK抗体アレイを選別した。すなわち、ロッキング・プラットフォーム振とう器上で１時間、1.5 mLのアレイバッファー1（Part番号895477: R&D Systems抗体アレイARYOO1）でインキュベートすることによって、各ヒトホスホ-RTKプロファイラ膜を調製した。各処理について、150 μgの総タンパク質をアレイバッファー1で希釈して1.5 mLの総体積にした。この混合物を調製したプロファイラ膜に加え、ロッキング・プラットフォーム振とう器上で終夜４℃でインキュベートした。次いで、各膜をIX洗浄バッファー（25Xストックから精製した蒸留水で希釈した（Part番号 895003: R&D Systems抗体アレイARYOO1））で３回洗浄し、1Xアレイバッファー2（5Xアレイバッファー2, Part番号895478: R&D Systems抗体アレイARYOO1）で希釈した、1.5 mLの抗-ホスホチロシン-HRP検出抗体カクテル（Part番号841403: R&D Systems抗体アレイARYOO1）で、２時間インキュベートした。膜を1X洗浄バッファーで３回洗浄し、現像のためにECL及びウェスタン検出試薬（GE Healthcare, Life Sciences, Piscataway, NJ）に曝露した。膜を化学発光フィルム（Kodak, Cedex, France）に曝露し、X-線医療プロセッサを用いて現像した。現像したXデンフィルムについてのホスホ-RTKアレイデータは、転送モードスキャナで該フィルムをスキャンし、Image J分析ソフトウェア（Image J 1.37v, NIH）を用いてアレイ画像ファイルを分析することによって定量した。各RTKについて、対応する二重スポットの平均ピクセル密度は、膜上の透明領域のピクセル密度を用いてバックグラウンドシグナルから計算し差し引いた。（ch）ARH460-16-2-IgG1-処理試料の平均標準化ピクセル密度を、各対応するホスホ-タンパク質標的について、同位体対照、ヒトIgG1-処理試料の平均標準化ピクセル密度によって割って、相対的変化の割合を得た。１から相対的変化の割合を差し引き、100を乗じることによって、ホスホ-タンパク質シグナルのパーセント減少を決定した。
（ch）ARH460-16-2-IgG1でインキュベートしたホスホ-RTKアレイからの結果を図14に示す。同位体対照と比較して、（ch）ARH460-16-2-IgG1処理は、イムノグロブリン様及びEGF用ドメイン1（Tie-1）を用いるRTXチロシンキナーゼのリン酸化の減少を誘導した（約51パーセント）。Tie-1は、Tie-2と一緒になって、脈管形成を促進する成長因子であるアンギオポイエチン用受容体を形成する。アンギオポイエチンのその受容体への結合は、Tie-1及びTie-2のリン酸化、及び細胞成長を促進する細胞死シグナル伝達の開始を誘導する。前記（ch）ARH460-16-2-IgG1は、血清及び栄養物によって刺激するとTie-1のリン酸化を誘導し得ることは、（ch）ARH460-16-2-IgG1がアンギオポイエチン/Tie-1/2受容体リガンド複合体の成長因子誘導をブロックすることができることを示唆している。
実施例９
H460-16-2のヒト化
必要に応じて当該分野で周知の方法において使用される酵素の使用のための供給者の教示と共に、該方法を用いて組換えDNA技術を行った。詳細な実験室的方法も以下に記載する。
mRNAは、製造者の教示に従ってPoly A Tract System 1000 mRNA抽出キット（Promega Corp., Madison, WI）を用いて、ハイブリドーマH460-16-21細胞から抽出した。mRNAは、以下のようにして逆転写した。カッパ軽鎖については、5.0 μlのmRNAを、1.0 μlの20 pmol/μlのMuIgG VL-3'プライマーOL040（図15）及び5.5 μlのヌイクレアーゼ無しの水（Promega Corp., Madison, WI）を混合した。ラムダ軽鎖については、5.0 μlのmRNAを、1.0 μlの20 pmol/μlのMuIgG VL-3'プライマーOL042（図15）及び5.5 μlのヌイクレアーゼ無しの水 （Promega Corp., Madison, WI） を混合した。ガンマ重鎖については、5.0 μlのmRNAを、1.0 μlの20 pmol/μlのMuIgG VH-3'プライマーOL023（図16）及び5.5 μlのヌイクレアーゼ無しの水（Promega Corp., Madison, WI）を混合した。３つの反応混合物すべては、70℃、５分間に設定したサーマルサイクラーの予備加熱ブロックに置いた。4.0 μlのImPromII 5x反応バッファー（Promega Corp., Madison, WI）、0.5 μlのRNasinリボヌレクアーゼインヒビタ（Promega Corp., Madison, WI）、2.0 μlの25 mM MgCl2（Promega Corp., Madison, WI）、1.0 μlの10 mM dNTPミックス（Invitrogen, Paisley, UK）及び1.0 μlのImprom II逆転写酵素（Promega Corp., Madison, WI）の各々に加える前に、これらを５分間氷上で冷却した。反応混合物、42℃、１時間に設定した予備加熱ブロックに移す前に５分間インキュベートした。この後、PCRブロック中で70℃で15分間インキュベートすることによって、逆転写酵素を加熱不活性化した。
