KR20090088879A - 암 질환 조절 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 스크리닝 패러다임을 사용하여 암 질환 조절 항체들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 암 세포 세포독성을 결과변수로 사용하여 항-암 항체를 분리함으로써, 상기 방법은 치료 및 진단 목적을 위한 항-암 항체의 제조를 가능하게 한다. 상기 항체들을 암의 병기결정 및 진단에 도움이 되도록 사용할 수 있으며, 원발성 종양 및 종양 전이를 치료하는데 사용할 수 있다. 상기 항-암 항체를 독소, 효소, 방사성 화합물, 및 혈행성 세포에 결합시킬 수 있다.
Figure P1020097009747
CDMAB, 항체, 암, 화학요법제, 결합 검정법

Description

암 질환 조절 항체 {CANCEROUS DISEASE MODIFYING ANTIBODIES}
협동 연구 협정에 관한 진술
본원 청구항들에 의해 정의되는 본 발명은, Arius Research Inc. 및 Takeda Pharmaceutical Company Limited 간의 공동 연구 협정 ("협정") 에 대한 양자에 의해, 상기 협정의 범위 내에서 수행된 활동의 결과로서 이루어졌다. 상기 협정은 본 발명의 발명일 전에 유효하게 되었다.
본 발명은 암 질환 조절 항체 (cancerous disease modifying antibody, CDMAB) 의 분리 및 제조 및 치료 및 진단 과정에서, 임의로는 하나 이상의 화학요법제와 병용한, 이들 CDMAB 의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 CDMAB 를 이용하는 결합 검정법에 관한 것이다.
암 치료요법으로서의 단일클론 항체: 암을 나타내는 각 개인은 독특하며, 해당 개인의 정체성만큼이나 다른 암들과는 상이한 암을 갖는다. 이러함에도 불구하고, 현재의 치료법은 동일한 단계에 있는 동일 유형의 암을 가진 모든 환자들을 동일한 방식으로 다룬다. 이들 환자 중 적어도 30 % 는 1차 치료에서 실패하게 되는데, 이로써 다음 차수의 치료에 이르게 되고, 치료 실패, 전이, 및 종국 에는 사망의 가능성이 증가하게 된다. 치료에 대한 보다 나은 접근법은 특정 개인에 대한 맞춤 치료일 것이다. 맞춤화에 적합한 현재의 유일한 치료법은 수술이다. 화학요법 및 방사선 치료는 환자에 맞춤일 수 없고, 수술은 그 자체로는 대부분의 경우에 치유를 일으키기에 불충분하다.
단일클론 항체의 출현과 함께, 맞춤 치료 방법의 개발 가능성이 더욱 현실성 있게 되었는데, 그 이유는 각 항체를 단 하나의 항원결정기를 지향하게 할 수 있기 때문이다. 나아가, 특정 개인의 종양을 독특하게 정의하는 일군의 항원결정기들을 지향하는 항체 조합물을 제조하는 것이 가능하다.
암 세포 및 정상 세포 간의 유의미한 차이는 암 세포들이 변형 세포들에 특이적인 항원들을 갖고 있는 점임을 인지하여, 과학계는 오랫동안 단일클론 항체들을 이들 암 항원들에 특이적으로 결합하게 함으로써 변형 세포들을 특이적으로 표적화하도록 설계할 수 있다고 여겨왔는데; 따라서 이는 단일클론 항체들이 암 세포를 제거하는 "마법의 탄환"으로 기능할 수 있다는 믿음을 불러일으켰다. 그러나, 현재는 모든 경우의 암에 있어서 기능할 수 있는 단일한 단일클론 항체는 없으며, 표적화 암 치료로서 단일클론 항체들을 일 부류로 개발할 수 있다는 것이 널리 인식되어 있다. 본 개시된 발명의 교시에 따라 분리되는 단일클론 항체들은 환자에 유익한 방식으로, 예를 들어 종양 적하 (tumor burden) 를 감소시킴으로써, 암 질환 진행 과정을 조절하는 것으로 나타났으며, 이들은 본원에서 암 질환 조절 항체 (CDMAB) 또는 "항암" 항체로 다양하게 언급될 것이다.
현재, 암 환자는 보통 선택할 수 있는 치료가 별로 없다. 암 치료법에 대한 엄격히 통제된 접근법은 전체적인 생존률 및 이환률의 향상을 가져왔다. 그러나, 특정 개인에게, 이들 향상된 통계는 자신들의 개인적 상황의 향상과 반드시 상관된 것은 아니다.
따라서, 의사가 동일 코호트 내 다른 환자들과 무관하게 각 종양을 치료할 수 있게 하는 방법론이 제안된다면, 이는 바로 그 한 사람에 대한 유일한 맞춤 치료 유일한 접근법을 가능하게 할 것이다. 이러한 치료 과정은 이상적으로는 치유율을 증가시키고, 보다 나은 결과를 생성할 것으며, 그에 따라 오랫동안 감지되어온 필요가 충족될 것이다.
역사적으로, 다클론 항체의 사용은 인간 암 치료에서 제한된 성공을 나타내었다. 림프종 및 백혈병은 인간 혈장으로 치료하였으나, 장기적인 경감 또는 반응은 거의 없었다. 게다가, 재현성이 결여되었고, 화학요법과 비교하여 추가적인 유익이 전혀 없었다. 유방암, 흑색종 및 신세포 암종과 같은 고형 종양 또한 인간 혈액, 침팬지 혈청, 인간 혈장 및 말 혈청으로 치료되었으나 결과는 마찬가지로 예측불가능하고 비효과적이었다.
고형 종양에 대해 단일클론 항체를 사용하는 많은 임상 실험이 있었다. 1980 년대에, 특이 항원에 대한 항체들을 사용하거나 또는 조직 선택성에 기초한 것으로 인간 유방암에 대한 적어도 4 번의 임상 실험이 있었는데, 최소 47 명의 환자들로부터 단 한 명의 반응자가 나타났다. 1998 년에서야 비로소 인간화 항-Her2/neu 항체 (Herceptin®) 를 CISPLATIN 과 병용한 성공적인 임상 실험이 있었 다. 상기 실험에서는 37 명의 환자들에 대하여 반응을 평가하였는데, 이들 중 약 1/4 에서는 부분 반응률이 나타났고, 또 다른 1/4 에서는 지엽적인 또는 안정적인 질환 진행이 나타났다. 상기 반응자들에서 질환 진행까지의 시간의 중앙값은 8.4 개월이었고, 반응 지속기간의 중앙값은 5.3 개월이었다.
Herceptin® 은 1998 년에 Taxol® 과 병용한 1 차적 사용이 승인되었다. 임상적 연구 결과들은 항체 요법 + Taxol® 을 받은 사람들에 있어서 질환 진행까지의 시간의 중앙값 (6.9 개월) 이 Taxol® 만을 투여받은 군 (3.0 개월) 과 비교하여 증가된 것을 보여주었다. 또한 생존 기간의 중앙값도 약간 증가되었다; Herceptin® + Taxol® 치료 부분 대 Taxol® 단독 치료 부분에 있어서 22 개월 대 18 개월. 또한, Taxol® 단독 군과 비교하여 항체 + Taxol® 조합 군에서는 완전 반응자 (8 대 2 %) 및 부분 반응자 (34 대 15 %) 모두의 수가 증가되었다. 그러나, Herceptin® 과 Taxol® 을 이용한 치료는 Taxol® 단독 치료와 비교하여 더 높은 심장독성 발생률을 야기하였다(각각 13 대 1 %). 또한, Herceptin® 치료법은 현재 알려진 기능 또는 생물학적으로 중요한 리간드가 없는 수용체인 인간 상피세포 성장인자 수용체 2 (Her2/neu) 를 (면역조직화학법 (IHC) 분석을 통해 측정한 바) 과발현하는 환자들 (전이성 유방암을 가진 환자의 대략 25 %) 에 대해서만 유효하였다. 따라서, 유방암을 가진 환자들에 있어서 커다란 필요가 아직 충족되 지 않고 있다. 심지어 Herceptin® 치료로부터 유익을 얻을 수 있는 환자들도 여전히 화학요법을 필요로 하며, 따라서 여전히 이러한 종류의 치료의 부작용이, 최소한 어느 정도까지는, 다루어져야할 것이다.
결장직장암을 연구하는 임상 실험에서는 당단백질 및 당지질 표적 모두에 대한 항체가 포함된다. 17-1A 와 같은 항체는, 선암에 대해 다소의 특이성을 갖는데, 60 명이 넘는 환자들에서 2 상 임상 실험을 거쳤고, 단 1 명의 환자가 부분 반응을 나타내었다. 다른 실험들에서는, 시클로포스파미드를 추가 사용한 프로토콜에서 17-1A 의 사용에 의해 52 명의 환자 중에서 단 1 건의 완전 반응 및 2 건의 소반응이 나타났다. 현재까지, 17-1A 에 대한 III 상 임상 실험은 3 기 대장암에 대한 보조 요법으로서 효능 개선이 입증되지 않고 있다. 화상 진찰을 위해 최초 승인된 인간화 쥣과 단일클론 항체의 사용 또한 종양 퇴화를 일으키지 않았다.
아주 최근에 단일클론 항체의 사용을 이용한 결장직장암 임상 연구로부터 얼마간의 긍정적인 결과들이 있었다. 2004 년도에, ERBITUX® 는, 이리노테칸에 기초한 화학요법이 유효하지 않은 EGFR-발현성 전이성 결장직장암을 가진 환자들에 대한 2 차 치료를 위해 승인되었다. 2-군 (two-arm) II 상 임상 연구 및 단일군 (single arm) 연구 모두로부터의 결과는, ERBITUX® 을 이리노테칸과 병용시 반응률이 각각 23 및 15 % 이었고, 질환 진행까지의 시간의 중앙값은 각각 4.1 및 6.5 개월이었던 것을 보여주었다. 동일한 2-군 II 상 임상 연구 및 또 다른 단 일군 연구로부터는, ERBITUX® 단독으로 치료한 것이 각각 11 및 9 % 반응률을 생성하였고, 질환 진행까지의 시간의 중앙값은 각각 1.5 및 4.2 개월인 결과가 나타났다.
결과적으로 스위스 및 미국 모두에서는, 이리노테칸과 병용한 ERBITUX® 치료가, 및 미국에서는, ERBITUX® 단독 치료가, 1차 이리노테칸 치료법이 실패한 결장암 환자에 대한 2 차 치료로서 승인되었다. 따라서, Herceptin® 과 마찬가지로, 스위스에서의 치료는 단일클론 항체 및 화학요법의 조합으로서만이 승인된다. 또한, 스위스 및 US 모두에서의 치료는 환자들에 대해 2 차 치료법으로서만 승인된다. 또한, 2004 년도에, AVASTIN® 은 전이성 결장직장암에 대한 1차 치료로서 정맥내 5-플루오로우라실-기반 화학요법과 병행하여 사용하는 것이 승인되었다. III 상 임상 연구 결과들에 의해, AVASTIN® + 5-플루오로우라실로 치료된 환자의 생존 기간 중앙값이 5-플루오로우라실 단독으로 치료된 환자와 비교하여 연장되는 것이 입증되었다(각각 20 개월 대 16 개월). 그러나, Herceptin® 및 ERBITUX® 와 또한 마찬가지로, 치료는 단일클론 항체 및 화학요법의 조합으로서만 승인된다.
