JP2010516631A - 癌性疾患修飾抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規なスクリーニング実例を用いる癌性疾患修飾抗体を産生する方法に関する。この方法は、終点として癌細胞の細胞傷害性を使用して抗-癌抗体を分離することによって、抗-癌抗体の産生、又は治療的及び診断的目的を可能にする。抗体は癌の段階分け及び診断の目的で使用され、一次腫瘍及び腫瘍転移を治療するために使用され得る。抗-癌抗体は、毒素、酵素、放射活性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、及び造血細胞に複合化され得る。

Description

発明の分野
本発明は、癌性疾患修飾抗体（CDMAB）の単離及び産性、並びに治療及び診断プロセスにおけるCDMAB単独又は１以上のCDMAB/化学療法剤と組み合わせての使用、に関する。本発明は、本発明のCDMABを利用する結合アッセイに更に関する。
発明の背景
癌療法としてのモノクローナル抗体：癌を示す個体は、独特であり、人の個性として、他の癌と異なった癌を有する。このことにもかかわらず、現在の治療は、同一の方法で同一の段階にある同一種の癌を有するすべての患者を治療する。これらの患者の少なくとも30パーセントは、第一選択治療に失敗し、それによって、治療の更なる段階、並びに治療上の失敗、転移及び究極的には死の高い可能性を招く。治療への優れたアプローチは、特定の個体のための治療法のオーダーメイドであろう。それ自体をオーダーメイドに導く唯一の現在の治療法は、外科手術である。化学療法及び放射線治療は、患者に合せることができず、外科手術自体はほとんど場合、治療となるには不充分である。
モノクローナル抗体の出現に伴い、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性は、各抗体が単一エピトープに関し得るので、より現実的になる。更に、特定の個体の腫瘍を独自に定義するエピトープの配列に関する抗体の組合せをつくる可能性がある。
癌性細胞と正常細胞との顕著な差は、癌性細胞が、形質転換された細胞に特異的である抗原を含むことであると理解しているので、モノクローナル抗体が、これらの癌性抗原に特異的に結合することによって形質転換された細胞を特異的に標的するように設計され得、従って、癌細胞を除去するためにモノクローナル抗体が「マジックブレット」として役立つことができるという信念を生み出す、ことを科学界は長く維持してきた。しかしながら、単一モノクローナル抗体が癌のすべての場合に役立ち得ず、モノクローナル抗体が１つの種類として、標的癌療法として配置され得る、ことが現在では広く理解されている。本発明に開示されている技術に従って単離されたモノクローナル抗体は、患者に有益である方法において、例えば腫瘍付加を減少させることによって、癌性疾患プロセスを改変することが分かっており、そして、癌性疾患修飾抗体（CDMAB）又は「抗癌」抗体として本明細書で様々に言及される。
現時点では、癌患者は、通常、治療のいくつかの選択を有する。癌療法への組織化された方法は、世界的な生存率及び疾病率において改善を生み出している。しかしながら、特定の個体について、これらの改善された統計は、その個体の状況における改善と必ずしも相関していない。
従って、同一の集団における他の患者には無関係に実務者に各腫瘍を治療させることができる方法論が提案された場合には、このことは、目的に合った治療の独特な方法を１個人に適合させるだろう。かかる治療計画は、理想的には、治療率を上げ、より優れた結果を生み出し、それによって長い間の要求を満足させるだろう。
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用は、ヒト癌の治療において限定された成功をもって使用されてきた。リンパ腫及び白血病はヒト血漿で治療されてきたが、長期の回復又は応答はほとんどなかった。更に、再現性が欠如し、化学療法と比べて更なる利益はなかった。乳癌、黒色腫及び腎細胞癌のような固形癌も、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿及びウマ血清で治療されてきたが、これに相当する予測できずかつ効果のうすい結果であった。
固形癌のためのモノクローナル抗体の多くの臨床試験がある。1980年代では、特定の抗原に対する抗体を用いて又は組織選択性に基く少なくとも47患者からの１つの応答者のみを得たヒト乳癌用の少なくとも4臨床試験が存在した。1998年まで、シスプラチンと組み合わせてヒト化抗-Her2/neu抗体（ハーセプチン（登録商標））を用いる成功的な臨床試験は存在しなかった。この試験において、37患者は、その約４分の１が部分的応答を有し、更に４分の１がより少ない又は安定な疾患進行を有した、応答について評価された。応答者の内で進行の平均期間は8.4ケ月であり、5.3ケ月の平均応答期間であった。
ハープセチン（登録商標）は、タキソール（登録商標）と組み合わせて第一選択治療での使用のために1998年に承認された。臨床試験結果は、タキソール（登録商標）のみを与えた群（3.0ケ月）と比べて、抗体療法に加えてタキソール（登録商標）を与えた群（6.9ケ月）では、疾患進行に対する平均期間の増加を示した。平均生存のわずかな増加も見られた；ハープセチン（登録商標）及びタキソール（登録商標）治療群、対、タキソール（登録商標）治療単独群について、22ケ月対18ケ月。加えて、タキソール（登録商標）単独と比べた抗体及びタキソール（登録商標）の組合せ群において、完全応答者の数（8対2パーセント）及び部分的応答者の数（34対15パーセント）が増加した。しかしながら、ハープセチン（登録商標）及びタキソール（登録商標）での治療は、タキソール（登録商標）治療単独と比べて、高い心臓毒性をもたらした（それぞれ、13対1パーセント）。また、ハープセチン（登録商標）治療は、ヒト表皮成長因子受容体2（Her2/neu）、すなわち、現在、公知の機能又は生物学的に需要なリガンドを有さない受容体、を過剰に発現する患者、すなわち転移性乳癌を有する約25パーセントの患者、に対してのみ効果的であった（免疫組織学化学的（IHC）分析を通して決定される）。そのため、乳癌患者には大きな未だ対処されていない必要性が依然として存在する。ハープセチン（登録商標）治療から利益を受け得る人でさえも、化学療法を依然として必要とし、その結果、少なくともある程度、この種の治療の副作用を依然として対処しなければならないだろう。
結腸直腸癌を試験する臨床試験は、糖タンパク質及び糖脂質の標的に対する抗体を含む。腺癌に対する特異性を有する17-IAのような抗体は、部分的応答を有するたった１患者を含む、60患者超において第2相臨床試験を受けた。他の試験では、17-IAの使用は、追加のシクロホスファミドを用いるプロトコールにおいて52患者の内たった１つの完全な応答、及び２つの比較的小さな応答を生み出した。従来、17-IAの第III相臨床試験は、ステージIIIの直腸結腸癌のアジュバント治療として改善された効率を立証しなかった。画像化のために最初に承認されたヒト化ネズミモノクローナル抗体の使用もまた、腫瘍退縮をもたらさなかった。
近年になってやっと、モノクローナル抗体を使用する、結腸直腸癌の臨床試験からの陽性の結果がある。2004年、エルビタックス（登録商標）は、イリノテカン-型化学療法に難治性であるEGFR-発現転移性結腸直腸癌を有する患者の第二選択治療のために承認された。２つのアーム第II相臨床試験及び単一アーム試験からの結果は、イリノテカンと組み合わせたエルビタックス（登録商標）が、それぞれ4.1及び6.5ケ月の疾患進行までの平均時間で、それぞれ23及び15パーセントの応答率を有した、ことを示した。２つのアーム第II相臨床試験及び別の単一アーム試験からの結果は、エルビタックス（登録商標）単独による治療が、それぞれ1.5及び4.2ケ月の疾患進行までの平均時間で、それぞれ11及び9パーセントの応答率をもたらした、ことを示した。
結果的に、スイス及び米国では、イリノテカンと組み合わせたエルビタックス治療、及び米国では、エルビタックス単独による治療は、第一選択治療のイリノテカン治療に失敗した結腸直腸癌患者の第二選択治療として承認された。従って、ハープセチン（登録商標）のように、スイスでの治療は、モノクローナル抗体及び化学療法の組合せとして承認されているにすぎない。加えて、スイス及び米国での治療は、第二選択療法として患者のために承認されているにすぎない。また、2004年、アバスタチン（登録商標）は、転移性結腸直腸癌の第一選択療法として静脈内5-フルオロウラシル-型化学療法と組み合わせての使用が承認された。第III相臨床試験結果は、5-フルオロウラシル単独で治療された患者に比べて、アバスタチン（登録商標）及び5-フルオロウラシルで治療された患者の平均的生存が伸びたことを証明した（それぞれ、20ケ月対16ケ月）。しかし、この場合も同様に、ハープセチン（登録商標）及びエルビタックス（登録商標）のように、治療は、モノクローナル抗体及び化学療法の組合せとして承認されたにすぎない。
肺、脳、卵巣、膵臓、前立腺、及び胃癌については成績不良であり続けた。非-小細胞肺癌についての最も有望な近年の結果は、治療が、化学療法剤タキソテレ（登録商標）と組み合わせて細胞殺傷薬ドキソルビシンに複合化されたモノクローナル抗体を含む第II相臨床試験から得られた。タキソテレ（登録商標）は、肺癌の第二選択療法のためのFDAが承認した唯一の化学療法である。初期のデータは、タキソテレ（登録商標）単独と比べて改良された全体的な生存を示した。試験のために集められた62患者の内、３分の２はタキソテレ（登録商標）との組み合わせでSGN-15を受け、一方、残りの３分の１はタキソテレ（登録商標）単独を受けた。タキソテレ（登録商標）との組み合わせでSGN-15を受けた患者のために、平均の全体的な生存は、タキソテレ（登録商標）単独を受けた患者についての5.9ケ月と比べて7.3ケ月であった。1年及び18ケ月での全体的な生存は、SNG-15及びタキソテレ（登録商標）を受けた患者について、それぞれ、29及び18パーセントであり、タキソテレ（登録商標）単独を受けた患者について、それぞれ、24及び8パーセントであった。更なる臨床試験が計画されている。
前臨床的には、黒色腫に対するモノクローナル抗体の使用において限定された成功があった。これらの抗体の極少数は臨床試験に到達しているが、今日まで第III相臨床試験での好ましい結果を承認又は証明している抗体はない。疾患を治療するための新規医薬の発見は、疾患の原因であり得る30,000の公知の遺伝子産物の内の関連する標的の同定の欠如によって隠されている。癌の研究において、潜在的な薬物標的は、通常、腫瘍細胞中でそれらが過剰発現するという事実に因ってのみ選択される。このようにして同定された標的は、次いで、多数の化合物との相互作用について選別される。潜在的な抗体療法の場合には、これらの候補化合物は、通常、Kohler及びMilsteinによって提案された基本的な原則に従うモノクローナル抗体産生の典型的方法から得られる（1975, Nature, 256, 495-497, Kohler and Milstein）。脾臓細胞は、抗原で免疫されたマウスから回収され（例えば、全細胞、細胞フラクション、精製された抗原）、不死化ハイブリドーマパートナーと融合される。得られたハイブリドーマは、標的に最も強く結合する抗体の分泌のために選別され、そして選択される。ハープセチン（登録商標）及びリタキシマブを含む癌細胞に対する多くの治療的及び診断的抗体は、これらの方法を用いて産生され、そしてそれらの親和性に基づいて選択されている。この方法の欠点は２倍である。第一に、治療的又は診断的な抗体結合のための好適な標的の選択は、組織特異的癌化プロセスの周辺の知識、及びこれらの標的がそれによって同定される過剰発現による選択のような得られた単純化された方法、の不足によって限定されている。第二に、最も大きな親和性を有する受容体に結合する薬物分子が、通常、シグナルを開始又は阻害する最も高い可能性を有するという推測は、必ずしも当てはまらない。
乳癌及び結腸直腸癌の治療に伴う進歩にもかかわらず、効率的な抗体療法の同定及び開発は、単一薬又は同時療法のいずれかとして、すべての種類の癌に十分ではなかった。
先行特許：
米国特許第5,750,102号明細書は、患者の腫瘍が患者由来の細胞又は組織からクローン化され得るMHC遺伝子でトランスフェクトされる、プロセスを開示している。これらのトランスフェクトされた細胞は、次いで、患者をワクチン化するために使用される。
米国特許第4,861,581号明細書は、哺乳動物の新生物及び正常細胞の外部成分にではなく、内部細胞成分に特異的であるモノクローナル抗体を取得し、新生物細胞を殺す治療法を受けている哺乳動物の組織で抗体を標識し、及び新生物細胞を退縮する内部細胞成分への標識された抗体の結合を測定することによって治療法の効率を決定するステップ、を含む方法を開示する。ヒト細胞内抗原に関する抗体を調製するときに、悪性細胞がかかる抗原の従来の起源を示すことを特許権者は認識している。
米国特許第5,171,665号明細書は、新規抗体及びその産生のための方法を提供する。具体的には、特許は、ヒト腫瘍、例えば、直腸結腸及び肺のヒト腫瘍、に関連したタンパク質抗原に強力に結合し、同時により低度で正常細胞に結合する性質を有するモノクローナル抗体の形成を教示する。
米国特許第5,484,596号明細書は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に取り除き、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処理し、生細胞であるが、非-発癌性のある腫瘍細胞を照射し、及び一次腫瘍の再発を阻害することができる患者用ワクチンを調製するためにこれらの細胞を使用し、同時に転移を阻害すること、を含む癌療法の方法を提供する。該特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応性のあるモノクローナル抗体の開発を教示する。第４欄第45行、以下参照に記載されているように、特許権者は、ヒト腫瘍形成において活性な特定の免疫療法を発現するモノクローナル抗体の開発において自発性腫瘍細胞を利用する。
米国特許第5,693,763号明細書は、ヒト癌を特徴付ける糖タンパク質抗原を教示しており、起源の上皮組織に依拠しない。
米国特許第5,783,186号明細書は、Her2発現細胞においてアポトーシスを誘導する抗-Her2抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、該抗体を利用する癌の治療方法、及び該抗体を含む医薬組成物に関する。
米国特許第5,849,876号明細書は、腫瘍及び非-腫瘍組織源から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体の産生のための新規なハイブリドーマ細胞株を記載する。
米国特許第5,869,268号明細書は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球、モノクローナル抗体を産生するための方法、及び該方法によって産生されるモノクローナル抗体に関する。該特許は、特に、癌の診断及び治療のために有用な抗-HDヒトモノクローナル抗体の産生に関する。
米国特許第5,869,045号明細書は、ヒト癌細胞と反応する、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体及び単一-鎖抗毒素に関する。ヒト癌の表面上に存在する細胞膜抗原と反応性であり、更に、該抗体が癌細胞内で吸収し次いで結合する点で、これらの抗体の機能が２倍であるメカニズムは、該抗体を、抗体-薬物及び抗体-毒素複合体を形成させるために特に有用にする。その非修飾形態において、抗体はまた、特定の濃度において細胞傷害性を明らかにする。
