KR20100002275A - 암 질환 조절 항체 - Google Patents

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수잔 이 한
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Abstract

본 발명은 신규 스크리닝 패러다임을 사용하는 암 질환 조절 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 결과변수로서 암세포 세포독성을 사용하는 항암 항체를 분리함으로써, 본 방법은 치료 및 진단 목적을 위한 항암 항체의 제조를 가능하게 한다. 항체는 암의 병기화 및 진단을 돕는데 사용될 수 있고, 1 차 종양 및 종양 전이를 치료하는데 사용될 수 있다. 항암 항체는 독소, 효소, 방사능 화합물, 및 조혈 세포에 공액될 수 있다.

Description

암 질환 조절 항체 {CANCEROUS DISEASE MODIFYING ANTIBODIES}
공동 연구 계약 선언
본원의 청구의 범위에 정의된 바와 같은 본 발명은 계약 범주 내에서 수행된 활동의 결과로서, 아리우스 리서치 인크. [Arius Research Inc.] 와 (주)다케다 제약 [Takeda Pharmaceutical Company Limited] 사이의 공동 연구 계약 [Joint Research Agreement ("Agreement")] 의 서명에 의해 이루어졌다. 상기 계약은 본 발명일 이전에 효력이 있었다.
본 발명은 암 질환 조절 항체 (CDMAB) 의 단리 및 제조 및, 치료 및 진단 방법에서의, 임의로 하나 이상의 화학요법제와 조합으로의 상기 CDMAB 의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 CDMAB 를 이용하는 결합 검정법에 관한 것이다.
암 요법으로서의 단일클론 항체: 암 환자 각 개인은 독특하고, 사람의 독자성만큼 그 밖의 암들과 상이한 암을 가진다. 이런 점에도 불구하고, 현행 요법은 모든 동일한 유형의 암 환자를 동일한 단계에서, 동일한 방식으로 치료한다. 이러한 환자의 30% 이상이 1 차 요법에서 실패할 것이고, 그러면 추가 치료 단계 가 발생하며, 치료 실패, 전이, 및 궁극적으로 사망 가능성을 높인다. 치료에 대한 우세한 접근법은 특정 개인에 대한 요법의 맞춤화 (customization) 일 것이다. 맞춤화를 제공하는 현재의 유일한 요법은 수술이다. 화학요법 및 방사능 치료는 환자에게 맞출 수 없고, 수술 그 자체는 대부분의 경우 치유에 부적당하다.
단일클론 항체의 출현으로, 각 항체가 단일 에피토프에 대한 것일 수 있으므로, 맞춤 요법을 위한 방법의 개발 가능성이 더욱 실현가능해지고 있다. 게다가, 특정 개인의 종양을 독특하게 정의하는 에피토프 무리에 대한 항체의 조합을 생성하는 것이 가능하다.
암세포와 정상 세포 사이의 유의한 차이가 암세포는 변형된 세포에 특이적인 항원를 함유하고 있다는 것을 인지하면서, 과학계는 단일클론 항체가 이러한 암 항원에 특이적으로 결합하여 변형된 세포를 특이적으로 표적하도록 고안될 수 있을 것이라고 오랫동안 고대해 왔고; 그러므로 단일클론 항체가 암세포를 제거하기 위한 "마법 탄환" 으로서의 역할을 할 수 있을 것이라는 믿음을 불러일으켰다. 그러나, 이제 단독의 단일클론 항체가 암의 모든 경우를 담당할 수 있는 없으며, 단일클론 항체가 표적 암 치료로서 계열로서 개발될 수 있다는 것이 널리 인지되고 있다. 바로 설명되는 발명의 기술에 따라 단리된 단일클론 항체는 예를 들어 종양 하중을 감소시켜, 환자에게 이익이 되는 방식으로 암 질환 과정을 변형하는 것으로 제시되고 있으며, 본원에서 암 질환 조절 항체 (CDMAB) 또는 "항암" 항체로서 다양하게 언급될 것이다.
현재, 암 환자는 통상 치료 옵션이 몇 가지 없다. 암 요법에 대한 조직화된 접근법은 전체적인 생존률 및 사망률의 개선을 가져왔다. 그러나, 특정 개인에 대해, 상기 개선된 통계가 개인적인 상황의 개선과 반드시 연관되지는 않는다.
그러므로, 담당의로 하여금 동일한 코호트에서 다른 환자와 독립적으로 각 종양을 치료할 수 있게 하는 방법론이 제시된다면, 이것은 바로 한 명의 개인에 대한 맞춤 요법의 독특한 접근법을 가능하게 할 것이다. 이러한 과정의 요법은, 이상적으로는 치유 속도를 향상시키고, 더욱 양호한 결과를 산출하여, 오랜 기간의 필요성을 충족시킬 것이다.
역사적으로는, 폴리클론 항체의 사용은 인간 암 치료에서 제한적으로 성공하며 사용되어 왔다. 림프종 및 백혈병은 인간 혈장으로 치료되어 왔으나, 장기적인 완화 또는 반응이 거의 없었다. 게다가, 재현성이 결핍되고, 화학요법과 비교하여 부가적인 이점이 없었다. 유방암, 흑색종 및 신장 세포 암종과 같은 고형 종양은 또한 상응하게 예측 불가능하고 무능한 결과를 가지고 인간 혈액, 침팬치 혈청, 인간 혈장 및 말 혈청으로 처리하였다.
고형 종양에 대한 단일클론 항체의 많은 임상 시험이 이루어졌다. 1980 년대, 특이적 항원에 대한 항체를 사용하여 또는 조직 선택성에 근거하여 47 명 이상의 환자로부터 하나의 반응자만을 생성하는 인간 유방암에 대한 4 가지 이상의 임상 시험이 있었다. CISPLATIN 과 조합하여 인간화 항-Her2/neu 항체 (Herceptin®) 를 사용하는 성공적인 임상 시험이 있었던 것은 1998 년이었다. 상기 시험에서, 37 명의 환자에게 약 ¼ 이 부분적인 반응 속도를 갖는, 그리고 부가적인 ¼ 이 미약하거나 안정적인 질환 진행을 갖는 반응으로 평가되었다. 반응자 중에서 진행까지의 시간 중앙값은 8.4 개월로, 반응 기간 중앙값은 5.3 개월이었다.
Herceptin® 은 Taxol® 과 조합으로 일선 (first-line) 사용을 위해 1998 년에 승인되었다. 임상 시험 결과는 Taxol® 을 단독으로 받은 그룹 (3.0 개월) 과 비교하여, 항체 요법과 Taxol® 을 받은 그룹 (6.9 개월) 에 대한 진행까지의 시간 중앙값의 증가를 나타내었다. 또한 Herceptin® 과 Taxol® 처리군 대 Taxol® 단독 처리군에 있어 22 개월 대 18 개월로, 생존 중앙값이 약간 증가하였다. 게다가, Taxol® 단독에 비해 항체와 Taxol® 조합 그룹에서 완전한 반응자 (8% 대 2%) 및 부분적인 반응자 (34% 대 15%) 모두의 수가 증가하였다. 그러나, Herceptin® 및 Taxol® 로의 처리는 Taxol® 단독 처리보다 높은 심장독성 빈도 (13 대 1 퍼센트 각각) 를 야기한다. 또한, Herceptin® 요법은 생물학적으로 중요한 리간드나 현재 공지된 기능이 없는 수용체인 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (Her2/neu) 가 과발현된 (면역조직화학 (IHC) 분석을 통해 측정됨) 환자 (전이성 유방암이 있는 대략 25% 의 환자) 에 대해서만 효과가 있었다. 그러므로, 여전 히 유방암 환자에 있어서 많은 미충족된 요구가 있다. 심지어 Herceptin® 치료에 의해 이득을 볼 수 있는 환자도 여전히 화학요법을 필요로 할 것이고, 따라서 이러한 종류의 치료의 부작용을, 적어도 어느 정도까지 겪어야만 할 것이다.
결장직장암을 조사하는 임상 시험에는 당단백질 및 당지질 표적 모두에 대한 항체가 포함된다. 선암에 일부 특이성을 갖는 17-1A 와 같은 항체는 60 명 초과의 환자에서 제 2 상 임상 시험을 수행하였을 때, 오직 1 명의 환자만이 부분 반응을 보였다. 다른 시험에서, 17-1A 의 사용은 부가적인 시클로포스파미드를 사용하는 프로토콜로 52 명의 환자 중에서 오직 1 명의 완전 반응 및 2 명의 미약 반응을 나타냈다. 지금까지, 17-1A 의 제 3 상 임상 시험은 3 기 결장암에 대한 보조제 요법으로 개선된 효능을 나타내지 않았다. 화상 진찰을 위해 처음으로 승인된 인간화 쥣과 단일클론 항체의 사용은 또한 종양 쇠퇴를 가져오지 않았다.
오직 최근에 단일클론 항체를 사용하는 결장직장암 임상 시험으로부터 임의의 긍정적인 결과를 산출하였다. 2004 년에, ERBITUX® 가 이리노테칸에 근거한 화학요법에도 난치성인 EGFR-발현 전이성 결장직장암 환자의 차선 (second line) 치료를 위해 승인되었다. 2 개 군 제 2 상 임상 시험 및 단일군 연구 모두에서의 결과는 이리노테칸과 조합으로의 ERBITUX® 가 각각 4.1 내지 6.5 개월의 질환 진행까지의 시간 중앙값으로 각각 23% 내지 15% 의 반응 속도를 갖는다는 것을 보 여주었다. 2 개 군 제 2 상 임상 시험 및 또다른 단일군 연구 결과는 ERBITUX® 단독으로의 치료로 각각 1.5 내지 4.2 개월의 질환 진행까지의 시간 중앙값으로 각각 11% 내지 9% 의 반응 속도가 산출된다는 결과를 보여주었다.
따라서, 스위스와 미국 모두에서, 이리노테칸과 조합으로의 ERBITUX® 치료, 그리고 미국에서, ERBITUX® 치료 단독은, 일선 이리노테칸 요법에 실패한 결장암 환자의 차선 요법으로 승인되었다. 그러므로, Herceptin® 과 유사하게, 스위스에서 치료는 단일클론 항체와 화학요법의 조합으로서만 승인되었다. 또한, 스위스와 미국 모두에서 치료는 오직 차선 요법으로서만 환자에 대해서 승인되었다. 또한, 2004 년에, AVASTIN® 은 전이성 결장직장암의 일선 치료로서 정맥 5-플루오로우라실에 근거한 화학요법과 조합으로 사용하기 위해 승인되었다. 제 3 상 임상 시험 결과는 5-플루오로우라실 단독으로 치료된 환자에 비해 AVASTIN® 과 5-플루오로우라실으로 치료된 환자의 생존 중앙값의 연장을 나타내었다 (20 개월 대 16 개월 각각). 그러나, 다시 Herceptin® 및 ERBITUX® 와 마찬가지로, 치료는 단일클론 항체 및 화학요법의 조합으로서만 승인된다.