폐-, 뇌-, 난소-, 췌장-, 전립선- 및 위암에 대한 결과도 역시 계속적으로 좋지 않다. 비소세포 폐암에 대한 가장 유망한 최근의 결과는, 세포-살해 약물 인 독소루비신에 결합시킨 단일클론 항체 (SGN-15; dox-BR96, 항-Sialyl-LeX) 를 화학요법제 TAXOTERE® 와 조합하여 치료에 포함시킨 II 상 임상 실험으로부터 나타났다. TAXOTERE® 는 폐암에 대한 2 차 치료를 위한 것으로는 유일하게 FDA 승인된 화학요법이다. 초기 데이터는 TAXOTERE® 단독과 비교하여 전체 생존률이 향상된 것을 나타낸다. 상기 연구를 위해 모집된 62 명의 환자 중, 2/3 에는 SGN-15 를 TAXOTERE® 와 조합하여 투여하였고 나머지 1/3 에는 TAXOTERE® 만을 투여하였다. SGN-15 를 TAXOTERE® 와 조합하여 투여한 환자들에 있어서, 전체 생존 기간 중앙값은 7.3 개월이었고, 이에 비해 TAXOTERE® 만을 투여한 환자들에서는 5.9 개월이었다. SGN-15 + TAXOTERE® 를 투여받은 환자들에 있어서 1 년 및 18 개월시의 전체 생존률은 각각 29 및 18 % 이었고, 이에 비해 TAXOTERE® 만을 투여받은 환자들에서는 각각 24 및 8 % 이었다. 추가적인 임상 실험들이 계획되고 있다.
전임상적으로, 흑색종에 대해 단일클론 항체를 사용한 것에서 약간의 제한적인 성공이 있었다. 이들 항체 중 임상 실험에 이른 것은 거의 없으며, 현재까지 어느 것도 승인되거나 III 상 임상 실험에서 긍정적인 결과가 입증된 것이 없다.
질병을 치료하는 새로운 약물의 발견이 지체되는 이유는 질병 병인에 기여할 수 있는 30,000 개의 알려진 유전자들의 산물 중에 관련성 있는 표적을 규명하지 못하는 것에 있다. 종양학 연구에서, 잠재적인 약물 표적들은 종종 단순히 이들이 종양 세포에서 과발현된다는 사실에 기인하여 선택된다. 이렇게 규명된 표적들을 그 후 다수의 화합물과의 상호작용이 있는 것에 대해 스크리닝한다. 잠재적인 항체 요법의 경우, 이들 후보 화합물들은 보통 Kohler 및 Milstein 에 의해 세워진 근본 원리들에 따른 전통적인 단일클론 항체 생성 방법으로 도출된다(1975, Nature, 256, 495-497, Kohler 및 Milstein). 항원 (예컨대 전체 세포, 세포 분획, 정제된 항원) 으로 면역화한 마우스로부터 비장 세포를 수집하고, 이를 불멸화 하이브리도마 상대편과 융합시킨다. 생성된 하이브리도마를 스크리닝하여 표적에 가장 열렬히 결합하는 항체들을 분비하는 것을 선택한다. Herceptin® 및 RITUXIMAB 를 비롯한, 암 세포에 대항한 다수의 치료용 및 진단용 항체는 이러한 방법들을 사용하여 제조되었고, 이들의 친화력을 기초로 선별되었다. 이 전략의 결점은 이중적이다. 첫째로, 치료용 또는 진단용 항체 결합에 대한 적절한 표적을 선택하는 것은, 조직 특이적 발암 과정을 둘러싼 지식의 부족 및 결과적인, 이들 표적들을 규명하는, 과발현에 의한 선별과 같은 극단적으로 단순한 방법에 의해 제한된다. 둘째로, 상기 수용체에 가장 큰 친화력으로 결합하는 약물 분자는 보통 신호를 개시 또는 저해할 가망성이 가장 크다는 가정은 항상 그렇지는 않을 수 있다.
유방- 및 결장암의 치료에 있어서의 일부 진전에도 불구하고, 단일 작용제 또는 공동-치료로서 중 어느 것으로든지, 효력있는 항체 요법의 규명 및 개발은 모든 유형의 암에 대해 부적절하였다.
선행 특허:
U.S. 특허 제 5,750,102 호에는, 환자의 종양으로부터의 세포를 상기 환자의 세포 또는 조직으로부터 클로닝한 것일 수 있는 MHC 유전자로 트랜스펙션하는 방법이 개시되어 있다. 그 후 이들 트랜스펙션된 세포는 상기 환자에의 백신 접종에 사용된다.
U.S. 특허 제 4,861,581 호에는 포유동물의 종양성 신생 (neoplastic) 및 정상 세포의 내부 세포 성분에는 특이적이나 외부 성분들에는 그렇지 않은 단일클론 항체들을 수득하고, 상기 단일클론 항체를 표지하고, 상기 표지된 항체를 종양성 신생 세포를 살상하는 치료를 받은 포유동물의 조직과 접촉시키고, 퇴화하는 종양성 신생 세포의 내부 세포 성분에 대한 상기 표지된 항체의 결합을 측정하여 치료법의 효과성을 측정하는 단계들을 포함하는 방법이 개시되어 있다. 인간 세포내 항원을 지향하는 항체를 제조함에 있어서, 당해 특허권자는 악성 세포들이 상기와 같은 항원들에 대한 편리한 원천을 대표한다는 것을 인식한다.
U.S. 특허 제 5,171,665 호는 신규한 항체 및 이의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 당해 특허는, 결장 및 폐 종양과 같은 인간 종양이 결합된 단백질 항원에는 강하게 결합하는 한편 정상 세포에는 훨씬 더 낮은 수준으로 결합하는 특성을 가진 단일클론 항체의 형성을 교시한다.
U.S. 특허 제 5,484,596 호는 인간 암 환자로부터 종양 조직을 외과적으로 절제하고, 상기 종양 조직을 처리하여 종양 세포를 수득하고, 상기 종양 세포에 방사선을 조사하여 생존가능하나 비(非)-종양형성성이 되게 하고, 이들 세포를 사용하여, 상기 원발성 종양의 재발을 저해하는 한편 동시에 전이를 저해할 수 있는, 상기 환자를 위한 백신을 제조하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 당해 특허는 종양 세포의 표면 항원들에 반응성 있는 단일클론 항체들의 개발을 교시한다. 4 번째 컬럼, 45 번째 줄 이하에 개시된 바와 같이, 당해 특허권자는 인간 신생물 (neoplasia) 에서 활성의 특이적 면역치료를 나타내는 단일클론 항체의 개발에서 자생적 종양 세포들을 이용한다.
U.S. 특허 제 5,693,763 호는 인간 암종에 특유한 것으로서 기원의 상피 조직에 비의존적인 당단백질 항원을 교시한다.
U.S. 특허 제 5,783,186 호는 Her2 발현 세포에서 세포사멸 (apoptosis) 을 유도하는 항-Her2 항체, 상기 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 이용한 암 치료 방법 및 상기 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
U.S. 특허 제 5,849,876 호에는, 종양 및 비(非)-종양 조직 원천으로부터 정제한 뮤신 (mucin) 항원들에 대한 단일클론 항체들의 생성을 위한 새로운 하이브리도마 세포주가 기재되어 있다.
U.S. 특허 제 5,869,268 호는 목적 항원에 특이적인 항체를 생성하는 인간 림프구의 생성 방법, 단일클론 항체의 제조 방법, 및 상기 방법으로 제조된 단일클론 항체에 관한 것이다. 당해 특허는 특히 암의 진단 및 치료에 유용한 항-HD 인간 단일클론 항체의 제조에 관한 것이다.
U.S. 특허 제 5,869,045 호는 항체, 항체 절편, 항체 접합체 및 인간 암종 세포에 반응성 있는 단쇄 면역독소에 관한 것이다. 이들 항체가 기능하는 기작은, 상기 분자들이 인간 암종의 표면 상에 존재하는 세포막 항원들에 반응성 있는 점에서, 또한 상기 항체들이 결합 후에 상기 암종 세포 내로 내재화되는 능력이 있어, 항체-약물 및 항체-독소 접합체를 형성하는데 특히 유용하게 된다는 점에서, 이중적이다. 비변형 형태에서 상기 항체들은 또한 특정 농도에서 세포독성 특성을 나타낸다.
U.S. 특허 제 5,780,033 호에는, 종양 치료 및 예방을 위한 자가항체의 사용이 개시되어 있다. 그러나, 이 항체는 노령의 포유동물로부터의 항핵 자가항체이다. 이러한 경우, 상기 자가항체는 면역체계에서 발견되는 천연 항체의 한 가지 유형으로 불린다. 상기 자가항체가 "노령의 포유동물"로부터 유래하기 때문에, 상기 자가항체는 실제적으로 치료 대상 환자로부터 유래한 것일 필요는 없다. 또한, 상기 특허에는 노령의 포유동물로부터의 천연 및 단일클론 항핵 자가항체, 및 단일클론 항핵 자가항체를 생성하는 하이브리도마 세포주가 개시되어 있다.
발명의 개요
본 출원은 암 질환 조절 단일클론 항체를 인코딩하는 하이브리도마 세포주를 분리하는 U.S. 6,180,357 특허에서 교시된 환자 특이적 항-암 항체를 제조하는 방법론을 이용한다. 이들 항체들을 하나의 종양에 대해 특이적으로 제조할 수 있으며, 따라서 이들은 암 치료법에 대한 맞춤화를 가능하게 한다. 본 출원의 맥락 내에서, 세포-살해 (세포독성) 또는 세포-성장 저해 (세포 증식 억제) 특성 중 하나를 갖는 항-암 항체를 이하 세포독성이 있는 것으로 지칭할 것이다. 이들 항체는 암의 병기결정 (staging) 및 진단에 도움이 되도록 사용할 수 있으며, 종양 전이를 치료하는데 사용할 수 있다. 이들 항체는 또한 예방적 치료로서 암의 예방에 사용될 수 있다. 종래의 신약 개발 패러다임에 따라 생성한 항체와 달리, 상기 방식으로 생성한 항체는 이전에 악성 조직의 성장 및/또는 생존에 필수적인 것으로 나타나지 않은 분자 및 경로를 표적으로 할 수 있다. 나아가, 이들 항체의 결합 친화력은 더 강한 친화 상호작용에 순응하지 않을 수 있는 세포 독성 사건의 개시를 위한 요건에 알맞다. 또한, 표준 화학요법 양식 (예컨대 방사성 핵종) 을 본 발명의 CDMAB 와 결합시켜, 상기 화학요법의 사용의 초점을 맞추는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. CDMAB 를 또한 독소, 세포독성 잔기, 효소 예컨대 비오틴 결합 효소, 또는 혈행성 (hematogenous) 세포에 결합시켜, 항체 접합체를 형성시킬 수도 있다.
개별화된 항-암 치료의 가능성은 환자 관리 방식의 변화를 야기할 것이다. 가능성 있는 임상적 시나리오는 종양 시료를 나타난 시점에 수득하여 보관하는 것이다. 상기 시료로부터, 상기 종양의 유형을 일단(一團)의 기 존재하는 암 질환 조절 항체들로부터 결정할 수 있다. 상기 환자의 병기결정은 종래의 방식으로 할 것이나, 상기 이용가능한 항체들은 상기 환자에 대한 추가적인 병기결정에 소용될 수 있다. 상기 환자를 상기 기존의 항체들로 즉시 치료할 수 있으며, 상기 종양에 특이적인 일단(一團)의 항체들은 본원에 개요된 방법을 사용하거나 또는 본원에 개시된 스크리닝 방법과 함께 파지 (phage) 디스플레이 라이브러리들을 사용하여 제조할 수 있다. 생성된 모든 항체들은 항-암 항체 라이브러리에 추가될 것인데, 그 이유는 다른 종양들이 치료 중인 것과 동일한 항원결정기 중 일부를 포함하고 있을 가능성이 있기 때문이다. 상기 방법에 따라 제조된 항체들은 이들 항체에 결합하는 암을 가진 임의 수의 환자들에서 암 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
항-암 항체에 더하여, 해당 환자는 다중적 치료 요법 중 일부로서 현재 권장되는 치료법을 받는 것을 선택할 수 있다. 본 방법론으로 분리한 항체들이 비(非)-암 세포에 대해서는 비교적 비(非)-독성이라는 사실은 항체들의 조합물을 고용량으로, 단독 또는 통상의 치료법과 병행하여 사용할 수 있게 한다. 상기 높은 치료 지수 (therapeutic index) 는 또한 단기 규모의 재치료를 가능하게 하는데, 이는 치료 저항성 세포들의 출현 가능성을 감소시킬 것이다.