重鎖及び軽鎖配列をcDNAから以下のように増幅した。PCRプライマーミックスは、37.5 μlの10x Hi-Fi Expand PCRバッファー（Roche, Mannheim, Germany）、7.5 μlの10 mM dNTPミックス（Invitrogen, Paisley, UK）及び3.75 μlのHi-Fi Expand DNAポリメラーゼ（Roche, Mannheim, Germany）を273.75 μlヌクレアーゼ無しの水に加えることによって調製した。このマスタ・ミックスを21.5 μlのアリコートに分散し、氷上で15個の薄壁PCR反応チューブに分注した。これらのチューブの中の６個に、2.5 μlのMuIgVH-3'逆転写反応ミックス及び1.0 μlの重鎖5'プライマープールHA〜HF（プライマー配列及びプライマープール成分については図16参照）を加えた。別の７個のチューブには、2.5 μlのMuIgKVL-3'逆転写反応及び1.0 μlの軽鎖5'プライマープールLA〜LG（図15）を加えた。最後のチューブには、2.5 μlのMuIgKVL-3逆転写反応及び1.0 μlのラムダ軽鎖プライマーMuIgλVL5'-LIを加えた。反応は、サーマルサイクラーのブッロクに置き、95℃で２分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）反応は、94℃で30秒間、55℃で１分間及び72℃で30秒間のサイクルを40回行った。最後に、PCR産物を72℃で５分間加熱し、次いで４℃で維持した。
pGEM-TイージーVector System I（Promega Corp., Madison, WI）キットを用いてpGEM-Tイージーベクターに増幅産物をクローン化し、配列決定した。図17及び18にそれぞれ得られたVH及びVL配列を示す。
キメラ抗体の作製のために、プライマーOL437及びOL438を用いてPCRによってVH領域遺伝子を増幅した（図19）；これらは、鋳型としてcDNAクローンの１つ由来のプラスミドDNAを用いて5' MIuI及び3' HindIII制限酵素部位で操作するように設計した。0.5 mL PCRチューブに、5 μlの10X Hi-Fi Expand PCRバッファー:（Roche, Mannheim, Germany）、1.0 μlの10 mM dNTPミックス（Invitrogen, Paisley, UK）、0.5 μlのプライマーOL437、0.5 μlのプライマーOL438、1.0 μlの鋳型DNA及び0.5 μlのHi-Fi Expand DNAポリメラーゼ（Roche, Mannheim, Germany）を、41.5 μlのヌクレアーゼ無しの水に加えた。
VL領域は、BssHII及びBamHI制限酵素部位で操作するために、オリゴヌクレオチドOL439及びOL090（図20）を用いて同様な方法で増幅した。反応はサーマルサイクラーのブロックに置き、95℃で２分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）反応は、94℃で30秒間、55℃で１分間及び72℃で30秒間のサイクルを40回行った。最後に、PCR産物を72℃で５分間加熱し、次いで４℃で維持した。次いで、VH及びVL領域PCR産物をそれぞれMluI/HindIII及びBssHII/BamHI部位で二重ベクターpANT18（図21）にクローン化した。
pANT18は、ヒト重鎖及び軽鎖発現カセット並びにdhfr選択遺伝子を含むpAT153-型プラスミドである。重鎖カセットは、hCMVieプロモーターによって駆動されたヒトゲノムIgG1定常領域遺伝子、及び下流のヒトIgG polyA部位からなる。軽鎖カセットは、hCMVieプロモーターによって駆動されたヒトゲノムカッパ定常領域遺伝子、及び下流の軽鎖polyA部位からなる。ヒトIgリーダー配列と定常領域との間のクローニング部位は、可変領域遺伝子の挿入を許容する。pANT18は、SV40プロモーターによって駆動されたハムスターdhfr遺伝子及び下流のSV40 polyA部位からなる。
ヒト化V領域遺伝子は、相同なヒトVH及びVL配列由来のアミノ酸を導入するために、長い重複オリゴヌクレオチドを用いるPCR用のマウスH460-16-2 VH及びVL鋳型を用いて構築した。変異ヒトVH及びVL配列の作製のために使用したオリゴヌクレオチドは、それぞれ図19及び20に示す。ヒト化変異体も発現ベクターpANT18に直接的にクローン化した。ヒト化VH及びVL変異体の配列はそれぞれ図22及び23に示す。