米国特許第5,780,033号明細書は、腫瘍治療及び予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、加齢の哺乳動物由来の抗核自己抗体である。この場合において、自己抗体は、免疫形において見出された自然抗体の１種であると言われる。自己抗体は「加齢哺乳動物」由来であるので、自己抗体が実際に治療されるべき患者から得られる必要性はない。加えて、該特許は、加齢哺乳動物由来の自然及びモノクローナル抗核自己抗体、及びモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示している。
発明の概要
本願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するための、米国特許第6,180,357号明細書に教示された患者特異的な抗癌抗体を産生するための方法論を利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍に特異的に作製され、そのため、癌療法のカスタマイズを可能にすることができる。本願の記載の範囲内で、細胞殺傷性（細胞傷害性）又は細胞増殖阻害性（細胞増殖抑制性）のいずれかを有する抗-癌抗体は、以下、細胞傷害性と言う。これらの抗体は、癌の段階区分及び診断の目的で使用され、腫瘍転移を治療するために使用され得る。これらの抗体は、予防的治療によって癌の抑制ためにも使用され得る。典型的な薬物発見の実例に従って作製された抗体とは異なり、このような方法で作製された抗体は、悪性組織の増殖及び/又は生存に不可欠であると以前は分かっていなかった分子及び経路を標的することがある。更に、これらの抗体の結合親和性は、より強い親和性相互作用を受けにくいかもしれない細胞傷害性事象の開始のための要件に適している。また、標準的な化学療法的様式、例えば放射性核種を、本願のCDMABと複合化し、それによって該化学療法の使用に焦点を当てることは、本発明の範囲内にある。CDMABは、毒素、細胞傷害性部分、酵素、例えばビオチン複合化酵素、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分又は血液原性細胞に複合化され、それによって抗体複合体を形成することができる。CDMABは、単独で、又は１以上のCDMAB/化学療法剤と組み合わせて使用され得る。
個人に合わせた抗-癌治療の予想は、患者が管理される方法において変化をもたらすだろう。可能性のある臨床的シナリオは、腫瘍試料が発表の際に得られ、そして積み上げられることである。この試料から、腫瘍は、予め存在する癌性疾患修飾抗体のパネルから分類され得る。患者は、慣習的に段階区分されるが、入手できる抗体は患者を更に段階区分する点で使用され得る。患者は、現存する抗体で直ちに治療され、そして、腫瘍に特異的な抗体のパネルは、本明細書に概略した方法を用いるか、又は本明細書に開示されたスクリーニング方法と組み合わせてファージディスプレイライブラリーの使用のいずれかによって産生され得る。他の腫瘍が治療されるエピトープと同一のエピトープのいくつかを有すルことができる可能性があるので、作製されたすべての抗体は、抗-癌抗体のライブラリーに加えられるだろう。この方法に従って産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有するかなり多数の患者における癌性疾患を治療するために有用であり得る。
抗-癌抗体に加えて、患者は、治療の多数-モデルレジメの一部として、現在推奨されている治療法を受けることを選択できる。本方法論によって単離された抗体が、非-癌性細胞に対して比較的に非-毒性であるという事実は、単独又は従来の治療法と組み合わせて使用される高用量の抗体の組合せを可能にする。高い治療的指数は、治療耐性細胞の発現の可能性を減少させる短期間での再-治療をも可能にするだろう。
患者が治療又は転移進行の最初のコースに難治性である場合には、腫瘍に特異的な抗体を作製する方法が再治療のために繰り返され得る。更に、抗-癌抗体が患者から得られた赤血球に複合化され、転移の治療のために再注入され得る。転移性癌のための効果的な治療法はほとんどなく、転移は通常、死を招く不幸な結果の前兆となる。しかしながら、転移性癌は、通常、よく視覚化され、赤血球による抗-癌抗体の送達は、腫瘍部位に該抗体を濃縮する効果を有し得る。転移前ですら、ほとんどの癌細胞は、その生存のために宿主の血液供給に依拠し、そして赤血球に複合化された抗-癌抗体は、インサイチュの腫瘍に対しても効果的である。あるいは、該抗体は、他の血液原性細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞等に複合化され得る。
抗体には５つのクラスがあり、各々は、その重鎖によって付与される機能と関連する。一般的に、ネイキド抗体による癌細胞致死は、抗体依存的細胞傷害性又は補体依存的細胞傷害性のいずれかによって仲介される。例えば、ネズミIgM及びIgG2a抗体は、補体系のC-1成分との結合によってヒト補体を活性化することができ、それによって腫瘍溶解を導く補体活性化の典型的な経路を活性化する。ヒト抗体について、最も効果的な補体活性化抗体は、一般的に、IgM及びIgG1である。IgG2a及びIgG3アイソタイプのネズミ抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球及びあるリンパ球による細胞致死を招くFc受容体を有する細胞傷害性細胞を補強する点で効果的である。IgG1及びIgG3アイソタイプのヒト抗体は、ADCCを仲介する。
Fc部位によって仲介される細胞傷害性は、Fc部位が、エフェクター細胞及びその対応する受容体又はタンパク質、例えばそれぞれNK細胞、補体及びT-細胞、の存在を必要とする。これらのエフェクターメカニズムの非存在下で、抗体のFc部分は不活性である。抗体のFc部分は、インビボで抗体の薬物動力学に影響を及ぼす性質を与えることがあるが、インビトロではこの性質は働かない。
我々が抗体を試験する細胞傷害性アッセイは、存在するエフェクターメカニズムを何ら有しておらず、インビトロで実行される。これらのアッセイは、存在する、エフェクター細胞（NK、マクロファージ、又はT-細胞）又は補体を有さない。これらのアッセイは、一緒に加えられるものによって完全に定義されるので、各成分は特徴付けられ得る。本発明で使用されるアッセイは、標的細胞、培地及び血清のみを含む。標的細胞は、それらが癌細胞又は繊維芽細胞であるので、エフェクター機能を有さない。エフェクター機能特性を有する外因性細胞がない場合には、この機能を有する細胞性要素は存在しない。培地は、補体又は任意の細胞を含まない。標的細胞の成長を支持するために使用される血清は、製造供給元によって開示された補体活性を有さない。更に、我々の研究室では、使用される血清中における補体活性の非存在を実証した。そのため、我々の仕事は、抗体の効果がFabによって仲介される抗原結合の効果に全体的に起因するという事実を証明することである。効率的なことに、標的細胞はFcのための受容体を有さないので、それらは、Fabのみを見、Fabのみと相互作用している。ハイブリドーマは、標的細胞で試験された完全免疫グロブリンを分泌するが、該細胞と相互作用する免疫グロブリンの一部分のみは、抗原結合フラグメントとして働くFabである。
本願でクレームされた抗体及び抗原結合フラグメントに関して、出願された本願は、表１のデータによって明らかにされた細胞傷害性を証明した。上で指摘したように及び客観的な証拠によって本明細書で確認されているように、この効果は、全体的にはFabによる腫瘍細胞への結合に因る。
Fcによって補強されるエフェクターメカニズムに関わりなく、標的抗原に対する抗体の直接的な結合に因って細胞傷害性仲介抗体の分野には十分な証拠が存在する。これについての最も優れた証拠は、（それらのメカニズムを形式的に排除するための）補充細胞又は補体を有さないインビトロでの実験である。これらの種類の実験は、完全免疫グロブリンで実施されているか、又はF(ab)'2フラグメントのような抗原結合フラグメントで実施されている。これらの種類の実験では、抗体又は抗原結合フラグメントは、抗-Her2及び抗-EGFR抗体の場合のように標的細胞のアポローシスを直接的に誘導することができる。それらのいずれも、癌療法におけるマーケッティングのための、US FDAによって承認されている抗体を有する。
抗体仲介癌死滅の別の可能性のあるメカニズムは、細胞膜及びその関連した糖タンパク質又は糖脂質における様々な化学結合の加水分解を触媒するために機能する抗体、いわゆる触媒抗体、の利用によるものでもよい。
抗体-仲介癌細胞殺傷の３つの更なるメカニズムがある。第1は、身体に、癌細胞に存在する仮想的抗原に対する免疫応答を産生するようにさせるワクチンとしての抗体の利用である。第２は、成長受容体を標的し及び抗体の機能を干渉し、又はその機能が効率的に失われるようにその受容体をダウンレギュレートする、抗体の利用である。第３は、TRAIL R1もしくはTRAIL R2のような死受容体又はアルファVベータ3等のようなインテグリン分子のライゲーションのような直接的細胞死を導くことがある、細胞表面部分の直接的ライゲーションに対するこのような抗体の効果である。
癌薬の臨床的有用性は、患者に許容される危険プロファイルの下での該薬物の利益に基づく。癌療法では、生存は、一般的に利益の次に最も追求されてきたが、伸びた寿命に加えて多数の他のよく理解されている利益がある。治療が生存に逆に影響を与えないこれらの他の利益は、症状の苦痛緩和、逆事象に対する保護、行く行くは再発又は疾患のない生存への延長、及び行く行くは進行への延長を含む。これらの基準は、一般的に受け入れられ、米国の食品医薬品局（FDA）のような規制機関は、これらの利益を生じる薬物を承認している（Hirschfeld他, Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42: 137-143 200）。これらの基準に加えて、これらの種類の利益を予測することができる他の評価項目があることは十分に認識される。一つには、米国のFDAによって認可された加速された承認プロセスは、患者利益を予測することができるだろう代用評価項目があることを認知している。2003年末の時点において、このプロセス下で16種の医薬が承認され、これらの内で４種が完全承認に進んだ、すなわち追加の試験が、代用評価項目によって予測される直接的な患者の利益を証明した。固形腫瘍における薬物効果を決定するための１つの重要な評価項目は、治療に対する応答を測定することによる腫瘍負荷の評価である（Therasse他, Journal of the National Cancer Institute 92(3): 205-216, 2000）。かかる評価のための臨床的基準（RECIST基準）は、癌の国際的な専門家集団である、固形癌ワーキング・グループにおける応答評価基準によって普及されてきた。好適な対照群と比べてRECIST基準に従った客観的応答によって示される、腫瘍負荷に対する証明された効果を有する薬物は、究極的には、直接的な患者利益を生み出す傾向にある。前臨床状況では、腫瘍負荷は、一般的に、評価及び立証がより簡単である。前臨床試験が臨床的状況に解釈され得るという理由で、前臨床モデルでの延長された生存を生み出す薬物は、最も大きな予測された臨床的有用性を有する。臨床的治療に対する陽性応答を生み出すアナログ、すなわち前臨床状況における腫瘍負荷を減少させる薬物は、疾患に対する重要かつ直接的な影響を有することもある。生存の延長は癌薬物治療からの臨床的成果後に最も追求されるものであるが、臨床的有用性を有する他の利益が存在し、そして、疾患の進行の遅延、延長した生存又はそれらの両方に関連するかもしれない腫瘍負荷減少が、直接的な利益を導き及び臨床的影響をも有し得ることは明らかである（Eckhardt他, Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 第39版 Annual Meeting, 2003, 第209-219頁）。
本発明は、細胞傷害性アッセイ及びヒト癌の動物モデルでのその効果によって同定されたAR81A410.7の開発及び使用を記載する。本発明は、標的分子上に存在するエピトープ又はエピトープ（複数）に特異的に結合し、そして、またネイキド抗体として正常細胞に対してではなく悪性腫瘍細胞に対してインビトロでの細胞傷害性を有し、ネイキド抗体として腫瘍成長の阻害を直接的に仲介する、試薬を記載する。更なる進歩は、腫瘍成長阻害を達成するための同系の抗原マーカーを発現する腫瘍を標的することのような抗-癌抗体の使用、及び癌治療の他の陽性の評価項目に関する。
総じて、本発明は、投与すると、哺乳動物において抗原を発現する癌の腫瘍負荷を減少させることができる、治療剤の標的としてのAR81A410.7抗原の使用を教示する。本発明はまた、哺乳動物において抗原を発現する癌の腫瘍負荷を減少させるためにその抗原を標的とするための、CDMAB（AR81A410.7）及びその誘導体、及びその抗原結合フラグメント、及びその細胞傷害性誘導リガンドの使用を教示する。更に、本発明はまた、AR81A410.7抗原を発現する腫瘍を担持する哺乳動物の診断、治療予測及び予後のために有用であり得る癌性細胞中の該抗原を検出する使用を教示する。
従って、ハイブリドーマ細胞株、及びハイブリドーマ細胞株をコードする、対応する単離されたモノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメントを単離するために、特定の個体又は１以上の特定の癌細胞株から得られる癌性細胞に対する癌疾患修飾抗体（CDMAB）、ここで、CDMABは、癌細胞に関して毒性であり、同時に非-癌細胞に対して比較的非毒性である、を産生するための方法を利用するのが、本発明の目的である。
癌性疾患修飾抗体、リガンド及びその抗原結合フラグメントを教示することが本発明の更なる目的である。
抗体の細胞傷害性が抗体依存的細胞傷害性によって仲介される、癌性疾患修飾抗体を産生することが、本発明の更なる目的である。抗体の細胞傷害性が補体依存的細胞傷害性によって仲介される、癌性疾患修飾抗体を産生することが、本発明のさらに更なる目的である。
抗体の細胞傷害性が細胞性化学結合の加水分解を触媒するその能力の１機能である、癌性疾患修飾抗体を産生することが、本発明のなお更なる目的である。
癌の診断、予後及びモニタリングのための結合アッセイにおいて有用である癌性疾患修飾抗体を産生することが、本発明のなお更なる目的である。本発明の他の目的及び利点は、実例及び例、本発明のある実施態様の方法によって記載される以下の説明から明らかであろう。
図1は、細胞傷害性の割合と、細胞株A549、NCI-H23、NCI-H460、MDA-MB-231及びHs888.Luに対するハイブリドーマ上清の結合レベルとを比較する。 図2は、癌及び正常細胞株へのAR81A410.7の結合を示す。データは、アイソタイプ対照を超える倍率増加として平均蛍光強度を表すために集めた。 図3は、AR81A410.7の代表的なFACSヒストグラム、及び数種類の癌及び非-癌細胞株に対する抗-EGFR抗体を含む。 図4は、予防的BxPC-3膵臓癌モデルにおける腫瘍成長に対するAR81 A410.7の効果を証明する。縦の破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は平均±SEMを示す。 図5は、予防的BxPC-3膵臓癌モデルにおける体重に対するAR81 A410.7の効果を証明する。データ点は平均±SEMを示す。
発明の詳細な説明
一般的に、以下の用語又は語句は、概要、説明、実施例及びクレームで使用される場合に、所定の定義を有する。