해당 환자가 치료법의 초기 과정에서 난치성이거나 또는 전이가 일어나는 경우, 재-치료를 위해 해당 종양에 대한 특이 항체들을 생성하는 방법을 반복할 수 있다. 나아가, 상기 항-암 항체를 상기 환자로부터 수득한 적혈구에 결합시켜 전이의 치료를 위해 재-주입할 수 있다. 전이성 암에 대한 효과적인 치료는 거의 없었으며, 전이는 보통 사망에 이르게 하는 좋지 않은 예후의 전조이다. 그러나, 전이성 암은 보통 혈관화가 잘 이루어져 있어, 적혈구에 의한 항-암 항체의 전달은 해당 종양 부위에 상기 항체들이 집중되게 하는 효과를 가질 수 있다. 심지어 전이 전이라도, 대부분의 암 세포들은 자신들의 생존을 위해 숙주의 혈액 공급에 의존하며, 적혈구에 결합된 항-암 항체는 원위치 (in situ) 종양에 대항해서도 마찬가지로 효과적일 수 있다. 다르게는, 상기 항체들을 다른 혈행성 세포들, 예컨대 림프구, 대식세포, 단핵구, 자연 살해 세포 등에 결합시킬 수도 있다.
항체에는 5 가지 부류가 있으며, 각각은 그의 중쇄로 부여되는 기능과 관련되어 있다. 일반적으로 순수 (naked) 항체들에 의한 암 세포 살해는 항체 의존성 세포독성 또는 보체 의존성 세포독성 중 하나를 통해 매개되는 것으로 여겨진다. 예를 들어 쥣과 IgM 및 IgG2a 항체들은 보체계의 C-1 구성요소에 결합함으로써 인간 보체를 활성화할 수 있는데, 이에 의해 종양 용해를 초래할 수 있는 전형적인 보체 활성화 경로를 활성화할 수 있다. 인간 항체에 있어서 가장 효과적인 보체 활성화 항체는 일반적으로 IgM 및 IgG1 이다. IgG2a 및 IgG3 아이소타입 (isotype) 의 쥣과 항체들은 Fc 수용체를 가진 세포독성 세포들을 모으는데 효과적이며, 이는 단핵구, 대식세포, 과립구 및 특정 림프구에 의한 세포 살해를 야기하게 된다. IgG1 및 IgG3 아이소타입 둘 다의 인간 항체는 ADCC 를 매개한다.
항체 매개성 암 살해의 또 다른 가능한 기작은 세포막 및 그에 결합된 당단백질 또는 당지질에서의 다양한 화학 결합들의 가수분해를 촉매하는 기능을 하는 항체, 소위 촉매 항체의 사용을 통한 것일 수 있다.
항체-매개성 암 세포 살해의 기작에는 3 가지가 추가로 존재한다. 첫번째는 신체로 하여금 암 세포 상에 존재하는 추정상의 항원에 대한 면역 반응을 일으키도록 유도하는 백신으로서 항체를 사용하는 것이다. 두번째는 성장 수용체들을 표적으로 하여 이들의 기능을 방해하거나 또는 상기 수용체를 하향 조절하여 그의 기능이 효과적으로 상실되게 하는 항체들을 이용하는 것이다. 세번째는 이러한 항체들이 직접적인 세포사를 초래할 수 있는 세포 표면 부분들의 직접 결찰에 미치는 영향으로서, 예컨대 TRAIL R1 또는 TRAIL R2 와 같은 사멸 수용체, 또는 알파 V 베타 3 등과 같은 인테그린 분자의 결찰이 있다.
항암제의 임상적 유용성은 해당 환자에 용인가능한 위험 프로필 하에서의 상기 약물의 유익을 기초로 한다. 암 치료법에서 생존이 일반적으로 가장 추구되는 유익이었으나, 생명 연장 외에도 충분히 인지된 다수의 다른 유익들이 있다. 치료가 생존에 악영향을 주지 않는 경우의 이들 다른 유익들로는, 증상 완화, 유해 사례들에 대항한 보호, 재발까지의 시간 또는 무병 생존 기간의 연장, 및 질병 진행까지의 시간의 연장이 있다. 이러한 기준들은 일반적으로 받아들여지는 것으로서, U.S. 식품의약품 안전청 (F.D.A.) 과 같은 규제 기관들은 이러한 유익들을 가져오는 약물들을 승인한다(Hirschfeld 등, Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002). 이들 기준 외에, 이러한 유형의 유익들의 전조가 될 수 있는 기타 결과변수 (endpoint) 들이 존재한다는 것은 익히 인식되어 있다. U.S. F.D.A. 에 의해 허가되는 가속 승인 과정은 환자 유익을 예측할 가능성이 있는 대리물이 존재한다는 것을 얼마간 인정한다. 2003 년말 현재, 16 개의 약물이 상기 과정 하에 승인되었고, 이들 중, 4 개는 완전히 승인되었는데, 즉, 후속적인 연구들에 따라, 대리결과변수 (surrogate endpoint) 들에 의해 예측된 직접적인 환자 유익이 입증되었다. 고형 종양에서 약물 효과를 결정하는 한 가지 중요한 결과변수는 치료에 대한 반응을 측정하여 종양 적하를 평가하는 것이다(Therasse 등, Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000). 상기와 같은 평가를 위한 임상적 기준 (RECIST 기준) 은 국제 암 전문가 집단인 Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group 에 의해 공표되었다. 적절한 대조군과 비교하여 RECIST 기준에 따른 객관적 반응이 나타난 바 종양 적하에 대한 효과가 입증된 약물들은 궁극적으로는 직접적인 환자 유익을 산출하는 경향이 있다. 전임상 환경에서 종양 적하는 평가 및 기록이 일반적으로 더 직선적이다. 전임상 연구가 임상 환경으로 옮겨질 수 있다는 점에서, 전임상 모델에서 생존 연장을 가져오는 약물들은 임상적 유용성이 가장 크게 예기된다. 임상적 치료에 대해 긍정적인 반응을 일으키는 것과 유사하게, 전임상 환경에서 종양 적하를 감소시키는 약물들은 또한 해당 질병에 대해 유의한 직접적인 영향을 가질 수 있다. 생존 연장이 항암제 치료로부터 가장 추구되는 임상적 결과이긴 하지만, 임상적 유용성이 있는 다른 유익들이 존재하며, 질환 진행의 지연과 상관될 수 있는 종양 적하 감소, 생존 연장 또는 둘 다가 또한 직접적인 유익을 초래할 수 있으며 임상적 영향을 가질 수 있다는 것은 명백하다(Eckhardt 등, Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, 209-219 페이지).
본 발명은 세포독성 검정에서 및 인간 암의 동물 모델에서 효과가 밝혀진 AR27A807.14.1 의 개발 및 사용을 기술한다. 본 발명은 표적 분자 상에 존재하는 항원결정기 또는 항원결정기들에 특이적으로 결합하고, 또한 순수 항체로서 악성 종양 세포에 대항하여 시험관내 세포독성 특성을 가지나 정상 세포에 대해서는 그렇지 않은 시약들을 기술하는데, 이들은 또한 순수 항체로서 종양 성장 저해를 직접적으로 매개한다. 또 다른 진보는, 동족 (cognate) 항원 표지자들을 발현하는 종양들을 표적으로 하는 상기와 같은 항-암 항체를 사용하여 종양 성장 저해, 및 암 치료에 대한 기타 긍정적인 결과변수들을 달성하는 것이다.
종합하여, 본 발명은 투여시에 포유동물에서 하기 항원을 발현하는 암의 종양 적하를 감소시킬 수 있는 치료제를 찾기 위한 표적으로서 AR27A807.14.1 항원을 사용하는 것을 교시한다. 본 발명은 또한 CDMAB (AR27A807.14.1), 및 이들의 유도체, 및 이들의 항원 결합 절편, 및 이들의 세포독성 유도 리간드를 사용하여, 이들의 항원을 표적으로 하여 포유동물에서 상기 항원을 발현하는 암의 종양 적하를 감소시키는 것을 교시한다. 나아가, 본 발명은 또한, 상기 항원을 발현하는 종양을 가진 포유동물의 진단, 치료에 대한 예측, 및 예후에 유용할 수 있는, 암 세포에서의 AR27A807.14.1 항원 검출을 이용하는 것을 교시한다.
따라서, 본 발명의 목적은, 하이브리도마 세포주 및 상기 하이브리도마 세포주를 인코딩하는 대응하는 분리된 단일클론 항체 및 이들의 항원 결합 절편을 분리하기 위해서, 특정 개인, 또는 하나 이상의 특정 암 세포주에서 유래한 암 세포에 대항하여 일어나는 것으로서 암 세포에 대해서는 세포독성인 한편, 동시에 비(非)-암 세포에 대해서는 비교적 비(非)-독성인 암 질환 조절 항체 (CDMAB) 를 제조하는 방법을 이용하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 암 질환 조절 항체들, 이들의 리간드 및 항원 결합 절편을 교시하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 항체 의존성 세포 독성을 통해 매개되는 세포독성을 갖는 암 질환 조절 항체들을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 추가적인 목적은, 보체 의존성 세포 독성을 통해 매개되는 세포독성을 갖는 암 질환 조절 항체들을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 세포성 화학 결합들의 가수분해를 촉매하는 능력의 작용으로서의 세포독성을 가진 암 질환 조절 항체들을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 암에 대한 진단, 예후, 및 모니터링을 위한 결합 검정법에 유용한 암 질환 조절 항체들을 제조하는 것이다.
본 발명의 기타 목적 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것인데, 여기서 본 발명의 특정 구현예들이 실례 및 실시예로써 개시된다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 HT-29, SW1116, Lovo 및 CCD-27sk 세포주들에 대항한 하이브리도마 상청액들의 세포독성 백분율 및 결합 수준을 비교한다.
도 2 는 암 및 정상 세포주들에 대한 AR27A807.14.1 의 결합을 나타낸다. 상기 결합을 아이소타입 대조군과 비교한 증가 배수로서 나타내는 데이터가 표로 정리되어 있다.
도 3 은 예방적 DLD-1 결장암 모델에서 AR27A807.14.1 이 종양 성장에 미치는 영향을 나타낸다. 세로로 된 점선들은 항체가 투여된 기간을 나타낸다. 데이터 점들은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 4 는 예방적 DLD-1 결장암 모델에서 AR27A807.14.1 이 체중에 미치는 영향을 나타낸다. 데이터 점들은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
일반적으로, 하기 단어 또는 구절들은 본 개요, 상세한 설명, 실시예 및 청구항들에 사용될 때 하기 나타낸 정의를 갖는다.
"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는, 예를 들어, 단독의 단일클론 항체 (효현제, 길항제, 및 중화 항체, 탈-면역화, 쥣과, 키메라화 또는 인간화 항체 포함), 다수 항원결정 특이성 (polyepitopic specificity) 을 갖는 항체 조성물, 단쇄 항체, 면역접합체 및 항체 절편을 포함한다(하기 참조).
본원에서 사용된 "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하는데, 즉, 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이들을 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체들은 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위를 지향한다. 나아가, 상이한 결정인자들 (항원결정기들) 을 지향하는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체 제조물과 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 해당 항원 상의 단일 결정인자를 지향한다. 상기 단일클론 항체들은 그들의 특이성에 더하여, 다른 항체들로 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. "단일클론"이라는 수식어구는, 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득된 해당 항체의 특질을 나타내는 것이며, 임의의 특정 방법에 의해 상기 항체를 제조하여야 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 문헌 [Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)] 에 최초 기재된 하이브리도마 (쥣과 또는 인간) 방법으로 제조할 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법으로 제조할 수도 있다(예컨대, U.S. 특허 제 4,816,567 호 참조). "단일클론 항체"는 또한, 예를 들어, 문헌 [Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)] 에 기재된 기법들을 사용하여 파지 항체 라이브러리들로부터 분리할 수도 있다.
