ES2829597T3 - Anticuerpo humanizado anti-CDH3, conjugado de fármaco del mismo y utilización del mismo - Google Patents

Anticuerpo humanizado anti-CDH3, conjugado de fármaco del mismo y utilización del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2829597T3
ES2829597T3 ES14751339T ES14751339T ES2829597T3 ES 2829597 T3 ES2829597 T3 ES 2829597T3 ES 14751339 T ES14751339 T ES 14751339T ES 14751339 T ES14751339 T ES 14751339T ES 2829597 T3 ES2829597 T3 ES 2829597T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
cdh3
cancer
seq
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14751339T
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Perseus Proteomics Inc
Original Assignee
Perseus Proteomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Perseus Proteomics Inc filed Critical Perseus Proteomics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2829597T3 publication Critical patent/ES2829597T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Anticuerpo humanizado anti-CDH3 expuesto en uno cualquiera de los siguientes (1) o (2): (1) un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 50 en la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 51 en la región variable de cadena ligera; (2) un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 54 en la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 55 en la región variable de cadena ligera.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo humanizado anti-CDH3, conjugado de fármaco del mismo y utilización del mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado anti-CDH3 y a un inmunocomplejo del mismo, y particularmente a un conjugado de fármaco del mismo. Además, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado anti-CDH3 ya un inmunocomplejo del mismo para su uso en un método de tratamiento tal como se define en las reivindicaciones.
Antecedentes de la técnica
El cáncer es una enfermedad grave que representa una de las principales causas de muerte. Sin embargo, aún no se han satisfecho las necesidades terapéuticas para ello. En los últimos años, con el fin de superar el problema de la quimioterapia convencional que provoca daño incluso a las células normales, se han realizado estudios intensivos sobre la terapia contra el cáncer usando fármacos dirigidos molecularmente, en los que se diseña un fármaco que se dirige a una molécula específica que se expresa específicamente en una célula cancerosa y luego se lleva a cabo la terapia con el fármaco.
Como una de las dianas, se ha identificado CDH3 (P-cadherina), que es un antígeno de la superficie de la membrana celular. La CDH3 es una proteína de membrana que se ha descubierto como una molécula que depende del calcio y se asocia con la adhesión de células hemofílicas (Yoshida y Takeichi, Cell 28: 217-224, 1982 (documento no de patente 1)). Una proteína, que tiene repeticiones de cadherina que consiste en aproximadamente 110 residuos de aminoácido que tienen una alta homología entre sí, se denomina “superfamilia de cadherina”, y CDH3 es un miembro principal de la superfamilia de cadherina.
Se ha informado de un aumento en la expresión de CDH3 en determinados tipos de células cancerosas. Por tanto, se ha estudiado la terapia contra el cáncer en la que se usa un anticuerpo en células cancerosas que tienen una mayor expresión de CDH3 en tejidos cancerosos que en tejidos normales (documentos WO 2002/097395 (documento de patente 1), WO 2007/102525 (documento de patente 2), publicación de patente japonesa (Kohyo) n.° 2011-526583 A (documento de patente 4) y WO 2011/080796 A1 (documento de patente 5)).
Un gran número de fármacos dirigidos a moléculas, que se dirigen a un antígeno específico tal como se mencionó anteriormente, ya se han comercializado como fármacos de anticuerpos, y la mayoría de los fármacos tienen citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC; Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) como un modo de acción principal. Sin embargo, sus efectos farmacológicos no son necesariamente suficientes y, por tanto, el desarrollo de la tecnología avanza hacia el logro de un efecto anticanceroso más fuerte.
Un medio eficaz para mejorar la capacidad anticancerosa de un anticuerpo es la unión del anticuerpo a una sustancia que tiene una fuerte toxicidad (toxina). Si la toxina sola se administrara a un paciente, también afectaría a los tejidos normales y, por tanto, no podría ser un medio terapéutico eficaz. Sin embargo, como resultado de la unión de la toxina a un anticuerpo que se une a un antígeno específico de la célula cancerosa, la toxina es capaz de lograr la capacidad de destruir sólo las células cancerosas, mientras que no afecta a los tejidos normales. Un fármaco de este tipo se denomina conjugado anticuerpo-fármaco (ADC; Antibody Drug Conjúgate, conjugado anticuerpo-fármaco). Es decir, una toxina no muestra toxicidad en un estado en el que se une a un anticuerpo. Sin embargo, cuando un determinado tipo de anticuerpo se une a una célula que expresa un antígeno diana, se incorpora en la célula y luego se descompone por un lisosoma. Por consiguiente, el determinado tipo de anticuerpo, al que se une una toxina, se incorpora en la célula y luego se descompone en ella, de modo que se libera la toxina. Como resultado, la toxina se expresa sólo en una célula específica, y luego se destruye la célula por su efecto.
Los ejemplos de un principio activo usado en ADC incluyen toxinas proteicas bacterianas tales como toxina diftérica, toxinas proteicas vegetales tales como ricina y toxinas de bajo peso molecular tales como una auristatina, un maitansinoide o una caliqueamicina y derivados de los mismos.
En el ADC, un fármaco que se une a un anticuerpo circula en la sangre y luego se acumula en un tumor diana y, posteriormente, presenta sus efectos farmacológicos. La liberación de un fármaco en sitios distintos a los del tumor (la liberación del anticuerpo) no es necesariamente preferible porque es probable que provoque efectos secundarios. Es decir, un fármaco que se une a un anticuerpo se diseña preferiblemente de modo que se retire del anticuerpo después de que se haya incorporado a una célula.
En los últimos años, desde el punto de vista mencionado anteriormente, un fármaco (nombre del fármaco desarrollado: T-DM1), en el que una toxina se une, a través de un ligador no escindible (SMCC), a trastuzumab que ya estaba disponible comercialmente como agente terapéutico para el cáncer de mama, ha sido desarrollado por Genentech, y se han obtenido efectos clínicos extremadamente altos (N. Engl. J. Med. 8 de noviembre de 2012; 367 (19): 1783-91 (documento no de patente 2)). Además, también se ha desarrollado un conjugado anticuerpo-fármaco, en el que un anticuerpo se une a un componente de fármaco a través de un ligador escindible. Por ejemplo, Immunogen ha promovido el desarrollo de un conjugado anticuerpo-fármaco, en el que un fármaco se une a un anticuerpo HuN901 a través de un ligador escindible (SPP), que se dirige a enfermedades que expresan el antígeno de NCAM.
Además, también se ha desarrollado un agente para radioinmunoterapia, en el que un material radiactivo se une a un anticuerpo y el anticuerpo así obtenido se somete a la radioinmunoterapia. Como fármaco formado por la unión de un material radiactivo 90Y (itrio) o 111In (indio) a un anticuerpo quimérico anti-CD20, se ha comercializado Zevalin (nombre común: ibritumomab tiuxetán).
Cuando el presente anticuerpo se usa en forma de un conjugado de fármaco o similar, y en particular, cuando el anticuerpo se administra a un paciente durante un largo periodo de tiempo, la inmunogenicidad del anticuerpo que va a administrarse que puede generar un anticuerpo contra una inmunoglobulina heteróloga (por ejemplo, un anticuerpo humano anti-IgG de ratón (HAMA)) es deseablemente un mínimo o nada. Es ventajoso producir un conjugado de fármaco usando un anticuerpo de este tipo.