또한 폐암, 뇌암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 위암에서는 불충분한 결과가 지속된다. 비-소세포 폐암에 대한 가장 유망한 최근의 결과는 치료에 화학요법제 TAXOTERE® 와 조합으로 세포-사멸 약물 독소루비신에 공액된 단일클론 항체 (SGN-15; dox-BR96, 항-Sialyl-LeX) 가 포함되는 제 2 상 임상 시험으로부터 산출되었다. TAXOTERE® 는 폐암의 차선 치료를 위한 유일한 FDA 승인된 화학요법이다. 초기 데이터는 TAXOTERE® 단독에 비해 전체적인 생존이 증가하였음을 나타낸다. 연구를 위해 모집된 62 명의 환자 중에서, 3 분의 2 는 TAXOTERE® 와 조합된 SGN-15 를 제공받은 반면 3 분의 1 은 TAXOTERE® 단독을 제공받았다. TAXOTERE® 와 조합된 SGN-15 를 제공받은 환자에 있어서는 전체적 생존 중앙값은 7.3 개월로, TAXOTERE® 단독을 제공받은 환자에 있어서 5.9 개월과 비교된다. 1 년 및 18 개월에서의 전체 생존은 SNG-15 와 TAXOTERE® 를 제공받은 환자에 있어서는 각각 29% 및 18% 로, TAXOTERE® 단독을 제공받은 환자에 있어서는 각각 24% 및 8% 와 비교된다. 추가의 임상 시험이 계획된다.
전임상적으로, 흑색종에 대한 단일클론 항체의 사용시 일부 제한된 성공이 있다. 이러한 항체의 거의 대부분은 임상 시험에 도달할 수 없었고, 지금까지 이들은 승인되거나 제 3 상 임상 시험에서 바람직한 결과를 나타내지 못했다.
질환 치료를 위한 신규 약물의 발견은 질환 병인에 기여할 수 있을 것인 30,000 가지의 공지된 유전자의 생성물 중 관련 표적의 동정 결핍에 의해 방해받는다. 종양학 연구에서, 잠재 약물 표적은 단순히 종양 세포에서 과발현된다는 사실로 인해 종종 선택된다. 이렇게 확인된 표적은 그 다음 다수의 화합물과의 반응에 대해 스크리닝된다. 잠재 항체 요법의 경우, 이들 후보 화합물은 통상 [Kohler and Milstein] (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler and Milstein) 에 의해 주장된 기본 원리에 따른 전통적인 단일클론 항체 생성 방법으로 유도된다. 비장 세포가 항원 (예를 들어, 전체 세포, 세포 분획, 정제 항원) 으로 면역화된 마우스로부터 수집되고, 불멸화된 하이브리도마 파트너와 융합된다. 수득된 하이브리도마를 스크리닝하고 표적에 가장 잘 결합하는 항체의 분비에 대해 선별하였다. Herceptin® 및 RITUXIMAB 를 비롯한 암세포에 대항하는 많은 치료 및 진단 항체는 상기 방법을 사용하여 생성되고, 이들의 친화력에 근거하여 선별된다. 상기 전략의 결함은 2 가지이다. 먼저, 치료 또는 진단 항체 결합에 대한 적합한 표적의 선택이, 주변 조직 특이성 발암 과정 및 이들 표적이 확인되는 수득된 단순화된 방법 (예컨대 과발현에 의한 선별) 에 대한 지식의 결핍으로 인해 제한된다. 둘째로, 최대 친화력으로 수용체에 결합하는 약물 분자가 통상 신호를 개시 또는 억제시키는 최고 가능성을 갖는다는 가정이 항상 경우가 될 수 있지는 않다.
유방암 및 결장암 치료의 일부 진전에도 불구하고, 단일 작용제 또는 공동-치료로서 효능 있는 항체 요법의 확인 및 개발이 모든 유형의 암에 있어 불충분했다.
종래 특허 문헌:
미국 특허 제 5,750,102 호에는 환자의 종양 유래 세포가 환자로부터의 세포 또는 조직으로부터 클로닝될 수 있는 MHC 유전자로 트랜스펙션되는 방법이 기재되어 있다. 그러면 이러한 트랜스펙션된 세포는 환자에 백신접종을 하는데 사용된다.
미국 특허 제 4,861,581 호에는 포유류의 신생물 및 정상 세포의 내부 세포 성분에는 특이적이나 외부 성분에는 특이적이지 않은 단일클론 항체를 수득하고, 단일클론 항체를 표지하고, 표지된 항체를 신생물 세포를 사멸시키는 요법을 받은 포유류의 조직과 접촉시키고, 퇴행하는 신생물 세포의 내부 세포 성분에 대한 표지된 항체의 결합을 측정함으로써 요법의 유효성을 측정하는 단계를 포함하는 방법이 기재되어 있다. 인간 세포내 항원에 대한 항체를 제조하는데 있어서, 특허권자는 악성 세포가 이러한 항원의 편리한 공급원을 나타낸다는 것을 인지한다.
미국 특허 제 5,171,665 호는 신규 항체 및 이의 생성 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 특허는 인간 종양 (예를 들어, 결장 및 폐 종양) 과 결합된 단백질 항원에 강하게 결합하는 반면 정상 세포에는 훨씬 덜 결합하는 특성을 갖는 단일클론 항체의 형성을 교시한다.
미국 특허 제 5,484,596 호는 인간 암 환자로부터 종양 조직을 수술로 제거하고, 종양 조직을 처리하여 종양 세포를 수득하고, 종양 세포를 생존가능하나 비-종양원성이도록 조사 (irradiating) 하고, 이러한 세포를 사용하여 전이를 억제하면서 동시에 일차 종양 재발 억제가 가능한 환자에 대한 백신을 제조하는 것을 포함하는 암 요법 방법을 제공한다. 상기 특허는 종양 세포의 표면 항원과 반응성인 단일클론 항체의 발달을 교시한다. 원문 페이지 45 의 제 4 단락 (이하 참조) 에 언급된 바와 같이, 특허권자는 인간 종양형성에서 단일클론 항체 발현 활성인 특이적인 면역요법의 개발에 토착 종양 세포를 이용한다.
미국 특허 제 5,693,763 호는 인간 암종이고, 기원 상피 조직에 의존하지 않은 당단백질 항원의 특징을 교시한다.
미국 특허 제 5,783,186 호는 Her2 발현 세포에서 세포자멸사를 유도하는 항-Her2 항체, 상기 항체 생성 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 사용하는 암 치료 방법 및 상기 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
미국 특허 제 5,849,876 호에는 종양 및 비-종양 조직원에서 정제된 뮤신 항원에 대한 단일클론 항체의 제조를 위한 신규 하이브리도마 세포주가 기재되어 있다.
미국 특허 제 5,869,268 호는 바람직한 항원에 특이적인 항체를 생성하는 인간 림프구 생성 방법, 단일클론 항체 생성 방법, 및 상기 방법에 의해 생성되는 단일클론 항체에 관한 것이다. 상기 특허는 특히 암의 진단 및 치료에 유용한 항-HD 인간 단일클론 항체의 생성에 관한 것이다.
미국 특허 제 5,869,045 호는 인간 암종 세포와 반응성인 항체, 항체 조각, 항체 공액체 및 단쇄 면역독소에 관한 것이다. 상기 항체가 기능하는 기작은, 분자가 인간 암종의 표면에 존재하는 세포막 항원과 반응성이고, 추가로 항체가 암종 세포 내에 내면화하는 능력을 가지고, 결합을 수반하여 이들을 항체-약물 및 항체-독소 공액체의 형성에 특히 유용하게 하는 2 단계이다. 비개질된 형태로, 항체는 또한 특정 농도에서 세포 독성이 명백하다.
미국 특허 제 5,780,033 호에는 종양 요법 및 예방을 위한 자가항체의 용도가 기재되어 있다. 그러나, 상기 항체는 연령이 있는 포유류로부터의 항핵 (antinuclear) 자가항체이다. 이 경우, 자가항체는 면역계에서 발견된 천연 항체 중 하나의 종류인 것으로 일컬어진다. 자가항체가 "연령이 있는 포유류" 로부터 유래하기 때문에, 자가항체가 실제로 치료되는 환자로부터 유래할 필요가 없다. 또한 상기 특허에는 연령이 있는 포유류로부터의 천연 및 단일클론 항핵 자가항체, 및 단일클론 항핵 자가항체를 생성하는 하이브리도마 세포주가 기재되어 있다.
발명의 요약
본 출원은 암 질환 변형 단일클론 항체를 코딩하는 하이브리도마 세포주를 단리하기 위해 U.S. 6,180,357 특허에서 교시된 환자 특이적 항암 항체를 생성하기 위한 방법론을 이용한다. 상기 항체는 하나의 종양에 특이적으로 제조될 수 있어, 암 요법의 맞춤화를 가능하게 한다. 본 출원의 문맥 내에서, 세포-사멸 (세포독성) 또는 세포-성장 억제 (세포증식억제) 성질을 갖는 항암 항체는 이하 세포독성으로서 언급될 것이다. 상기 항체는 암의 병기화 (staging) 및 진단을 돕는데 사용될 수 있고, 종양 전이를 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 또한 예방 치료를 통한 암의 예방에 사용될 수 있다. 통상의 약물 발견 프로그램에 따라 생성되는 항체와 달리, 상기 방식으로 생성되는 항체는 악성 조직의 성장 및/또는 생존에 없어서는 안되는 것으로 이전에 제시되지 않은 분자 및 경로에 표적할 수 있다. 게다가, 상기 항체의 결합 친화력은 더욱 강한 친화력 상호작용을 따를 수 없게 할 수 있는 세포독성 사건의 개시에 대한 필요성에 적합하다. 또한, 표준 화학치료 양상, 예를 들어, 방사성 핵종을 본 발명의 CDMAB 와 공액시켜, 상기 화학치료의 사용에 초점을 두는 것이 본 발명의 범주 내에 있다. 상기 CDMAB 는 또한 독소, 세포독성 부분, 효소 (예를 들어 비오틴 공액 효소), 또는, 조혈 세포에 공액되어, 항체 공액체를 형성할 수 있다.
개별화된 항암 치료의 가망성은 환자를 다루는 방식에 변화를 가져올 것이다. 있음직한 임상 시나리오는 종양 샘플을 제시 시점에 수득하고, 저장하는 것이다. 상기 샘플로부터, 종양은 이전에 존재하는 암 질환 조절 항체의 패널 (panel) 로부터 유형화될 수 있다. 환자는 통상적으로 병기화될 것이나, 이용가능한 항체는 환자의 추가 병기화에서 사용될 수 있다. 환자는 존재하는 항체로 즉시 치료받을 수 있고, 종양에 특이적인 항체의 패널은 본원에 약술된 방법을 사용하거나 본원에 기재된 스크리닝 방법과 함께 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 생성될 수 있다. 생성되는 모든 항체는, 다른 종양이 치료되는 종양과 동일한 에피토프 일부를 가질 수 있는 가능성이 있으므로 항암 항체의 라이브러리에 첨가될 것이다. 상기 방법에 따라 생성되는 항체는 상기 항체에 결합하는 임의의 수의 암 환자에서 암 질환을 치료하는데 유용할 것이다.