"항체 절편"은 완전한 항체의 일부분, 바람직하게는 이의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함하는 부분을 포함한다. 항체 절편의 예로서는 하기가 있다: 전장 (full length) 보다 짧은 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편들; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 단쇄 항체, 단일 도메인 항체 분자, 융합 단백질, 재조합 단백질 및 항체 절편(들)으로부터 형성된 다중특이적 항체.
"완전한(intact)" 항체는 항원-결합 가변 영역뿐 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인들인, CH1, CH2 및 CH3 을 포함하는 것이다. 상기 불변 도메인들은 본래적 서열의 불변 도메인 (예컨대 인간 본래적 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변형체일 수 있다. 바람직하게는, 완전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 완전한 항체들은 상이한 "부류"로 할당될 수 있다. 완전한 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 의 5 가지의 주요 부류가 있으며, 이들 중 몇몇은 "하위부류"(아이소타입), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2 로 더욱 나뉠 수 있다. 상이한 항체 부류들에 대응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 불린다. 상이한 면역글로불린 부류들의 아단위 (subunit) 구조 및 3차원 형상은 익히 공지되어 있다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (본래적 서열의 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변형체의 Fc 영역) 에 기인한 것일 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예로서는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예컨대 B 세포 수용체; BCR) 에 대한 하향 조절 등이 있다.
"항체-의존성 세포-매개성 세포독성" 및 "ADCC"는, Fc 수용체 (FcR) 를 발현하는 비특이적 세포독성 세포들 (예컨대 자연 살해 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포) 이 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 상기 표적 세포의 용해를 일으키는, 세포-매개성 반응을 지칭한다. ADCC 를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)] 의 464 페이지의 표 3 에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, U.S. 특허 제 5,500,362 호 또는 5,821,337 호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정법을 수행할 수도 있다. 이러한 검정법에 유용한 효과기 세포들로는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포가 있다. 다르게는, 또는 부가적으로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예컨대, 문헌 [Clynes 등 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)] 에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"효과기 세포"는 하나 이상의 FcR 을 발현하여 효과기 기능들을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 상기 세포는 적어도 FcγRIII 를 발현하여 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC 를 매개하는 인간 백혈구의 예로서는 하기가 있으며: 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 본원에 기재된 바와 같이 그의 본래적 원천으로부터, 예컨대 혈액 또는 PBMC 로부터 분리할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"이라는 용어들은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR 은 본래적 서열의 인간 FcR 이다. 나아가, 바람직한 FcR 은 IgG 항체 (감마 수용체) 에 결합하는 것으로서, 이에는 대립유전자 변형체 및 이들 수용체들의 선택적 스플라이싱 (alternatively spliced) 형태들을 포함하여, FcγRI, FcγRII, 및 Fcγ RIII 하위부류들의 수용체가 포함된다. FcγRII 수용체로서는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체") 가 있으며, 이들은 세포질 도메인 부분이 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체인 FcγRIIA 는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 를 갖는다. 저해 수용체인 FcγRIIB 는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프 (ITIM) 를 갖는다(하기 총설 참조: M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR 에 대해서는 하기에 개관되어 있다: 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel 등, Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas 등, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]. 미래에 동정될 것들을 포함한, 다른 FcR 들도 본원에서 "FcR"라는 용어에 포함된다. 상기 용어에는 또한, 모체 IgG 들의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체인 FcRn 이 포함된다(Guyer 등, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim 등, Eur. J. Immunol. 24:2429 (1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해할 수 있는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체계의 제 1 구성요소 (C1q) 가 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예컨대 항체) 에 결합함에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예컨대 문헌 [Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)] 에 기재된 것과 같은, CDC 검정법을 수행할 수 있다.
"가변"이라는 용어는, 가변 도메인의 특정 부분들의 서열이 항체들 간에 광범위하게 상이하여 이들이 각 특정 항체의 대응 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용되는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체들의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포하지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 존재하는 과가변 (hypervariable) 영역으로 불리는 3 개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 더욱 고도로 보존된 부분은 구조형성 영역 (framework region, FR) 으로 불린다. 본래적 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들은 각각 4 개의 FR 을 포함하는데, 이들은 주로 3 개의 과가변 영역들로 연결된 β-시트 배열을 취하며, 상기 과가변 영역들은 상기 β-시트 구조를 연결하는, 일부 경우에는 상기 구조의 일부를 형성하는 루프들을 형성한다. 각 쇄 내의 과가변 영역들은 상기 FR 들에 의해 아주 근접하게 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 과가변 영역들과 함께 항체들의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(하기 참조: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991)). 상기 불변 도메인들은 항체가 항원에 결합하는데 있어서 직접적으로 관여하는 것은 아니나, 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 에서 항체의 관여와 같은 다양한 효과기 기능들을 나타낸다.
"과가변 영역"이라는 용어는 본원에 사용될 때 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 과가변 영역은 일반적으로 하기를 포함한다: "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기들(예컨대 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991)) 및/또는 "과가변 루프"로부터의 아미노산 잔기들 (예컨대 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "구조형성 영역" 또는 "FR" 잔기들은 본원에서 정의되는 과가변 영역 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기들이다. 항체들을 파파인으로 절단하면, "Fab" 절편들로 불리는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2 개의 동일한 항원-결합 절편들과, 쉽게 결정화하는 그의 능력이 명칭에 반영된 나머지 "Fc" 절편이 생성된다. 펩신 처리에 의해서는, 2 개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')2 절편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 가진 최소 항체 절편이다. 상기 영역은 강한 비공유 결합 상태로 있는 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어져 있다. 이러한 배열로, 각 가변 도메인의 3 개의 과가변 영역들은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 특징짓는다. 집합적으로, 6 개의 과가변 영역들은 해당 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3 개의 과가변 영역들만 포함하는 Fv 의 절반) 이라도, 전체 결합 부위보다 친화력이 덜하긴 하지만, 항원을 인식하여 그에 결합하는 능력을 가진다. Fab 절편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH I) 을 갖는다. Fab' 절편들은 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯한 수 개의 잔기들이 추가된 점이 Fab 절편들과 상이하다. Fab'-SH 는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올기를 갖는 Fab'를 나타낸다. F(ab')2 항체 절편들은 원래는 그들 사이에 힌지 시스테인이 존재하는 Fab' 절편들의 쌍으로 생성되었다. 항체 절편들의 다른 화학적 커플링들 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물종의 항체의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 불리는, 2 개의 분명히 구별되는 유형들 중 하나로 분류될 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 절편은 항체의 VH 및 VL 도메인들을 포함하는데, 여기서 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인들 사이에, scFv 가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 연결자를 추가로 포함한다. scFv 에 대한 개관을 위해서는, 하기를 참조할 수 있다: 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)].
"디아바디"라는 용어는 2 개의 항원-결합 부위를 가진 소형 항체 절편으로서, 동일 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에서 가변 중쇄 도메인 (VH) 이 가변 경쇄 도메인 (VL) 에 연결되어 있는 절편을 지칭한다. 너무 짧아서 상기 동일 사슬 상의 상기 두 도메인들 간의 쌍 형성 (pairing) 을 허용하지 않는 연결자를 사용함으로써, 상기 도메인들은 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2 개의 항원-결합 부위들을 생성하도록 촉진된다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 90:6444-6448 (1993)] 에 더욱 상세히 기술되어 있다.
"분리된" 항체는 그의 천연 환경의 구성요소로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염물 요소들은 상기 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비(非)단백질성 용질들이 포함될 수 있다. 분리된 항체에는 재조합 세포 내의 원 위치에 존재하는 항체가 포함되는데, 그 이유는 상기 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 구성요소가 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로는, 분리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
관심 항원에 "결합하는" 항체는 당해 항체가 상기 항원을 발현하는 세포를 표적으로 함에 있어서 치료제 또는 진단제로 유용하도록 충분한 친화력을 갖고서 상기 항원에 결합할 수 있는 것이다. 상기 항체가 항원성 부분에 결합하는 것인 경우, 이는 보통 다른 수용체들에 반대되는 것으로서 상기 항원성 부분에 우선적으로 결합할 것인데, 이에는 비(非)-특이적 Fc 접촉과 같은 우연적인 결합, 또는 다른 항원들에 공통인 번역후 변형된 부분에의 결합이 포함되지 않으며, 이는 다른 단백질들과 유의미하게 교차반응하지 않는 것일 수도 있다. 관심 항원에 결합하는 항체의 검출 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이로서는 하기에 제한되는 것은 아니나, FACS, 세포 ELISA 및 웨스턴 블랏과 같은 검정법들을 들 수 있다.
본원에서 사용된, "세포", "세포주", 및 "세포 배양"이라는 표현들은 상호교환가능하게 사용되며, 이러한 모든 표기에는 자손이 포함된다. 또한, 고의적인 또는 고의적인 것이 아닌 돌연변이들로 인해서, 모든 자손의 DNA 내용이 정확히 동일하지는 않을 수 있음은 자명할 것이다. 최초 변형 세포에서 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이 자손이 포함된다. 다른 표기들이 의도된 경우는 문맥으로부터 명백할 것이다.
"치료 또는 치료하는"이란 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 지칭하는 것으로서, 이 때 이의 목적은 표적 병리학적 상태 또는 장애를 방지하거나 또는 진행을 늦추는 (약화시키는) 것이다. 치료를 요하는 자들에는, 이미 상기 장애를 가진 자들뿐 아니라, 상기 장애를 가지기 쉬운 자들 또는 상기 장애가 예방되어야 할 자들이 포함된다. 따라서, 본원에서 치료 대상인 포유동물은 상기 장애를 가진 것으로 진단된 것일 수도 있고 또는 상기 장애에 걸리기 쉬운 또는 그에 취약한 것일 수도 있다.
"암" 및 "암성"이라는 용어들은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장 또는 사멸을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 기술한다. 암의 예로서는, 하기에 제한되는 것은 아니나, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프계 종양 (lymphoid malignancies) 이 있다. 이러한 암의 더 구체적인 예로서는, 편평 세포 암 (예컨대 편평 상피 세포 암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막의 암, 간세포 암, 위장관 암을 포함하는 위(gastric 또는 stomach)암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 선종 (hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장- 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 및 두부 (head) 및 경부 암이 있다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로서는 하기가 있다: 알킬화제, 예컨대 티오테파 (thiotepa) 및 시클로포스파미드 (CYTOXANTM); 알킬 술포네이트, 예컨대 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan) 및 피포설판 (piposulfan); 아지리딘, 예컨대 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa), 및 우레도파 (uredopa); 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 (trimethylolomelamine) 을 포함하는 메틸멜라민 (methylmelamine) 및 에틸렌이민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 노벰비킨 (novembichin), 페네스테린 (phenesterine), 프레드니무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 (uracil mustard); 니트로스우레아 (nitrosurea), 예컨대 카르무스틴 (carmustine), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine); 항생제, 예컨대 아클라시노마이신 (aclacinomycin), 악티노마이신 (actinomycin), 안트라마이신 (anthramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 카라비신 (carabicin), 카르노마이신 (carnomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 마이코페놀산 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), 쿠엘라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토조신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 (methotrexate) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린 (denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈 (fludarabine), 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌 (thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘 (6-azauridine), 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 디데옥시우리딘 (dideoxyuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록수리딘 (floxuridine), 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론 (calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피티오스타놀 (epitiostanol), 메피티오스탄 (mepitiostane), 테스토락톤 (testolactone); 항-부신제 (anti-adrenal), 예컨대 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트리로스탄 (trilostane); 엽산 보충물, 예컨대 폴린산 (folinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드 (aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비산트렌 (bisantrene); 에다트락세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 디아지쿠온 (diaziquone); 엘포르미틴 (elformithine); 엘리프티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 니트레이트 (gallium nitrate); 히드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다민 (lonidamine); 미토구아존 (mitoguazone); 미토잔트론 (mitoxantrone); 모피다몰 (mopidamol); 니트라크린 (nitracrine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드 (2-ethylhydrazide); 프로카르바진 (procarbazine); PSK®; 라족산 (razoxane); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄 (urethan); 빈데신 (vindesine); 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노시드 (arabinoside) ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산 (taxane), 예컨대 파클리탁셀 (paclitaxel) (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈 (gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 (cisplatin) 및 카르보플라틴 (carboplatin); 빈블라스틴 (vinblastine); 백금; 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide); 미토마이신 C (mitomycin C); 미토잔트론; 빈크리스틴 (vincristine); 비노렐빈 (vinorelbine); 나벨빈 (navelbine); 노반트론 (novantrone); 테니포시드 (teniposide); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 젤로다 (xeloda); 이반드로네이트 (ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신 (esperamicin); 카페시타빈 (capecitabine); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체. 상기 정의에는 또한 하기가 포함된다: 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜 (raloxifene), 아로마타제 (aromatase) 저해 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), LY117018, 오나프리스톤 (onapristone), 및 토레미펜 (toremifene) (Fareston); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드 (flutamide), 닐루타미드 (nilutamide), 비카루타미드 (bicalutamide), 류프롤리드 (leuprolide), 및 고세렐린 (goserelin); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
치료를 목적으로 하는 "포유동물"은, 인간, 마우스, SCID 또는 누드 마우스 또는 마우스 변종, 가축 및 사육 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 양, 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯하여, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 포유동물은 인간이다.