Como medio para obtener un anticuerpo de este tipo, por ejemplo, una técnica de producción de un anticuerpo humanizado combinando la región determinante de complementariedad (CDR) obtenida de un organismo heterólogo como un ratón con la región de entramado (FR) de un anticuerpo derivado de un humano ha sido comúnmente usada por un experto en la técnica (publicación de patente japonesa (Kokai) n.° 2005-000169 A (documento de patente 12) y la patente japonesa n.° 4836147 (documento de patente 13)). Sin embargo, cuando se combina una FR inapropiada con una CDR, con frecuencia se obtienen resultados no deseables tales como la desaparición de la afinidad y una disminución de la estabilidad. Para hacer frente a tales fenómenos, se ha llevado a cabo un método denominado “remodelación”, que comprende la sustitución de residuos de aminoácido derivados del anticuerpo que actúa como donante de trasplante con residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes en la región de entramado. Si se llevaran a cabo las sustituciones apropiadas, se podría mejorar una reducción en la afinidad posiblemente provocada por la humanización (Nature; 332, pág. 323 (1988) documento no de patente 3), y patente estadounidense n.° 6180370 (documento de patente 3)).
Por tanto, la secuencia de CDR derivada de un organismo heterólogo tal como un ratón y la secuencia de FR derivada de un humano, que se usan en el presente anticuerpo humanizado, son preferiblemente 100% idénticas a sus secuencias de aminoácidos originales. Sin embargo, la sustitución de residuos de aminoácido se lleva a cabo comúnmente con el propósito de mantener la unión de un anticuerpo a un antígeno en el procedimiento de humanización y quimerización. Con el fin de mantener la afinidad, también es preferible añadir una modificación genética a un anticuerpo dentro de un intervalo en el que la capacidad de unión del anticuerpo a CDH3 se mantiene y la inmunogenicidad del mismo no aumenta extremadamente. La secuencia que consiste en CDR y FR, que se combinan para la humanización, muestra una homología de secuencia de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más, con la secuencia original, o es el 100% idéntica a la secuencia original. Se considera que el anticuerpo que comprende una secuencia parcialmente modificada de este tipo es un anticuerpo que mantiene las propiedades de la CDR derivadas del hibridoma original, en el sentido de que se une específicamente a un epítopo específico de CDH3.
Usando el anticuerpo humanizado así obtenido, la inmunogenicidad del anticuerpo se mantiene al mínimo y, además, se proporciona un inmunocomplejo que comprende el anticuerpo humanizado, que tiene una fuerte citotoxicidad tal como ADC, para el tratamiento de enfermedades. Esto beneficia claramente a los pacientes a los que se les administra el fármaco. Además, en el presente campo técnico, existe una demanda adicional de fármacos usados para tratar diversos cánceres tales como cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de mama. Un ejemplo de un fármaco de este tipo que es particularmente útil para este fin es un conjugado fármaco-anticuerpo humanizado anti-CDH3, que tiene una toxicidad significativamente baja, pero tiene una eficacia terapéutica ventajosa.
El documento WO 2012/057328 A1 describe que un anticuerpo que reconoce EC1 de CDH3 se internaliza in vitro, pero no muestra ningún ejemplo de anticuerpo humanizado.
Bibliografía de patentes
Documento de patente 1: WO 2002/097395
Documento de patente 2: WO 2007/102525
Documento de patente 3: patente estadounidense n.° 6180370
Documento de patente 4: publicación de patente japonesa (Kohyo) n.° 2011-526583 A
Documento de patente 5: WO 2011/080796 A1
Documento de patente 6: WO 2013/150623
Documento de patente 7: EP239400
Documento de patente 8: WO 96/02576
Documento de patente 9: publicación de patente japonesa (Kohyo) n.° 2008-516896 A
Documento de patente 10: patente estadounidense n.° 5.208.020
Documento de patente 11: patente estadounidense n.° 6.333.410 B1
Documento de patente 12: publicación de patente japonesa (Kokai) n.° 2005-000169 A
Documento de patente 13: patente japonesa n.° 4836147
Documento no de patente
Documento no de patente 1: Yoshida y Takeichi, Cell 28: 217-224, 1982
Documento no de patente 2: N. Engl. J. Med. 8 de noviembre de 2012; 367(19): 1783-91
Documento no de patente 3: Nature; 332, pág. 323 (1988)
Documento no de patente 4: Somat. Cell. Mol. Genet; 12, pág. 5555 (1986)
Documento no de patente 5: Nature; 276, pág. 269 (1978)
Documento no de patente 6: Cancer Res.; 68(22), pág. 9280 (2008)
Documento no de patente 7: Nature Biotechnology; 26(8), pág. 925 (2008)
Documento no de patente 8: Bio Conjugate Chemistry; 19, pág. 1673 (2008)
Documento no de patente 9: Cancer Res.; 68(15), pág. 6300 (2008)
Documento no de patente 10: Analytical Biochemisty; 173, pág. 93 (1988)
Documento no de patente 11: “Phage Display - A Laboratory Manual -” PROTOCOLO 9.5
Documento no de patente 12: J. Med. Chem.; 49, pág. 4392 (2006)
Documento no de patente 13: Cancer Res.; 52, pág. 127 (1992)
Documento no de patente 14: Journal of Immunology; 169, pág. 1119 (2002)
Documento no de patente 15: Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, MD (1991)
Documento no de patente 16: J. Mol Biol.; 196, pág. 901 (1987)
Documento no de patente 17: J. Immunol.; 151, pág. 2296 (1993)
Documento no de patente 18: J. Mol. Biol.; 196: pág. 901 (1987))
Documento no de patente 19: Biotechnology; 9, pág. 266 (1991)
Documento no de patente 20: Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 89, pág. 4285 (1992)
Documento no de patente 21: Methods. Mol. Biol.; 525, pág. 445 (2009)
Sumario de la invención
Objeto que va a resolverse mediante la invención
Un objeto de la presente invención es producir un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que tenga menor inmunogenicidad, y proporcionar un conjugado fármaco-anticuerpo humanizado anti-CDH3 que comprenda el anticuerpo humanizado anti-CDH3 mencionado anteriormente que destruye de manera más eficaz las células cancerosas que expresan CDH3.
Medios para resolver el objeto
Como resultado de estudios intensivos dirigidos a lograr el objeto mencionado anteriormente, los presentes inventores han combinado las secuencias de CDR de un anticuerpo que reconoce específicamente CDH3 con diversas secuencias de FR derivadas de humanos, y han introducido mutaciones de aminoácidos apropiadas en las mismas para mejorar la afinidad, de modo que los inventores han producido un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que tiene baja inmunogenicidad. Después de eso, usando este anticuerpo humanizado anti-CDH3, los presentes inventores han logrado producir un conjugado fármaco-anticuerpo humanizado anti-CDH3 que destruye de manera más eficaz las células cancerosas que expresan CDH3, completando así la presente invención.
La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado anti-CDH3, que se define en las reivindicaciones adjuntas.
También se divulga un anticuerpo humanizado anti-CDH3, que comprende secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR-H1, H2 y H3) derivadas de la región variable de cadena pesada de un anticuerpo producido por células que tienen el número de registro NITE BP-1536 (a continuación en el presente documento este anticuerpo de ratón se denomina número de anticuerpo: PPAT-076-44M) y secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR-L1, L2 y L3) derivadas de la región variable de cadena ligera del mismo, y que también comprende los residuos del entramado consenso del subgrupo III de cadena pesada humana y los residuos del entramado consenso del subgrupo I de cadena ligera humana k.
La presente divulgación proporciona además un anticuerpo humanizado anti-CDH3, que comprende las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR-H1, H2 y H3) de la región variable de cadena pesada que se muestran en SEQ ID NO: 56, s Eq ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 respectivamente, y las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR-L1, L2 y L3) de la región variable de cadena ligera que se muestran en SEQ ID NO: 59, Se Q ID NO: 60 y Se Q ID NO: 6 l respectivamente, y que también comprende los residuos del entramado consenso del subgrupo III de cadena pesada humana y los residuos del entramado consenso del subgrupo I de cadena ligera humana k.