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には例えば（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体、脱-免疫されたネズミ、キメラ、又はヒト化抗体（複数）を含む）単一のモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、単一-鎖抗体、ダイアボディー、トリアボディー、免疫複合体及び抗体フラグメントを包含する（以下、参照）。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体、すなわち、少量で存在することがある可能性のある自然突然変異を除いて同一である集団を含む個々の抗体を言う。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対して高度に特異的である。更に、異なった決定因子（エピトープ）に対する異なった抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されることなく合成され得る点で、有利である。修飾語の「モノクローナル」は、実質的に同質の抗体集団から得られた抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler他, Nature, 256: 495 (1975) によって最初に記載されたハイブリドーマ法（ネズミ又はヒト）によって作製されても、あるいは組換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号明細書参照）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson他, Nature, 352: 624-628 (1991)、及びMarks他, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991) によって記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
「抗体フラグメント」は、好ましくは抗原結合又はその可変領域を含む無傷の抗体の一部分を含む。抗体フラグメントの例は、完全長抗体未満、すなわちFab、Fab'、F(ab')2及びFvフラグメント；ダイアボディー；線状抗体；単一-鎖抗体分子；単一-鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質及び抗体フラグメント（複数）から形成された多重特異的抗体、を含む。
「無傷」の抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン（CL）及び重鎖定常ドメイン、CH1、CH2及びCH3を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸変形体でよい。好ましくは、無傷の抗体は、１以上のエフェクター機能を有する。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、無傷の抗体は、異なった「クラス」に帰属され得る。無傷の抗体の５つの主なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、これらの数種類は、更に「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に更に分けられる。抗体の異なったクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なったクラスのサブユニット構造及び3次元構造はよく知られている。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のFc領域（天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域）に帰因するその生物学的活性を言う。抗体のエフェクター機能の例は、C1q結合：補体依存的細胞傷害性；Fc受容体結合：抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性（ADCC）；食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、B細胞受容体：BCR）等を含む。
「抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性」及び「ADCC」は、Fc受容体（FcR）(例えば、Natural Killer (NK) 細胞、好中球及びマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合された抗体を認識し、次いで該標的細胞の溶解を引き起こす、細胞仲介反応を言う。ADCC、NK細胞を仲介するための一次細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) の第４頁第３表に纏められている。対象の分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号明細書又は同第5,821,337号明細書に記載されているようなインビトロでのADCCアッセイが行われ得る。かかるアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）及びナチュラルキラー（NK）細胞を含む。あるいは又は追加的に、対象の分子のADCC活性は、インビボ、例えばClynes他, PNAS(USA) 95: 652-656 (1998) に開示された動物モデルにおいて評価され得る。
「エフェクター細胞」は、１以上のFcRを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、該細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を果たす。ADCCを仲介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単核、細胞傷害性T細胞及び好中球を含む；PBMC及びNK細胞が好ましい。該エフェクター細胞は、その天然源、例えば本明細書に記載の血液又はPBMCから単離され得る。
用語「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を記載するために使用される。好ましいFcRは、天然配列ヒトFcRである。更に、好ましいFcRは、IgG抗体（ガンマ受容体）に結合し、そしてアレル変異体及びこれらの受容体の代替的にスプライスされた形態を含む、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含む、ものである。FcγRII受容体は、その細胞ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、FcγRIIA（「活性化受容体」）及びFcγRIIB（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞ドメイン中に免疫受容体チロシン型モチーフ（ITAM）を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞ドメイン中に、免疫受容体チロシン型阻害モチーフ（ITAM）を含む（M. in Dagron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) 参照）。FcRは、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel等, Immunomethods 4: 25-34 (1994); 並びにde Haas他, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995) を参照されたい。将来同定されるものを含む他のFcRは、本明細書に記載の用語「FcR」によって包含される。該用語は、胎児への母親IgGの移動の原因となる、新生児受容体、すなわちFcRnも含む（Guyer他, J. Immunol. 117: 587 (1976) 及びKim他, Eur. J. Immunol. 24: 2429 (1994))。
「補体依存的細胞傷害性」又は「CDC」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を言う。補体活性化経路は、補体系（C1q）の第１成分の、同系抗原と複合化された分子（例えば、抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ、例えばGazzano-Santoro他, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) に記載されたものを行ってもよい。
用語「可変」は、可変ドメインのある部分は抗体間の配列において大きく異なり、そしてその特定の抗原のためのそれぞれの特定の抗体の結合性及び特異性において使用される、事実を言う。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインに渡って等しく分布されない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域と呼ばれる３つの断片に濃縮されている。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、ループ結合を形成する３つの超可変領域によって結合されたβ-シート構造を主に採用し、そして場合によっては該β-シート構造の一部を形成する、４つのFRを含む。各鎖中の超可変領域は、FRによって互いに近接して及び他の鎖由来の超可変領域と共に維持され、抗体の抗原-結合部位の形成をもたらす（Kabat他, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) 参照）。定常領域は、抗原に対する抗体の結合に直接的に関連しないが、抗体依存的細胞傷害性（ADCC）における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
本明細書で使用される用語「超可変領域」は、抗原-結合の原因となっている抗体のアミノ酸残基を言う。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基24-34 (L1)、50-56 (L2)及び89-97 (L3)、及び重鎖可変ドメイン中の残基31-35 (H1)、50-65 (H2)及び95-102 (H3)；Kabat他, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 及び/又は「超可変ループ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基2632 (L1)、50-52 (L2)及び91-96 (L3)、及び重鎖可変ドメイン中の残基26-32 (H1)、53-55 (H2)及び96-101 (H3)；Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）を含む。
「フレームワーク領域」又は「FR」は、本明細書で定義された超可変領域以外の可変ドメイン残基である。抗体のパパイン消化は、「Fab」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原-結合フラグメントを生じ、各々は、単一の抗原-結合部位及び残りの「Fc」フラグメントを有し、その名称は容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理は、２つの抗原-結合を有し、依然として架橋抗原であり得るF(ab')2フラグメントを生じる。
「Fv」は、完全な抗原-認識及び抗原-結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、固く非-共有結合での、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとのダイマーからなる。それは、各可変ドメインの３つの超可変領域がVH-VLダイマーの表面上の抗原-結合部位を特徴付けるために相互作用するというこの構造にある。共同して、３つの超可変領域は、抗体に対する抗原-結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むFvの半分）さえも、全体的な結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識し及び抗原と結合する能力を有する。Fabフラグメントも、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1定常ドメイン（CH I）を含む。Fab'フラグメントは、抗体のヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加によって、Fabフラグメントとは異なる。Fab'-SHは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数）が少なくとも１つの遊離のチオール基を有するFab'の消化である。F(ab')2抗体フラグメントは、元々は、F(ab')2フラグメント間でヒンジシステインを有するFab'フラグメントの対として作られた。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（K）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の内の１つに帰属され得る。
「単一-鎖Fv」又は「scFv」抗体フラグメントは、単一のポリペプチド鎖に存在する、抗体のVH及びVLドメインを含む。好ましくは、Fvポリペプチドは、scFvに抗原結合のための所望の構造を形成させるVHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーを更に含む。scFvの総説に関しては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113巻, Rosenburg and Moore著, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 参照。
用語「ダイアボディー」は、２つの抗原-結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、同一のポリペプチド鎖（VH-VL）中の可変軽鎖ドメイン（VL）に結合された可変重鎖ドメイン（VH）を含む該フラグメントを言う。同一鎖上の２つのドメイン間でペアリングを可能にするには短いリンカーを用いることによって、ドメインは、他の鎖の相補的ドメインと強制的にペアをつくり、２つの抗原-結合部位をつくる。ダイアボディーは、例えば欧州特許第EP 404,097号明細書; WO 93/11161; 及びHollinger他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) により詳細に記載されている。
用語「トリアボディー」又は「三価のトリマー」は、３つの単一鎖抗体の組合せを言う。トリアボディーは、VL又はVHドメインのアミノ酸末端、すなわちリンカー配列無しで構築される。トリアボディーは、環状の、頭-尾形式で並べられたポリペプチドを有する３つのFv頭を有する。トリアボディーの可能な構造は、他の部位と120度の角度で平面内に位置する３つの結合部位を有する平面である。トリアボディーは、単一特異的でも、二重特異的でも又は三重特異的でもよい。
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定及び分離され、及び/又は回復されたものである。その天然環境の汚染成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含むことがある。単離された抗体は、該抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、組換え細胞内でインサイチュで該抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製ステップによって調製されるだろう。