"올리고뉴클레오티드"는 공지된 방법으로 화학적으로 합성된 짧은 길이의, 단일- 또는 이중-가닥 폴리데옥시뉴클레오티드이다(예컨대, 1988년 5월 4일 공개된 EP 266,032 에 기재된 것과 같은 고체상 기법들을 사용하거나 또는 문헌 [Froehler 등, Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986] 에 기재된 바와 같은 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간체를 통한, 포스포트리에스테르, 포스파이트, 또는 포스포라미다이트 화학). 이들을 그 후 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제한다.
본 발명에 따르면, 비(非)-인간 (예컨대 쥣과) 면역글로불린의 "인간화" 및/또는 "키메라" 형태는 원래의 항체와 비교하여, 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA) 또는 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응의 저하를 야기하는 특정 키메라 면역글로불린, 이들의 면역글로불린 사슬 또는 절편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체들의 기타 항원-결합 하위서열) 을 포함하고, 목적하는 효과를 재현하는데 필요한, 상기 비(非)-인간 면역글로불린에서 유래한 필수 부분들 (예컨대 CDR(들), 항원 결합 영역(들), 가변 도메인(들) 등) 을 포함하는 한편, 동시에 상기 비(非)-인간 면역글로불린에 필적하는 결합 특질을 보유하는 항체들을 지칭한다. 대부분, 인간화 항체들은, 수용자 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 잔기들이 목적하는 특이성, 친화력 및 능력을 가진 비(非)-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR 의 잔기들로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체) 이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 구조형성 영역 (FR) 잔기는 대응 비(非)-인간 FR 잔기로 대체된다. 나아가, 상기 인간화 항체는 수용자 항체나 이입되는 CDR 또는 FR 서열에는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 전형적으로는 2 개의, 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 이 때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비(非)-인간 면역글로불린의 것에 해당하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기들은 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 상기 인간화 항체는 최적으로는 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 의 적어도 일부를 포함할 것이다.
"탈-면역화" 항체들은 주어진 종에 대해 비(非)-면역원성이거나, 또는 면역원성이 보다 덜한 면역글로불린이다. 탈-면역화는 상기 항체에 구조적 변경을 가하여 달성할 수 있다. 당업자들에 공지된 임의의 탈-면역화 기법을 이용할 수 있다. 항체를 탈-면역화하는 한 가지 적당한 기법은, 예를 들어, 2000년 6월 15일 공개된 WO 00/34317 에 기재되어 있다.
"세포사멸"을 유도하는 항체는 임의 수단에 의해, 하기에 제한되는 것은 아니나 아넥신 V (annexin V) 의 결합, 카스파제 (caspase) 활성, DNA 파편화, 세포 수축, 소포체 팽창, 세포 파편화, 및/또는 막 소포 (아포토시스 소체로 불림) 형성으로 예증되는, 예정된 세포사를 유도하는 항체이다.
본원에서 사용된 "항체 유도성 세포독성"은, IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 하이브리도마 상청액 또는 항체로부터 유래한 세포독성 효과를 의미하는 것으로, 상기 효과는 결합의 정도에 필수적으로 관련된 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 하이브리도마 세포주, 및 이로부터 생성된 분리된 단일클론 항체는 다르게는 이들의 내부적 호칭인, AR27A807.14.1 또는 기탁 명칭인, IDAC 180706-03 으로 지칭된다.
본원에서 사용된 "항체-리간드"에는, 표적 항원의 적어도 하나의 항원결정기에 대한 결합 특이성을 나타내는 부분이 포함되는데, 이는 IDAC 180706-03 으로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체에 의해 결합된 항원 (IDAC 180706-03 항원) 의 적어도 하나의 항원결정기를 특이적으로 인식하여 결합하는 완전한 항체 분자, 항체 절편, 및 적어도 이들의 항원-결합 영역 또는 부분 (즉, 항체 분자의 가변 부분) 을 가진 임의의 분자, 예컨대, Fv 분자, Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 이특이성 (bispecific) 항체, 융합 단백질, 또는 임의의 유전자 조작된 분자일 수 있다.
본원에서 사용된 "암 질환 조절 항체" (CDMAB) 란 환자에 유익한 방식으로, 예를 들어 종양 적하를 감소시키거나 또는 종양을 가진 개인의 생존을 연장시키는 등으로 암 질환 과정을 조절하는 단일클론 항체 및 이의 항체-리간드를 지칭한다.
본원에서 사용된 "항원-결합 영역"은 표적 항원을 인식하는 분자의 일부분을 의미한다.
본원에서 사용된 "경쟁적으로 저해하다"란 통상의 대등한 (reciprocal) 항체 경쟁 검정을 사용하여 IDAC 180706-03 로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단일클론 항체 (IDAC 180706-03 항체) 가 지향하는 결정인자 부위를 인식하여 그에 결합할 수 있는 것을 의미한다. (Belanger L., Sylvestre C. 및 Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15).
본원에서 사용된 "표적 항원"은 IDAC 180706-03 항원 또는 이의 일부분이다.
본원에서 사용된, "면역접합체"는 세포독소, 방사능제 (radioactive agent), 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 결합된 항체와 같은 임의의 분자 또는 CDMAB 를 의미한다. 상기 항체 또는 CDMAB 는, 해당 표적에 결합할 수 있는 한, 상기 분자 상의 임의의 위치에서 세포독소, 방사능제, 항-종양 약물 또는 치료제에 결합될 수 있다. 면역접합체의 예로서는, 항체 독소 화학 접합체 및 항체-독소 융합 단백질이 있다.
본원에서 사용된, "융합 단백질"은 항원 결합 영역이 생물학적으로 활성인 분자, 예컨대, 독소, 효소, 또는 단백질 약물에 연결된 임의의 키메라 단백질을 의미한다.
본원에 기재된 본 발명을 더욱 상세히 이해할 수 있게 하기 위해, 하기 설명을 개시한다.
본 발명은 IDAC 180706-03 항원을 특이적으로 인식하여 그에 결합하는 CDMAB (즉, IDAC 180706-03 CDMAB) 를 제공한다.
IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체의 CDMAB 는, 하이브리도마 IDAC 180706-03 에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체의 해당 표적 항원에 대한 면역특이적 결합을 경쟁적으로 저해하는 항원-결합 영역을 갖는 한 임의의 형태일 수 있다. 따라서, IDAC 180706-03 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 임의의 재조합 단백질 (예컨대, 항체가 림포카인 또는 종양 저해 성장인자와 같은 제 2 의 단백질에 결합된 융합 단백질) 은 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명의 한 가지 구현예에서, CDMAB 는 IDAC 180706-03 항체이다.
다른 구현예들에서, CDMAB 는 IDAC 180706-03 항체의 항원-결합 영역을 가진 Fv 분자 (예컨대, 단쇄 Fv 분자), Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 융합 단백질, 이특이성 항체, 이종항체 또는 임의의 재조합 분자일 수 있는 항원 결합 절편이다. 본 발명의 CDMAB 는 IDAC 180706-03 단일클론 항체가 지향하는 항원결정기를 지향한다.
본 발명의 CDMAB 를 변형시켜, 즉, 상기 분자 내의 아미노산 변형에 의해 변형시켜, 유도체 분자를 생성할 수 있다. 화학적 변형 또한 가능할 수 있다.
유도체 분자는 상기 폴리펩티드의 기능적 특성을 보유할 것인데, 즉, 상기와 같은 치환을 가진 분자는 여전히 IDAC 180706-03 항원 또는 이의 일부분에 대한 상기 폴리펩티드의 결합을 가능하게 할 것이다.
이러한 아미노산 치환에는, 반드시 이에 제한되는 것은 아니나 당업계에 "보존적인 것"으로 공지된 아미노산 치환이 포함된다.
예를 들어, 해당 단백질의 형태나 기능을 변경시키지 않는 "보존적 아미노산 치환"으로 일컬어지는 특정 아미노산 치환이 종종 단백질 내에서 이루어질 수 있다는 것은 단백질 화학에 있어서 잘 확립된 원리이다.
이러한 변경에는, 이소류신 (I), 발린 (V), 및 류신 (L) 중 임의의 것을 이들 소수성 아미노산 중 임의의 다른 것으로; 아스파르트산 (D) 을 글루탐산 (E) 으로 및 그 반대로; 글루타민 (Q) 을 아스파라긴 (N) 으로 및 그 반대로; 및 세린 (S) 을 트레오닌 (T) 으로 및 그 반대로 치환하는 것이 포함된다. 다른 치환들도, 특정 아미노산의 환경 및 해당 단백질의 3차원 구조 내에서의 그의 역할에 따라 보존적인 것으로 또한 간주될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G) 및 알라닌 (A) 은 빈번히 상호교환가능하며, 알라닌 및 발린 (V) 도 마찬가지이다. 메티오닌 (M) 은 비교적 소수성인 것으로서, 류신 및 이소류신과 빈번히, 및 간혹 발린과 상호교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R) 은, 해당 아미노산 잔기의 유의한 특징이 그의 전하이며 이들 두 아미노산 잔기들의 상이한 pK 가 유의하지 않은 위치에서 빈번히 상호교환가능하다. 또 다른 변경들도 특정 환경에서 "보존적"인 것으로 간주될 수 있다.
실시예 1
하이브리도마 제조 - 하이브리도마 세포주 AR27A807.14.1
하이브리도마 세포주 AR27A807.14.1 을, 부다페스트 조약에 따라, 2006년 7월 18일에 캐나다 R3E 3R2 마니토바 위니펙 알링턴 스트리트 1015 에 소재한 캐나다 보건부 미생물학 사무국의 캐나다 국제 기탁 기관 (International Depository Authority of Canada, IDAC) 에, 등록번호 180706-03 하에 기탁하였다. 37 CFR 1.808 에 따라, 당 기탁자들은 기탁된 물질에 대한 공중의 이용가능성에 대한 모든 부여된 제한들을 특허 등록승인시에 확정적으로 제거할 것임을 보장한다. 상기 기탁은 상기 기탁 기관이 생존가능한 시료를 제공해줄 수 없을 경우 대체될 것이다.