La presente divulgación proporciona además un anticuerpo humanizado anti-CDH3, que comprende secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR-H1, H2 y H3) derivadas de la región variable de cadena pesada de un anticuerpo producido por células que tienen el número de registro NITE BP-1536, y secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR-L1, L2 y L3) derivadas de la región variable de cadena ligera de la misma, y que también comprende secuencias de la región de entramado que se derivan de una línea germinal humana y se seleccionan con una alineación óptima.
La presente divulgación proporciona además un anticuerpo humanizado anti-CDH3, que comprende las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR-H1, H2 y H3) de la región variable de cadena pesada que se muestran en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 respectivamente, y las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR-L1, L2 y L3) de la región variable de cadena ligera que se muestran en SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61 respectivamente, y que también comprende secuencias de la región de entramado que se derivan de una línea germinal humana y se seleccionan con una alineación óptima.
La presente divulgación proporciona además un anticuerpo humanizado anti-CDH3, que muestra una homología de secuencia de al menos el 90% con el anticuerpo humanizado anti-CDH3 mencionado anteriormente, y que es capaz de reconocer CDH3.
La presente divulgación proporciona además un anticuerpo humanizado anti-CDH3, en el que de uno a varios aminoácidos en las porciones de la región de entramado del anticuerpo mencionado anteriormente se sustituyen con otros aminoácidos, y el anticuerpo humanizado anti-CDH3 es capaz de reconocer CDH3.
La presente divulgación proporciona además un anticuerpo humanizado anti-CDH3, en el que de uno a varios aminoácidos en las secuencias de la región determinante de complementariedad del anticuerpo mencionado anteriormente, que están en el límite con las regiones de entramado, están sustituidos con otros aminoácidos, y el humanizado anti-CDH3 es capaz de reconocer CDH3.
Preferiblemente, el aminoácido que va a sustituirse es el aminoácido en la posición 55 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena ligera.
Preferiblemente, los aminoácidos que van a sustituirse son uno o más seleccionados de los aminoácidos en las posiciones 49, 71 y 78 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena pesada.
Preferiblemente, el aminoácido en la posición 55 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena ligera se sustituye por alanina.
Preferiblemente, el aminoácido en la posición 71 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena pesada se sustituye por lisina.
Preferiblemente, el aminoácido en la posición 78 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena pesada se sustituye por valina.
Preferiblemente, el aminoácido en la posición 49 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena pesada se sustituye por alanina.
Preferiblemente, el anticuerpo anteriormente mencionado tiene una o más sustituciones seleccionadas de la sustitución del residuo de aminoácido en la posición 49 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena pesada por alanina, la sustitución del residuo de aminoácido en la posición 71 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena pesada por lisina, la sustitución del residuo de aminoácido en la posición 78 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena pesada por valina, y la sustitución del residuo de aminoácido en la posición 55 (numeración de Kabat) en la región variable de cadena ligera por alanina.
La presente invención proporciona un anticuerpo expuesto en uno cualquiera de los siguientes:
(2) un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 50 en la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 51 en la región variable de cadena ligera; (número de anticuerpo: PPAT-076-44Hb) y
(4) un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 54 en la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 55 en la región variable de cadena ligera: (número de anticuerpo: PPAT-076-44Hd).
Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención tiene capacidad para unirse a CDH3.
Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención es Fab, F(ab')2 o scFv.
La presente invención proporciona además una secuencia parcial del anticuerpo mencionado anteriormente, en la que la secuencia parcial tiene capacidad para unirse a CDH3.
Preferiblemente, la CDH3 es CDH3 humana.
Preferiblemente, la CDH3 es una región extracelular mostrada en SEQ ID NO: 2 (correspondiente a los aminoácidos 1-654 de SEQ ID NO:2).
La presente invención proporciona además un inmunocomplejo, en el que el anticuerpo humanizado anti-CDH3 mencionado anteriormente de la invención, el fragmento del mismo, o la secuencia parcial del mismo se conjuga con un agente quimioterápico a través de un ligador.
Preferiblemente, el agente quimioterápico es una sustancia citotóxica.
Preferiblemente, la sustancia citotóxica es un maitansinoide o un derivado del mismo, o una auristatina o un derivado de la misma.
Preferiblemente, la sustancia citotóxica es un maitansinoide seleccionado de DM1, DM3 y DM4, o un derivado del mismo, o una auristatina seleccionada de MMAE y MMAF, o un derivado de la misma.
Preferiblemente, un promedio de una a siete moléculas de DM1 se unen a una única molécula del anticuerpo humanizado anti-CDH3, el fragmento del mismo, o la secuencia parcial del mismo.
Preferiblemente, el anticuerpo humanizado anti-CDH3, el fragmento del mismo, o la secuencia parcial del mismo se conjuga con un agente quimioterápico, a través de un enlace disulfuro intramolecular en la región Fc del anticuerpo, o modificando la región Fc del anticuerpo a través de una técnica de ingeniería genética.
Preferiblemente, el ligador es un reactivo de reticulación de reacción divalente.
Preferiblemente, el ligador se selecciona del grupo que consiste en 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) de N-succinimidilo (LC-SMCC), éster N-succinimidílico del ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), éster N-succinimidílico del ácido y-maleimidabutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido £-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidabenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a -maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), 6-(P-maleimidopropionamida)hexanoato de succinimidilo (SMPH), 4-(p-maleimidofenil)butirato de N-succinimidilo (s Mp B), isocianato de N-(p-maleimidofenilo) (PMPI), 4(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), (4-yodo-acetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB), maleimidopropanoilo (MP) y (4-(2-piridiltio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB).
Preferiblemente, el ligador se escinde mediante proteasa.
Preferiblemente, el ligador comprende al menos uno de valina-citrulina (Val-Cit), alanina-fenilalanina (ala-phe) y ácido para-aminobenzoico (PABA).
Preferiblemente, el rendimiento citotóxico se refuerza por la humanización de las secuencias de la región de entramado de las regiones variables del anticuerpo.
La presente invención proporciona además un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad que se caracteriza por sobreexpresión de CDH3, en el que el medicamento comprende el inmunocomplejo mencionado anteriormente, en el que la enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CDH3 es cáncer, en el que el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga invasivo, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro metastásico, cáncer de tiroides, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, carcinoma de células escamosas del esófago, carcinoma de células escamosas del pulmón, carcinoma de células escamosas de la piel, melanoma, cáncer mamario, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de células escamosas del cuello uterino, carcinoma de células escamosas del páncreas, carcinoma de células escamosas del colon, carcinoma de células escamosas del estómago, cáncer de próstata, osteosarcoma, y sarcoma de tejidos blandos.
Preferiblemente, el medicamento de la presente invención se usa como antineoplásico.
La presente invención proporciona además el uso del inmunocomplejo mencionado anteriormente para la producción de un medicamento para tratar una enfermedad que se caracteriza por sobreexpresión de CDH3.