항암 항체 외에도, 환자는 다양한 방식의 치료 섭생의 일부로서 현행의 추천되는 요법을 받는 것을 택할 수 있다. 본 방법론을 통해 단리된 항체가 비-암세포에 비교적 무독성이라는 사실은 항체의 조합을 높은 투여량으로 사용하게 하거나, 또는 단독으로 또는 통상의 요법과 함께 사용하게 한다. 높은 치료 지수는 또한 치료 저항성 세포의 출현 가능성을 감소시켜야만 하는 짧은 시간으로 재-치료를 가능하게 할 것이다.
환자가 초기 요법 과정에 대해 난치성이거나 또는 전이가 전개되는 경우, 종양에 특이적인 항체의 생성 방법은 재-치료를 위해 반복될 수 있다. 게다가, 항암 항체는 상기 환자로부터 수득된 적혈구 세포에 공액되거나 전이 치료를 위해 재-주입될 수 있다. 전이성 암에 대한 효과적인 치료가 거의 없어, 전이는 통상 사망으로 이르게 하는 나쁜 결과의 전조가 된다. 그러나, 전이성 암은 통상 혈관이 잘 발달하고, 적혈구에 의한 항암 항체의 전달이 종양 부위에서 항체를 집중시키는 효과를 가질 수 있다. 심지어 전이 이전에, 대부분의 암세포는 생존을 위해 숙주의 혈액 공급에 의존적이고, 적혈구에 공액된 항암 항체는 더욱이 제 자리에서 종양에 효과적일 수 있다. 대안적으로는, 항체는 기타 조혈 세포, 예를 들어 림프구, 대식세포, 단핵구, 자연 살해 세포 등에 공액될 수 있다.
5 가지 계열의 항체가 있고, 각각은 중쇄에 의해 부여된 기능과 연관되어 있다. 일반적으로 있는 그대로의 항체에 의한 암세포 살해는 항체 의존성 세포 세포독성 또는 보체 의존성 세포독성을 통해 매개되는 것으로 생각된다. 예를 들어 쥣과 IgM 및 IgG2a 항체는 보체계의 C-1 성분에 결합하여, 종양 용해를 야기할 수 있는 보체 활성화의 고전적인 경로를 활성화시키는 것에 의해 인간 보체를 활성화시킬 수 있다. 인간 항체에 있어서 가장 효과적인 보체 활성 항체는 일반적으로 IgM 및 IgG1 이다. IgG2a 및 IgG3 동종형의 쥣과 항체는 단핵구, 대식세포, 과립구 및 특정 림프구에 의해 세포 살해를 야기할 것인 Fc 수용체를 갖는 세포독성 세포를 모집하는데 효과적이다. IgG1 및 IgG3 동종형 모두의 인간 항체는 ADCC 를 매개한다.
항체 매개 세포 살해의 또다른 가능한 메카니즘은 세포막 및 이의 연관된 당단백질 또는 당지질 내의 다양한 화학 결합의 가수분해를 촉매화하는 작용을 하는 항체, 소위 촉매성 항체의 사용을 통한 것일 수 있다.
항체-매개 암세포 살해의 3 가지 부가적인 메카니즘이 있다. 첫번째는 암세포에 잔류하는 추정 항원에 대항하는 면역 반응을 신체에 생성하도록 유도하는 백신으로서 항체의 사용이다. 두번째는 성장 수용체에 표적하고 이들의 기능을 간섭하거나 수용체를 하향 조절하여 그 기능을 효과적으로 상실하게 하는 항체의 사용이다. 세번째는 직접적인 세포 사멸을 야기할 수 있는 세포 표면 부분의 직접적인 라이게이션, 예컨대 TRAIL R1 또는 TRAIL R2 와 같은 사멸 수용체, 또는 인테그린 분자, 예컨대 알파 V 베타 3 등의 라이게이션에 대한 이러한 항체의 영향이다.
암 약물의 임상 유용성은 환자에 대한 허용가능한 위험 프로파일하의 약물의 이점에 근거한다. 암 요법에서 일반적으로 생존이 가장 모색되는 이점이지만, 수명 연장 외에도 수많은 기타 잘 인지된 이점이 있다. 이러한 기타 이점에는 치료가 생존에 역효과를 주지 않는 경우, 증상 완화, 역효과에 대한 보호, 재발 또는 질환이 없는 생존 시간 연장, 및 진행까지의 시간 연장이 포함된다. 상기 척도는 일반적으로 수용되고, 미국 식약청 (F.D.A.) 과 같은 규제 기관은 이러한 이득을 산출하는 약물을 승인한다 (Hirschfeld et al. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002). 상기 척도 외에도, 이러한 유형의 이점을 예상할 수 있는 기타 결과변수가 있다는 것이 잘 인지된다. 일부분, U.S. F.D.A. 에 의해 승인된 가속화된 승인 과정은 환자 이득을 예상할 것 같을 대리지표 (surrogate) 가 있다는 것을 인정한다. 2003 년 말에, 상기 과정에 의해 승인된 16 가지의 약물이 있고, 이들 중, 4 가지는 완전한 승인이 난 상태이다, 즉 후속 연구가 대리지표 결과변수에 의해 예견되는 바와 같은 직접적인 환자 이점을 입증하였다. 고체 종양에서의 약물 효과를 측정하는 하나의 중요한 결과변수는 치료에 대한 반응 측정에 의한 종양 하중의 평가이다 (Therasse et al. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000). 이러한 평가를 위한 임상 척도 (RECIST 척도) 는 암 국제 전문가 그룹인, [Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group] 에 의해 공표되었다. 적합한 대조군과 비교해, RECIST 척도에 따른 실증적인 반응에 의해 제시된 바와 같은 종양 하중에 대한 입증된 효과를 가진 약물은 궁극적으로 직접적인 환자 이점을 제공한다. 전임상 설정에서 종양 하중은 일반적으로 평가하고 증명하기가 더욱 수월하다. 임상 설정으로 옮겨갈 수 있는 전임상 연구에서, 전임상 모델에서 생존을 연장시키는 약물은 최대로 예견되는 임상 유용성을 갖는다. 임상 치료에 대한 양상 반응 생성과 유사하게, 전임상 설정에서 종양 하중을 감소시키는 약물은 또한 질환에 유의한 직접적인 영향을 줄 수 있다. 생존 연장이 암 약물 치료에서 가장 모색되는 임상 결과임에도 불구하고, 임상 유용성을 갖는다는 기타 이점이 있고, 질환 전개를 지연시키는 것과 연관성이 있을 수 있는 종양 하중 감소, 생존 연장 또는 양자 (both) 가 직접적인 이점을 야기할 수 있고 임상 영향력을 갖는다는 것이 명확하다 (Eckhardt et al. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, pages 209-219).
본 발명은 세포독성 검정법 및 인간 암의 동물 모델에서의 효과에 의해 확인된 AR59A367.7 의 개발 및 용도를 기재한다. 본 발명은 표적 분자에 존재하는 에피토프(들) 에 특이적으로 결합하고, 또한 원래 그대로의 항체와 같이 악성 종양 세포에는 시험관 내 세포독성 특성을 가지나 정상 세포에는 상기 특성을 갖지 않는, 또한 원래 그대로의 항체와 같이 직접 종양 성장 억제를 매개하는 시약을 기재한다. 추가 진척은 종양 성장 억제를 달성하기 위한 동족 항원 마커를 발현하는 종양을 표적하기 위한 것과 같은 항암 항체의 용도, 및 암 치료의 기타 양성 결과변수이다.
모두에서, 본 발명은 투여시 포유류에서 항원을 발현하는 암의 종양 하중을 감소시킬 수 있는 치료제에 대한 표적으로서의 AR59A367.7 항원의 용도를 교시한다. 본 발명은 또한 포유류에서 항원을 발현하는 암의 종양 하중을 감소시키기 위해 이의 항원에 표적하기 위한 CDMAB (AR59A367.7), 및 이의 유도체, 및 이의 항원 결합 조각, 및 이의 세포독성 유도성 리간드의 용도를 교시한다. 게다가, 본 발명은 또한 상기 항원을 발현하는 종양을 갖는 포유류의 진단, 요법의 예측, 및 예후에 유용할 수 있는 암세포에서 AR59A367.7 항원을 검출하는 용도를 교시한다.
따라서, 특정 개인으로부터 유래된 암세포, 또는 하나 이상의 특정 암 세포주에 대해 길러진 암 질환 조절 항체 (CDMAB) 의 제조 방법을 이용하는 것이 본 발명의 목적이며, 여기서 상기 CDMAB 는 하이브리도마 세포주 및 상기 하이브리도마 세포주가 코딩되는 상응하는 단리된 단일클론 항체 및 이의 항원 결합 조각을 단리하기 위해, 암세포에 대해 세포독성이면서 동시에 비암세포에 대해 비교적 무독성이다.
암 질환 조절 항체, 리간드 및 이의 항원 결합 조각을 교시하는 것이 본 발명의 부가적인 목적이다.
세포독성이 항체 의존성 세포 세포독성에 의해 매개되는 암 질환 조절 항체를 생성하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다.
세포독성이 보체 의존성 세포 독성에 의해 매개되는 암 질환 조절 항체를 생성하는 것이 본 발명의 또다른 부가적인 목적이다.
세포독성이 세포 화학 결합의 가수분해를 촉매화하는 능력의 작용인 암 질환 조절 항체를 생성하는 것이 본 발명의 또다른 추가의 목적이다.
암의 진단, 예후 및 모니터링을 위한 결합 검정법에 유용한 암 질환 조절 항체를 생성하는 것이 본 발명의 또다른 추가의 목적이다.
본 발명의 기타 목적 및 장점은 본원의 하기 기재로부터 명백해질 것이고, 본 발명의 설명 및 실시예, 특정 구현예에 의해 언급된다.
도 1 은 세포주 MDA-MB-231, OVCAR-3, SW1116, Lovo 및 CCD-27sk 에 대한 하이브리도마 상청액의 % 세포독성 및 결합 수준을 비교한다.
도 2 는 암 및 정상 세포주에 대한 AR59A367.7 의 결합을 나타낸다. 상기 데이터는 상기 동종형 대조군의 배수 증가로서 평균 형광 강도를 나타내기 위해 표로 작성되었다.
도 3 에는 여러 암 및 비-암 세포주에 대한 AR59A367.7 및 항-EGFR 항체의 대표적인 FACS 히스토그램이 포함된다.
도 4 는 예방 BxPC-3 췌장암 모델에서 종양 성장에 대한 AR59A367.7 의 효과를 나타낸다. 수직 점선은 항체가 투여된 기간을 나타낸다. 데이터 지점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 5 는 예방 BxPC-3 췌장암 모델에서 체중에 대한 AR59A367.7 의 효과를 나타낸다. 데이터 지점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
일반적으로, 하기 단어 또는 구절은 요약, 설명, 실시예 및 청구항에 사용되는 경우 지시되는 정의를 갖는다.