항-암 항체 AR27A807.14.1 을 생성하는 하이브리도마를 제조하기 위해, 동결한 인간 결장 선암 종양 조직의 단일 세포 현탁액 (Genomics Collaborative, Cambridge, MA) 을 PBS 중에 제조하였다. IMMUNEASYTM (Qiagen, Venlo, 네덜란드) 애주번트 (adjuvant) 를 온건하게 혼합하여 사용을 위해 제조하였다. 5 - 7 주령의 BALB/c 마우스들에 상기 항원-애주번트 50 마이크로리터 중의 2 백만개의 세포를 피하로 주사하여 마우스들을 면역화하였다. 상기 최초 면역화 후 2 주 후에, 최근 제조된 항원-애주번트를 사용하여 70 마이크로리터 중의 2 백만개 세포로 상기 면역화된 마우스들을 복강내로 부스팅(boosting)하였다. 마지막 면역 화 3 일 후에 비장을 사용하여 융합하였다. 분리한 비장세포를 NSO-1 골수종 상대편과 융합시켜 하이브리도마를 제조하였다. 상기 융합물로부터의 상청액을 상기 하이브리도마의 서브클론으로부터 시험하였다.
상기 하이브리도마 세포에 의해 분비된 항체들이 IgG 또는 IgM 아이소타입 중 어느 것인지 결정하기 위해, ELISA 검정법을 이용하였다. 4 ℃ 의 코팅 완충액 (coating buffer) (0.1 M 탄산염/중탄산염 완충액, pH 9.2-9.6) 중의 2.4 마이크로그램/mL 농도의 염소 항-마우스 IgG + IgM (H+L) 를 100 마이크로리터/웰로 ELISA 플레이트들에 첨가하여 하룻밤 두었다. 상기 플레이트들을 세척 완충액 (PBS + 0.05 % Tween) 중에서 3 회 세척하였다. 상기 플레이트에 100 마이크로리터/웰의 차단 완충액 (세척 완충액 중 5 % 우유) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 둔 후, 세척 완충액 중에서 3 회 세척하였다. 100 마이크로리터/웰의 하이브리도마 상청액을 첨가하고, 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 염소 항-마우스 IgG 또는 IgM 양고추냉이 과산화효소 접합체의 1/100,000 희석물 (5 % 우유를 함유한 PBS 중에 희석시킨 것) 을, 100 마이크로리터/웰로 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. TMB 용액 100 마이크로리터/웰을 실온에서 1-3 분간 인큐베이션하였다. 50 마이크로리터/웰의 2M H2SO4 를 첨가하여 색 반응을 종결시키고, 상기 플레이트를 Perkin-Elmer HTS7000 플레이트 판독기로 450 nm 에서 판독하였다. 도 1 에 나타난 바와 같이, AR27A807.14.1 하이브리도마는 주로 IgG 아이소타입의 항체들을 분비하였다.
상기 하이브리도마 세포에 의해 분비되는 항체의 하위부류를 결정하기 위해, Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC) 를 사용하여 아이소타입 결정 (isotyping) 실험을 수행하였다. 항체-포함 하이브리도마 상청액을 (TBS-T 로 1:10 희석하여), 상이한 유형의 펩티드 사슬들에 대해 특이적인 염소 항체를 지닌 아이소타입 결정 스트립 (isotyping strip) 이 담긴 시험관에 첨가하였다. 상기 시험관을 15 분간 진탕하였다. 그 후, 상기 스트립을 진탕하면서 TBS-T 로 5 분간 2 회 세척하였다. 상기 시험관에, 과산화효소-표지된, 종-특이적 항-마우스 항체를 (TBS-T 로 1:500 희석하여) 15 분간 첨가하여, 상기 막대 상에서 상기 염소 항체에 결합된 단일클론 항체를 검출하였다. 상기 스트립을 진탕하면서 TBS-T 로 5 분간 다시 2 회 세척하였다. 그 후, 상기 스트립에 결합된 상기 과산화효소-표지된 항체를 과산화효소 기질 시스템을 이용하여 검출하였다. 4-클로로-1-나프톨의 30 mg 정제 1 개를 10 mL 의 저온의 에탄올에 용해시키고, 과산화수소 용액 (30 % v/v) 1 방울을 50 mL TBS 중에 희석시켰다. 상기 두 용액을 사용 직전에 배합하고, 3 mL 를 상기 아이소타입 결정 스트립에 진탕하면서 15 분간 첨가하였다. 그 후, 상기 기질 용액을 버리고, 상기 스트립을 5 mL 증류수로 진탕하면서 3 회 세척하였다. 그 후, 상기 타입 결정 막대를 시험관에서 꺼내어 결과를 분석하였다. 상기 항-암 항체 AR27A807.14.1 은 IgG1, 카파 아이소타입이다.
하이브리도마 상청액을 2 회 한계 희석한 후에 이에 대해 세포 ELISA 검정법에서 표적 세포들에 결합한 항체들이 있는지 시험하였다. 하기 3 개의 인간 결장암 세포주 및 1 개의 인간 정상 피부 세포주를 시험하였다: 각각, HT-29, SW1116, Lovo 및 CCD-27sk. 모든 세포주들은 American Type Tissue Collection (ATCC; Manassas, VA) 로부터 입수하였다. 상기 플레이팅한 세포들을 사용전에 고정시켰다. 상기 플레이트들을 MgCl2 및 CaCl2 를 함유한 PBS 로 실온에서 3 회 세척하였다. PBS 에 희석한 2 % 파라포름알데히드 100 마이크로리터를 각 웰에 실온에서 10 분간 첨가한 후, 버렸다. 상기 플레이트들을 다시 MgCl2 및 CaCl2 를 함유한 PBS 로 실온에서 3 회 세척하였다. 세척 완충액 (PBS + 0.05 % Tween) 중의 5 % 우유 100 마이크로리터/웰로 실온에서 1 시간 동안 차단을 수행하였다. 상기 플레이트들을 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 하이브리도마 상청액을 75 마이크로리터/웰로 실온에서 1 시간 동안 첨가하였다. 상기 플레이트들을 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 양고추냉이 과산화효소에 결합시킨 염소 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체의 1/25,000 희석물 (5 % 우유를 함유한 PBS 중에 희석시킴) 을 100 마이크로리터/웰로 첨가하였다. 실온에서 1 시간 인큐베이션 후, 플레이트들을 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 100 마이크로리터/웰의 TMB 기질을 실온에서 1-3 분간 인큐베이션하였다. 상기 반응을 50 마이크로리터/웰의 2M H2SO4 로 종결시키고, 플레이트를 Perkin-Elmer HTS7000 플레이트 판독기로 450 nm 에서 판독하였다. 도 1 에 표로 나타나 있는 결과는 이전에 상기 시험된 세포 주들에 결합하지 않는 것으로 나타난 자체 제조 (in-house) IgG 아이소타입 대조군과 비교하여 바탕값 (background) 에 대한 배수로 표현되었다. 하이브리도마 AR27A807.14 로부터의 항체들은 시험된 세포주들에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않았다.
항체 결합에 대한 시험과 함께, 상기 하이브리도마 상청액들의 세포독성 효과 (항체 유도성 세포독성) 를 하기 세포주들에서 시험하였다: HT-29, SW1116, Lovo 및 CCD-27sk. 칼세인 (Calcein) AM 은 Molecular Probes (Eugene, OR) 로부터 입수하였고, 검정은 하기 개요한 바와 같이 수행하였다. 세포를 상기 검정 전에 미리 결정한 적절한 밀도로 플레이팅하였다. 2 일 후에, 상기 하이브리도마 마이크로타이터 플레이트로부터의 상청액 75 마이크로리터를 상기 세포 플레이트들에 옮기고, 5 % CO2 인큐베이터에서 5 일간 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로 이용된 웰들을 비워질 때까지 흡인하고, 배양 배지 중에 용해시킨 소듐 아지드 (NaN3, 0.01 %, Sigma, Oakville, ON), 시클로헥시미드 (CHX, 0.5 마이크로몰, Sigma, Oakville, ON) 또는 항-EGFR 항체 (c225, IgG1, 카파, 5 마이크로그램/mL, Cedarlane, Hornby, ON) 100 마이크로리터를 첨가하였다. 처리 5 일 후, 상기 플레이트들을 그 후 뒤집어 흡취지로 건조 (blotting dry) 하여 비웠다. MgCl2 및 CaCl2 가 함유된 실온의 DPBS (Dulbecco 인산 완충 식염수) 를 다채널 스퀴즈 병 (squeeze bottle) 으로부터 각 웰에 분배하고, 가볍게 3 회 두드리고, 뒤집어 비운 후, 흡취지로 건조시켰다. MgCl2 및 CaCl2 가 함유된 DPBS 중에 희석 시킨 형광 칼세인 염료 50 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고, 5 % CO2 인큐베이터 내에서 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 상기 플레이트들을 Perkin-Elmer HTS7000 형광 플레이트 판독기에서 판독하고, 데이터를 마이크로소프트 엑셀로 분석하였다. 결과는 도 1 에 표로 나타나 있다. AR27A807.14.1 하이브리도마로부터의 상청액은 HT-29 세포에 대해서는 39 %, SW1116 세포에 대해서는 29 % 및 Lovo 세포에 대해서는 20 % 의 특이적 세포독성을 일으켰다. 이는, HT-29 에 있어서는 양성 대조군들인 소듐 아지드 및 시클로헥시미드 각각을 이용하여 수득한 세포독성의 63 및 75 %; SW1116 에 있어서는 시클로헥시미드 및 c225 의 세포독성의 각각 67 및 112 %, 및 마찬가지로, Lovo 에 있어서는 시클로헥시미드의 세포독성의 54 % 이었다. 정상 피부 세포주 CCD-27sk 에 대한 세포독성은 관찰할 수 없었다. 공지된 비(非)-특이적 세포독성제들인 시클로헥시미드 및 NaN3 은 전반적으로 예상된 세포독성을 일으켰다. 항-EGFR 항체 c225 는 SW1116 에 대해 예상된 세포독성을 일으켰다.
도 1 로부터의 결과는 상이한 세포주들에 대한 AR27A807.14.1 의 세포독성 효과가 결합 수준에 상관되지 않았다는 것을 나타낸다. 이들 조건 하에서 상기 3 가지 결장 세포주들에 대한 검출가능한 결합은 없었지만, 세포독성은 검출가능한 수준으로 존재하였다. AR27A807.14.1 은 CCD-27sk 정상 피부 세포주에서 세포독성을 일으키지도, 그에 결합하지도 않았다. 따라서 상기 항체는 기능적 특이성을 나타내었는데, 이는 결합의 정도에 반드시 관련된 것은 아니었다.
실시예 2
시험관내 결합
상기 하이브리도마를 주 2 회 수집 및 재파종 (reseeding) 하면서 CL-1000 플라스크 (BD Biosciences, Oakville, ON) 내에서 배양하여 AR27A807.14.1 단일클론 항체를 제조하였다. Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC) 를 이용한 표준 항체 정제 절차를 수행하였다. 인간화, 탈-면역화, 키메라화 또는 쥣과인 단일클론 항체들을 이용하는 것은 본 발명의 범위에 속한다.
유방 (MDA-MB-231 및 MCF-7), 결장 (HT-29, Lovo, DLD-1, SW620 및 SW1116), 전립선 (PC-3), 췌장 (BxPC-3) 및 난소 (OVCAR-3) 암, 및 비(非)-암 세포주들로서 피부 (CCD-27sk) 및 폐 (Hs888.Lu) 로부터의 것들에 대한 AR27A807.14.1 의 결합을 세포 ELISA 로 검정하였다. 모든 세포주들은 American Type Tissue Collection (ATCC; Manassas, VA) 으로부터 입수하였다. 하이브리도마 상청액 대신 20 마이크로그램/mL 농도의 정제된 항체를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1 에 개요된 바와 동일한 절차를 이용하였다.