Efectos ventajosos de la invención
Se anticipa que el anticuerpo humanizado anti-CDH3 tenga una inmunogenicidad menor que la del anticuerpo original del mismo. Un anticuerpo humanizado está compuesto por una combinación apropiada de las secuencias de la CDR del anticuerpo original y secuencias de la FR derivadas de humanos. Si un anticuerpo humanizado de este tipo no presenta afinidad por un antígeno, se intenta además recuperar la afinidad mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos en la región variable del anticuerpo. Como resultado de la combinación de las secuencias de la CDR y las secuencias de la FR apropiadas y, según sea necesario, la introducción de mutaciones de aminoácidos, puede obtenerse un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que se une específicamente a CDH3. Un inmunocomplejo obtenido conjugando el anticuerpo humanizado anti-CDH3 así obtenido de la presente invención con un agente quimioterápico presenta una citotoxicidad más fuerte para las células cancerosas que expresan CDH3, cuando se compara con un anticuerpo que no se une a un agente quimioterápico. Además, el inmunocomplejo obtenido conjugando el anticuerpo humanizado anti-CDH3 de la presente invención con un agente quimioterápico presenta una afinidad mejorada en comparación con un anticuerpo quimérico anti-CDH3 tal como se describe en el documento WO 2013/150623 (documento de patente 6), y también presenta una citotoxicidad más fuerte en comparación con un inmunocomplejo obtenido conectando el anticuerpo quimérico anti-CDH3 con un agente quimioterápico. Por consiguiente, mediante la administración del inmunocomplejo de la presente invención a un paciente que tiene células cancerosas que expresan CDH3, puede presentarse una alta acción anticancerosa y, al mismo tiempo, también puede lograrse una reducción de su propia inmunogenicidad. El inmunocomplejo de la presente invención es útil como agente anticanceroso.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La figura 1 muestra los resultados de la citometría de flujo, en la que una línea celular con expresión forzada de CDH3 humana se hizo reaccionar con un anticuerpo anti-CDH3 humano disponible comercialmente. A: células CHO, B: células CHO con expresión forzada de CDH3 y C: línea celular derivada de cáncer de pulmón NCI-H358. a: anticuerpo anti-CDH30,01 |i g/ml, b: anticuerpo anti-CDH30,1 |i g/ml y c: anticuerpo anti-CDH3 1 |i g/ml.
[Figura 2] La figura 2 muestra los resultados de la citometría de flujo realizada en los anticuerpos obtenidos. Tres casos de resultados típicos de citometría de flujo obtenidos del grupo de anticuerpos obtenidos se muestran en las figuras 2A a 2C. A: células CHO con expresión forzada de CDH3, B: células CHO y C: línea celular derivada de cáncer de pulmón NCI-H358. a: anticuerpo anti-CDH3 0,01 |i g/ml, b: anticuerpo anti-CDH3 0,1 |i g/ml y c: anticuerpo anti-CDH31 |i g/ml. La figura 2D muestra los resultados de la citometría de flujo realizada en un anticuerpo de ratón (PPAT-076-44M) purificado a partir del hibridoma derivado del n.° de registro NlTE BP-1536. El pico derecho en cada vista de la figura 2D indica un control negativo en el que se usó un anticuerpo con isotipo idéntico, y el pico izquierdo en cada vista indica los resultados obtenidos midiendo PPAT-076-44M a 10 |i g/ml.
[Figura 3] La figura 3 muestra los resultados en cuanto a la expresión de ARNm de CDH3 en diversos tipos de tejidos tumorales. A: tejidos normales, B: diversos tipos de tejidos cancerosos y C: el grado de diferenciación de cáncer de páncreas.
[Figura 4] La figura 4 muestra los resultados en cuanto a la expresión de CDH3 en diversos tipos de tejidos tumorales humanos.
[Figura 5] La figura 5 muestra los resultados de la citometría de flujo en la que anticuerpos contra CDH3 individuales se hicieron reaccionar cada uno con las células mencionadas a continuación. Las líneas celulares usadas fueron A: línea celular derivada de cáncer de pulmón NCI-H358, B: células CHO y C: células CHO con expresión forzada de CDH3. El pico en el lado izquierdo en cada vista indica un control negativo.
[Figura 6] La figura 6 muestra la estructura de DM1SMe.
[Figura 7] La figura 7 muestra los resultados de una prueba de citotoxicidad realizada en conjugados anticuerpo contra CDH3-fármaco. A: línea celular NCI-H358, conjugados anticuerpo-fármaco (PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd, a los que se une un fármaco), B: línea celular HCC1954, conjugado anticuerpo-fármaco (PPAT-076-44Hd, al que se une un fármaco), C: línea celular HCC70, conjugado anticuerpo-fármaco (PPAT-076-44Hd, al que se une un fármaco) y D: las líneas celulares mostradas en la tabla 1, conjugado de anticuerpo (PPAT-076-44Hd, al que se une un fármaco).
[Figura 8] La figura 8 muestra los resultados de una prueba en animales (modelo de cáncer de mama HCC1954), en la que se usaron conjugados anticuerpo contra CDH3-fármaco (PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd, a los que se une un fármaco).
[Figura 9] La figura 9 muestra los resultados de una prueba en animales (modelo de cáncer de mama HCC70), en la que se usó un conjugado anticuerpo humanizado contra CDH3-fármaco (PPAT-076-44Hb, al que se une un fármaco), en la que los resultados implican dependencia de la dosis y los resultados de una comparación realizada con un conjugado anticuerpo quimérico-fármaco (PPAT-076-44C, al que se une un fármaco).
[Figura 10] La figura 10 muestra los resultados de una prueba en animales (modelo de cáncer de mama HCC70), en la que se usó un conjugado anticuerpo humanizado contra CDH3-fármaco (PPAT-076-44Hd, al que se une un fármaco), en la que los resultados implican dependencia de la dosis y los resultados de una comparación realizada con un conjugado anticuerpo quimérico-fármaco (PPAT-076-44C, al que se une un fármaco).
[Figura 11] La figura 11 muestra los resultados de una prueba en animales (modelo de cáncer de pulmón OKa-C-1), en la que se usó un conjugado anticuerpo humanizado contra CDH3-fármaco (PPAT-076-44Hd, al que se une un fármaco).
[Figura 12] La figura 12 muestra los resultados en cuanto a la expresión de a proteína CDH3 de longitud parcial del extremo N-terminal. A: tinción con CBB (carril derecho: producto de expresión, carril izquierdo: marcador de peso molecular). B: inmunotransferencia de tipo Western (M: marcador de tamaño, 1: anticuerpo contra CDH3 disponible comercialmente (BD BIOSCIENCE), 2: anticuerpo contra CDH3 disponible comercialmente (R & D Systems), y 3: sin anticuerpos).
[Figura 13] La figura 13 muestra los resultados de medición de ELISA, en los que se usó una proteína CDH3 de longitud parcial del extremo N-terminal como fase sólida.
[Figura 14] La figura 14 muestra los resultados obtenidos comparando la afinidad entre PPAT-076-44Hd (anticuerpo humanizado) y los anticuerpos originales PPAT-076-44M (anticuerpo de ratón) y PPAT-076-44C (anticuerpo quimérico).
[Figura 15] La figura 15 muestra la afinidad relativa de conjugados anticuerpo contra CDH3-fármaco que tienen diferentes razones promedio de fármaco con respecto a anticuerpo (DAR), con respecto a un anticuerpo al que no se une un fármaco. A: PPAT-076-44Hb y B: PPAT-076-44Hd.
[Figura 16] La figura 16 muestra la expresión de CDH3 en las porciones de tejido tumoral que portan cáncer de modelos de ratón que tiene cáncer usados en pruebas en animales. A: HCC1954, B: HCC70 y C: Oka-C-1.
Realizaciones para llevar a cabo la invención
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá en más detalle.
La presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado anti-CDH3 y un método de uso del mismo tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. El anticuerpo humanizado anti-CDH3 de la presente divulgación se proporciona combinando las secuencias de la CDR de un anticuerpo que reconoce específicamente CDH3 con diversas secuencias de la FR derivadas de humanos adecuadas. Además, el presente anticuerpo humanizado anti CDH3 se proporciona introduciendo una mutación de aminoácido adecuada en el mismo para mejorar su afinidad. En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención se une a CDH3 expresada en la superficie de una célula. En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención se une a un epítopo en la región CDH3. El anticuerpo de la presente invención se une preferiblemente a CDH3 expresada en la superficie de una célula humana, y de manera particularmente preferible a CDH3 expresada en la superficie de una célula cancerosa. En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención puede ser un fragmento de anticuerpo humanizado seleccionado de los fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2. Un anticuerpo de este tipo se une eficazmente a un agente quimioterápico a través de, por ejemplo, diversos tipos de ligadores, de modo que puede usarse como un conjugado anticuerpo-fármaco. Además, el anticuerpo de la presente invención también puede unirse a la toxina a través de cualquier espaciador dado. Es decir, según la presente invención, se proporciona un conjugado fármaco-anticuerpo humanizado anti-CDH3 que destruye eficazmente las células cancerosas.
Como antígeno usado para generar el anticuerpo de la presente invención, puede usarse CDH3 o un péptido parcial de la misma. Como ejemplo, puede usarse una proteína CDH3 soluble que corresponde a una región extracelular de CDH3 (correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 1 a 654 de SEQ ID NO: 2), pero los ejemplos del antígeno no se limitan a la misma.
El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humanizado. En la presente invención, se obtiene un hibridoma por inmunización de un ratón y se usa como materia prima para obtener un anticuerpo monoclonal humanizado de este tipo. Una materia prima de este tipo puede obtenerse mediante diversos métodos que son bien conocidos en el presente campo. La materia prima puede obtenerse, por ejemplo, mediante el método mencionado a continuación, pero el método no se limita al mismo.
Para establecer un hibridoma que genere un anticuerpo que se una específicamente a CDH3, en primer lugar, se administra CDH3 o un péptido parcial de la misma como antígeno a un ratón. La cantidad de dosificación de un antígeno de este tipo por ratón es de 0,1 a 100 mg si no se usa un adyuvante, y es de 1 a 100 |ig cuando se usa un adyuvante. Los ejemplos de un adyuvante de este tipo usado en el presente incluyen documento un adyuvante completo de Freund (FCA), un adyuvante incompleto de Freund (FIA) y un adyuvante de hidróxido de aluminio. La inmunización se lleva a cabo principalmente mediante la inyección del antígeno en la vena, hipodermis o cavidad abdominal. Además, los intervalos de inmunización no están particularmente limitados y la inmunización se lleva a cabo de 1 a 10 veces, y más preferiblemente de 2 a 5 veces, a intervalos de varios días a varias semanas, y preferiblemente a intervalos de 2 a 5 semanas. Después de esto, de uno a sesenta días, y preferiblemente de uno a catorce días después de la inmunización final, se recogen las células que producen anticuerpos. Los ejemplos de células que producen anticuerpos incluyen células esplénicas, células de nódulos linfáticos y células de sangre periférica. Entre estas células, son preferibles las células esplénicas o las células de los ganglios linfáticos locales.
Para obtener hibridomas, se lleva a cabo la fusión celular de células que producen anticuerpos con células de mieloma. Como células de mieloma, pueden usarse células establecidas disponibles comercialmente, que tienen selectividad de fármaco para un medio HAT y similares y se derivan de ratones. Los ejemplos de células de mieloma incluyen P3X63-Ag.8.U1 (P3U1) y NS-1.
Para la fusión celular, las células que producen anticuerpos (de 1 * 106 a 1 x 107 células/ml) se mezclan con células de mieloma (de 2 * 105 a 2 * 106 células/ml) en un medio de cultivo de células animales que no contenga suero, tal como DMEM o un medio RPMI-1640, de modo que pueda llevarse a cabo una reacción de fusión en presencia de un promotor de fusión celular. Como promotor de fusión celular, puede usarse polietilenglicol con un peso molecular medio de 1000 a 6000 Daltons o similar. Además, las células que producen anticuerpos también pueden fusionarse con células de mieloma usando un aparato de fusión celular disponible comercialmente que utiliza estimulación eléctrica.
Los hibridomas pueden obtenerse mediante una operación para cultivar un medio de selección. Una suspensión celular se diluye apropiadamente, por ejemplo, con un medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal, y la suspensión celular resultante se siembra a una densidad celular de aproximadamente 3 * 105 células/pocillo en una placa de microtitulación. Después de esto, se añade un medio de selección a cada pocillo, y luego se lleva a cabo un cultivo, intercambiando el medio de selección por uno recién preparado, según sea apropiado. Como resultado, las células que crecen aproximadamente 14 días después del inicio del cultivo en el medio de selección pueden obtenerse como hibridomas.
Después de esto, se analiza la presencia o ausencia de un anticuerpo de interés en un sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento. El cribado de hibridomas puede realizarse según un método habitual, y el tipo de método de cribado no está particularmente limitado. Por ejemplo, se recoge una alícuota del sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento contenidos en el pocillo y luego se somete a inmunoensayo enzimático, radioinmunoensayo o similares, de modo que puedan cribarse los hibridomas que producen un anticuerpo que se une a CDH3. Las células fusionadas se clonan según una dilución limitativa o similar y, por tanto, los hibridomas pueden establecerse finalmente como células que producen un anticuerpo monoclonal.
Usando los hibridomas establecidos como materias primas, puede lograrse la humanización de un anticuerpo derivado de los mismos mediante un método conocido. Específicamente, una secuencia de ADN diseñada para unir la CDR de un anticuerpo de ratón a la región de entramado (FR) de un anticuerpo humano se sintetiza a partir de varios oligonucleótidos producidos para tener algunas porciones solapadas en los extremos terminales de los mismos según un método de p Cr . El ADN obtenido se une a ADN que codifica para la región constante de un anticuerpo humano, y la porción de ADN así unida se incorpora luego en un vector de expresión, y este vector de expresión luego se introduce en un huésped, de modo que pueda generarse un anticuerpo humanizado (documento EP239400 (documento de patente 7), publicación internacional WO 96/02576 (documento de patente 8), etc.).
La secuencia de la región determinante de complementariedad (CDR) es particularmente diferente en las regiones variables entre los anticuerpos, y esta secuencia indica una región de secuencia que desempeña un papel extremadamente importante para la determinación de la especificidad del anticuerpo. Se considera que los residuos de aminoácido en esta región comprenden muchos residuos que se asocian directamente con la capacidad de unión y la especificidad del anticuerpo a un antígeno, y hay tres regiones presentes en cada una de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada.
La CDR se determina por comparación de secuencias de acuerdo según Kabat et al. (Sequences of proteins of inmunological interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (documento no de patente 15)), y también se determina basándose en su estructura tridimensional de según Chothia et al. (J. Mol. Biol.; 196, pág. 901 (1987) (documento no de patente 16)).
La CDR determinada por Kabat se localiza generalmente alrededor de los residuos 24-34, 50-56 y 89-97 en la región variable de cadena ligera, y también alrededor de los residuos 31-35, 50-65 y 95-102 en la región variable de cadena pesada. Sin embargo, no siempre es necesario que todos los residuos de esta región se asocien directamente con la unión del anticuerpo a un antígeno. No es el caso de que los residuos sean completamente idénticos a la región CDR determinada basándose en la estructura tridimensional. Cabe señalar que el sistema de asignación de números usado para describir un número de residuo de aminoácido en la presente descripción se basa en un sistema de numeración de Kabat.
La secuencia de la FR humana se selecciona apropiadamente de manera oportuna. En la presente descripción, la secuencia de la FR humana seleccionada comprende una región variable de cadena ligera o una región variable de cadena pesada obtenida de una secuencia de entramado de consenso humana.