"항체" 라는 용어는 광범위하게 사용되고, 구체적으로 예를 들어, 단일클론 항체 (아고니스트, 길항제, 및 중화 항체, 탈면역화, 쥣과, 키메라 또는 인간화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 가진 항체 조성물, 단일쇄 항체, 면역공액체 및 항체 조각 (하기 참조) 을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "단일클론 항체" 라는 용어는 실질적으로 상 동인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하고, 즉, 집단에 포함되는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대한 것으로, 매우 특이적이다. 게다가, 상이한 결정소 (에피토프) 에 대한 상이한 항체가 포함되는 폴리클론 항체와는 반대로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정소에 대한 것이다. 이들의 특이성 외에, 단일클론 항체는 기타 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 장점이 있다. 수식어구 "단일클론" 은 실질적으로 상동인 집단의 항체로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성이 필요한 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)] 에 의해 처음 기재된 하이브리도마 (쥣과 또는 인간) 방법에 의해 제조될 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호 참조) 에 의해 제조될 수 있다. "단일클론 항체" 는 또한 예를 들어 [Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)] 에 기재된 기술을 사용하는 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
"항체 조각" 은 미손상 항체의 (바람직하게는 이의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함하는) 부분을 포함한다. 항체 조각의 예에는 전장 미만의 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 조각; 디아바디 (diabodies); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 항체 조각(들) 으로부터 형성된 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체 분자, 융합 단백 질, 재조합 단백질 및 다중특이적 항체가 포함된다.
"미손상" 항체는 항원-결합 가변 영역 뿐 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3 을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 선천적 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 선천적 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 미손상 항체는 하나 이상의 효과기 작용을 갖는다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 미손상 항체는 상이한 "계열" 로 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 의 5 가지 주요한 계열의 미손상 항체가 있고, 이들 중 몇몇은 "하위계열" (동종형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2 로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 계열의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 불린다. 상이한 계열의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3 차원 배열은 잘 알려져 있다.
항체 "효과기 작용" 은 항체의 Fc 영역 (선천적 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역) 에 기여가능한 생물학적 활성을 말한다. 항체 효과기 작용의 예에는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR) 의 하향 조절 등이 포함된다.
"항체-의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC" 는 Fc 수용체 (FcR) (예를 들어, 자연 살해자 (Natural Killer: NK) 세포, 중성구, 및 대식세포) 를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합된 항체를 인지하고, 이어서 표적 세포의 용해를 일으키는 세포 매개 반응을 말한다. ADCC 를 매개하는 1 차 세포, NK 세포는 오직 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)] 의 페이지 464 의 표 3 에 요약된다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관 내 ADCC 검정법, 예컨대 미국 특허 제 5,500,362 호 또는 제 5,821,337 호에 기재된 바와 같은 방법을 수행할 수 있다. 상기 검정법에 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해자 (NK) 세포가 포함된다. 대안적으로는 또는 부가적으로는, 관심의 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)] 에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 생체 내에서 평가될 수 있다.
"효과기 세포" 는 하나 이상의 FcR 을 발현하고 효과기 작용을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII 을 발현하고 ADCC 효과기 작용을 수행한다. ADCC 를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해자 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구가 포함되며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 본원에 기재된 바와 같이 이의 있는 그대로의 공급원, 예를 들어 혈액 또는 PBMC 로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR" 라는 용어는 항체의 Fc 영역에 결합되는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR 은 있는 그대로의 서열 인간 FcR 이다. 게다가, 바람직한 FcR 은 IgG 항체 (감마 수용체) 에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII, 및 Fcγ RIII 하위계열의 수용체 및, 이러한 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태가 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체") 가 포함되며, 이것은 이의 세포질 도메인과 우선적으로 상이한, 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA 는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM) 를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB 는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM) 를 함유한다 (리뷰 M. in Daeron, Amzu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참조). FcR 은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)] 에서 리뷰된다. 앞으로 확인될 것을 비롯한 기타 FcR 은 본원에서 용어 "FcR" 에 포함된다. 상기 용어에는 또한 모체 IgG 를 태아에게 옮기는 것을 담당하는 신생아 수용체, FcRn 이 포함된다 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., Eur. J. Immunol. 24:2429 (1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC" 는 보체의 존재하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 말한다. 보체 활성화 경로는 보체계의 첫번째 성분 (C1q) 이 동족 항원과 복합체를 이룬 분자 (예를 들어, 항체) 에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)] 에 기재된 바와 같은 CDC 검정법을 평가할 수 있다.
"가변" 이라는 용어는 가변 도메인의 특정 부분이 항체 간의 서열이 광범위 하게 상이하고, 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 말한다. 그러나, 변이성은 항체의 가변 도메인 내에 동등하게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 과가변 영역이라 불리는 3 개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 골격 영역 (FR) 으로 불린다. 원래 그대로의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 3 개의 과가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-쉬트 배열을 채택하는 4 개의 FR 을 포함하고, 이것은 일부 경우 β-쉬트 구조의 일부를 형성하는 연결하는 루프를 형성한다. 각 사슬에서의 과가변 영역은 FR 과 근접하게 함께 유지되고, 기타 사슬로부터의 과가변 영역은 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원에 대한 결합에 직접 관여하지 않으나, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 작용을 나타낸다.
본원에 사용되는 경우 "과가변 영역" 이라는 용어는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991)) 및/또는 "과가변 루프" 로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 2632 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 를 포함한다. "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 기재된 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 조각으로 불리는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2 개의 동일한 항원-결합 조각과, 쉽게 결정화하는 그의 능력이 명칭에 반영된 나머지 "Fc" 조각이 생성된다. 펩신 처리에 의해서는, 2 개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')2 조각이 생성된다.
"Fv" 는 완전한 항원-인지 및 항원-결합 부위를 가진 최소 항체 조각이다. 상기 영역은 강한 비공유 결합 상태로 있는 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어져 있다. 이러한 배열로, 각 가변 도메인의 3 개의 과가변 영역들은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6 개의 과가변 영역은 해당 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3 개의 과가변 영역만 포함하는 Fv 의 절반) 이라도, 전체 결합 부위보다 친화력이 덜하긴 하지만, 항원을 인지하여 그에 결합하는 능력을 가진다. Fab 조각은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 갖는다. Fab' 조각은 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 항체 경첩 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯 한 수 개의 잔기들이 추가된 점이 Fab 조각과 상이하다. Fab'-SH 는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들) 이 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 Fab' 를 나타낸다. F(ab')2 항체 조각은 원래는 그들 사이에 힌지 시스테인이 존재하는 Fab' 조각의 쌍으로 생성되었다. 항체 조각의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종의 항체의 "경쇄" 는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 불리는 2 개의 분명히 구별되는 유형들 중 하나로 분류될 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 조각은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인들 사이에, scFv 가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 연결자를 추가로 포함한다. scFv 에 대한 리뷰를 위해서는, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 를 참조할 수 있다.
"디아바디" 라는 용어는 2 개의 항원-결합 부위를 가진 소형 항체 조각으로서, 동일 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에서 가변 중쇄 도메인 (VH) 이 가변 경쇄 도메인 (VL) 에 연결되어 있는 조각을 지칭한다. 너무 짧아서 상기 동일 사슬 상 의 상기 두 도메인들 간의 쌍 형성 (pairing) 을 허용하지 않는 연결자를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2 개의 항원-결합 부위를 생성하도록 촉진된다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 에 더욱 상세히 기술되어 있다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염물 성분은 상기 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내 그 자리에 존재하는 항체가 포함되는데, 그 이유는 상기 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로는, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
관심 항원에 "결합하는" 항체는 항체가 상기 항원을 발현하는 세포를 표적으로 함에 있어서 치료제 또는 진단제로 유용하도록 충분한 친화력을 갖고서 상기 항원에 결합할 수 있는 항체이다. 상기 항체가 항원성 부분에 결합하는 항체인 경우, 이는 보통 다른 수용체들에 반대되는 것으로서 상기 항원성 부분에 우선적으로 결합할 것인데, 이에는 비-특이적 Fc 접촉과 같은 우연적인 결합, 또는 다른 항원들에 공통인 번역후 변형 부분에의 결합이 포함되지 않으며, 이는 다른 단백질들과 유의미하게 교차반응하지 않는 것일 수도 있다. 관심 항원에 결합하는 항체의 검출 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이로서는 하기에 제한되는 것은 아니나, FACS, 세포 ELISA 및 웨스턴 블랏과 같은 검정법이 있다.
본원에서 사용되는 "세포", "세포주", 및 "세포 배양" 이라는 표현은 상호교환가능하게 사용되며, 이러한 모든 표기에는 자손이 포함된다. 또한, 고의적인 또는 고의적인 것이 아닌 돌연변이로 인해서, 모든 자손의 DNA 내용이 정확히 동일하지는 않을 수 있음은 자명할 것이다. 최초 변형 세포에서 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이 자손이 포함된다. 다른 의미가 의도된 경우는 문맥으로부터 명백할 것이다.
"치료 또는 치료하는" 이란 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 지칭하는 것으로서, 이 때 이의 목적은 표적 병리학적 상태 또는 장애를 방지하거나 또는 진행을 늦추는 (약화시키는) 것이다. 치료를 필요로 하는 자들에는, 이미 상기 장애를 가진 자들뿐 아니라, 상기 장애를 가지기 쉬운 자들 또는 상기 장애가 예방되어야 할 자들이 포함된다. 따라서, 본원에서 치료 대상인 포유류는 상기 장애를 가진 것으로 진단된 것일 수도 있고 또는 상기 장애에 걸리기 쉬운 또는 그에 취약한 것일 수도 있다.
"암" 및 "암성" 이라는 용어는 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장 또는 사멸을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 기술한다. 암의 예에는, 하기에 제한되는 것은 아니나, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프계 종양 (lymphoid malignancies) 이 포함된다. 이러한 암의 더욱 구체적인 예로서는, 편평 세포 암 (예컨대 편평 상피 세포 암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종을 비롯한 폐암, 복막의 암, 간세포 암, 위장관 암을 비롯한 위 (gastric 또는 stomach) 암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 선종 (hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 및 두경부암이 있다.