対象の抗原に「結合する」抗体は、抗体が、抗原を発現する細胞を標的することにおいて治療剤又は診断剤として有用であるような十分な親和性を有する抗原と結合することができる抗体である。該抗体が抗原部分と結合するものである場合に、それは、通常、好ましくは、他の受容体とは反対の抗原部分と結合するだろう、そして、非-特異的Fc定常のような付随的な結合、又は他の抗原に共通する転写後修飾への結合を含まず、他のタンパク質とほとんど交差反応しないものでよい。対象の抗原に結合する抗体の検出のための方法は、当該分野でよく知られており、FACS、細胞ELISA及びウェスタンブロットのようなアッセイを含み、これらに限定されない。
本明細書で用いる表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」は、交換的に使用され、すべてのかかる意味は子孫を含む。すべての子孫は、故意又は不注意の変異に因ってDNA含量が正確に同一ではないことがあることも理解されたい。最初に形質転換された細胞中で選別された同一の機能又は生物学的活性を有する変異子孫も含まれる。明確な意味が意図される文脈から明らかであろう。
「治療又は治療すること」は、治療的な処置及び予防的又は抑制的手段の両方を言う。その目的は、標的された病状又は疾患を予防し又は衰えさせる（減少させる）ことである。治療の必要のある者は、疾患を既に有する者、及び疾患を有する傾向にある者又は疾患が予防されるべき者である。従って、本明細書で治療されるべき哺乳動物は、疾患を有すると診断されているかもしれないし、又は疾患にかかりやすい又は疾患の影響を受けやすいかもしれない。
用語「癌」及び「癌性」は、非制御された細胞増殖又は死によって典型的に特徴付けられる哺乳動物の生理学的症状を言うか又は説明する。癌の例は、悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例は、扁平上皮細胞癌 (例えば、上皮扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非-小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌又は胃がん、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、及び頭頸部癌を含む。
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（サイトキサン（商標））；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチルエニミン及びメチルアメラミン；ナイトロジェン・マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマウスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガカマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗-代謝物質、例えばメトトレキサート及び5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトトレキサート；プリンアナログ、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシタビン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、5-FU；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗-副腎剤、例えばアミノグルテチミド、マイトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラクトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォミチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイトグアゾン；マイトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；マイトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（タキソール（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.）及びドセタキセル（タキソテラ（登録商標）、Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル；ゲンシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；マイトマイシンC；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；CPT-11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイル酸；エスペラマイシン；カペシタビン；及び上記の任意の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。この定義には、腫瘍に対してホルモン作用を制御又は阻害するように働く抗-ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン及びトレミフェン（ファレストン）を含む抗-エストロゲン剤；及び抗-アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；及び上記の任意の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体も含まれる。
治療目的のための「哺乳動物」は、ヒト、マウス、SCIDもしくはヌードマウス又はマウス種族、家畜（domestic animals）及び家畜（farm animals）、及び動物園動物、娯楽動物、あるいはペット動物を含む哺乳動物として分類される任意の動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を言う。本明細書では、好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法（例えば、1988年5月4日に公開されたEP 266,032に記載されたような固相法を用いる、あるいは、Froehler他, Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407, 1986によって記載されたデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を経る、ホスホトリエステル、ホスファイト、又はホスホラミデート化学）によって化学的に合成される、短鎖、単一-又は二重鎖のポリデオキシヌクレオチドである。それらは、次いで、ポリアクリルアミドゲル上で精製される。
本発明に従って、非-ヒト（例えば、ネズミ）免疫グロブリンの「ヒト化」及び/又は「キメラ」形態は、元の抗体と比べて、ヒト抗-マウス抗体（HAMA）、ヒト抗-キメラ抗体（HACA）又はヒト抗-ヒト抗体（HAHA）応答の減少をもたらす、特定のキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又はフラグメント（例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、又は抗体の他の抗原-結合サブシーケンス）を含み、そして所望の効果を再現し、同時に前記の非-ヒト免疫グロブリンに匹敵する結合特性を維持するために必要である、前記の非-ヒト免疫グロブリンから得られる不可欠な部分（例えば、CDR（複数）、抗原結合領域（複数）、可変ドメイン（複数）等）を含む、抗体を言う。たいていは、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そこでは、レシピエント抗体の相補性決定領域（CDR）由来の残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット又はウサギのような非-ヒト種（ドナー抗体）のCDR由来の残基によって置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非-ヒトFR残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、移入されたCDR又はFR配列においても見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の能力を更に洗練し及び最適化するためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの及び典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含むことになる。そこでは、CDR領域のすべて又は実質的にすべては、非-ヒト免疫グロブリンのCDR領域に該当し、FR残基のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR残基である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも１部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも１部を含むだろう。
「脱-免疫」抗体は、所与の種に対して、非-免疫原性であるか又はほとんど免疫原性でない、免疫グロブリンである。脱-免疫は、抗体への構造的変化によって達成され得る。当業者に公知の任意の脱-免疫法が採用され得る。例えば2000年6月15日に公開されたWO 00/34317には、脱-免疫抗体の１つの好適な技術が記載されている。
「アポトーシス」を誘導する抗体は、任意の手段によってプログラムされた細胞死を誘導する抗体であり、アネキシンVの結合、カスパーゼ活性、DNAの断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞断片化、及び/又は膜小胞の形成（アポトーシス細胞と呼ばれる）によって説明されるがこれらに限定されない。
本明細書で用いる「抗体誘導細胞傷害性」は、効果が結合の程度に必ずしも関連しない受入番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生されたハイブリドーマ上清又は抗体から得られた細胞傷害性効果を意味するものと理解される。
本明細書において、ハイブリドーマ細胞株、及びそこから産生される単離されたモノクローナル抗体は、代わりに、国内表示AR81A410.7又は寄託表示IDAC 051206-01によって言及される。
本明細書で使用される「抗体-リガンド」は、標的抗原の少なくとも１つのエピトープの結合特異性を示す部分を含み、そして、無傷の抗体分子、抗体フラグメント及び少なくとも抗原-結合領域又はその部分（すなわち、抗体分子の可変部分）を有する任意の分子、例えばFv分子、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、あるいはIDAC 051206-01（IDAC 051206-01抗原）として指定されたハイブリドーマ細胞株によって産生された単離モノクローナル抗体によって結合された抗原の少なくとも１つのエピトープを特異的に認識及びそれに結合する任意の遺伝子工学によって作製された分子でよい。
本明細書で使用される「癌疾患修飾抗体」（CDMAB）は、患者に有益である方法、例えば、腫瘍を担持する個体の腫瘍負荷又は延長された生存を減少させることによる、で癌性疾患プロセスを修飾するモノクローナル抗体、及びその抗体-リガンドを言う。
「CDMAB関連結合剤」は、その最も広い意味において、少なくとも１つのCDMAB標的エピトープに競争的に結合する、ヒト又は非-ヒト抗体、抗体フラグメント、抗体リガンド等の任意の形態を含むがこれらに限定されないと理解される。「競争的バインダー」は、少なくとも１つのCDMAB標的エピトープに対して結合親和性を有する、ヒト又は非-ヒト抗体、抗体フラグメント、抗体リガンド等の任意の形態を含むがこれらに限定されないと理解される。
治療されるべき腫瘍は、一次腫瘍及び転移腫瘍、並びに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独又はそれらの組合せによる治療に応答しない、又はこれらに対して耐性がある腫瘍を含む。難治性腫瘍はまた、かかる物質での治療によって阻害されるように見えるが、治療後に最大5年、場合によっては最大10年又より長く停止される腫瘍を包含する。治療され得る腫瘍は、血管新生腫瘍でないか、又は実質的に未だ血管新生していない腫瘍、及び血管新生腫瘍を含む。よって治療され得る固形腫瘍の例は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫及びリンパ種を含む。かかる腫瘍の例は、類表皮癌、扁平上皮癌、例えば頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、小細胞及び非-小細胞肺癌を含む肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌及び肝臓癌を含む。他の例は、カポ肉腫、CNS腫瘍、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫及び脳転移、黒色腫、胃腸及び腎臓の癌及び肉腫、横紋筋肉腫、グリア芽腫、好ましくは多形性膠芽腫及び平滑筋肉腫を含む。
本明細書で使用される「抗原-結合領域」は、標的抗原を認識する分子の１部分を意味する。
本明細書で使用される「競争的阻害」は、IDAC 051206-01（IDAC 051206-01抗体）として指定されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体（IDAC 051206-01抗体）が、慣用的な相反抗体競合アッセイを用いて方向付けられる決定部位を認識し及びこれに結合することができることを意味する（Belanger L., Sylvestre C.及びDufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15）。
本明細書で用いる「標的抗原」は、IDAC 051206-01抗原又はその部分である。本明細書で用いる「免疫複合体」は、任意の分子又はCDMAB、例えば、細胞毒、放射活性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、酵素、毒素、抗-腫瘍剤もしくは治療剤に化学的又は生物学的に結合された抗体、を意味する。抗体又はCDMABは、その標的に結合することができる限り、分子の任意の位置で、細胞毒、放射活性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、酵素、毒素、抗-腫瘍剤もしくは治療剤に結合されてもよい。免疫複合体の例は、抗体毒素化学複合体、及び抗体-毒素融合タンパク質を含む。
抗-腫瘍剤としての使用に好適な放射活性剤は当業者に知られている。例えば131I又は211Atが使用される。これらのアイソトープは、慣用的な方法を用いて抗体に結合される（例えば、Pedley他, Br. J. Cancer 68, 69-73 (1993)）。あるいは、抗体に結合される抗-腫瘍剤は、プロドラッグを活性化する酵素である。一旦抗体複合体が投与されたらプロドラッグが細胞毒素の形態に変換される腫瘍部位に到達するまで、依然としてその不活性な形態のままであるプロドラッグが投与されてもよい。実際に、抗体-酵素複合体は、患者に投与され、治療される組織部位に局在化され得る。次いで、プロドラッグは、細胞毒への変換が治療される組織部位で起こるように患者に投与される。あるいは、抗体に複合化された抗-腫瘍剤は、サイトカイン、例えばインターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）又はアルファ腫瘍壊死因子（TNF-α）である。他の組織に影響を与えることなく、サイトカインが腫瘍に対する損傷又は腫瘍の破壊を仲介するように、抗体は腫瘍に対するサイトカインを標的する。サイトカインは、慣用的組換えDNA技術を用いてDNAレベルで抗体に融合される。インターフェロンを使用してもよい。