La secuencia de entramado de consenso humana es una secuencia de la FR que indica los residuos de aminoácido que aparecen más comúnmente en las cadenas ligeras de inmunoglobulina humana o en la región variable de cadena pesada. En general, la región variable de cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina humana se selecciona de subgrupos de secuencias de región variable. Según Kabat et al., La región variable de cadena ligera es un subgrupo I de cadena ligera humana k, y la región variable de cadena pesada es un subgrupo III de cadena pesada humana.
En una realización, la secuencia de consenso del subgrupo I de la cadena ligera humana k comprende al menos una parte o la totalidad de las siguientes secuencias, y está configurada de manera que las secuencias de la CDR están intercaladas por una parte o la totalidad de las secuencias de FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ: SEQ ID NO: 62 (FR-L1)
WYQQKPGKAPK: SEQ ID NO: 63 (FR-L2)
LQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC: SEQ ID NO: 64 (FR-L3)
FGQGTKVEIK: SEQ ID NO: 65 (FR-L4)
En una realización, la secuencia de consenso del subgrupo III de la cadena pesada humana comprende al menos una parte o la totalidad de las siguientes secuencias, y está configurada de manera que las secuencias de la CDR están intercaladas por una parte o la totalidad de las secuencias de FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF: SEQ ID NO: 66 (FR-H1)
WVRQAPGKGLEWV: SEQ ID NO: 67 (FR-H2)
YADSVKGRFTISRDNSKNTLILQMNSLRAEDTAVYYC: SEQ ID NO: 68 (FR-H3)
WGQGTLVTVSS: SEQ ID NO: 69 (FR-H4)
La secuencia de entramado de consenso humana mencionada anteriormente se compone de residuos de aminoácido que aparecen con la frecuencia más alta en cada subgrupo.
Además, en la presente divulgación, también puede usarse una secuencia de entramado derivada de una línea germinal humana seleccionada bajo alineación óptima. Esta secuencia de entramado cumple con un caso en el que una secuencia de entramado de consenso humana no es necesariamente adecuada para la humanización del anticuerpo, y se conoce como método de ajuste óptimo.
Específicamente, la secuencia de la región variable de un anticuerpo de ratón se criba frente a una biblioteca conocida de secuencias de la región variable humana. Como resultado, una secuencia de la región variable humana que es más similar a la secuencia de la región variable del anticuerpo de ratón puede usarse como una secuencia de entramado humana derivada de la línea germinal de un anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol.; 151, pág.
2296 (1993) (documento no de patente 17), Chothia et al., J. Mol. Biol.; 196, pág. 901 (1987) (documento no de patente 18), y Tempest et al., Biotechnology; 9, pág. 266 (1991) (documento no de patente 19)).
La secuencia de la línea germinal más similar a la secuencia puede confirmarse llevando a cabo una alineación frente a la secuencia del anticuerpo original, usando una base de datos en la que se ha registrado un gran número de tales bibliotecas (por ejemplo, IMGT/V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Opción=humanIg)). En una realización, la secuencia de línea germinal de cadena ligera comprende al menos una parte o la totalidad de las siguientes secuencias, y está configurada de manera que las secuencias de la CDR están intercaladas por una parte o la totalidad de las secuencias de FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4.
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ: SEQ ID NO: 72 (FR-L1)
WYQQKPGKAPK: SEQ ID NO: 73 (FR-L2)
LESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC: SEQ ID NO: 74 (FR-L3)
FGQGTKVEIK: SEQ ID NO: 75 (FR-L4)
En una realización, la secuencia de línea germinal de cadena pesada comprende al menos una parte o la totalidad de las siguientes secuencias, y está configurada de manera que las secuencias de la CDR están intercaladas por una parte o la totalidad de las secuencias de FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4.
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGF: SEQ ID NO: 76 (FR-H1)
WVRQAPGKGLEWV: SEQ ID NO: 77 (FR-H2)
YADSVKGRFTISRDNSKNTLILQMNSLRAEDTAVYYC: SEQ ID NO: 78 (FR-H3)
WGQGTLVTVSS: SEQ ID NO: 79 (FR-H4)
Puede determinarse si una secuencia de entramado (FR) seleccionada por un determinado método es adecuada para la humanización basándose en si la combinación de las secuencias de la CDR de cada clon de anticuerpo y la secuencia de la FR es apropiada o no y si puede mantenerse o no una conformación apropiada con respecto a un antígeno al que se va a unir el anticuerpo.
Con respecto a un anticuerpo humanizado expresado por trasplante de la combinación alternativa de secuencias de la CDR y secuencias de la FR derivadas de humanos, si las secuencias seleccionadas no fueran adecuadas, a menudo se produciría una reducción en la afinidad. Esto significa que varios residuos presentes en la región FR también desempeñan un papel importante para el mantenimiento de la estructura. Para hacer frente a este fenómeno, puede llevarse a cabo una sustitución de residuos de aminoácido. Por ejemplo, como resultado de la alineación, pueden sustituirse varios residuos de aminoácido con los residuos de aminoácido derivados de un anticuerpo de ratón, que están presentes en ubicaciones homólogas a una secuencia derivada de humanos (remodelación). Por tanto, existe un caso en el que puede mejorarse una reducción en la afinidad provocada por la humanización.
Las posiciones de los residuos de aminoácido que van a sustituirse son diferentes dependiendo del anticuerpo diana. En muchos casos, tales posiciones no pueden especificarse hasta que el anticuerpo se exprese realmente. En los ejemplos mencionados a continuación, uno o más residuos de aminoácido en las posiciones seleccionadas de la posición 55 en la región variable de cadena ligera y las posiciones 49, 71 y 78 en la región variable de cadena pesada, que se han sustituido en relativamente muchas publicaciones (por ejemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 89, pág.
4285 (1992) (documento no de patente 20)), se sustituyeron, de modo que pudo mejorarse una reducción en la afinidad. Sin embargo, las posiciones que van a sustituirse, las combinaciones y los tipos de residuos de aminoácido una vez completada la sustitución no se limitan a las mismas y se determinan, según sea apropiado.
Muchos huéspedes usados para producir anticuerpos se derivan de mamíferos. Un experto en la técnica podría seleccionar de manera apropiada un sistema de células huésped específico que sea más adecuado para que se exprese un producto génico. Los ejemplos de un sistema de células huésped común incluyen, pero no se limitan a, una línea celular derivada de CHO (una línea celular de ovario de hámster chino), CV1 (un sistema de riñón de mono), COS (un derivado de CV1 contra un antígeno SV40T), SP2/0 (mielomas de ratón), P3x63-Ag3.653 (mielomas de ratón), 293 (riñón humano) y 293T (un derivado de 293 contra un antígeno SV40T). Un sistema de células huésped de este tipo está disponible en diversos tipos de fabricantes, la Colección Estadounidense de Tejidos Tipo (ATCC) o las instituciones de publicación de artículos de estudio descritas en algunas publicaciones.
Como sistema de células huésped, puede usarse preferiblemente una línea celular derivada de CHO que implica una expresión defectuosa de un gen dgfr, o SP2/0 (Urland, G. et al., Somat. Cell. Mol. Genet.; 12, pág. 5555 (1986) (documento no de patente 4), y Schulman, M. et al., Nature; 276, pág. 269 (1978) (documento no de patente 5)). Lo más preferiblemente, el sistema de células huésped es CHO deficiente en DHFR.
La transfección de un plásmido en una célula huésped puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica dada. Los ejemplos específicos de un método de transfección de este tipo incluyen, pero no se limitan a, transfección (incluyendo un método de fosfato de calcio, un método DEAE, lipofección y electroporación), un método de introducción de ADN utilizando una envuelta como el virus Sendai, microinyección e infección usando vectores virales tales como retrovirus o adenovirus (Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 9 Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wiley and Sons, Inc.), Es más preferible la introducción de un plásmido en un huésped mediante electroporación.