"화학요법제" 는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로서는 하기가 있다: 알킬화제, 예컨대 티오테파 (thiotepa) 및 시클로포스파미드 (CYTOXAN™); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판 (busulfan), 임프로술판 (improsulfan) 및 피포술판 (piposulfan); 아지리딘, 예컨대 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa), 및 우레도파 (uredopa); 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 (trimethylolomelamine) 을 비롯한 메틸멜라민 (methylmelamine) 및 에틸렌이민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 노벰비킨 (novembichin), 페네스테린 (phenesterine), 프레드니무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 (uracil mustard); 니트로스우레아 (nitrosurea), 예컨대 카르무스틴 (carmustine), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine); 항생제, 예컨대 아클라시노마이신 (aclacinomycin), 악티노마이신 (actinomycin), 안트라마이신 (anthramycin), 아자세린 (aza세린), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 카라비신 (carabicin), 카르노마이신 (carnomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 마이코페놀산 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), 쿠엘라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토조신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 (methotrexate) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린 (denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈 (fludarabine), 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌 (thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘 (6-azauridine), 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 디데옥시우리딘 (dideoxyuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플 록수리딘 (floxuridine), 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론 (calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피티오스타놀 (epitiostanol), 메피티오스탄 (mepitiostane), 테스토락톤 (testolactone); 항-부신제 (anti-adrenal), 예컨대 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트리로스탄 (trilostane); 엽산 보충물, 예컨대 폴린산 (folinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드 (aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비산트렌 (bisantrene); 에다트락세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 디아지쿠온 (diaziquone); 엘포르미틴 (elformithine); 엘리프티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 니트레이트 (gallium nitrate); 히드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다민 (lonidamine); 미토구아존 (mitoguazone); 미토잔트론 (mitoxantrone); 모피다몰 (mopidamol); 니트라크린 (nitracrine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드 (2-ethylhydrazide); 프로카르바진 (procarbazine); PSK®; 라족산 (razoxane); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄 (urethan); 빈데신 (vindesine); 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노시드 (arabinoside) ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산 (taxane), 예컨대 파클리탁셀 (paclitaxel) (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈 (gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 (cisplatin) 및 카르보플라틴 (carboplatin); 빈블라스틴 (vinblastine); 백금; 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide); 미토마이신 C (mitomycin C); 미토잔트론; 빈크리스틴 (vincristine); 비노렐빈 (vinorelbine); 나벨빈 (navelbine); 노반트론 (novantrone); 테니포시드 (teniposide); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 젤로다 (xeloda); 이반드로네이트 (ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신 (esperamicin); 카페시타빈 (capecitabine); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체. 상기 정의에는 또한 하기가 포함된다: 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜 (raloxifene), 아로마타제 (aromatase) 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), LY117018, 오나프리스톤 (onapristone), 및 토레미펜 (toremifene) (Fareston); 및 항-안드로겐, 예컨대 플 루타미드 (flutamide), 닐루타미드 (nilutamide), 비카루타미드 (bicalutamide), 류프롤리드 (leuprolide), 및 고세렐린 (goserelin); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
치료를 목적으로 하는 "포유류" 는 인간, 마우스, SCID 또는 누드 마우스 또는 마우스 균주 (strain), 가축 및 사육 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 양, 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯하여, 포유류로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 포유류는 인간이다.
"올리고뉴클레오티드" 는 공지된 방법으로 화학적으로 합성된 짧은 길이의, 단일- 또는 이중-가닥 폴리데옥시뉴클레오티드이다 (예컨대, 1988 년 5 월 4 일 공개된 EP 266,032 에 기재된 것과 같은 고체상 기법을 사용하거나 또는 문헌 [Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986] 에 기재된 바와 같은 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간체를 통한, 포스포트리에스테르, 포스파이트, 또는 포스포라미다이트 화학). 이들을 그 후 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제한다.
본 발명에 따르면, 비-인간 (예컨대 쥣과) 면역글로불린의 "인간화" 및/또는 "키메라" 형태는 원래의 항체와 비교하여, 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA) 또는 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응의 저하를 야기하는 특이적인 키메라 면역글로불린, 이의 면역글로불린 사슬 또는 조각 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 하위서열) 을 포함하고, 목적하는 효과 를 재현하는데 필요한, 상기 비-인간 면역글로불린에서 유래한 필수 부분들 (예컨대 CDR(들), 항원 결합 영역(들), 가변 도메인(들) 등) 을 포함하는 한편, 동시에 상기 비-인간 면역글로불린에 필적하는 결합 특질을 보유하는 항체를 지칭한다. 대부분, 인간화 항체는, 수용자 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 잔기가 목적하는 특이성, 친화력 및 능력을 가진 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR 의 잔기들로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체) 이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 FR 잔기로 대체된다. 나아가, 상기 인간화 항체는 수용자 항체나 이입되는 CDR 또는 FR 서열에는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상의, 전형적으로는 2 개의, 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 이 때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 공통 서열의 잔기이다. 상기 인간화 항체는 최적으로는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다.
"탈-면역화" 항체는 제시된 종에 대해 비-면역원성이거나, 또는 면역원성이 보다 덜한 면역글로불린이다. 탈-면역화는 상기 항체에 구조적 변경을 가하여 달성할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 탈-면역화 기법을 이용할 수 있다. 항체를 탈-면역화하는 한 가지 적당한 기법은, 예를 들어, 2000 년 6 월 15 일 공개된 WO 00/34317 에 기재되어 있다.
"세포자멸사" 를 유도하는 항체는 임의 수단에 의해, 이에 제한되는 것은 아니나 아넥신 V 의 결합, 카스파아제 활성, DNA 파편화, 세포 수축, 소포체 팽창, 세포 파편화, 및/또는 막 소포 (아포토시스 소체로 불림) 형성으로 예증되는, 예정된 세포사를 유도하는 항체이다.
본원에서 사용되는 "항체 유도성 세포독성" 은, IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 하이브리도마 상청액 또는 항체로부터 유래한 세포독성 효과를 의미하는 것으로, 상기 효과는 결합의 정도에 필수적으로 관련된 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 하이브리도마 세포주, 및 이로부터 생성되는 단리된 단일클론 항체는 다르게는 이의 내부적 호칭인 AR59A367.7 또는 기탁 명칭인 IDAC 010207-02 로 지칭된다.
본원에서 사용되는 "항체-리간드" 에는, 표적 항원의 하나 이상의 에피토프에 대한 결합 특이성을 나타내는 부분이 포함되는데, 이는 IDAC 010207-02 로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 의해 결합된 항원 (IDAC 010207-02 항원) 의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하여 결합하는 미손상 항체 분자, 항체 조각, 및 적어도 이의 항원-결합 영역 또는 부분 (즉, 항체 분자의 가변 부분) 을 가진 임의의 분자, 예컨대, Fv 분자, Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 2 특이성 (bispecific) 항체, 융합 단백질, 또는 임의의 유전자 조작된 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 "암 질환 조절 항체" (CDMAB) 란 환자에 유익한 방식으로, 예를 들어 종양 하중을 감소시키거나 또는 종양을 가진 개인의 생존을 연장시키는 등으로 암 질환 과정을 조절하는 단일클론 항체 및 이의 항체-리간드를 말한다.
본원에서 사용되는 "항원-결합 영역" 은 표적 항원을 인지하는 분자의 부분을 의미한다.
본원에서 사용되는 "경쟁적 억제제" 는 IDAC 010207-02 로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체 (IDAC 010207-02 항체) 가 통상의 상호 항체 경쟁 검정법 (Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15) 을 사용하여 지정되는 결정소 부위를 인지하고 이에 결합할 수 있는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "표적 항원" 은 IDAC 010207-02 항원 또는 이의 일부이다.
본원에서 사용되는 "면역공액체" 는 세포독소에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 항체, 방사성제, 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제와 같은 임의의 분자 또는 CDMAB 를 의미한다. 항체 또는 CDMAB 는 세포독소, 방사성제, 항-종양 약물 또는 치료제에, 표적에 결합할 수 있는 것이라면 분자를 따라 임의의 위치에서 연결될 수 있다. 면역공액체의 예에는 항체 독소 화학적 공액체 및 항체-독소 융합 단백질이 포함된다.
본원에서 사용되는 "융합 단백질" 은 항원 결합 영역이 생물학적 활성 분자, 예를 들어, 독소, 효소 또는 단백질 약물에 연결된 임의의 키메라 단백질을 의미한다.
본원에 기재된 발명을 더욱 완전히 이해하도록 하기 위해, 하기 설명이 언급된다.
본 발명은 IDAC 010207-02 항원을 특이적으로 인지하고 이에 결합하는 CDMAB (즉, IDAC 010207-02 CDMAB) 를 제공한다.
등록번호 010207-02 로서 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 CDMAB 는 표적 항원에 대한 하이브리도마 IDAC 010207-02 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 면역특이적 결합을 경쟁적으로 억제하는 항원-결합 영역을 갖는 것이라면 임의의 형태일 수 있다. 그러므로, IDAC 010207-02 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 임의의 재조합 단백질 (예를 들어, 항체가 림포카인 또는 종양 억제성 성장 인자와 같은 두번째 단백질과 조합된 융합 단백질) 이 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, CDMAB 는 IDAC 010207-02 항체이다.
기타 구현예에서, CDMAB 는 Fv 분자 (예컨대 단일쇄 Fv 분자), Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 융합 단백질, 2 특이적 항체, 헤테로항체 또는 IDAC 010207-02 항체의 항원-결합 영역을 갖는 임의의 재조합 분자일 수 있는 항원 결합 조각이다. 본 발명의 CDMAB 는 IDAC 010207-02 단일클론 항체가 지시되는 에피 토프에 대한 것이다.
본 발명의 CDMAB 는 유도성 분자를 생성할 수 있도록, 즉, 분자 내 아미노산 개질에 의해 개질될 수 있다. 화학적 개질이 또한 가능할 수 있다.
유도성 분자는 폴리펩티드의 기능적 특성을 보유할 것이며, 즉, 이러한 치환을 가진 분자는 여전히 폴리펩티드를 IDAC 010207-02 항원 또는 이의 일부에 결합시킬 것이다.
상기 아미노산 치환에는 반드시 하기에 제한되지는 않으나, "보존성" 으로서 당업계에 공지된 아미노산 치환이 포함된다.
예를 들어, 이것은 "보존성 아미노산 치환" 으로 지칭되는 특정 아미노산 치환이 단백질의 배열 또는 기능을 변경시키지 않고 단백질에 자주 행해질 수 있는 잘 성립된 단백질 화학 원칙이다.
이러한 변경에는 이소류신 (I), 발린 (V), 및 류신 (L) 중 임의의 것을 상기 소수성 아미노산 중 임의의 것에 대해 치환; 아스파르트산 (D) 을 글루탐산 (E) 에 대해 치환 및 역도 성립; 글루타민 (Q) 을 아스파라긴 (N) 에 대해 치환 및 역도 성립; 및 세린 (S) 을 트레오닌 (T) 에 대해 치환 및 역도 성립이 포함된다. 기타 치환은 또한 특정 아미노산의 환경 및 단백질 3 차 구조에서의 그의 역할에 따라 보존성인 것으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G) 및 알라닌 (A) 은 알라닌 및 발린 (V) 일 수 있듯이 종종 상호교환될 수 있다. 비교적 소수성인 메티오닌 (M) 은 류신 및 이소류신, 및 종종 발린과 상호교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R) 은 종종 아미노산 잔기의 유의한 특징이 그의 전하이고, 상기 2 개 아미노산 잔기의 pK 를 상이하게 하는 것이 유의하지 않은 위치에서 상호교환가능하다. 또 기타 변화는 특정 환경에서 "보존성" 으로 고려될 수 있다.
실시예 1
하이브리도마 제조 - 하이브리도마 세포주 AR59A367.7
하이브리도마 세포주 AR59A367.7 을, 부다페스트 조약에 따라, 2007 년 2 월 1 일에 캐나다 알3이 3알2 마니토바 위니펙 알링턴 스트리트 1015 에 소재한 캐나다 보건청 미생물학 사무국의 캐나다 국제 기탁 기관 (International Depository Authority of Canada, IDAC) 에, 등록번호 010207-02 하에 기탁하였다. 37 CFR 1.808 에 따라, 당 기탁자는 기탁된 물질에 대한 공중의 이용가능성에 대해 부여된 모든 제한들을 특허 등록승인시에 확정적으로 제거할 것임을 보장한다. 상기 기탁은 상기 기탁 기관이 생존가능한 시료를 제공해줄 수 없을 경우 대체될 것이다.