得られたキメラ（ch）ARH460-16-2 （VKOVHO）、及びヒト化構築物は、エレクトロポレーションによってCHO/dhfr-細胞（ECACC, 94060607）にトランスフェクトし、媒体（L-グルタミン及びピルビン酸Naを含む高グルコースDMEM（Invitrogen, Paisley, UK）及び5パーセント透析FBS（Cat No. 26400-044 Invitrogen, Paisley, UK）、プロリン（Sigma, Poole, UK）及びペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen, Paisley, UK）、ヒポキサンチン及びチミジン枯渇）中で選択した。下に記載のヒトIgG1/カッパ捕獲ELISAによって測定した媒体中に分泌されたヒトIgGレベルに基づいて、コロニーを選択した。選択したコロニーを拡大し、抗体を1 mL HiTrap MabSelect SuReカラム（GE Healthcare, Amersham, UK）を用いるプロテインAアフィニティカラムクロマトグラフィによって細胞培養上清から製造者の推奨する条件に従って精製した。精製した抗体を保存前に４℃でフィルタ殺菌（PBS、 pH 7.4）した。
該抗体の濃度は、標準として精製ヒトIgG1/カッパ（Sigma, Poole, UK）を用いてhIgG1/カッパELISAによって計算した。イムノソルブ（Immunosorb）96ウェルプレート（Nalge nunc, Hereford, UK）を、1X PBS（pH 7.4）で1:1500に希釈したマウス抗-ヒトIgG Fc-特異抗体（16260 Sigma, Poole, UK）で37℃で１時間コートした。２パーセントBSA/PBSで希釈した試料及び標準物質を加える前に、PBS及び0.05パーセントツィーン 20で３回、プレートを洗浄した。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後、PBS/ツィーンで３回洗浄し、２パーセントBSA/PBSで希釈した、100 μl/ウェルの検出抗体/ヤギ抗-ヒトカッパ軽鎖ペルオキシダーゼ複合体（A7164 Sigma, Poole, UK）を加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした後、PBS/ツィーンで５回洗浄し、結合抗体を、OPD基質（Sigma, Poole, UK）を用いて検出した。アッセイを５分間暗闇で行い、その後、3 M HClの添加によって停止した。次いでアッセイプレートをMRX TCIIプレートリーダー（Dynex Technologies, Worthing, UK）で吸光度490 nmで読んだ。
キメラ（ch）ARH460-16-2（VKOVHO）及びヒト化変異体抗体は、ビオチンタグ・マイクロビオチン標識キット（Sigma, Poole, UK）を用いてビオチン化した、H460-16-2マウス抗体を用いてELIS-型競争アッセイで試験した。ビオチン化マウスH460-16-2を組換えヒトCD44（R&D systems, Abingdon, UK）に結合するために様々な濃度の競争抗体の存在下で使用した。組換えヒトCD44を、5 μg/mLの0.05 M炭酸バッファーpH 9.0 （Sigma, Poole, UK）でイムノソルブ96ウェルマイクロタイタプレート（Nalge nunc, Hereford, UK）上に４℃で終夜、固定化した。ビオチン化マウスH460-16-2抗体を0.2 μg/mLに希釈し、0〜20 μg/mLの範囲の濃度で等量の競争抗体と混合した。PBS及び0.05パーセントツィーン 20で３回、CD44プレートを洗浄した。CD44コートプレートのウェルに100 μlの抗体混合物を移し、これを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン-HRP複合体（Sigma, Poole, UK）（diluted at 1:500）及びTMB基質（Sigma, Poole, UK）を加えて、結合ビオチン化マウスH460-16-2を検出した。アッセイは、５分間暗闇で行い、その後、3 M HClを加えて停止した。次いで、アッセイプレートをMRX TCIIプレートリーダー（Dynex Technologies, Worthing, UK）で吸光度450 nmで読んだ。吸光度を試験抗体濃度に対してプロットして、図24に示すチャートを得た。
実施例１０
ネズミH460-16-2及び（hu）ARH460-16-2変異体の、rhCD44への結合親和性の決定
H460-16-2、（hu）ARH460-16-2変異体1及び（hu）ARH460-16-2変異体2の結合親和性を、組換えCD44（rhCD44）への結合に続く各々の解離定数の決定によって比較した。
組換えヒトCD44/Fc（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を標準的なアミン結合方法を用いて固定した。CM5センサチップ（GE Healthcare, Piscataway, NJ USA、それ以前はBiacore）の表面を、104 μlの、0.4 M EDCと0.1 M NHSとの1:1混合物の注入によって活性化した（流速10 μl/分）。約500 RUに達するように、rhCD44を20 μg/mL（10 mM酢酸ナトリウム、pH 5.5で希釈）の濃度で注入した。最後に、119 μlの1.0 Mエタノールアミン-HCl pH 8.5を該センサチップ表面上の任意の非占有活性化部位をブロックするように表面全体に注入した。様々な濃度のH460-16-2、（hu）ARH460-16-2変異体1又は（hu）ARH460-16-2変異体2を注入した。