本明細書で使用される「融合タンパク質」は、抗原結合領域が生物学的に活性な分子、例えば毒素、酵素、蛍光タンパク質、発光マーカー、ポリペプチドタグ、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分又はタンパク質剤、に結合されている、任意のキメラタンパク質を意味する。
本発明は、標的又は受容体部分が結合されている本発明のCDMABを更に画する。標的部分は、結合対の第１メンバーである。抗-腫瘍剤は、例えば、かかる対の第２メンバーに複合化され、それによって抗原-結合タンパク質が結合されている部位に方向付けられる。かかる結合対の共有の例は、アビジン及びビオチンである。好ましい実施態様では、ビオチンは、本発明のCDMABの標的抗原に複合化され、それによってアビジン又はストレプトアビジンに複合化される抗-腫瘍剤又は他の部分に対する標的を提供する。あるいは、ビオチン又は他のこのような部分は、本発明のCDMABの標的抗原に結合され、例えば、検出可能なシグナル-生成剤がアビジン又はストレプトアビジンに複合化される診断系において、レポーターとして使用される。
検出可能なシグナル-生成剤は、診断目的でインビボ及びインビトロで有用である。シグナル生成剤は、外部的手段、通常、電磁放射線の測定、によって検出できる測定可能なシグナルを生成する。たいてい、シグナル生成剤は、酵素又はクロモフォアであり、蛍光、燐光又は化学発光によって光を発する。クロモフォアは、紫外又は可視領域の光を吸収する色素を含み、酵素触媒反応の基質又は分解物でよい。
更に、本発明の範囲には、当業者に周知である研究的又は診断的方法のためのインビボ及びインビトロでの該CDMABの使用が含まれる。本明細書で画される診断的方法を実行するために、本発明は、本発明のCDMABを含むキットを更に含んでもよい。かかるキットは、ある種類の癌のリスクにある個体の細胞上でのCDMABの標的抗原の過剰発現を検出することによって、該個体の同定に有用であろう。
診断アッセイキット
腫瘍の存在を決定するための診断的アッセイキットの形態で本発明のCDMABを利用することが画される。腫瘍は、一般的に、１以上の腫瘍-特異的抗原、例えば、タンパク質及び/又は血液、血清、尿及び/又は腫瘍生検のような患者から得られた生物的試料中のかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、の存在に基づいて患者において検出されるだろう。
該タンパク質は、特定の腫瘍、例えば結腸癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の存在又は非存在を示すマーカーとして機能する。抗原が他の癌性腫瘍の検出のための有用性を有するであろうことが更に画される。本発明のCDMABから成る結合剤又はCDMAB関連結合剤の診断的アッセイキットの包含は、生物学的試料中の該結合剤に結合する抗原レベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマー及びプローブは、癌の存在又は非存在の指標でもある腫瘍タンパク質をコードするmRNAのレベルを検出するために使用され得る。診断的である結合アッセイのために、結合認識に癌性腫瘍の存在についての診断を確実に与えるように、正常組織中に存在する抗原と関連して、統計的に有意な抗原レベルと相関するデータが作成されるだろう。試料中のポリペプチドマーカーを検出するための結合剤を使用するための、当業者に知られている多数の形式が、本発明の診断的アッセイのために有用であろうことが画される。例えば、Harlow及びLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapters 9-14, 1988に例示されている。 更に、上記の診断的アッセイ形式の任意及びすべての組合せ、置換又は修飾が画される。
患者における癌の存在又は非存在は、典型的には、(a) 患者から得られた生物学的試料と結合剤とを接触させ；(b) 結合剤に結合するポリペプチドレベルを試料中で検出し； 及び (c) ポリペプチドレベルを所定のカットオフ値と比べること、によって決定される。
例証的実施態様では、アッセイは、試料中の残余由来のポリペプチドに結合し及びそれを除くために、固体支持体上に固定化されるCDMAB型結合剤の使用を含むだろうことが画される。結合されたポリペプチドは、次いで、レポーター基を含みそして結合剤/ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を用いて検出され得る。例証的な検出試薬は、ポリペプチド又は抗体に特異的に結合するCDMAB型結合剤、又は該結合剤に特異的に結合する他の物質、例えば抗免疫グロブリン、プロテインG、プロテインA又はレクチンを含んでよい。他の実施態様では、ポリペプチドがレポーター基で標識され、試料での結合剤のインキュベーション後に固定化された結合剤に結合することができる、競争的アッセイが利用されてもよいことが画される。試料と固定化された結合剤との反応性の指標は、試料の成分が結合剤への標識されたポリペプチドの結合を阻害する程度である。かかるアッセイ内における使用のための好適なポリペプチドは、結合剤が結合親和性を有する、完全長腫瘍-特異的タンパク質及び/又はその部分を含む。
診断キットは、タンパク質が結合され得る当業者に公知の任意の材料の形態でよい固体支持体と共に提供されるだろう。好適な例は、マイクロタイタープレートもしくはニトロセルロース又は他の好適な膜における試験ウェルを含んでよい。あるいは、該支持体は、ビーズ又はディスク、例えばガラス、ファイバガラス、ラテックス、又はプラスチック材料、例えばポリスチレン又はポリ塩化ビニルでよい。支持体は、例えば米国特許第5,359,681号明細書に開示されたもののような磁性粒子又は光ファイバセンサーでもよい。
結合剤が、上記特許及び科学文献に十分に記載されている当業者に公知の様々な技術を用いて固体支持体上に固定されるだろうことが画される。用語「固定」は、本発明の文脈では、結合剤と支持体上の官能基との間の直接的な連結でもよく、又は架橋剤による連結でもよい、非共有的会合、例えば吸着、及び共有的会合の両方を言う。好ましくは、限定的態様ではないが、マイクロタイタープレート中のウェルへの、又は膜への吸着による固定が好ましい。吸着は、好適な時間、好適なバッファー中での結合剤と、固体支持体とを接触させることによって達成され得る。該接触時間は、温度によって変動してもよく、一般的に約１時間〜約１日の範囲であろう。
結合剤の固体支持体への共有的結合は、支持体と、支持体及びヒドロキシル又はアミノ基のような結合剤上の官能基の両方と反応する二官能性試薬とをまず反応させることによって通常達成されるだろう。例えば、結合剤は、ベンゾキノンを用いて、又は支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミン及び活性水素との縮合によって、好適なポリマコーティングを有する支持体に共有的に結合され得る。
診断的アッセイキットは、２つの抗体サンドイッチアッセイの形態をとるだろうと更に画される。このアッセイは、抗体、例えば、固体支持体、通常マイクロタイタープレートのウェル、上に固定されている本明細書に開示のCDMABと、試料とを、試料内のポリペプチドが固定された抗体に結合することができるように、まず接触させることによって達成され得る。結合されない試料は、次いで、固定されたポリペプチド-抗体複合体から除かれ、そして、レポーターを含む検出試薬（好ましくは、該ポリペプチド上の異なった部位に結合することができる第二抗体）が加えられる。次いで、固体支持体に結合されたままである検出試薬の量は、特定のレポーター基に好適な方法を用いて決定される。
具体的な実施態様では、一旦抗体が上記の支持体上に固定されると、ウシ血清アルブミン又はツィーン20（登録商標）（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）のような当業者に公知の任意の好適なブロッキング剤の使用によって、支持体上の残りのタンパク質結合部位が遮断される、ことが画される。次いで、固定された抗体は、試料とインキュベートされ、ポリペプチドは、抗体に結合され得るだろう。試料は、インキュベーションの前にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のような好適な希釈剤で希釈され得る。一般的に、好適な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、具体的に選択された腫瘍を有する固体から得られた試料中のポリペプチドの存在を検出するために十分な時間に対応するように選択されるだろう。好ましくは、接触時間は、結合されたポリペプチドと結合されていないポリペプチドとの平衡に到達した時間の少なくとも95パーセントである結合レベルを達成するために十分である。平行に達するために必要な時間が、長時間に渡って起こる結合レベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを、当業者は理解するだろう。
結合されていない試料は、その後、好適なバッファーで固体支持体を洗浄することによって除かれるだろうことが更に画される。レポーター基を含む第二抗体は、次いで、固体支持体に添加されるだろう。次いで、検出試薬の、固定された抗体-ポリペプチド複合体によるインキュベーションは、結合されたポリペプチドを検出するために十分な時間、実行されるだろう。次に、結合されていない試薬は、レポーター基を用いて検出されるだろう。レポーター基を検出するために採用された方法は、必ずしも、選択されたレポーター基の種類に特異的である必要はなく、例えば放射活性基、シンチレーション計数又はオートラジオグラフィー法が一般的に好適である。分光学的方法は、色素、発光基及び蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なったレポーター基（通常、放射活性もしくは蛍光基又は酵素）に結合されたアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は、一般的に、（一般的に特定の時間）基質の添加によって検出され、次いで反応性生物の分光学的分析又は他の分析がなされる。
前立腺癌のような癌の存在又は非存在を決定するために本発明の診断的アッセイキットを利用するために、固体支持体に結合されたままであるレポーター基から検出されたシグナルは、一般的に、所定のカットオフ値に対応するシグナルに匹敵するだろう。例えば、癌の検出のための例証的なカットオフ値は、固定された抗体が癌無しの患者由来の試料でインキュベートされる時に得られる平均シグナルでよい。一般的に、所定のカットオフ値を超える約３つの標準偏差であるシグナルを発生する試料は、癌に対して陽性であると考えられるだろう。別の実施態様では、カットオフ値は、Sackett他, Clinical Epidemiology. A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, 第106-7頁の方法に従って、受診者動作曲線を用いて決定され得る。このような実施態様では、カットオフ値は、真の陽性率（すなわち、感受性）と、診断的試験結果のための各々の可能なカットオフ値に対応する偽陽性率（100パーセント-特異性）との対のプロットから決定され得る。上左手隅（すなわち、最も大きな面積を囲む値）に最も近いプロット上のカットオフ値は、最も正確なカットオフ値であり、この方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを生成する試料は陽性であると考えられる。あるいは、カットオフ値は、偽陽性率を最小限にするためにプロットに沿って左にシフトし、又は偽陰性率を最小限にするためにプロットに沿って右にシフトし得る。一般的に、この方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを生成する試料は、癌に陽性であると考えられる。
上記キットによって可能になる診断的アッセイは、結合剤がニトロセルロースのような膜上で固定される、フロースルー試験形式又はストリップ試験形式のいずれかで行われる、ことが画される。フロースルー試験では、試料中のポリペプチドは、試料が膜を通過するので、固定された結合剤に結合する。第２の標識結合剤は、次いで、第二結合剤を含む溶液が膜を通過するので、結合剤-ポリペプチド複合体に結合する。結合された第二結合剤の検出は、次いで、上記のように行われ得る。ストリップ試験形式では、結合剤が結合される膜の１末端が、試料を含む溶液中に浸漬されるだろう。試料は、第二結合剤を含む領域に渡る膜の方へ移動し、固定された結合剤の領域に移動する。固定された領域での第二結合剤の濃度は、癌の存在を示す。視覚的に読み取れる、結合部位での線のようなパターンの発生は、陽性試験の指標であろう。かかるパターンの非存在は、陰性の結果を示す。生物試料が、上記の形式において、２つのサンドイッチアッセイにおける陽性シグナルを生成するために充分であろうポリペプチドのレベルを含む時に、一般的に、膜上に固定された結合剤の量は、視覚的に認識できるパターンを生成するように選択される。本診断的アッセイにおいて使用するための好ましい結合剤は、本明細書に開示された抗体、その抗原-結合フラグメント、及び本明細書に記載された任意のCDMAB関連結合剤である。膜上に固定された抗体の量は、診断アッセイを作製するために効果的な任意の量であり、約25ナノグラム〜約１マイクログラムの範囲でよい。典型的に、このようなアッセイは、非常に少量の生物学的試料で行われ得る。
更に、本発明のCDMABは、その標的抗原を同定する能力に因って研究用研究室で使用され得る。
本明細書に記載の発明が更に十分に理解されるように、以下の説明を記載する。
本発明は、IDAC 051206-01抗原を特異的に認識し、及びこれに結合するCDMAB（すなわち、IDAC 051206-01 CDMAB）を提供する。受入番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のCDMABは、それが、ハイブリドーマIDAC 051206-01によって産生された単離モノクローナル抗体の、標的抗原への免疫特異的結合を競走的に阻害する抗原-結合領域を有する限り、いずれの形態でもよい。従って、IDAC 051206-01抗体と同一の結合特異性を有する任意の組換えタンパク質（例えば、抗体が、リンホカイン又は腫瘍阻害成長因子のような第二タンパク質と混合されている、融合タンパク質）は、本発明の範囲内に入る。
本発明の１つの実施態様では、CDMABは、IDAC 051206-01抗体である。
他の実施態様では、CDMABは、Fv分子（例えば、単一鎖Fv分子）でよい抗原結合フラグメント、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、融合タンパク質、二重特異的抗体、異種抗体又はIDAC 051206-01抗体の抗原-結合部位を有する任意の組換え分子でよい。本発明のCDMABは、IDAC 051206-01モノクローナル抗体が指向するエピトープに関する。
本発明のCDMABは、誘導化分子を産生するように、修飾、すなわち分子内でアミノ酸修飾がなされ得る。直接的な変異、親和性成熟の方法、ファージディスプレイ、又は鎖シャッフリングも可能である。
親和性及び特異性は、CDR及び/又はフェニルアラニントリプトファン（FW）残基を変異させることによって、及び所望の特徴を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって、修飾又は改善され得る（例えば、Yang他, J. Mol. Biol., (1995) 254: 392-403）。１つの方法は、他の同一の抗原結合部位の集団において、2又は20アミノ酸の基質が特定の位置で見出されるように、個々の残基又は残基の組合せを無作為化することである。あるいは、変異は、エラープローンPCR方によってある残基の範囲で誘導され得る（例えば、Hawkins他, J. Mol. Biol., (1992) 226: 889-96））。他の例では、重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、E. コリの突然変異誘発遺伝子株中で増殖され得る（例えば、Low他, J. Mol. Biol., (1996) 250: 359-68））。これらの突然変異発生法は、当業者に知られている多くの方法の例証である。