Estos anticuerpos pueden ser uno cualquiera de un anticuerpo monovalente, un anticuerpo divalente y un anticuerpo polivalente, siempre que sean capaces de reconocer CDH3. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos de bajo peso molecular, tales como un fragmento de anticuerpo, o modificaciones de anticuerpos. Además, los anticuerpos también pueden ser fragmentos de anticuerpos o anticuerpos de bajo peso molecular, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv (Fv monocatenario) o un diacuerpo, con el que se fusiona una porción de Fc. Para obtener tales anticuerpos, pueden construirse genes que codifican para estos anticuerpos, y luego pueden introducirse cada uno de ellos en vectores de expresión, y luego puede permitirse que se expresen en células huésped adecuadas.
Un aspecto de uso preferido del anticuerpo de la presente invención puede ser un inmunocomplejo en el que un agente quimioterápico tal como una sustancia citotóxica se une a un anticuerpo, concretamente, un conjugado anticuerpofármaco (ADC). Se permite que el inmunocomplejo de la presente invención entre en contacto, por ejemplo, con células cancerosas que expresan CDH3, para dañar las células cancerosas.
Los ejemplos del agente quimioterápico usado en la presente invención incluyen duocarmicina, análogos y derivados de duocarmicina, CC-1065, análogos de duocarmicina que comprenden CBI como componente principal, análogos de duocarmicina que comprenden MCBI como componente principal, análogos de duocarmicina que comprenden CCBI como componente principal, doxorrubicina, conjugados de doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, dolastatina, dolastatina-10, combretastatina, caliqueamicina, maitansina, análogos de maitansina, DM1, DM2, DM3, DM4, DMI, auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), éster de AE del ácido 5-benzoilvalérico (AEVB), tubulisina, disorazol, epotilona, paclitaxel, docetaxel, SN-38, topotecán, rizoxina, equinomicina, colchicina, vinblastina, vindesina, estramustina, cemadotina, eriuterobina, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, melfalán, leurosina, leurosideína, actinomicina, daunorrubicina, conjugados de daunorrubicina, mitomicina C, mitomicina A, carminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina, derivados de podofilotoxina, etopósido, fosfato de etopósido, vincristina, Taxol, Taxol, Taxotere, ácido retinoico, ácido butírico, N8-acetilespermidina y camptotecina. Sin embargo, los ejemplos del presente agente quimioterápico no se limitan a los mismos.
El inmunocomplejo de la presente invención puede producirse uniendo el agente quimioterápico descrito anteriormente a un anticuerpo según un método conocido. El anticuerpo se une directamente al agente quimioterápico a través de su grupo de unión o similar, o pueden unirse indirectamente entre sí a través de un ligador.
Los ejemplos del grupo de unión usado cuando un fármaco se une directamente al anticuerpo incluyen un enlace disulfuro que usa un grupo SH y un enlace mediado por maleimida. Por ejemplo, se reducen un enlace disulfuro intramolecular en la región Fc del anticuerpo y el enlace disulfuro de un fármaco, y luego se unen entre sí a través de un enlace disulfuro. Además, también existe un método que implica la mediación de maleimida. Además, como método alternativo, también existe un método de introducción de cisteína en un anticuerpo mediante ingeniería genética.
También es posible unir indirectamente el anticuerpo al agente quimioterápico a través de otra sustancia (ligador). El ligador tiene deseablemente uno o dos o más tipos de grupos funcionales que reaccionan con el anticuerpo, o con el fármaco, o con ambos. Los ejemplos de un grupo funcional de este tipo incluyen un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo mercapto, un grupo maleimida y un grupo piridinilo.
Los ejemplos del ligador incluyen 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) de N-succinimidilo (LC-SMCC), éster N-succinimidílico del ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), éster N-succinimidílico del ácido y-maleimidabutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido £-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidabenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a -maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), 6-(P-maleimidopropionamida)hexanoato de succinimidilo (SMPH), 4-(pmaleimidofenil)butirato de N-succinimidilo (SMPB), isocianato de N-(p-maleimidofenilo) (PMPI), 4(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), (4-yodo-acetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB), 6-maleimidocaproilo (MC), maleimidopropanoilo (MP), p-aminobenciloxicarbonilo (PAB) y (4-(2-piridiltio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB), pero los ejemplos no se limitan a los mismos. Como un ligador de este tipo, puede combinarse un ligador peptídico tal como valina-citrulina (Val-Cit) o alanina-fenilalanina (ala-phe) con ácido para-aminobenzoico (PABA), o alternativamente, los ligadores mencionados anteriormente pueden combinarse entre sí, según sea apropiado y luego pueden usarse.
Con respecto al método de unión de un fármaco a un anticuerpo, tal unión puede llevarse a cabo según los métodos descritos, por ejemplo, en Cancer Res.; 52, pág. 127 (1992) (documento no de patente 13), Cancer Res.; 68 (22), pág.
9280 (2008) (documento no de patente 6), Nature Biotechnology; 26 (8), pág. 925 (2008) (documento no de patente 7), Bio Conjugate Chemistry; 19, pág. 1673 (2008) (documento no de patente 8), Cancer Res.; 68 (15), pág. 6300 (2008) (documento no de patente 9), o publicación de patente japonesa (Kohyo) n.° 2008-516896 A (documento de patente 9).
Otra realización de la presente invención incluye lo que se denomina inmunotoxina, en la que una toxina se une a un anticuerpo mediante ingeniería química o genética. Los ejemplos de la toxina usada en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cadena A de la toxina diftérica, endotoxina de Pseudomonas, cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, gelonina y saporina.
En una realización adicional de la presente divulgación, puede unirse un material radiactivo al anticuerpo. Cuando el anticuerpo se usa como agente terapéutico para el cáncer, el material radiactivo es preferiblemente un metal radiactivo citotóxico. Por otro lado, cuando el anticuerpo se usa como agente de diagnóstico para el cáncer, es preferiblemente un metal radiactivo no citotóxico.
Los ejemplos de metales radiactivos citotóxicos incluyen itrio 90 (90Y), renio 186 (186Re), renio 188 (188Re), cobre 67 (67cu ), hierro 59 (59Fe), estroncio 89 (89Sr), oro 198 (198Au), mercurio 203 (203Hg), plomo 212 (212Pb), disprosio 165 (165Dy), rutenio 103 (103Ru), bismuto 212 (212Bi), bismuto 213 (213Bi), holmio 166 (166Ho), samario 153 (153Sm) y lutecio 177 (177Lu). Entre estos metales radiactivos, 90Y, 153Sm y 177Lu son preferibles en términos de semivida, energía de radiación, una reacción de marcado fácil, la velocidad de marcado, la estabilidad de un complejo, etc. Sin embargo, los ejemplos del metal radiactivo citotóxico no son limitado a los mismos.
Por otro lado, los ejemplos del metal radioactivo no citotóxico que se usa preferiblemente en agentes de diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, tecnecio 99m (99mTc), indio 111 (111In), indio 113m (113mIn), galio 67 (67Ga), galio 68 (68Ga), talio 201 (201T1), cromo 51 (51Cr), cobalto 57 (57Co), cobalto 58 (58Co), cobalto 60 (60Co), estroncio 85 (85Sr), mercurio 197 (197Hg) y cobre 64 (64Cu).
Para unir un elemento metálico radiactivo de este tipo al anticuerpo anti-cadherina, es preferible que se haga reaccionar un reactivo quelante de metales con el anticuerpo, y que el producto de reacción reaccione además con un elemento metálico radiactivo, para formar un complejo. Al anticuerpo modificado así obtenido, se une el elemento metálico radiactivo a través del reactivo quelante de metales.