次の注入のためのセンサチップ表面の再生は、50 μl/分の流速で70秒間、10 mMグリシン-HCl pH 2.0の注入によって行った。抗体をランニングバッファー（HBS-EP+, GE Healthcare, Piscataway, NJ USA、それ以前はBiacore）で希釈し、0.67〜667 nMの範囲の濃度で段階的に注入し、表面を各サイクル間で再生した。対照として、各抗体濃度はまた、表面に固定されたrhCD44を有しない参照表面上に注入した。Biacore T1OO Evaluation Software Version 1.1を用いて、単一の1:1相互作用モデルを用いて、得られたセンソグラムについて速度論的分析を行った。抗体のKDを計算するために会合定数及び解離定数を使用した。実験は、Biacore T1OOシステム（GE Healthcare, Piscataway, NJ USA、それ以前はBiacore）を用いて行った。この実験の結果は、ネズミH460-16-2について4.19 nMのKDを与えたが、（hu）ARH460-16-2変異体HV1/KV1及び（hu）ARH460-16-2変異体HV2のKDがそれぞれ6.32及び3.17 nMであることが分かった（図25）。この結果は、AR37A335.8がサブナノモーラーのKDを有し、AR37A335.8の親和性がH460-16-2のそれよりも高い、ことを示している（以下の実施例10参照）。会合定数（Ka）及び解離定数（Kd）を表にした（図13）。抗体のすべてがナノモラー範囲のKDを有し、ヒト化抗体の親和性は親ネズミH460-16-2の親和性と同様であることを示している。会合定数（Ka）及び解離定数（Kd）を表にした（図25）。
実施例１１
競争的結合物の単離
抗体があれば、当業者は、同一のエピトープを認識する競争的に阻害するCDMAB、例えば競争する抗体、を作製することができる（Belanger L他, Clinica Chimica Acta 48: 15-18 （1973））。ある方法は、抗体によって認識される抗原を発現するイムノゲンで免疫することを伴う。試料は。組織、単離されたタンパク質（複数）又は細胞株（複数）を含むことがあるが、これらに限定されない。得られるハイブリドーマは、ELISA、FACS又はウェスタンブロッティングのような、試験抗体の結合を阻害する抗体を同定する競争アッセイを用いて選別することができた。別の方法は、前記抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体のためのファージディスプレイ抗体ライブラリ及びパニングを利用することができた（Rubinstein JL et al. Anal Biochem 314: 294-300（2003））。いずれの場合にも、抗体は、その標的抗原の少なくとも１つのエピトープへの、元の標識された抗体の結合を置き換えるその能力に基づいて選択される。そのため、かかる抗体は、元の抗体として抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する特性を有することになる。
実施例１２
H460-16-2モノクローナル抗体の可変領域のクローニング
H460-16-2ハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体の重鎖（VH）及び軽鎖（VL）由来の可変領域の配列は、（S.N. 11/364,013に開示されているように）先に決定された。キメラ及びヒト化IgGに対して、可変軽ドメイン及び可変重ドメインは、発現用の好適なバクターにサブクローン化され得る（上の実施例９に開示されている）。
別の実施態様では、H460-16-2又はその脱-免疫されたキメラもしくはヒト化体は、該抗体が発現され回収され得るように、トランスジェニック動物において該抗体をコードする核酸をは発現することによって産生される。例えば、該抗体は回収及び精製を助ける組織特異的方法において発現され得る。１つのかかる実施態様では、本発明の抗体は、授乳中の分泌用乳腺において発現される。トランスジェニック動物は、マウス、ヤギ及びウサギを含むがこれらに限定されない。
（i） モノクローナル抗体
モノクローナ抗体をコードするDNA（実施例9に概略した）は、慣用的な手段を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい起源として役立つ。一旦単離されると、DNAは、発現ベクターに導入され、これは、次いで、E.コリ細胞、サルOCS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、又は他には免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主に形質移入されて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。DNAは、例えば、相同なネズミ配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのためのコーディング配列を置き換えることによって修飾されてもよい。キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を含む方法を含む合成タンパク質化学において公知の方法を用いて、インビトロで調製され得る。例えば、抗毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的のための好適な試薬の例は、イミノチオエート及びメチル−4-メルカプトブチルイミデートを含む。