本発明の抗体の親和性を増加するための別の方法は、重鎖又は軽鎖が他の重鎖又は軽鎖と無作為的に一組にされてより高い親和性を有する抗体を調製する、鎖シャッフリングを実行することである。抗体の様々なCDRは、他の抗体中の対応するCDRとシャッフリングしてもよい。
誘導化分子は、ポリペプチドの機能的特性を保持するだろう、すなわち、かかる置換を有する分子は、IDAC 051206-01抗原へのポリペプチド又はその部分の結合を依然として可能にするだろう。
これらのアミノ酸置換は、「保存的」として当該分野で知られているアミノ酸置換を含むが、これに必ずしも限られない。
例えば、「保存的アミノ酸置換」と称されるあるアミノ酸置換が、タンパク質の構造又は機能のいずれかを変更することなく、該タンパク質において頻繁に行われることは、タンパク質化学の充分に確立された原則である。
かかる変化は、イソロイシン（I）、バリン（V）及びロイシン（L）と、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸との置換；アスパラギン酸（D）とグルタミン酸（E）との置換、及びその逆；グルタミン（Q）とアスパラギン（N）との置換、及びその逆；並びに、セリン（S）とスレオニン（T）との置換、及びその逆を含む。他の置換は、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の3次元構造におけるその役割に依拠して、保存的であるとも考えられる。例えば、グリシン（G）及びアラニン（A）は、アラニン及びバリン（V）と同様に、頻繁に交換され得る。メチオニン（M）は、比較的に疎水性であり、ロイシン及びイソロイシンと、時にはバリンと、頻繁に交換され得る。リジン（K）及びアルギニン（R）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその変化であり、そしてこれら２つのアミノ酸残基のpKの差が重要でない、位置で頻繁に交換可能である。更に他の変化も、特定の環境において「保存的」であると考慮され得る。
実施例 1 ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株AR81A410.7
ブタペスト条約に従ってカナダ国際寄託機関（カナダ保険省微生物局、1015アーリントン通り、ウィニペグ、マニトバ、カナダ、R3E 3R2）に、受入番号051206-01で、2006年12月5日に、ハイブリドーマ細胞株AR81A410.7を寄託した。37 CFR 1.808に従って、寄託者は、寄託された材料の公共性への、利用可能性に対して課されたすべての限定が、特許の登録の際に決定的に除かれるだろう、ことを保証する。受託者が実行可能な試料を配布できない場合に、寄託がそれによって代わる。
抗-癌抗体AR81A410.7を産生するハイブリドーマを製造するために、凍結肺腺癌腫瘍組織（Genomics Collaborative, Cambridge, MA）の単一細胞懸濁液をPBSで調製した。IMMUNEASY（登録商標）（Qiagen, Venlo, Netherlands）アジュバントを緩やかに攪拌しながら使用のために調製した。50マイクロリットルの抗原-アジュバント中の200万個細胞を皮下的に注射することによって、5〜7週齢のBALB/cマウスを免疫した。最初の免疫から2及び5週間後に、免疫されたマウスを腹腔内で追加免疫するために、最近調製された抗原-アジュバントを50マイクロリットル中の200万個の細胞と共に使用した。最終免疫の後に3日間、融合のために脾臓を使用した。単離された脾臓細胞をNSO-I骨髄腫パートナーと融合することによってハイブリドーマを調製した。融合物由来の上清をハイブリドーマのサブクローンから試験した。
ハイブリドーマによって分泌された抗体がIgGアイソタイプか又はIgMアイソタイプであるかを決定するために、ELISAアッセイを採用した。コーティングバッファー（0.1 M 炭酸/重炭酸バッファー、pH 9.2〜9.6）中の2.4マイクログラム/mLの濃度のヤギ抗-マウスIgG + IgM（H+L）の100マイクロリットル/ウェルは、ELISAプレートに4℃で終夜加えた。プレートを洗浄バッファー（PBS + 0.05パーセントのツィーン）で3回洗浄した。100マイクロリットル/ウェルのブロッキングバッファー（5パーセントのミルク洗浄バッファー）は、室温で1時間、プレートに加え、次いで洗浄バッファーで3回洗浄した。100マイクロリットル/ウェルのハイブリドーマ上清を加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、ヤギ抗-マウスIgG又はIgM西洋ワサビペルオキシダーゼ（1パーセントミルクを含むPBSで希釈）複合体の1/100,000希釈を100マイクロリットル/ウェルで加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファーで3回洗浄した。100マイクロリットル/ウェルのTMB溶液を室温で1〜3分間インキュベートした。50マイクロリットル/ウェルの2M H2SO4を加えることによって呈色反応を停止し、パーキンエルマーHTS7000プレートリーダーで450 nmでプレートを読んだ。図1に示したように、AR81A410.7ハイブリドーマは、IgGアイソタイプの抗体を主に分泌した。
ハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体のサブクラスを決定するために、マウスモノクローナル抗体アイソトープキット（HyCult Biotechnology, Frontstraat, オランダ）を用いて、アイソタイピング実験を行った。500マイクロリットルのバッファー溶液をラット抗-マウスサブス特異的抗体を含む試験ストリップに加えた。500マイクロリットルのハイブリドーマ上清を試験管に加え、緩やかに攪拌することによって沈殿させた。獲得されたマウス免疫グロブリンを、コロイド粒子に結合される第二ラットモノクローナル抗体によって直接的に検出した。これらの２つのタンパク質の組み合わせは、アイソタイプを分析するために使用される視覚信号をつくる。抗-癌抗体AR81A410.7は、IgG2a、カッパアイソトープについてのものである。
1ラウンドの制限的希釈の後、細胞ELISAアッセイにおいて標的細胞に結合された抗体に関して、ハイブリドーマ上清を試験した。３つのヒト肺癌細胞株、１つのヒト乳癌細胞株及び１つのヒト非-癌肺細胞株：A549、NCI-H23、NCI-H460、MDA-MB-231及びHs888.Luをそれぞれ試験した。すべての細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC, Manassas, VA）から入手した。プレートに蒔かれた細胞を使用前に固定した。プレートをMgCl2及びCaCl2を含むPBSで3回、室温で洗浄した。100マイクロリットルのPBSで希釈された2パーセントパラホルムアルデヒドを、室温で10分間、各ウェルに加え、次いで廃棄した。プレートを再度、MgCl2及びCaCl2を含むPBSにて室温で洗浄した。ブロッキングは、室温で1時間、100マイクロリットル/ウェルの5パーセントミルクの洗浄バッファー（PBS + 0.05パーセントのツィーン）で行った。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、ハイブリドーマ上清を室温で1時間、100マイクロリットル/ウェルで加えた。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、そして、100マイクロリットル/ウェルの、西洋ワサビペルオキシダーゼ（1パーセントのミルクを含むPBSで希釈）に複合化されたヤギ抗-マウスIgG抗体の1/25,000希釈を加えた。室温での1時間のインキュベーションの後に、プレートを洗浄バッファーで洗浄し、100マイクロリットル/ウェルのTMS基質を室温で1〜3分間インキュベートした。反応は、50マイクロリットル/ウェルの2M H2SO4で終了させ、パーキンエルマーHTS7000プレートリーダーで450 nmにてプレートを読んだ。図１に表形式にした結果は、試験された細胞株に結合することが従来明らかでなかった社内のIgGアイソタイプ対照と比較して、バックグラウンドを超える倍数として表示した。ハイブリドーマAR81A410.7由来の抗体は、MDA-MB-231乳癌細胞株に強く結合し、肺癌細胞株NCI-H23及びNCI-H460並びに正常細胞株Hs888.Luに弱く結合することを示した。
抗体結合のための試験に関連して、ハイブリドーマ上清の細胞傷害性効果（抗体誘導された細胞傷害性）を細胞株：A549、NCI-H23、NCI-H460、MDA-MB-231及びHs888.Luで試験した。カルセインAMは、モレキュラープローブ（Eugene, OR）から入手し、アッセイは以下に概略されるように行った。所定の好適な濃度でのアッセイの前に細胞を蒔いた。2日後に、ハイブリドーマ・マイクロタイター・プレート由来の100マイクロリットルの上清を細胞プレートに移し、5パーセントCO2インキュベーターで5日間インキュベートした。陽性対照としてのウェルを空になるまで吸引し、そして、培養培地に溶解された100マイクロリットルのナトリウムアジド (NaN3, 0.01パーセント, Sigma, Oakville, ON) 又はシクロヘキシミド (CHX, 0.5マイクロモーラー, Sigma, Oakville, ON) を加えた。処理の5日後、プレートをひっくり返し、吸い取り乾燥することによって空にした。MgCl2及びCaCl2を含む室温DPBS（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）を、複数チャンネル小型容器から各ウェルに分配し、3回吸引し、ひっくり返し次いで吸引乾燥して空にした。MgCl2及びCaCl2を含むDPBSに希釈した50マイクロリットルの蛍光カルセイン色素を各ウェルに添加し、5パーセントCO2インキュベーターで30分間、37℃でインキュベートした。プレートをパーキンエルマーHTS7000蛍光プレートリーダーで読み、データをマイクロソフトエクセルで分析した。結果を図１に表の形式で示す。AR81 A410.7ハイブリドーマ由来の上清は、NCI-H23肺癌細胞において43パーセントの特異的な細胞傷害性を示した。これは、陽性対照のナトリウムアジド及びシクロヘキシミドについてそれぞれ得られた細胞傷害性の86パーセント、391パーセントであった。AR81A410.7も、陽性対照のナトリウムアジド及びシクロヘキシミドについてそれぞれ得られた細胞傷害性の17パーセント、52パーセントであった、NCI-H460肺癌細胞について12パーセントの特異的な細胞傷害性を示した。
図１からの結果は、AR81A410.7の細胞傷害性効果が癌細胞種の結合レベルと直接的に関連しないことを証明した。最も高い結合は、MDA-MB-231乳癌細胞で検出されたが、細胞傷害性は、NCI-H23及びNCI-H460肺癌細胞で検出された。図１に表形式で示したように、AR81A410.7は、Hs888.Lu正常ヒト肺細胞株で細胞傷害性を示さなかった。公知の非-特異的な細胞傷害性剤であるシクロヘキシミド及びNaN3は、一般的に予想された細胞傷害性を示した。
実施例 2 インビトロ結合
AR81A410.7モノクローナル抗体は、CL-1000フラスコ（BD Biosciences, Oakville, ON）中でハイブリドーマを培養し、2回/週に回収及び再播種することによって製造した。次に、プロテインGセファロース4ファストフロー（Amersham Biosciences, Bair d'Urfe, QC）を用いる標準抗体精製手段を行った。脱-免疫化、ヒト化、キメラ又はネズミであるモノクローナル抗体を利用するのは本発明の範囲内である。
肺癌（A549、NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460及びNCI-H520）、結腸癌（Lovo）、乳癌（MDA-MB-231）、膵臓癌（BxPC-3）、前立腺癌（PC-3）及び卵巣癌（OVCAR-3）、並びに及び皮膚（CCD-27sk）及び肺（Hs888.Lu）由来の非-癌細胞株へのAR81A410.7の結合は、フローサイトメトリー（FACS）で評価した。肺癌細胞株NCI-H322Mを除くすべての細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC, Manassas, VA）から入手した。NCI-H322Mは、NCI-Frederick癌DCTD腫瘍/細胞株リポジトリー（Frederick, MD）から入手した。
細胞は、細胞単層膜をDPBS（Ca++及びMg++を含まない）で先ず洗浄することによってFACS用に調製した。次いで、細胞解離バッファー（Invitrogen, Burlington, ON）は、37℃の細胞培養プレートから細胞を取り除くために使用した。遠心及び回収の後に、細胞をMgCl2、CaCl2及び2パーセントのウシ胎児血清を含むDPBSに4℃で再懸濁し（染色媒体）、カウントし、好適な細胞濃度に等分し、回転させて、細胞をペレットにし、そして試験抗体（AR81A410.7）又は対照抗体（アイソトープ対照、抗-EGFR）の存在下で、4℃で染色媒体に再懸濁した。アイソトープ対照及び試験抗体は、20マイクログラム/mLで評価し、一方、抗-EGFRは、30分間氷上で5マイクログラム/mLで評価した。Alexa Fluor 546-複合化第二抗体の添加前に、細胞は染色媒体で一度洗浄した。次いで、染色媒体中のAlexa Fluor 546-複合化抗体を4℃で30分間加えた。次いで、細胞を最終時のために洗浄し、固定媒体（1.5パーセントパラホルムアルデヒドを含む染色媒体）に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリー収集は、FACSarray（商標）System Software（BD Biosciences, Oakville, ON）を用いて、T試料をFACSarray上に移動させることによって評価した。細胞の前方散乱光（FSC）及び側方散乱光（SSC）は、FSC及びSSC検出器上の電圧及び振幅ゲインを調整することによって設定した。蛍光（Alexa-546）チャンネルの検出器は、細胞が約1〜5単位の平均蛍光強度を有する均一なピークを有するように、非染色細胞を移動させることによって調整した。各試料について、約10,000ゲート事象（染色された固定細胞）は、分析のために取得され、その結果は図２に示される。
図２は、平均蛍光強度倍率がアイソタイプを超えて増加することを示している。AR81A410.7抗体の代表的なヒストグラムは、図３に従った。AR81A410.7は、肺癌細胞株NCI-H23 (3.5-倍)、乳癌細胞株MDA-MB-231 (1.6倍)、膵臓癌細胞株BxPC-3 (2.6-倍)、卵巣癌細胞株OVCAR-3 (2.5-倍)、前立腺癌細胞株PC-3 (2.5-倍)、皮膚非-癌細胞株CCD-27sk (1.9-倍)、及び肺非-癌細胞株Hs888.Lu (2.7-倍) への検出可能な結合を証明した。これらのデータは、AR81A410.7が、抗原発現レベルを変化させながら、数種類の異なった細胞株に結合したことをも証明する。
実施例 3 BxPC-3細胞を用いるインビトロ腫瘍実験