도 2 에 표로 나타나 있는 결과는 이전에 상기 시험된 세포주들에 대해 결합하지 않는 것으로 나타난 자체 제조 IgG 아이소타입 대조군과 비교하여 바탕값에 대한 배수로 표현되었다. AR27A807.14 는 결장암 세포주 HT-29 에 대해 가장 강한 결합 (6.1 배) 을 나타내었고, 난소암 세포주 OVCAR-3 (1.8 배) 및 정상 폐 세포주 Hs888.Lu (1.8 배) 에 대해서는 보다 낮은 수준의 결합을 보였다. 이러 한 조건 하에서, Lovo 또는 SW1116 결장암 세포주 또는 정상 피부 세포주 CCD-27sk 에 대해서는 결합이 관찰되지 않았다. 실시예 1 및 2 로부터, Lovo 및 SW1116 결장암 세포주들에 대한 AR27A807.14.1 의 결합이 세포 ELISA 를 이용해서는 검출불가능하다는 것이 명백하다. 그럼에도 불구하고, 상기 항체는 이들 세포주들에서 세포독성 효과를 유도할 수 있었다. 상기 효과는 하기 요인에 기인한 것일 수 있다. Lovo/ SW1116 결장암 세포주가 이러한 조건 하에서 상기 방법에 의한 검출의 역가 미만의 수준으로 항원 표적을 발현하나, 그러한 낮은 수준의 발현이 종양 성장 지연을 초래하는 사건을 일으키기에 충분하다는 가능성이 있다. Lovo 및 SW1116 결장암 모델에서 상기 항체의 세포독성 효과는 결합에 기초하여서는 예측될 수 없었던 비(非)-자명한 발견이다. 실시예 1 에서, 결장 세포주 HT-29 에 대한 AR27A807.14.1 결합이 세포 ELISA 에 의해 검출되지 않은 반면, 실시예 2 에서는 분명한 결합이 존재하였는데; 이는 후자가 정제된 형태로 시험된 것에 비해 상기 상청액 중의 더 낮은 항체 농도 때문일 수 있다.
실시예 3
DLD-1 세포를 이용한 생체내 종양 실험
실시예 1 에서, AR27A807.14.1 이 여러 결장암 세포주들에 대해 항-암 특성을 가진다는 것이 증명되었다. 도 3 및 4 와 관련하여, 4 내지 6 주령의 암컷 SCID 마우스들에 100 마이크로리터 식염수 중의 5 백만 개의 인간 결장암 세포 (DLD-1) 를 목덜미에 피하로 주사하여 주입하였다. 상기 마우스들을 임의대로 5 마리씩의 2 개 처리군으로 나누었다. 주입 당일에, 20 mg/kg 의 AR27A807.14.1 시험 항체 또는 완충액 대조군의 저장 농축물 (stock concentration) 을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4 를 함유한 희석제를 이용하여 희석한 후 이를 각 코호트에 300 마이크로리터 부피로 복강내 투여하였다. 그 후 연구 기간 동안 상기 항체 및 대조군 시료들을 동일한 방식으로 주 1 회 투여하였다. 대략 7 일마다 캘리퍼스 (calipers) 로 종양 성장을 측정하였다. 당해 연구는 항체 6 회 주사 후 완료되었다. 연구 기간 동안 주 1 회 동물들의 체중을 기록하였다. 상기 연구의 말미에 모든 동물들을 CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR27A807.14.1 은 인간 결장암의 고도 공격성 DLD-1 생체내 예방적 모델에서 종양 성장을 감소시켰다. 도 3 은 항체 AR27A807.14.1 로 처리된 마우스들의 종양 용적을, 완충액 처리군과 비교한 결과를 제시한다. 당해 연구의 말미에, 제 37 일에, AR27A807.14.1 은 완충액 처리 대조군과 비교하여 종양 성장을 65 % (p=0.0039) 로 저해하였다. 실시예 2 로부터, DLD-1 세포주에 대한 AR27A807.14.1 의 결합이 세포 ELISA 를 이용해서는 검출불가하다는 것이 명백하다. 그럼에도 불구하고, 상기 항체는 DLD-1 이종이식 모델에서 종양 성장을 감소시킬 수 있었다. 상기 DLD-1 세포주는 이러한 조건 하에서 세포 ELISA 에 의한 검출의 역가 미만의 수준으로 항원 표적을 발현하나, 그러한 낮은 수준의 발현이 종양 성장 지연을 초래하는 사건을 일으키기에 충분하다는 가능성이 있다. 또한, DLD-1 세포들이 보다 생리학적인 생체내 환경에 놓일 때 항원 발현이 유도된 다는 가능성도 있다. 어느 경우에서도, DLD-1 결장암 모델에서 상기 항체의 효능은 결합을 기초로는 예측될 수 없었던 비(非)-자명한 발견이다.
본 연구 전체에 걸쳐 임상적인 독성 징후는 없었다. 1주일 간격으로 측정한 체중은 건강함 및 성장 실패에 대한 대리지표였다. 도 4 에 나타난 바와 같이, 제 37 일에 대조군 (p=0.0033) 및 AR27A807.14.1 처리군 (p=0.0421) 모두의 평균 체중에 있어 유의미한 감소가 있었다. 그러나, 당해 연구의 말미에 상기 대조군과 항체 처리군 간에 체중의 유의미한 차이는 없었다.
요컨대, AR27A807.14.1 은 당해 인간 결장암 이종이식 모델에서 만족스럽게 용인되었고, 종양 적하를 감소시켰다.
실시예 4
경쟁적 결합자들의 분리
항체가 주어지면, 당업계의 통상의 지식을 가진 자는 경쟁적으로 저해하는 CDMAB, 예를 들어 경쟁 항체를 생성할 수 있는데, 이는 동일한 항원결정기를 인식하는 항체이다(Belanger L 등, Clinica Chimica Acta 48:15-18 (1973)). 한 가지 방법은 상기 항체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 면역원으로 면역화하는 것을 수반한다. 시료에는, 하기에 제한되는 것은 아니나, 조직, 분리된 단백질(들) 또는 세포주(들)가 포함될 수 있다. 결과적으로 생성된 하이브리도마는 경쟁 분석법을 사용하여 스크리닝할 수 있는데, 이는 시험 항체의 결합을 저해하는 항체들을 규명하는 것으로, 예컨대 ELISA, FACS 또는 웨스턴 블랏팅이 있다. 또 다른 방법으로는, 파지 디스플레이 항체 라이브러리들 및 상기 항원의 적어도 하나의 항원결정기를 인식하는 항체들에 대한 패닝 (panning) 을 이용할 수 있다(Rubinstein JL 등 Anal Biochem 314:294-300 (2003)). 두 경우 모두에서, 항체들은 그의 표적 항원의 적어도 하나의 항원결정기에 대한 본래의 표지된 항체의 결합을 대체하는 능력에 기초하여 선택된다. 이러한 항체들은 따라서 본래의 항체처럼 상기 항원의 적어도 하나의 항원결정기를 인식하는 특성을 지닐 것이다 .
실시예 5
AR27A807.14.1 단일클론 항체의 가변 영역의 클로닝
AR27A807.14.1 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단일클론 항체의 중쇄 (V.H) 및 경쇄 (V.L) 로부터의 가변 영역의 서열들을 결정할 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 RNA 는, 구아니디늄 이소티오시아네이트를 이용한 세포 용해를 수반하는 표준 방법을 사용하여 대상 하이브리도마로부터 추출할 수 있다(Chirgwin 등 Biochem. 18:5294-5299 (1979)). 상기 mRNA 를, 당업계에 공지된 PCR 방법론에 의해 후속적인 V.H 및 V.L 유전자의 분리를 위한 cDNA 를 제조하는데 사용할 수 있다(Sambrook 등, eds., Molecular Cloning, Chapter 14, Cold Spring Harbor laboratories Press, N. Y. (1989)). 상기 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열은 자동화 Edman 서열분석으로 독립적으로 결정될 수 있다. CDR 및 플랭킹 (flanking) FR 들에 대한 추가적인 서열들은 V.H 및 V.L 절편들에 대한 아미노산 서열분석으로 결정할 수 있다. 그 후 AR27A807.14.1 단일클론 항체로부터의 V.H 및 V.L 유전자들의 분리를 위해 합성 프라이머들을 설계할 수 있 고, 분리된 유전자를 적절한 서열분석용 벡터 내로 결찰할 수 있다. 키메라 및 인간화 IgG 를 생성하기 위해서, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인들을 적절한 발현용 벡터 내로 서브클로닝할 수 있다.
(i) 단일클론 항체
단일클론 항체 (실시예 1 에 개요된 바와 같은 것) 를 인코딩하는 DNA 는 통상의 절차를 이용하여 (예컨대, 단일클론 항체들의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자들에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침자를 사용함으로써) 용이하게 분리 및 서열분석된다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 에 대한 바람직한 공급원으로 소용된다. 상기 DNA 가 분리되면, 이를 발현 벡터 내에 위치시킬 수 있는데, 상기 벡터를 그 후, 다른 경우에는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 대장균 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 트랜스펙션하여, 재조합 숙주 세포에서의 단일클론 항체들의 합성을 달성한다. 또한, 예를 들어, 상동 쥣과 서열들을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인들에 대한 코딩 서열들로 대체함으로써, 상기 DNA 를 변형시킬 수 있다. 키메라 또는 하이브리드 항체들 또한, 가교제를 수반한 것들을 비롯한 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법들을 사용하여, 시험관내 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적당한 시약의 예로서는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티리미데이트가 있다.
(ii) 인간화 항체
인간화 항체는 비(非)-인간 원천으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비(非)-인간 아미노산 잔기들은 종종 "이입(import)" 잔기로 지칭되는데, 이들은 전형적으로 "이입" 가변 도메인에서 취해진다. 인간화는 인간 항체의 CDR 또는 CDR 서열을 대응하는 설치류 서열들로 대체함에 의한 Winter 및 동료들의 방법으로 수행될 수 있다(Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science 239:1534-1536 (1988); Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000) 에서 개관됨).
인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용한 모 서열 및 다양한 개념상의 인간화 생성물에 대한 분석 방법에 의해 제조가능하다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하고, 당업자들에 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열들의 가능한 3차원적 형태 구조를 도시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램들이 이용가능하다. 이러한 나타낸 것들을 검토함으로써, 후보 면역글로불린 서열의 작용에 있어서 상기 잔기들의 가능한 역할에 대한 분석, 즉 상기 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기들에 대한 분석이 가능하게 된다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록, 공통 및 이입 서열로부터 FR 잔기들을 선택 및 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기들은 항원 결합에 영향을 끼침에 있어 직접적으로 및 가장 실질적으로 연루되어 있다.
(iii) 항체 절편
항체 절편의 제조를 위한 다양한 기법들이 개발되었다. 이들 절편들은 재조합 숙주 세포에 의해 생성가능하다(Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999) 에서 개관됨; Little 등, Immunol. Today 21:364-370 (2000)). 예를 들어, Fab'-SH 절편들을 대장균에서 직접 회수하여 화학적으로 커플링하여 F(ab')2 절편을 형성시킬 수 있다(Carter 등, Biotechnology 10:163-167 (1992)). 또 다른 구현예에서는, F(ab')2 를, F(ab')2 분자의 조립을 촉진하는 류신 지퍼 (zipper) GCN4 를 사용하여 형성한다. 또 다른 접근법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 절편들을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리할 수 있다.
실시예 6
본 발명의 항체를 함유하는 조성물
본 발명의 항체를 암 방지/치료를 위한 조성물로 사용할 수 있다. 본 발명의 항체를 함유하는, 암 방지/치료를 위한 조성물은 저독성이며, 그대로 액체 제제의 형태로, 또는 적당한 제제들의 약학 조성물로서 인간 또는 포유동물 (예컨대, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 경구적으로 또는 비경구적으로 (예컨대, 혈관내로, 복강내로, 피하로 등) 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 그 자체로 투여될 수도 있고, 또는 적절한 조성물로서 투여될 수도 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 염을 지닌 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수도 있다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 약학 제제의 형태로 제공된다.