（ii） ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非-ヒト起源からそこに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非-ヒトアミノ酸残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから得られる「インポート」残基を通常言う。ヒト化は、齧歯動物のCDR又はCDR配列をヒト化抗体の対応する配列と置き換えることによって、Winter及び協力者の方法によって行われる（Jones他, Nature 321: 522-525 （1986）; Riechmann他, Nature 332: 323-327 （1988）; Verhoeyen他, Science 239: 1534-1536 （1988）; Clark, Immunol. Today 21: 397-402 （2000）参照）。
ヒト化抗体は、親の及びヒト化配列の3次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物の分析方法によって調製され得る。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の３次元立体構造を明らかにし及び表示することができるコンピュータプログラムは入手できる。これらの表示の検討は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原への結合能力に影響を与える残基の分析、を可能にする。このようにして、所望の抗体の特徴、例えば標的抗原（複数）に対する増加した親和性が達成されるように、FR残基は、コンセンサス配列及びインポート配列から選択され、組み合わされる。一般的に、CDR残基は、抗原結合に影響を与えることに直接的及びほとんど実質的に関連する。
（iii） 抗体フラグメント
抗体フラグメントの製造のための様々な技術が開発されている。これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって製造され得る（Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 （1999）；Little他, Immunol. Today 21: 364-370 （2000） 参照）。例えば、Fab'-SHフラグメントは、E.コリから直接的に回収され、化学的に結合されてF（ab'）2フラグメントを形成し得る（Carter他, Biotechnology 10: 163-167 （1992））。別の実施態様では、F（ab'）2は、ロイシンジッパーGCN4を用いて形成されて、F（ab'）2分子の会合を促進する。別の方法によれば、Fv、Fab又はF（ab'）2フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離され得る。
実施例１３
本発明の抗体を含む組成物
本発明の抗体は、癌を予防/治療するための組成物として使用され得る。本発明の抗体を含む癌を予防/治療するための組成物は、液状調製物の形態のままで、又は好適な調製物の医薬組成物として、ヒト又は哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に、経口的又は非経口的に（例えば、静脈内に、腹腔内に、皮下的に）投与され得る。本発明の抗体は、それ自体自体投与してもよく、又は好適な組成物として投与してもよい。投与のために使用される組成物は、本発明の抗体又はその塩、希釈剤及び賦形剤と共に薬理学的に許容される担体を含むことがある。かかる組成物は、経口又は非経口投与のために好適な薬学的調製物の形態で提供される。
非経口投与用の組成物の例は、注射可能な調製物、座薬等である。注射可能な調製物は、静脈、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴、間接内注射等のような投薬剤形を含んでよい。これらの注射可能調製物は、公知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、本発明の抗体又はその塩を注射のために従来使用されている殺菌した水性媒体又は油性媒体中で溶解、懸濁又は乳化することによって調製され得る。注射用の水溶媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤等を含む等張液があり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート80、HCO-50（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（50モル）生成物）等のような好適な溶解剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油等が採用され、これらは、ベンジル安息香酸エステル、ベンジルアルコール等のような溶解剤と組み合わせて使用され得る。