実施例1及び2は、AR81A410.7が、数種類の異なった癌の兆候に渡る検出可能な結合を有するヒト癌細胞株に対して抗-癌特性を有した、ことを証明した。図４び５に関連して、8〜10週齢雌性SCIDマウスに、首筋に皮下的に注射された100マイクロリットルPBS溶液中の500万のヒト膵臓細胞（BxPC-3）を移植した。6の中の2治療群にマウスを無作為に分けた。移植の翌日、20 mg/kgのAR81A410.7試験抗体又はバッファー対照を、2.7 mM KCl、1 mM KH2PO4、137 mM NaCl及び20 mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃縮液からの希釈の後、300マイクロリットルの体積で各集団に腹腔内に投与した。次いで、抗体及び対照試料は、同一形式で、試験期間中、1週間に1回投与した。だいたい7日ごとに腫瘍成長をキャリパーで測定した。抗体の8回投薬後に試験を完了した。試験期間中、週に1回、動物の体重を記録した。試験の最後に意、CCACガイドラインに従って、すべての動物を安楽死させた。
AR81A410.7は、ヒト膵臓癌のインビボ予防モデルでのBxPC-3における腫瘍成長を減少させた。ARIUS抗体AR81 A410.7を用いる治療は、抗体の最終投与の6日後である56日目に測定されたバッファー-治療対照群に比べて、71.5パーセント、BxPC-3腫瘍の成長を減少させた（図4）。その結果は、各群における低数のマウスに因って有意（p=0.14、t-試験）に達しなかったが、抗体-処置群における腫瘍サイズは、ビヒクル対照に比べてすべての時点で低かった。41日目に、すべてのマウスは生存している時に、腫瘍成長は、75パーセント阻害された（p=0.104、t-試験）。
試験を通じて、細胞傷害性の臨床的兆候はなかった。1週間ごとに測定された体重は、成長がうまくいっていること及び失敗の代わりになるものであった。試験の最初から最後まで、いずれかの群のついても体重の有意差はなかった（対照、p=1.000、t-試験; AR81A410.7、p=0.2094、t-試験）。しかしながら、試験の最後、62日目には、群間での有意差があった（p=0.0396、t-試験）（図5）。纏めると、AR81A410.7は、よく寛容され、このヒト膵臓異種移植モデルにおける腫瘍負荷を減少させた。
実施例 4 競争的結合剤の単離
抗体を考慮すると、各々の当業者は、同一のエピトープを認識する抗体である、競争的に阻害するCDMAB、例えば、競争する抗体を作製することができる（Belanger L.他, Clinica ChimicaActa 48: 15-18 (1973)）。１つの方法は、抗体によって認識される抗原を発現する免疫源で免疫することを伴う。試料は、組織、単離されたタンパク質（複数）又は細胞株（複数）を含んでもよいが、これらに限定されない。得られたハイブリドーマは、試験抗体の結合を阻害する抗体を同定するものである、競争アッセイ、例えばELISA、FACS又はウェスタンブロット、を用いて選別され得る。別の方法は、ファージディスプレイ抗体ライブラリー及び前記抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体のパンニング法を利用することができた（Rubinstein JL他. Anal Biochem 314: 294-300 (2003)）。いずれの場合にも、抗体は、その標的抗原の少なくとも１つのエピトープへの元の標識抗体の結合を置き換えるその能力に基づいて選択される。従って、かかる抗体は、元の抗体として抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する特徴を有するだろう。
実施例 5 AR81A410.7モノクローナル抗体の可変領域のクローニング
AR81A410.7ハイブリドーマ細胞株によって産生されたものクローナル抗体の重鎖（VH）及び軽鎖（VL）由来の可変領域の配列が決定され得る。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードするRNAは、グアニジンイソチオシアン酸による細胞溶解に関連する標準的方法を用いて、対象のハイブリドーマから抽出され得る（Chirgwin他. Biochem. 18: 5294-5299 (1979)）。mRNAは、当該分野で公知のPCR法によってVH及びVL遺伝子の後の単離のためのcDNAを調製するために使用され得る（Sambrook他著, Molecular Cloning, Chapter 14, Cold Spring Harbor laboratories Press, N. Y. (1989)）。重鎖及び軽鎖のN-末端アミノ酸配列は、各々、自動エドマンシークエンス法によって決定され得る。CDRの更なるストレッチ及び隣接するFRは、VH及びVLフラグメントのアミノ酸シークエンスによっても決定され得る。次いで、合成プライマーは、AR81A410.7モノクローナル抗体由来のVH及びVL遺伝子の単離のために設計され、そして、単離された遺伝子は、シークエンスのための好適なベクターにライゲートされ得る。二量体型及びヒト化IgGを作製するために、可変軽ドメイン及び可変重ドメインは、発現用の好適なベクターにサブクローン化され得る。
別の実施態様では、AR81A410.7又はその脱-免疫化されたキメラ又はヒト化変形体は、抗体が発現され回収され得るようなトランスジェニック動物中で、抗体をコードする核酸を発現することによって産生される。例えば、抗体は、回収及び生成を助ける組織特異的な方法で発現され得る。１つのこのような実施態様では、本発明の抗体は、授乳中に分泌用の乳房中で発現される。トランスジェニック動物は、マウス、ヤギ及びウサギを含むがこれらに限定されない。
(i) モノクローナル抗体
モノクローナ抗体をコードするDNA（実施例1に概略した）は、慣用的な手段を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい起源として役立つ。一旦単離されると、DNAは、発現ベクターに導入され、これは、次いで、E.コリ細胞、サルOCS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、又は他には免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主に形質移入されて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。DNAはまた、例えば、相同なネズミ配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのためのコーディング配列を置き換えることによって修飾され得る。キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を含む方法を含む合成タンパク質化学において公知の方法を用いて、インビトロで調製され得る。例えば、抗毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的のための好適な試薬の例は、イミノチオエート及びメチル−4-メルカプトブチルイミデートを含む。
(ii) ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非-ヒト起源からそこに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非-ヒトアミノ酸残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから得られる「インポート」残基を通常言う。ヒト化は、齧歯動物のCDR又はCDR配列をヒト化抗体の対応する配列と置き換えることによって、Winter及び協力者の方法によって行われる（Jones他, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann他, Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen他, Science 239: 1534-1536 (1988); Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000) 参照）。
ヒト化抗体は、親の及びヒト化配列の3次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物の分析方法によって調製され得る。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の３次元立体構造を明らかにし及び表示することができるコンピュータプログラムは入手できる。これらの表示の検討は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原への結合能力に影響を与える残基の分析、を可能にする。このようにして、所望の抗体の特徴、例えば標的抗原（複数）に対する増加した親和性が達成されるように、FR残基は、コンセンサス配列及びインポート配列から選択され、組み合わされる。一般的に、CDR残基は、抗原結合に影響を与えることに直接的及びほとんど実質的に関連する。
(iii) 抗体フラグメント
抗体フラグメントの製造のための様々な技術が開発されている。これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって製造され得る（Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little他, Immunol. Today 21: 364-370 (2000) 参照）。例えば、Fab'-SHフラグメントは、E.コリから直接的に回収され、化学的に結合されてF(ab')2フラグメントを形成し得る（Carter他, Biotechnology 10: 163-167 (1992)）。別の実施態様では、F(ab')2は、ロイシンジッパーGCN4を用いて形成されて、F(ab')2分子の会合を促進する。別の方法によれば、Fv、Fab又はF(ab')2フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離され得る。
実施例 6 本発明の抗体を含む組成物
本発明の抗体は、癌を予防/治療するための組成物として使用され得る。本発明の抗体を含む癌を予防/治療するための組成物は、低-毒性であり、液状調製物の形態であるように又は好適な調製物の医薬組成物として、ヒト又は哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、腹腔内、皮下的など）に投与され得る。本発明の抗体は、それ自体投与され、又は好適な組成物として投与され得る。投与に使用される組成物は、本発明の抗体もしくはその塩、希釈剤又は賦形剤と共に薬理学的に許容される担体を含んでもよい。かかる組成物は、経口又は非経口投与のための好適な医薬調製物の形態で提供される。
非経口投与用の組成物の例は、注射可能な調製物、座薬等である。注射可能な調製物は、静脈、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴、間接内注射等のような投薬剤形を含んでよい。これらの注射可能調製物は、公知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、本発明の抗体又はその塩を注射のために従来使用されている殺菌した水性媒体又は油性媒体中で溶解、懸濁又は乳化することによって調製され得る。注射用の水溶媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤等を含む等張液があり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート80、HCO-50（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（50モル）生成物）等のような好適な溶解剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油等が採用され、これらは、ベンジル安息香酸エステル、ベンジルアルコール等のような溶解剤と組み合わせて使用され得る。このようにして調製された注射剤は、好適なアンプルに通常充填される。直腸投与のために使用される座薬は、本発明の抗体又はその塩を座薬用の慣用的基剤と混合することによって調製され得る。経口投与用の組成物は、固体又液状の調製物、具体的には、錠剤（糖衣錠及びフィルム-コート錠剤を含む）、ピル剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤（軟カプセルを含む)。シロップ剤、乳化剤、懸濁剤など、を含む。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、医薬調製物の分野で慣用的に使用されているビヒクル、希釈剤又は賦形剤を含んでもよい。錠剤用のビヒクル又は賦形剤の例は、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウム等である。
有利なことに、上記の経口又は非経口的使用のための組成物は、活性成分の用量に適合するように単位投薬量を有する医薬調製物に調製される。かかる単位投薬調製物は、例えば、錠剤、ピル剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、座薬等を含む。含有される前記化合物の量は、一般的に、5〜500 mg/投薬剤形であり；上記の抗体は、特に注射剤の形態で約5〜約100 mg、他の形態については10〜250 mg含まれることが好ましい。
本発明の抗体を含む上記の予防/治療剤又は調整剤の用量は、投与される対象、標的疾患、症状、投与経路等によって変動し得る。例えば、成人の例えば乳癌を治療/予防する目的のために使用される場合には、本発明の抗体を、約0.01〜約20 mg/kg体重、好ましくは約0.1〜約10 mg/kg体重、及びより好ましくは約0.1〜約5 mg/kg体重の用量で静脈内に、約1〜5回/日、好ましくは約1〜3回/日、投与することが有利である。他の非経口的及び経口的投与では、薬剤は、上記の用量に対応する用量で投与され得る。症状が特に重度の場合には、用量は症状に従って増やすことができる。
本発明の抗体は、そのままで又は好適な組成物の形態で投与され得る。投与のために使用される組成物は、前記の抗体もしくはその塩、希釈剤又は賦形剤と共に、薬理学的に許容される担体を含んでもよい。かかる組成物は、経口的投与又は非経口的投与（例えば、血管内注射、皮下注射等）に好適な医薬調製物の形態で提供される。上記の各組成物は、他の活性成分を更に含んでもよい。更に、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例えば、シクロホスホラミド、イホスファミド等）、代謝アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート、5-フルオロウラシル等）、抗-腫瘍抗体（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物-由来の抗-腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカン等を組み合わせて使用され得る。本発明の抗体及び上記の薬剤は、患者に同時に又は時差的に投与されてもよい。
本明細書に記載の治療方法、特に癌の治療方法は、他の抗体又は化学療法剤の投与と共に行ってもよい。例えば、EGFR、例えばエルビタックス（登録商標）(セツキシマブ）に対する抗体は、特に結腸癌を治療する時に投与されてもよい。エルビタックス（登録商標）は、乾癬の治療のために効果的であることも分かっている。組合せ使用のための他の抗体は、特に乳癌を治療する時のハープセチン（登録商標）（トラスツズマブ）、特に結腸癌を治療する時のアバスチン（登録商標）、及び非-小細胞肺癌を治療する時のSGN-15を含む。他の抗体/化学療法剤と共に本発明の抗体の投与は、同一又は異なった経路で、同時に又は別個に行ってよい。