항암 항체 AR59A367.7 을 생성하는 하이브리도마를 제조하기 위해, 간 종양 조직으로의 동결한 인간 결장 전이의 단일 세포 현탁액 (Genomics Collaborative, Cambridge, MA) 을 PBS 중에 제조하였다. IMMUNEASY™ (Qiagen, Venlo, Netherlands) 면역보강제를 살짝 혼합하여 사용을 위해 제조하였다. 5 ~ 7 주령의 BALB/c 마우스에게 상기 항원-면역보강제 50 마이크로리터 중의 2 백만개의 세포를 피하로 주사하여 마우스를 면역화하였다. 상기 최초 면역화 후 2 주 후 에, 최근 제조된 항원-면역보강제를 사용하여 50 마이크로리터 중의 2 백만개 세포로 상기 면역화된 마우스에 복강내로 부스팅 (boosting) 하였다. 마지막 면역화 3 일 후에 비장을 사용하여 융합하였다. 단리한 비장세포를 NSO-1 골수종 파트너와 융합시켜 하이브리도마를 제조하였다. 상기 융합물로부터의 상청액을 상기 하이브리도마의 서브클론으로부터 시험하였다.
상기 하이브리도마 세포에 의해 분비된 항체가 IgG 또는 IgM 동종형 중 어느 것인지 결정하기 위해, ELISA 검정법을 이용하였다. 4 ℃ 의 코팅 완충액 (0.1 M 탄산염/중탄산염 완충액, pH 9.2-9.6) 중의 2.4 마이크로그램/mL 농도의 염소 항-마우스 IgG + IgM (H+L) 를 100 마이크로리터/웰로 ELISA 플레이트에 첨가하여 밤새 두었다. 상기 플레이트를 세척 완충액 (PBS + 0.05 % Tween) 중에서 3 회 세척하였다. 상기 플레이트에 100 마이크로리터/웰의 차단 완충액 (세척 완충액 중 5 % 우유) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 둔 후, 세척 완충액 중에서 3 회 세척하였다. 100 마이크로리터/웰의 하이브리도마 상청액을 첨가하고, 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 염소 항-마우스 IgG 또는 IgM 양고추냉이 과산화효소 공액체의 1/100,000 희석물 (5 % 우유를 함유한 PBS 중에 희석시킨 것) 을, 100 마이크로리터/웰로 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. TMB 용액 100 마이크로리터/웰을 실온에서 1 ~ 3 분간 인큐베이션하였다. 50 마이크로리터/웰의 2M H2SO4 를 첨가하여 색 반응을 종결시키고, 상기 플레이트를 Perkin-Elmer HTS7000 플레이트 판독기로 450 nm 에서 판독하였다. 도 1 에 나타난 바와 같이, AR59A367.7 하이브리도마는 주로 IgG 동종형의 항체를 분비하였다.
상기 하이브리도마 세포에 의해 분비되는 항체의 하위부류를 결정하기 위해, Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (HyCult Biotechnology, Frontstraat, Netherlands) 를 사용하여 동종형 결정 (isotyping) 실험을 수행하였다. 500 마이크로리터의 완충액을 래트 항-마우스 하위계열 특이적 항체를 포함한 시험 스트립 (test strip) 에 첨가하였다. 500 마이크로리터의 하이브리도마 상청액을 상기 시험관에 첨가하고, 살짝 진탕하여 침지시켰다. 포획된 마우스 면역글로불린을, 콜로이드 입자에 커플링시킨 2 차 래트 단일클론 항체로 직접 검출하였다. 이들 두 단백질의 조합은 동종형 분석에 사용되는 시각적 신호를 생성한다. 상기 항암 항체 AR59A367.7 은 IgG2a, 카파 동종형이다.
하이브리도마 상청액을 2 회 한계 희석한 후에 이에 대해 세포 ELISA 검정법에서 표적 세포에 결합한 항체가 있는지 시험하였다. 1 가지 인간 유방암 세포주, 2 가지 인간 결장암 세포주 및 1 가지 인간 비-암 피부 세포주: MDA-MB-231, SW1116, Lovo 및 CCD-27sk 를 각각 시험하였다. 모든 세포주는 American Type Tissue Collection (ATCC; Manassas, VA) 로부터 입수하였다. 상기 플레이팅한 세포를 사용전에 고정시켰다. 상기 플레이트를 MgCl2 및 CaCl2 를 함유한 PBS 로 실온에서 3 회 세척하였다. PBS 에 희석한 2 % 파라포름알데히드 100 마이 크로리터를 각 웰에 실온에서 10 분간 첨가한 후, 버렸다. 상기 플레이트를 다시 MgCl2 및 CaCl2 를 함유한 PBS 로 실온에서 3 회 세척하였다. 세척 완충액 (PBS + 0.05 % Tween) 중의 5 % 우유 100 마이크로리터/웰로 실온에서 1 시간 동안 차단을 수행하였다. 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 하이브리도마 상청액을 75 마이크로리터/웰로 실온에서 1 시간 동안 첨가하였다. 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 양고추냉이 과산화효소에 공액시킨 염소 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체의 1/25,000 희석물 (5 % 우유를 함유한 PBS 중에 희석시킴) 100 마이크로리터/웰을 첨가하였다. 실온에서 1 시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 100 마이크로리터/웰의 TMB 기질을 실온에서 1 ~ 3 분간 인큐베이션하였다. 상기 반응을 50 마이크로리터/웰의 2M H2SO4 로 종결시키고, 플레이트를 Perkin-Elmer HTS7000 플레이트 판독기로 450 nm 에서 판독하였다. 도 1 에 표로 나타나 있는 결과는 이전에 상기 시험된 세포주에 결합하지 않는 것으로 나타난 자체 제조 (in-house) IgG 동종형 대조군과 비교하여 바탕값에 대한 배수로 표현되었다. 하이브리도마 AR59A367.7 로부터의 항체들은 Lovo 결장암 및 CCD-27sk 비-암 피부 세포주에 대해서는 검출가능한 결합을 나타내었다.
항체 결합에 대한 시험과 함께, 상기 하이브리도마 상청액의 세포독성 효과 (항체 유도성 세포독성) 를 하기 세포주: MDA-MB-231, OVCAR-3 (인간 난소암 세포주; ATCC, Manassas, VA), SW1116, Lovo 및 CCD-27sk 에서 시험하였다. 칼세인 (Calcein) AM 은 Molecular Probes (Eugene, OR) 로부터 입수하였고, 하기 개요한 바와 같이 검정을 수행하였다. 상기 검정 전에 세포를 미리 결정한 적절한 밀도로 플레이팅하였다. 2 일 후에, 상기 하이브리도마 마이크로타이터 플레이트로부터의 상청액 75 마이크로리터를 상기 세포 플레이트에 옮기고, 5 % CO2 인큐베이터에서 5 일간 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로 이용된 웰이 비워질 때까지 흡인하고, 배양 배지 중에 용해시킨 나트륨 아지드 (NaN3, 0.01 %, Sigma, Oakville, ON), 시클로헥시미드 (CHX, 0.5 마이크로몰, Sigma, Oakville, ON) 또는 항-EGFR 항체 (c225, IgG1, 카파, 5 마이크로그램/mL, Cedarlane, Hornby, ON) 100 마이크로리터를 첨가하였다. 처리 5 일 후, 상기 플레이트를 그 후 뒤집어 흡취지로 건조 (blotting dry) 하여 비웠다. MgCl2 및 CaCl2 가 함유된 실온의 DPBS (Dulbecco 인산 완충 식염수) 를 다채널 스퀴즈 병 (squeeze bottle) 으로부터 각 웰에 분배하고, 가볍게 3 회 두드리고, 뒤집어 비운 후, 흡취지로 건조시켰다. MgCl2 및 CaCl2 가 함유된 DPBS 중에 희석시킨 형광 칼세인 염료 50 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고, 5 % CO2 인큐베이터 내에서 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 Perkin-Elmer HTS7000 형광 플레이트 판독기에서 판독하고, 데이터를 마이크로소프트 엑셀로 분석하였다. 결과는 도 1 에 표로 나타나 있다. AR59A367.7 하이브리도마로부터의 상청액은 SW1116 세포에 대해서 12 % 의 특이적 세포독성을 일으켰다. 이는, SW1116 에 대한 양성 대조군 C225 를 이용하여 수득한 세포독성의 60 % 이었다. 비-암 피부 세포주 CCD-27sk 에 대해서는 세포독성이 관찰되지 않았다. 공지된 비-특이적 세포독성제 시클로헥사미드 및 NaN3 은 일반적으로 예상되는 바의 세포독성을 나타내었다. 항-EGFR 항체 c225 는 SW1116 에 대해 예상되는 바의 세포독성을 나타내었다.
도 1 로부터의 결과는 상이한 암세포 유형에 대한 AR59A367.7 의 세포독성 효과가 결합 수준에 직접적으로 연관되지 않았음을 입증한다. 상기 조건하에서 SW1116 세포주에 대한 결합이 검출가능하지 않았지만, MDA-MB-231 유방암 세포에 대해 가장 높은 결합이 검출되었지만, 세포독성 수준은 검출가능하였다. AR59A367.7 은 세포독성을 생성하지 않았으나, Lovo 결장암 및 CCD-27sk 비-암 피부 세포주에는 결합하였다. 그러므로 항체는 결합도와 반드시 관련되지는 않은 기능 특이성을 나타내었다.
실시예 2
시험관 내 결합
상기 하이브리도마를 CL-1000 플라스크 (BD Biosciences, Oakville, ON) 내에서 주 2 회 수집 및 재파종 (reseeding) 하면서 배양하여 AR59A367.7 단일클론 항체를 제조하였다. Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC) 를 이용한 표준 항체 정제 절차를 수행하였다. 인간화, 탈-면역화, 키메라화 또는 쥣과인 단일클론 항체를 이용하는 것은 본 발명의 범주 내에 속한다.
유방 (MDA-MB-231), 결장 (Lovo, DLD-1, SW620 및 SW1116), 전립선 (PC-3), 췌장 (AsPC-1 및 BxPC-3), 폐 (A549) 및 난소 (OVCAR-3) 암, 및 피부 (CCD-27sk) 및 폐 (Hs888.Lu) 로부터의 비-암 세포주에 대한 AR59A367.7 의 결합을 유세포 분석기 (FACS) 로 평가하였다. 모든 세포주들은, American Type Tissue Collection (ATCC; Manassas, VA) 으로부터 입수하였다.