このようにして調製された注射剤は、好適なアンプルに通常充填される。直腸投与のために使用される座薬は、本発明の抗体又はその塩を座薬用の慣用的基剤と混合することによって調製され得る。経口投与用の組成物は、固体又液状の調製物、具体的には、錠剤（糖衣錠及びフィルム-コート錠剤を含む）、ピル剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤（軟カプセルを含む）。シロップ剤、乳化剤、懸濁剤など、を含む。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、医薬調製物の分野で慣用的に使用されているビヒクル、希釈剤又は賦形剤を含んでもよい。錠剤用のビヒクル又は賦形剤の例は、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウム等である。
有利なことに、上記の経口又は非経口的使用のための組成物は、活性成分の用量に適合するように単位投薬量を有する医薬調製物に調製される。かかる単位投薬調製物は、例えば、錠剤、ピル剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、座薬等を含む。含有される前記化合物の量は、一般的に、５〜500 mg/投薬剤形であり；上記の抗体は、特に注射剤の形態で約５〜約100 mg、他の形態については10〜250 mg含まれることが好ましい。
本発明の抗体を含む上記の予防/治療剤又は調整剤の用量は、投与される対象、標的疾患、症状、投与経路等によって変動し得る。例えば、成人の例えば乳癌を治療/予防する目的のために使用される場合には、本発明の抗体を、約0.01〜約20 mg/kg体重、好ましくは約0.1〜約10 mg/kg体重、及びより好ましくは約0.1〜約5 mg/kg体重の用量で静脈内に、約１〜５回/日、好ましくは約１〜３回/日、投与することが有利である。他の非経口的及び経口的投与では、薬剤は、上記の用量に対応する用量で投与され得る。症状が特に重度の場合には、用量は症状に従って増やすことができる。
本発明の抗体は、そのままで又は好適な組成物の形態で投与され得る。投与のために使用される組成物は、前記の抗体もしくはその塩、希釈剤又は賦形剤と共に、薬理学的に許容される担体を含んでもよい。かかる組成物は、経口的投与又は非経口的投与（例えば、血管内注射、皮下注射等）に好適な医薬調製物の形態で提供される。上記の各組成物は、他の活性成分を更に含んでもよい。更に、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例えば、シクロホスホラミド、イホスファミド等）、代謝アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート、5-フルオロウラシル等）、抗-腫瘍抗体（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物-由来の抗-腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカン等を組み合わせて使用され得る。本発明の抗体及び上記の薬剤は、患者に同時に又は時差的に投与されてもよい。
本明細書に記載の処置方法、特に癌のための処置方法は、他の抗体又は化学療法剤の投与と共に実行されてもよい。例えば、ERBITUX（登録商標）（セツキシマブ）のようなEGFRに対する抗体、特に結腸癌を治療するときに投与してもよい。ERBITUX（登録商標）は、乾癬の治療のために効果的であることも分かっている。組み合わせのための他の抗体は、乳癌を処置するときのハープセチン（登録商標）、特に結腸癌を治療するときのAVASTIN（登録商標）、及び特に小細胞肺癌を治療するときのSGN-15を含む。他の抗体/化学療法剤を用いる本発明の抗体の投与は、同一又は異なった経路で同時でも又は別個でもよい。
利用された化学療法剤/他の抗体レジメは、患者の症状の治療のために好ましくは好適であると考えられた。異なった悪性腫瘍は、個々の患者によって決定されることになる、特定の抗-腫瘍抗体及び特定の化学療法剤の使用を必要とし得る。本発明の好ましい実施態様では、化学療法剤は、抗体療法剤と同時に、又はこのましくは抗体療法剤に続いて投与される。しかしながら。本発明は、任意の特定の投与方法又は投与経路に限定されないことを強調しておく。
証拠の優越は、H460-16-2、（ch）ARH460-16-2-IgG2及び（ch）ARH460-16-2-IgG1がCD44上に存在するエピトープのライゲーションをによって抗-癌効果を仲介すること示している。H460-16-2抗体が、MD A-MB-231細胞のような発現細胞から同族抗原を免疫沈降するために使用され得ることを先に（S.N. 10/647,818、現在米国特許第7,189,397号明細書に開示されているように）示している。更に、H460-16-2、（ch）ARH460-16-2-IgG2、（ch）ARH460-16-2-IgG1、（ch）ARH460-16-2（VKOVHO）又はヒト化変異体、（hu）ARH460-16-2が、更に、FACS、細胞ELISA又はIHCに限定されないがこれらによって例証される技術を利用することによって、それらに特異的に結合するCD44抗原性部分を発現する細胞及び/又は組織の検出に使用され得る、ことを示すことができた。