利用される化学療法剤/他の抗体レジメは、患者の症状の治療に最適に適合していると考えられる任意のレジメを含む。異なった悪性腫瘍は、患者を基本に決定される、特定の抗-腫瘍抗体及び特定の化学療法剤の使用を必要とし得る。本発明の好ましい実施態様では、化学療法剤は、抗体と同時に、より好ましくは抗体の次に投与される。しかしながら、本発明は、投与のいずれかの特定の方法又は経路に限定されない、ことを強調しなければならない。
証拠の優越は、AR81A410.7が癌細胞株上に存在するエピトープのライゲーションによって抗-癌効果を仲介すること示している。更に、FACS、細胞ELISA又はIHCに限定されないがこれらによって例証される技術を利用することによって、AR81A410.7抗体が、それに特異的に結合するエピトープを発現する細胞の検出に使用され得る、ことを示すことができた。
本明細書に記載のすべての特許及び刊行物は、発明が求める当業者のレベルの指標である。すべての特許及び刊行物は、各々の刊行物が参考として援用されることが明確かつ個々に示されている場合に、同程度に参考として本明細書に援用される。
本発明のある形態が例証されるが、それが、本明細書に開示及び示された部分の特定の形態又は配置に限定されるべきではない、ことを理解されたい。様々な変更が本発明の範囲から逸脱することなくなされ、発明が明細書に示され及び記載されたことに限定されると考えるべきではないことは、当業者には明らかであろう。
当業者は、本発明が目的を実行し、上記の目的及び利点、並びにそれに固有の目的及び利点を獲得するためにうまく適合される、ことを容易に理解するだろう。本明細書に記載の、任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手段及び技術は、目下のところ、好ましい実施態様の代表例であり、具体的を意図したものであり、範囲を限定するものではない。本発明の趣旨内に包含され及び添付のクレームの範囲によって定義されるそこでの変更及び他の使用は、当業者に起こり得るだろう。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載してきたが、クレームされた本発明はこのような特定の実施態様に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、当業者に明らかである本発明を実行するための記載された形式の様々な変更は、以下のクレームの範囲内であることが意図される。
Figure 2010516631
Figure 2010516631

Claims (48)

  1. 受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された、単離モノクローナル抗体。
  2. 請求項１記載の単離モノクローナル抗体の抗体-リガンド。
  3. 受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナ抗体のヒト化変形体、又は該ヒト化変形体から産生された抗原結合フラグメント。
  4. 請求項３記載のヒト化抗体の抗体-リガンド。
  5. 受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナ抗体のキメラ変形体、又は該キメラ抗体から産生された抗原結合フラグメント。
  6. 請求項５記載のキメラ抗体の抗体-リガンド。
  7. 細胞傷害性部分、酵素、放射活性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分及び血液原性細胞からなる群より選ばれるメンバーと複合化された、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離抗体又はその抗体-リガンド。
  8. 受託番号051206-01としてIDACに寄託された単離ハイブリドーマ細胞株。
  9. ヒト腫瘍から選択される組織試料中の癌性細胞の抗体誘導細胞傷害性を開始する方法であって、以下：
    該ヒト腫瘍由来の組織試料を提供し；
    受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体、又はその抗体-リガンドを提供し、ここで、抗体-リガンドは、その標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競争的に阻害する能力によって特徴付けられる；及び
    該単離モノクローナル抗体、該ヒト化抗体、該キメラ抗体又はその抗体-リガンドを、該組織試料と接触させること；
    を含み、
    ここで、該単離モノクローナル抗体、該ヒト化抗体、該キメラ抗体又はその抗体-リガンドの、該組織試料との結合は、細胞傷害性を誘導する、前記方法。
  10. 哺乳動物における抗体誘導細胞傷害性を受けやすいヒト腫瘍の治療方法であって、
    該ヒト腫瘍は、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ここで、抗体-リガンドは、その標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競争的に阻害する能力によって特徴付けられ、
    該哺乳動物の腫瘍負荷の減少をもたらすような有効量で、該モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドを該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  11. 前記単離モノクローナル抗体が、細胞傷害性部分に複合化される、請求項１０記載の方法。
  12. 前記細胞傷害性部分が放射活性同位体である、請求項１１記載の方法。
  13. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが補体を活性化する、請求項１０記載の方法。
  14. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが、抗体依存的細胞傷害性を仲介する、請求項１０記載の方法。
  15. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のヒト化変形体である、請求項１０記載の方法。
  16. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のキメラ変形体である、請求項１０記載の方法。
  17. 受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体と同一のエピトープ又はエピトープ（複数）に特異的に結合することができるモノクローナル抗体。
  18. 哺乳動物におけるヒト腫瘍の治療方法であって、
    該ヒト腫瘍は、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ここで、抗体-リガンドは、その標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競争的に阻害する能力によって特徴付けられ、
    該哺乳動物の腫瘍負荷の減少をもたらすような有効量で、該単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドを該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  19. 前記単離モノクローナル抗体が、細胞傷害性部分に複合化される、請求項１８記載の方法。
  20. 前記細胞傷害性部分が放射活性同位体である、請求項１９記載に方法。
  21. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが補体を活性化する、請求項１８記載の方法。
  22. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが、抗体依存的細胞傷害性を仲介する、請求項１８記載の方法。
  23. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のヒト化変形体である、請求項１８記載の方法。
  24. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のキメラ変形体である、請求項１８記載の方法。
  25. 哺乳動物におけるヒト腫瘍の治療方法であって、
    該ヒト腫瘍は、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ここで、抗体-リガンドは、その標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競争的に阻害する能力によって特徴付けられ、
    該哺乳動物の腫瘍負荷の減少をもたらすような有効量で、少なくとも１つの化学療法剤と共に該モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドを該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  26. 前記単離モノクローナル抗体が、細胞傷害性部分に複合化される、請求項２５記載の方法。
  27. 前記細胞傷害性部分が放射活性同位体である、請求項２６記載の方法。
  28. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが補体を活性化する、請求項２５記載の方法。
  29. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが、抗体依存的細胞傷害性を仲介する、請求項２５記載の方法。
  30. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のヒト化変形体である、請求項２５記載の方法。
  31. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のキメラ変形体である、請求項２５記載の方法。
  32. IDAC受託番号051206-01を有するハイブリドーマ細胞株AR81A410.7によって産生された単離モノクローナル抗体、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体、又は受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体によって特異的に結合されている、ヒト腫瘍から選択された組織試料における癌性細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、以下：
    該ヒト腫瘍由来の組織試料を提供し；
    該単離モノクローナル抗体、該ヒト化抗体、該キメラ抗体、又はIDAC受託番号051206-01を有するハイブリドーマ細胞株AR81A410.7によって産生された単離モノクローナル抗体によって認識されたエピトープと同一のエピトープ又はエピトープ（複数）を認識するその抗体-リガンド、の少なくとも１つを提供し；
    該提供された抗体又はその抗体-リガンドの少なくとも１つを、該組織試料と接触させ；及び
    該提供された抗体又はその抗体-リガンドの少なくとも１つの、該組織試料との結合を決定すること；
    を含み、
    それによって、該組織試料中の癌性細胞の存在が示される、前記方法。
  33. ヒト腫瘍負荷の減少のためのモノクローナル抗体の使用であって、
    該ヒト腫瘍が、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ここで、抗体-リガンドは、その標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競争的に阻害する能力によって特徴付けられ、
    該哺乳動物の腫瘍負荷の減少をもたらすような有効量で、該モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドを該哺乳動物に投与することを含む、前記使用。
  34. 前記単離モノクローナル抗体が、細胞傷害性部分に複合化される、請求項３３記載の方法。
  35. 前記細胞傷害性部分が放射活性同位体である、請求項３４記載の方法。
  36. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが補体を活性化する、請求項３３記載の方法。
  37. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが、抗体依存的細胞傷害性を仲介する、請求項３３記載の方法。
  38. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のヒト化変形体である、請求項３３記載の方法。
  39. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のキメラ変形体である、請求項３３記載の方法。
  40. ヒト腫瘍負荷の減少のためのモノクローナル抗体の使用であって、
    該ヒト腫瘍が、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ここで、抗体-リガンドは、その標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競争的に阻害する能力によって特徴付けられ、
    該哺乳動物の腫瘍負荷の減少をもたらすような有効量で、少なくとも１つの化学療法剤と共に、該モノクローナル抗体又はそのCDMABを該哺乳動物に投与することを含む、前記使用。
  41. 前記単離モノクローナル抗体が、細胞傷害性部分に複合化される、請求項４０記載の方法。
  42. 前記細胞傷害性部分が放射活性同位体である、請求項４１記載の方法。
  43. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが補体を活性化する、請求項４０記載の方法。
  44. 前記単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが、抗体依存的細胞傷害性を仲介する、請求項４０記載の方法。
  45. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のヒト化変形体である、請求項４０記載の方法。
  46. 前記単離モノクローナル抗体が、単離モノクローナル抗体のキメラ変形体である、請求項４０記載の方法。
  47. 請求項１、２、３、６、７、８又は１７のいずれか１項記載の抗体又は抗体-リガンド；該抗体又はその抗原結合フラグメントの、細胞傷害性部分、酵素、放射活性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分及び血液原性細胞からなる群より選ばれるメンバーとの複合体；並びに、薬理学的に許容される担体の必要量、を組み合わせて含む、ヒト癌性腫瘍を治療するために効果的な組成物であって、該ヒト癌性腫瘍を治療するために効果的である、前記組成物。
  48. ヒト癌性腫瘍の存在を検出するためのアッセイキットであって、
    該ヒト腫瘍が、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ここで、抗体-リガンドは、その標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競争的に阻害する能力によって特徴付けられ、
    該アッセイキットが、受託番号051206-01としてIDACに寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンド、並びに該単離モノクローナル抗体又はその抗体-リガンドが、特定のカットオフレベルでのポリペプチドの存在が該ヒト癌性腫瘍の存在の診断であるようなポリペプチドに結合されるかを検出するための手段、を含む、前記アッセイキット。
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