먼저 DPBS (Ca++ 및 Mg++ 부재) 를 이용하여 세포 단층막을 세척하여 세포를 FACS 용으로 준비하였다. 그 다음, 세포 분리 완충액 (Invitrogen, Burlington, ON) 을 사용하여 세포를 37 ℃ 에서 각자의 세포 배양 플레이트로부터 분리시켰다. 원심분리 및 수집 후, 세포를 MgCl2, CaCl2 및 2 % 우태 혈청이 함유된 4 ℃ 의 DPBS (염색 매질) 에 재현탁하고, 계수한 후, 적절한 세포 밀도로 분취하고, 스핀 다운 (spin down) 하여 세포를 펠릿화하고, 시험 항체 (AR59A367.7) 또는 대조군 항체 (동종형 대조군, 항-EGFR) 의 존재 하의 4 ℃ 의 염색 매질에 재현탁하였다. 동종형 대조군 및 상기 시험 항체는 20 마이크로그램/mL 으로, 항-EGFR 은 5 마이크로그램/mL 으로, 얼음 상에서 30 분간 평가하였다. Alexa Fluor 546-공액체 2 차 항체를 첨가하기 전에 상기 세포를 염색 매질로 1 회 세척하였다. 그 후, 상기 염색 매질 중의 Alexa Fluor 546-공액체 항체를 4 ℃ 에서 30 분간 첨가하였다. 그 후, 세포를 마지막으로 세척하고, 고정화 매질 (1.5 % 파라포름알데히드가 함유된 염색 매질) 에 재현탁하였다. FACSarray™ System Software (BD Biosciences, Oakville, ON) 를 사용하는 FACSarray™ 상에 시료를 영동시켜 세포의 유세포 분석 획득값을 평가하였다. 전방 산란 (FSC) 및 측방 산란 (SSC) 검출기에 대해 전압 및 진폭 이득을 조정하여 상기 세포의 FSC 및 SSC 를 설정하였다. 염색되지 않은 세포를 영동시켜 세포가 대략 1 ~ 5 단위의 형광 강도 중앙값을 갖는 일정한 피크를 갖도록 형광 (Alexa-546) 채널용 검출기를 조정하였다. 각 시료에 대해, 분석을 위해 대략 10,000 회의 선택 사건 (gated event) (염색된 고정된 세포) 을 획득하였고, 결과는 도 2 에 나타내었다.
도 2 는 상기 동종형 대조군에 대한 평균 형광 강도 증가 배수를 제시한다. AR59A367.7 항체의 대표적인 히스토그램을 수집하여 도 3 에 나타내었다. AR59A367.7 은 비-암 피부 세포주 CCD-27sk 를 제외하고 시험된 세포주에 대한 결합을 입증하였다. 결장 DLD-1 (6.3 배), Lovo (5.9 배), SW620 (8.1 배) 및 SW1116 (4.7 배); 췌장 AsPC-1 (2.4 배) 및 BxPC-3 (2.6 배); 유방 MDA-MB-231 (2.1 배); 폐 A549 (2.8 배); 전립선 PC-3 (3.6 배) 및 난소 OVCAR-3 (6.4 배) 암 세포주 및 비-암 폐 Hs888.Lu (2.9 배) 세포주에 결합하였다. 이들 데이터는 또한 AR59A367.7 이 항원 발현 수준이 다양한 여러 상이한 세포주에 결합한 것을 입증한다.
실시예 3
BxPC-3 세포를 이용한 생체내 종양 실험
실시예 1 에 의해, AR59A367.7 이 인간 암 세포주들에 대해 항암 특성을 가진다는 것이 증명되었다. 도 4 및 5 를 참조로하여, 8 내지 10 주령의 암컷 SCID 마우스에 100 마이크로리터 PBS 용액 중의 5 백만 개의 인간 췌장암 세포 (BxPC-3) 를 목덜미에 피하로 주사하여 주입하였다. 상기 마우스를 임의로 5 마리씩의 2 개 처리군으로 나누었다. 주입 당일에, 20 mg/kg 의 AR59A367.7 시험 항체 또는 완충액 대조군의 저장 농축물 (stock concentration) 을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4 를 함유한 희석제를 이용하여 희석한 후 이를 300 마이크로리터 부피로 각 코호트에 복강내 투여하였다. 그 후 연구 기간 동안 상기 항체 및 대조군 샘플을 동일한 방식으로 주 1 회 투여하였다. 대략 제 7 일마다 캘리퍼스 (calipers) 로 종양 성장을 측정하였다. 본 연구는 항체 8 회 투여 후 완료되었다. 연구 기간 동안 주 1 회 동물의 체중을 기록하였다. 상기 연구의 종료시 모든 동물들을 CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR59A367.7 은 인간 췌장암의 BxPC-3 생체내 예방적 모델에서 종양 성장을 감소시켰다. ARIUS 항체 AR59A367.7 로 처리함에 의해 BxPC-3 종양의 성장이 마지막 항체 투여 후 제 6 일에, 제 56 일에 측정된 완충액 처리 대조군과 비교하여 55.2 % (p=0.0290, t-테스트) 감소하였다 (도 4). 이 시점에, 대조군 및 항체-처리군 내의 모든 마우스들은 여전히 살아있었다. 본 연구는 마지막 항체 투여 13 일 후, 제 63 일까지 지속되었다. 대조군 내의 1 마리 마우스 및 항체-처리군 내의 2 마리 마우스를 종양 병변으로 인해 제 56 일과 제 63 일 사이에서 연구로부터 제거되었다 (연구 종료시점 중 하나). 그러나, 제 63 일에, AR59A367.7 은 여전히 59.4 % (p=0.1663, t-테스트) 로 BxPC-3 종양의 성장 억제를 입증하였다.
본 연구 전체에 걸쳐 임상적인 독성 징후는 없었다. 1 주일 간격으로 측 정한 체중은 건강함 및 성장 실패에 대한 대리지표였다. 본 연구 기간 동안 모든 군에 있어서 평균 체중이 증가하였다 (도 5). 제 6 일 내지 제 56 일 사이에 얻어진 평균 중량은 대조군에서는 2.0 g (10.1 %), AR59A367.7-처리군에서는 2.0 g (10.2 %) 었다. 처리 기간 종료시에 그룹 간의 평균 체중에는 유의한 차이가 없었다.
요컨대, AR59A367.7 은 본 인간 췌장암 이종이식 모델에서 만족스럽게 용인되었고, 종양 하중을 유의하게 감소시켰다.
실시예 4
경쟁적 결합자의 단리
항체가 주어지면, 당업자는 경쟁적으로 저해하는 CDMAB, 예를 들어 경쟁 항체를 생성할 수 있는데, 이는 동일한 에피토프를 인지하는 항체이다 (Belanger L et al. Clinica Chimica Acta 48:15-18 (1973)). 한 가지 방법은 상기 항체에 의해 인지되는 항원을 발현하는 면역원으로 면역화하는 것을 수반한다. 샘플에는 하기에 제한되는 것은 아니나, 조직, 단리된 단백질(들) 또는 세포주(들) 가 포함될 수 있다. 결과적으로 생성되는 하이브리도마는 경쟁 검정법을 사용하여 스크리닝할 수 있는데, 이는 시험 항체의 결합을 저해하는 항체를 규명하는 것으로, 예컨대 ELISA, FACS 또는 웨스턴 블랏팅이 있다. 또 다른 방법으로는, 파지 디스플레이 항체 라이브러리 및 상기 항원의 하나 이상의 에피토프를 인지하는 항체에 대한 패닝 (panning) 을 이용할 수 있다 (Rubinstein JL et al. Anal Biochem 314:294-300 (2003)). 두 경우 모두에서, 항체는 그의 표적 항원의 하 나 이상의 에피토프에 대한 본래의 표지된 항체의 결합을 대체하는 그의 능력에 기초하여 선택된다. 따라서 이러한 항체는 본래의 항체처럼 상기 항원의 하나 이상의 에피토프를 인지하는 특성을 지닐 것이다.
실시예 5
AR59A367.7 단일클론 항체의 가변 영역의 클로닝
AR59A367.7 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 로부터의 가변 영역의 서열을 결정할 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 RNA 는, 구아니디늄 이소티오시아네이트를 이용한 세포 용해를 수반하는 표준 방법을 사용하여 대상 하이브리도마로부터 추출할 수 있다 (Chirgwin et al. Biochem. 18:5294-5299 (1979)). 상기 mRNA 를, 당업계에 공지된 PCR 방법론에 의해 후속적인 VH 및 VL 유전자의 단리를 위한 cDNA 를 제조하는데 사용할 수 있다 (Sambrook et al., eds., Molecular Cloning, Chapter 14, Cold Spring Harbor laboratories Press, N.Y. (1989)). 상기 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열은 자동화 Edman 서열분석으로 독립적으로 결정될 수 있다. CDR 및 플랭킹 (flanking) FR 에 대한 추가적인 서열은 또한 VH 및 VL 조각에 대한 아미노산 서열분석으로 결정할 수 있다. 그 후 AR59A367.7 단일클론 항체로부터의 VH 및 VL 유전자의 단리를 위해 합성 프라이머를 설계할 수 있고, 단리된 유전자를 적절한 서열분석용 벡터 내로 라이게이션할 수 있다. 키메라 및 인간화 IgG 를 생성하기 위해서, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 적절한 발현용 벡터 내 로 서브클로닝할 수 있다.
(i) 단일클론 항체
단일클론 항체 (실시예 1 에 개요된 바와 같은 것) 를 코딩하는 DNA 는 통상의 절차를 이용하여 (예를 들어, 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석된다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 에 대한 바람직한 공급원을 담당한다. 상기 DNA 가 일단 분리되면, 이를 발현 벡터 내에 위치시킬 수 있는데, 상기 벡터를 그 후, 다른 경우에는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 E. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 트랜스펙션하여, 재조합 숙주 세포에서의 단일클론 항체의 합성을 달성한다. 또한, 예를 들어, 상동 쥣과 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 대체함으로써, 상기 DNA 를 변형시킬 수 있다. 키메라 또는 하이브리드 항체 또한, 가교제를 수반한 것을 비롯한 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 사용하여, 시험관내 제조할 수 있다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적당한 시약의 예로서는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티리미데이트가 있다.
(ii) 인간화 항체
인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "이입" 잔기로 지칭되는데, 이들 은 전형적으로 "이입" 가변 도메인에서 취해진다. 인간화는 인간 항체의 CDR 또는 CDR 서열을 대응하는 설치류 서열로 대체함에 의한 Winter 및 동료의 방법으로 수행될 수 있다 (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000) 에 리뷰됨).
인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3 차원 모델을 이용한 모 서열 및 다양한 개념상의 인간화 생성물에 대한 분석 방법으로 제조가능하다. 3 차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하고, 당업자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3 차원적 형태 구조를 도시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 검토함으로써, 후보 면역글로불린 서열의 작용에 있어서 상기 잔기의 가능한 역할에 대한 분석, 즉 그의 항원에 결합하는 상기 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기에 대한 분석이 가능하게 된다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들) 에 대한 증가된 친화력이 달성되도록, 공통 및 이입 서열로부터 FR 잔기를 선택 및 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 끼침에 있어 직접적으로 및 가장 실질적으로 연관되어 있다.
(iii) 항체 조각
항체 조각의 제조를 위한 다양한 기술들이 개발되었다. 이들 조각은 재조합 숙주 세포에 의해 생성가능하다 (Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999) 에 리뷰됨; Little et al, Immunol. Today 21:364-370 (2000)). 예를 들어, Fab'-SH 조각을 E. 콜라이에서 직접 회수하여 화학적으로 커플링하여 F(ab')2 조각을 형성시킬 수 있다 (Carter et al., Biotechnology 10:163-167 (1992)). 또 다른 구현예에서는, F(ab')2 분자의 어셈블리를 촉진하는 류신 지퍼 (zipper) GCN4 를 사용하여 F(ab')2 를 형성한다. 또 다른 접근법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 조각을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리할 수 있다.