H460-16-2抗体に関して、他の抗-CD4抗体は、CD44抗原の他の形態を免疫沈降し単離するために使用することができ、そして該抗原は同一の種類のアッセイを用いて該抗原を発現する細胞又は組織へのこれらの抗体の結合を阻害するために使用してもよい。
Figure 0005363464
本明細書に記載のすべての特許及び刊行物は、本発明が追求する当業者のレベルの指標である。すべての特許及び刊行物は、あたかも個々の刊行物が参考として具体的かつ個々に援用されることが示されるように同程度に参考として本明細書に援用される。
本発明のある形態が例証されるが、それが、本明細書に開示及び示された部分の特定の形態又は配置に限定されるべきではない、ことを理解されたい。様々な変更が本発明の範囲から逸脱することなくなされ、発明が明細書に示され及び記載されたことに限定されると考えるべきではないことは、当業者には明らかであろう。当業者は、本発明が目的を実行し、上記の目的及び利点、並びにそれに固有の目的及び利点を獲得するためにうまく適合される、ことを容易に理解するだろう。本明細書に記載の、任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手段及び技術は、目下のところ、好ましい実施態様の代表例であり、具体的を意図したものであり、範囲を限定するものではない。本発明の趣旨内に包含され及び添付のクレームの範囲によって定義されるそこでの変更及び他の使用は、当業者に起こり得るだろう。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載してきたが、クレームされた本発明はこのような特定の実施態様に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、当業者に明らかである本発明を実行するための記載された形式の様々な変更は、以下のクレームの範囲内であることが意図される。
Figure 0005363464

Claims (7)

  1. 配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列の重鎖可変部位、及び配列番号８のアミノ酸配列の軽鎖可変部位を含む、ヒトCD44に特異的に結合するヒト化抗体、又はそのヒトCD44結合フラグメント。
  2. 配列番号９のアミノ酸配列の重鎖可変部位、及び配列番号８のアミノ酸配列の軽鎖可変部位を含む、請求項１記載のヒト化抗体又はそのヒトCD44結合フラグメント。
  3. ヒト癌を治療するために有効な医薬組成物であって、以下：
    請求項１又は２記載のヒト化抗体又はその結合フラグメント；
    該抗体又はその抗原結合フラグメントと、細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポータ部分及び造血細胞からなる群より選ばれるメンバーとの複合体；並びに
    薬理学的に許容される担体の必要量
    を組み合わせて含み、
    該組成物は、該ヒト癌を治療するために有効である、医薬組成物。
  4. ヒト癌を治療するために有効な医薬組成物であって、以下：
    請求項１又は２記載のヒト化抗体又はその結合フラグメント；及び
    薬理学的に許容される担体の必要量
    を組み合わせて含み、
    該組成物は、該ヒト癌を治療するために有効である、医薬組成物。
  5. ヒト癌を治療するために有効な医薬組成物であって、以下：
    請求項１又は２記載のヒト化抗体又はその結合フラグメントと、
    細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポータ部分及び造血細胞からなる群より選ばれるメンバーとの複合体；並びに
    薬理学的に許容される担体の必要量
    を組み合わせて含み、
    該組成物は、該ヒト癌を治療するために有効である、医薬組成物。
  6. ヒト癌性腫瘍の存在を検出するためのアッセイキットであって、
    該ヒト癌性腫瘍は、請求項１又は２記載のヒト化抗体又はその結合フラグメントに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、
    以下：
    前記ヒト化抗体又はその結合フラグメント、及び
    該ヒト化抗体又はその結合フラグメントが、特定のカットオフレベルでのポリペプチドの存在が該ヒト癌性腫瘍の存在の診断に用いるそのポリペプチドに結合されるか否かを検出するための手段
    を含む、キット。
  7. 前記癌が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌及び結腸癌からなる群より選択される、請求項３〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
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