비경구 투여를 위한 조성물의 예는 주사제, 좌제 등이다. 주사제로서는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입, 관절내 주사 등과 같은 투여 형태를 들 수 있다. 이들 주사제는 공지의 방법들로 제조할 수 있다. 예를 들어, 주사제는, 본 발명의 항체 또는 이의 염을 주사에 통상 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질 중에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 제조할 수 있다. 주사를 위한 수성 매질로서는, 예를 들어, 생리 식염수, 포도당 및 기타 보조제들 등을 함유한 등장액이 있는데, 이들을 알콜 (예컨대, 에탄올), 다가알콜 (예컨대, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온 계면활성제 [예컨대, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (경화 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가생성물)] 등과 같은 적절한 가용화제와 조합하여 사용할 수 있다. 유성 매질로서는, 예컨대, 참깨유, 대두유 등이 이용되는데, 이들을 벤질 벤조에이트, 벤질 알콜 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용할 수 있다. 이렇게 제조된 주사제는 보통 적절한 앰풀에 채워진다. 직장 투여에 사용되는 좌제는 본 발명의 항체 또는 이의 염을 통상의 좌제 기제와 블렌딩하여 제조할 수 있다. 경구 투여용 조성물에는, 고체 또는 액체 제제가 포함되는데, 구체적으로, 정제 (당의정 (dragee) 및 필름코팅정 포함), 환제, 과립, 분말제, 캡슐 (연질 캡슐 포함), 시럽, 에멀젼, 현탁제 등이 있다. 이러한 조성물은 공지의 방법들로 제조되며, 약학 제제 분야에서 통상 사용되는 비히클 (vehicle), 희석제 또는 부형제를 함유할 수도 있다. 정제를 위한 비히클 또는 부형제의 예는 락토오스, 전분, 수크로오스, 마그네슘 스테아레이트 등이다.
유리하게는, 상기 기술한 경구 또는 비경구 용도를 위한 조성물은 상기 활성 성분들의 용량에 맞도록 적합하게 된 단위 용량을 가진 약학 제제로 제조된다. 이러한 단위 용량 제제들에는, 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐, 주사제 (앰풀), 좌제 등이 포함된다. 상기한 화합물의 함유량은 일반적으로 투여 단위 형태당 5 내지 500 mg 이며; 상기 기술한 항체는 특별히 주사 형태에서는 약 5 내지 약 100 mg, 및 기타 형태에서는 10 내지 250 mg 으로 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체를 포함하는 상기한 예방/치료제 또는 조절자의 용량은 투여되는 대상, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 예컨대, 성인에서 유방암을 치료/방지하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 20 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 10 mg 및 더욱 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 5 mg 의 용량으로, 1 일 약 1 내지 5 회, 바람직하게는 1 일 약 1 내지 3 회 정맥내로 투여하는 것이 유리하다. 기타 비경구 및 경구 투여에서는, 상기 제제를 상기 제시한 용량에 상응하는 용량으로 투여할 수 있다. 상태가 특별히 심한 경우에는, 해당 상태에 따라 상기 용량을 증가시킬 수도 있다.
본 발명의 항체는 그대로 또는 적절한 조성물의 형태로 투여할 수 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 상기한 항체 또는 그의 염을 지닌 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여 (예컨대, 혈관내 주사, 피하 주사 등) 에 적당한 약학 제제의 형태로 제공된다. 상기 기술한 각 조성물은 기타의 활성 성분들을 추가로 함유할 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체를 다른 약물들, 예를 들어, 알킬화제 (예컨 대, 시클로포스파미드, 이포스파미드 등), 대사 길항제 (예컨대, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 등), 항종양 항생제 (예컨대, 미토마이신, 아드리아마이신 등), 식물 유래 항종양제 (예컨대, 빈크리스틴, 빈데신, 택솔 (Taxol) 등), 시스플라틴, 카르보플라틴, 에토포시드, 이리노테칸 등과 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 및 상기 기술한 약물들은 환자에 동시에 또는 시차를 두고 투여할 수 있다.
우세한 증거들이, AR27A807.14.1 이 암 세포주 상에 존재하는 항원결정기의 결찰을 통해 항-암 효과를 매개한다는 것을 보여준다. 나아가 AR27A807.14.1 항체가, 이에 제한되는 것은 아니나 FACS, 세포 ELISA 또는 IHC 로 예시되는 기법들을 이용하여 상기 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원결정기를 발현하는 세포를 검출하는데 있어 사용될 수 있는 것을 밝힐 수 있었다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속한 업계의 숙련된 자들의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개물은, 각 개별 공개물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지적되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 형태가 설명되지만, 본 발명을 본원에 기술된 및 나타낸 부분들의 특정 형태 또는 배열로 제한시키고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 가해질 수 있으며, 본 발명이 본 명세서에 나타내고 기술된 것에 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다는 것은 당업자들에 자명할 것이다.
당업자는 본 발명이 상기 목표들을 수행하고 언급된 목적 및 이점, 뿐만 아니라 그에 내재된 목적 및 이점들을 달성하기에 충분히 적합하게 되어있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 절차 및 기법들은 현재 바람직한 구현예들을 대표하며, 예시적인 것으로 의도된 것이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것들로 의도한 것이 아니다. 본 발명의 취지에 포함되며 첨부된 청구항들의 범위로 정의되는 상기에서의 변경 및 기타 용도가 당업자들에게 떠오를 것이다. 본 발명을 특정 바람직한 구현예들과 관련하여 기술하였지만, 청구된 본 발명이 이러한 특정 구현예들에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하여야 한다. 사실상, 기술된 본 발명의 수행 양식들에 대한, 당업자들에 자명한 다양한 변형은 하기 청구항들의 범위 내에 속하는 것으로 하고자 한다.

Claims (47)

  1. IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체.
  2. IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체의 인간화 항체 또는 상기 인간화 항체로부터 생성된 항원 결합 절편.
  3. IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체의 키메라 항체 또는 상기 키메라 항체로부터 생성된 항원 결합 절편.
  4. IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 분리된 하이브리도마 세포주.
  5. 하기를 포함하는, 인간 종양으로부터 선택된 조직 시료 내 암 세포들의 항체 유도성 세포독성을 개시하는 방법:
    상기 인간 종양으로부터 조직 시료를 제공하는 단계;
    IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체, 상기 IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체의 인간화 항체, 상기 IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체의 키메라 항체 또는, 이들의 CDMAB 로서 상기 분리된 단일클론 항체의 그의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력을 특징으로 하는 CDMAB 를 제공하는 단계; 및
    상기 분리된 단일클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이들의 CDMAB 를 상기 조직 시료에 접촉시키는 단계;
    이 때, 상기 분리된 단일클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이들의 CDMAB 가 상기 조직 시료에 결합함에 의해 세포독성이 유도됨.
  6. 제 1 항의 분리된 단일클론 항체의 CDMAB.
  7. 제 2 항의 인간화 항체의 CDMAB.
  8. 제 3 항의 키메라 항체의 CDMAB.
  9. 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물, 및 혈행성 세포로 이루어진 군에서 선택되는 구성원과 결합된, 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항의 분리된 항체 또는 이의 CDMAB.
  10. 포유동물에서 항체 유도성 세포독성에 취약한 인간 종양을 치료하는 방법으 로서, 이 때 상기 인간 종양은 IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체 또는, 이의 CDMAB 로서 상기 분리된 단일클론 항체의 그의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력을 특징으로 하는 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 적어도 하나의 항원결정기를 발현하는 것이고, 상기 방법은 상기 단일클론 항체 또는 상기 이의 CDMAB 를 상기 포유동물의 종양 적하를 감소시키기에 유효한 양으로 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 결합된 것인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화하는 것인 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 것인 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 인간화된 것인 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 키메라화된 것인 방법.
  17. IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체와 동일한 항원결정기 또는 항원결정기들에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체.
  18. 포유동물에서 인간 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 인간 종양은 IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체 또는, 이의 CDMAB 로서 상기 분리된 단일클론 항체의 그의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력을 특징으로 하는 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 적어도 하나의 항원결정기를 발현하는 것이고, 상기 방법은 상기 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 를 상기 포유동물의 종양 적하를 감소시키기에 유효한 양으로 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 결합된 것인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화하는 것인 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 것인 방법.
  23. 제 18 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 인간화된 것인 방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 키메라화된 것인 방법.
  25. 포유동물에서 인간 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 인간 종양은 IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체 또는, 이의 CDMAB 로서 상기 분리된 단일클론 항체의 그의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력을 특징으로 하는 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 적어도 하나의 항원결정기를 발현하는 것이고, 상기 방법은 상기 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 를 적어도 하나의 화학요법제와 병용하여 상기 포유동물의 종양 적하를 감소시키기에 유효한 양으로 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 결합된 것인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화하는 것인 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 것인 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 인간화된 것인 방법.
  31. 제 25 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 키메라화된 것인 방법.
  32. IDAC 등록번호가 180706-03 인 하이브리도마 세포주 AR27A807.14.1 에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체, IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체의 인간화 항체 또는 IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체의 키메라 항체에 의해 특이적으로 결합되는 인간 종양으로부터 선택된 조직 시료에서 암 세포의 존재를 측정하는 결합 검정법으로서, 하기 단계들을 포함하는 검정법:
    상기 인간 종양으로부터 조직 시료를 제공하는 단계;
    상기 분리된 단일클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는, IDAC 등록번호가 180706-03 인 하이브리도마 세포주 AR27A807.14.1 에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체에 의해 인식되는 것들과 동일한 항원결정기 또는 항원결정기들을 인식하는 이들의 CDMAB 중 적어도 하나를 제공하는 단계;
    적어도 하나의 상기 제공된 항체들 또는 이들의 CDMAB 를 상기 조직 시료에 접촉시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 제공된 항체 또는 이들의 CDMAB 의 상기 조직 시료에의 결합을 측정하는 단계;
    이로써 상기 조직 시료에서의 상기 암 세포의 존재가 지시됨.
  33. 인간 종양 적하의 감소를 위한 단일클론 항체의 용도로서, 이 때 상기 인간 종양은 IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 로서 상기 분리된 단일클론 항체의 그의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력을 특징으로 하는 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 적어도 하나의 항원결정기를 발현하는 것이고, 상기 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 를 상기 포유동물의 인간 종양 적하를 감소시키기에 유효한 양으로 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 용도.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 결합된 것인 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화하는 것인 방법.
  37. 제 33 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 것인 방법.
  38. 제 33 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 인간화된 것인 방법.
  39. 제 33 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 키메라화된 것인 방법.
  40. 인간 종양 적하의 감소를 위한 단일클론 항체의 용도로서, 이 때 상기 인간 종양은 IDAC 에 등록번호 180706-03 으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 로서 상기 분리된 단일클론 항체의 그의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력을 특징으로 하는 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 적어도 하나의 항원결정기를 발현하는 것이고, 상기 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 를 적어도 하나의 화학요법제와 병용하여 상기 포유동물의 인 간 종양 적하를 감소시키기에 유효한 양으로 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 용도.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 결합된 것인 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화하는 것인 방법.
  44. 제 40 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 것인 방법.
  45. 제 40 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 인간화된 것인 방법.
  46. 제 40 항에 있어서, 상기 분리된 단일클론 항체가 키메라화된 것인 방법.
  47. 하기를 조합하여 포함하는, 인간 암성 종양의 치료에 유효한 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항 또는 제 17 항 중 어느 한 항의 항체 또는 CDMAB;
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 절편과, 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물 및 혈행성 세포로 이루어진 군에서 선택되는 구성원과의 접합체; 및
    필요량의 약학적으로 허용가능한 담체;
    이 때 상기 조성물은 상기 인간 암성 종양을 치료하는데 유효함.
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