실시예 6
본 발명의 항체를 포함하는 조성물
본 발명의 항체를 암 방지/치료를 위한 조성물로 사용할 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는 암 방지/치료를 위한 조성물은 저독성이며, 그대로 액체 제제의 형태로, 또는 적당한 제제의 약학 조성물로서 인간 또는 포유류 (예를 들어, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 경구적으로 또는 비경구적으로 (예를 들어, 혈관내로, 복강내로, 피하로 등) 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 그 자체로 투여될 수도 있고, 또는 적절한 조성물로서 투여될 수도 있다. 투여에 사용되는 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 염과 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수도 있다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 약학 제제의 형태로 제공된다.
비경구 투여를 위한 조성물의 예는 주사제, 좌약 등이다. 주사제에는 정맥, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입, 관절내 주사 등과 같은 투여 형태가 포함될 수 있다. 이들 주사제는 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들 어, 주사제는 본 발명의 항체 또는 이의 염을 주사에 통상 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질 중에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 제조할 수 있다. 주사용 수성 매질로서는, 예를 들어, 생리 식염수, 글루코오스 및 기타 보조제를 함유한 등장액 등이 있는데, 이들을 알콜 (예를 들어, 에탄올), 다가알콜 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (경화 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가생성물)) 등과 같은 적절한 가용화제와 조합하여 사용할 수 있다. 유성 매질로서는, 예를 들어, 참깨유, 대두유 등이 이용되는데, 이들을 벤질 벤조에이트, 벤질 알콜 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용할 수 있다. 이렇게 제조된 주사제는 보통 적절한 앰풀에 채워진다. 직장 투여에 사용되는 좌약은 본 발명의 항체 또는 이의 염을 통상의 좌약용 기제와 혼련하여 제조할 수 있다. 경구 투여용 조성물에는, 고체 또는 액체 제제가 포함되며, 구체적으로, 정제 (당의정 및 필름코팅정 포함), 환제, 과립, 분말제, 캡슐 (연질 캡슐 포함), 시럽, 에멀젼, 현탁제 등이 있다. 이러한 조성물은 공지의 방법으로 제조되며, 약학 제제 분야에서 통상 사용되는 비히클 (vehicle), 희석제 또는 부형제를 함유할 수도 있다. 정제를 위한 비히클 또는 부형제의 예는 락토오스, 전분, 수크로오스, 마그네슘 스테아레이트 등이다.
유리하게는, 상기 기술한 경구 또는 비경구 용도를 위한 조성물은 상기 활성 성분의 용량에 맞도록 적합하게 된 단위 용량을 가진 약학 제제로 제조된다. 이러한 단위 용량 제제에는, 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐, 주사제 (앰플), 좌약 등이 포함된다. 상기한 화합물의 함유량은 일반적으로 투여 단위 형태당 5 내지 500 mg 이며; 상기 기술한 항체는 특별히 주사 형태에서는 약 5 내지 약 100 mg, 및 기타 형태에서는 10 내지 250 mg 으로 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체를 포함하는 상기한 예방/치료제 또는 조절자의 투여은 투여되는 대상, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 성인에서 유방암을 치료/예방하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 20 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 10 mg, 더욱 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 5 mg 의 투여량으로, 1 일 약 1 내지 5 회, 바람직하게는 1 일 약 1 내지 3 회 정맥내로 투여하는 것이 유리하다. 기타 비경구 및 경구 투여에서는, 상기 제제를 상기 제시한 투여량에 상응하는 용량으로 투여할 수 있다. 상태가 특별히 심한 경우에는, 해당 상태에 따라 상기 투여량을 증가시킬 수도 있다.
본 발명의 항체는 그대로 또는 적절한 조성물의 형태로 투여할 수 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 상기한 항체 또는 그의 염과 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여 (예를 들어, 혈관내 주사, 피하 주사 등) 에 적당한 약학 제제의 형태로 제공된다. 상기 기술한 각 조성물은 기타의 활성 성분을 추가로 함유할 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체를 다른 약물들, 예를 들어, 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파미드 등), 대사 길항제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 등), 항-종양 항생제 (예를 들어, 미토마이신, 아드리아마이 신 등), 식물 유래 항-종양제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈데신, 택솔 (Taxol) 등), 시스플라틴, 카르보플라틴, 에토포시드, 이리노테칸 등과 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 및 상기 기술한 약물은 환자에 동시에 또는 시차를 두고 투여할 수 있다.
우세한 증거들은 AR59A367.7 이 암 세포주 상에 존재하는 에피토프의 라이게이션을 통해 항암 효과를 매개한다는 것을 보여준다. 나아가 AR59A367.7 항체가, 이에 제한되는 것은 아니나 FACS, 세포 ELISA 또는 IHC 로 예시되는 기술을 이용하여 상기 항체에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프를 발현하는 세포를 검출하는데 있어 사용될 수 있는 것을 밝힐 수 있었다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속한 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개물은, 각 개별 공개물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지적되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 형태가 설명되지만, 본 발명을 본원에 기술된 및 나타낸 부분의 특정 형태 또는 배열로 제한시키고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 가해질 수 있으며, 본 발명이 본 명세서에 나타내고 기재된 것에 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
당업자는 본 발명이 상기 목표를 수행하고 언급된 목적 및 이점, 뿐만 아니라 그에 내재된 목적 및 이점을 달성하기에 충분히 적합하게 되어있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리 펩티드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 절차 및 기술은 현재 바람직한 구현예를 대표하며, 예시적인 것으로 의도된 것이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도한 것이 아니다. 본 발명의 취지에 포함되며 첨부된 청구항의 범주로 정의되는 상기에서의 변경 및 기타 용도가 당업자에게 떠오를 것이다. 본 발명을 특정 바람직한 구현예와 관련하여 기술하였지만, 청구된 본 발명이 이러한 특정 구현예에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하여야 한다. 사실상, 기재된 본 발명의 수행 양식에 대한, 당업자에게 자명한 다양한 변형은 하기 청구항의 범주 내에 속하는 것으로 하고자 한다.
Figure 112009068361805-PCT00001
Figure 112009068361805-PCT00002

Claims (47)

  1. IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체.
  2. IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체 또는 상기 인간화 항체로부터 생성되는 항원 결합 조각.
  3. IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체 또는 상기 키메라 항체로부터 생성되는 항원 결합 조각.
  4. IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 단리된 하이브리도마 세포주.
  5. 하기를 포함하는, 인간 종양으로부터 선택된 조직 샘플 내의 암 세포의 항체 유도성 세포독성을 개시하는 방법:
    상기 인간 종양으로부터 조직 샘플을 제공하는 단계;
    IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체, 상기 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의 해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체, 상기 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체 또는, 상기 단리된 단일클론 항체의 그의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 이의 CDMAB 를 제공하는 단계; 및
    상기 단리된 단일클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이의 CDMAB 를 상기 조직 샘플에 접촉시키는 단계;
    여기서, 상기 단리된 단일클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이의 CDMAB 가 상기 조직 샘플에 결합함에 의해 세포독성이 유도됨.
  6. 제 1 항의 단리된 단일클론 항체의 CDMAB.
  7. 제 2 항의 인간화 항체의 CDMAB.
  8. 제 3 항의 키메라 항체의 CDMAB.
  9. 세포독성 부분, 효소, 방사능 화합물, 및 조혈 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 일원과 공액된 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 CDMAB.
  10. 인간 종양이 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생 성되는 단리된 단일클론 항체 또는, 상기 단리된 단일클론 항체가 그의 표적 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 이의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는, 포유류에게 상기 단일클론 항체 또는 이의 상기 CDMAB 를 상기 포유류의 종양 하중을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 항체 유도성 세포독성에 취약한 인간 종양의 치료 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 공액되는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사능 동위원소인 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포 세포독성을 매개하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 인간화되는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 키메라성인 방법.
  17. IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체와 동일한 에피토프(들) 에 특이적 결합이 가능한 단일클론 항체.
  18. 인간 종양이 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는, 상기 단리된 단일클론 항체가 그의 표적 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 이의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는, 포유류에게 상기 단일클론 항체 또는 이의 상기 CDMAB 를 상기 포유류의 종양 하중을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 인간 종양의 치료 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 공액되는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사능 동위원소인 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포 세포독성을 매개하는 방법.
  23. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 인간화되는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 키메라성인 방법.
  25. 인간 종양이 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는, 상기 단리된 단일클론 항체가 그의 표적 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 이의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는, 포유류에게 상기 단일클론 항체 또는 이의 상기 CDMAB 를 하나 이상의 화학요법제와 함께 상기 포유류의 종양 하중을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 인간 종양의 치료 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 공액되는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사능 동위원소인 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포 세포독성을 매개하는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 인간화되는 방법.
  31. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 키메라성인 방법.
  32. IDAC 등록번호 010207-02 의 하이브리도마 세포주 AR59A367.7 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체, 상기 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체 또는 상기 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체에 특이적으로 결합되는, 인간 종양으로부터 선택되는 조직 샘플 중의 암세포의 존재를 측정하기 위한 하기를 포함하는 결합 검정법:
    상기 인간 종양으로부터 조직 샘플을 제공하는 단계;
    IDAC 등록번호 010207-02 의 하이브리도마 세포주 AR59A367.7 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 의해 인지되는 것과 동일한 에피토프(들) 을 인지하는 상기 하나 이상의 단리된 단일클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이의 CDMAB 를 제공하는 단계;
    상기 하나 이상의 제공된 항체 또는 이의 CDMAB 를 상기 조직 샘플에 접촉시키는 단계; 및
    상기 하나 이상의 제공된 항체 또는 이의 CDMAB 와 상기 조직 샘플과의 결합을 측정하여, 상기 조직 샘플 중의 상기 암세포의 존재를 나타내는 단계.
  33. 인간 종양이 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는, 상기 단리된 단일클론 항체가 그의 표적 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 이의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는, 포유류에게 상기 단일클론 항체 또는 이의 상기 CDMAB 를 상기 포유류의 인간 종양 하중을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 종양 하중의 감소를 위한 단일클론 항체의 용도.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 공액되는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사능 동위원소인 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  37. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포 세포독성을 매개하는 방법.
  38. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 인간화되는 방법.
  39. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 키메라성인 방법.
  40. 인간 종양이 IDAC 에 등록번호 010207-02 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는, 상기 단리된 단일클론 항체가 그의 표적 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 이의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는, 포유류에게 상기 단일클론 항체 또는 이의 상기 CDMAB 를 하나 이상의 화학요법제와 함께 상기 포유류의 인간 종양 하중을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 종양 하중의 감소를 위한 단일클론 항체의 용도.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 공액되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사능 동위원소인 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  44. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 CDMAB 가 항체 의존성 세포 세포독성을 매개하는 방법.
  45. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 인간화되는 방법.
  46. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단일클론 항체가 키메라성인 방법.
  47. 인간 암 종양의 치료에 효과적인, 하기를 조합으로 포함하는 인간 암 종양의 치료에 효과적인 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항 또는 제 17 항 중 어느 한 항의 항체 또는 CDMAB;
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 조각과 세포독성 부분, 효소, 방사능 화합물 및 조혈 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 일원과의 공액체; 및
    필요량의 약학적으로 허용가능한 담체.
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