Los ejemplos del reactivo quelante de metales usado en la formación de un complejo de este tipo incluyen: (1) derivados de quinolina tales como 8-hidroxiquinolina, 8-acetoxiquinolina, 8-hidroxiquinaldina, sulfato de oxiquinolina, O-acetiloxina, O-benzoiloxina, O-p-nitrobenzoiloxina, y compuestos de quinolona que tienen un esqueleto de quinolina (por ejemplo, norfloxacino, ofloxacino, enoxacino, ciprofloxacino, lomefloxacino, tosfloxacino, fleroxacino y esparfloxacino); (2) compuestos tales como ácido cloranílico, aluminón, tiourea, pirogalol, cupferrón, bismutiol (II), ácido galoilgálico, Tiolide, 2-mercaptobenzotiazol y cloluro de tetrafenilarsonio; (3) ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), y compuestos que tienen un esqueleto similar a los mismos (dihidroxietilglicina, diaminopropanoltetraacético, ácido etilendiaminadiacético, clorhidrato de ácido etilendiaminadipropiónico, ácido hidroxietiletilendiaminatriacético, ácido etilendiaminatetrakis(metilenosulfónico), ácido diaminatetraacético de éter de glicol, ácido hexametilendiaminatetraacético, ácido hidroxietiliminodiacético, ácido iminodiacético, ácido diaminopropanotetraacético, ácido nitrilotriacético, ácido nitrilotripropiónico, sal de trisodio del ácido nitrilotris(metilenosulfónico), ácido trietilentetraminahexaacético, metil-DTPA, ciclohexil-DTPA, aminobencil-EDTA, isotiocianobencil-EDTA, isotiocianobencil-DTPA, metilisotiocianobencil-DTPA, ciclohexilisotiocianobencil-DTPA, maleimidopropilamidobencil-EDTA, maleimidopentilamidobencil-EDTA, maleimidodecilamidobencil-EDTA, maleimidopentilamidobencil-DTPA, maleimidodecilamidobencil-EDTA y maleimidodecilamidobencil-DTPA); y (4) ácido 1.4.7.10- tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético (TETA), 1,4,7,10-tetraazaciclododecano (cicleno), 1.4.8.11- tetraazaciclotetradecano (ciclam), isotiocianobencil-DOTA e isotiocianobencil-NOTA.
Entre estos reactivos quelantes de metales, son preferibles isotiocianobencil-DOTA, metilisotiocianobencil-DTPA y ciclohexilisotiocianobencil-DTPA en cuanto a la facilidad de la reacción de introducción de un quelato metálico en el anticuerpo, la velocidad de marcado, la estabilidad de un complejo, etc.
Un elemento metálico radiactivo de este tipo puede unirse al anticuerpo según un método habitual. Por ejemplo, el anticuerpo se hace reaccionar con un reactivo quelante de metales para preparar un precursor marcador, y luego el precursor se hace reaccionar con un elemento metálico radiactivo.
El inmunocomplejo proporcionado por la presente invención puede comprender de manera apropiada un portador, excipiente, diluyente farmacéuticamente aceptables y similares, de modo que el fármaco pueda retenerse en un estado estable. Por ejemplo, el inmunocomplejo de la presente invención puede formularse en forma de inyección. La dosis aplicada del inmunocomplejo de la presente invención depende del grado de los síntomas, la edad y el peso corporal del paciente, un método de administración y similares. El peso del anticuerpo que sirve como principio activo está generalmente en el intervalo de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal.
La enfermedad que puede tratarse por el inmunocomplejo de la presente invención se caracteriza por la sobreexpresión de CDH3 y se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga invasivo, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro metastásico, cáncer de tiroides, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, carcinoma de células escamosas del esófago, carcinoma de células escamosas del pulmón, carcinoma de células escamosas de la piel, melanoma, cáncer mamario, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de células escamosas del cuello uterino, carcinoma de células escamosas del páncreas, carcinoma de células escamosas del colon, carcinoma de células escamosas del estómago, cáncer de próstata, osteosarcoma, y sarcoma de tejidos blandos.
La presente invención se describirá más específicamente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos se proporcionan sólo con fines de ilustración y, por tanto, no se pretende que los ejemplos limiten el contenido de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: establecimiento de una línea celular CHO que expresa CDH3
Para obtener una línea celular usada en el cribado, para un anticuerpo anti-CDH3, se establecieron células CHO que expresan el CDH3 de longitud completa.
(1) Construcción del vector de expresión del gen CDH3
Para insertar el ADN de CDH3 humano de longitud completa que se muestra en SEQ ID NO: 1 en un vector de expresión de mamífero pEF4/myc-HisB (Invitrogen), se digirió el ADN con dos tipos de enzimas de restricción, Kpnl (TAKARA BIO INC.) y Xbal (Ta Ka RA BlO INC.), a 37°C durante 1 hora. Posteriormente, se insertó el ADN resultante en el pEF4/myc-HisB que también había sido digerido con KpnI y XbaI según un método habitual usando ADN ligasa T4 (Promega), obteniendo así un vector de expresión, pEF4-CDH3-myc-His.
(2) Obtención de una línea celular de expresión estable de CDH3
El día anterior a la transfección, se sembraron las células CHO (8 * 105) en una placa con un diámetro de 10 cm según los protocolos incluidos con el reactivo de transfección FuGENE (marca registrada) 6 (Roche Diagnostics), y luego se cultivaron durante la noche. Después de esto, se mezclaron 8 |ig del vector de expresión pEF4-CDH3-myc-His y 16 |il del reactivo FuGENE 6 en 400 |il de medio RPMI1640 libre de suero (SIGMA-ALDRICH), y se dejó la mezcla obtenida en la habitación temperatura durante 15 minutos. Después de esto, se añadió la mezcla de reacción al cultivo celular, para realizar la transfección. Dos días después de la transfección, se llevó a cabo la clonación mediante dilución limitativa usando un reactivo selectivo (Zeocin (marca registrada)).
Se llevaron a cabo la clonación y selección de CHO de expresión de longitud completa de CDH3 mediante un método de inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpo monoclonal Anti-c-Myc (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). Como resultado, se obtuvo una línea celular CHO de expresión de longitud completa de CDH3 (EXZ1501) que tenía un alto nivel de expresión y una alta tasa de crecimiento. En la figura 1 se muestran los resultados de la medición obtenidos examinando la reactividad de esta línea celular, las células CHO como línea celular parental y una línea celular de cáncer de pulmón NCI-H358 que se había confirmado que expresaba CDH3, con un anticuerpo anti-CDH3 disponible comercialmente (R & D SYSTEMS) mediante citometría de flujo.
Ejemplo 2: producción de antígeno de CDH3 soluble
Para su uso como inmunógeno en la producción de un anticuerpo anti-CDH3, se produjo una proteína CDH3 soluble (sCDH3), en la que se delecionaron su región transmembrana C-terminal y las regiones posteriores.
(1) Construcción del vector de expresión del antígeno CDH3 soluble
Usando ADNc de CDH3 de longitud completa como molde, se llevó a cabo una reacción de PCR usando un cebador directo (CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT; SeQ ID NO: 3) y un cebador inverso (CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC; SEQ ID NO: 4) que se había diseñado para amplificar una región correspondiente a la región extracelular de CDH3 (que correspondía a las posiciones 1-2010 de SEQ ID NO: 1; a continuación en el presente documento denominado “ADNc de sCDH3”). Se usó KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) en la reacción, y se llevó a cabo la reacción en condiciones de reacción de 30 ciclos que consistían en 15 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C y 90 segundos a 68°C.
Después de esto, se cortó un fragmento de gel que contenía una banda de aproximadamente 2,0 kpb que tenía un tamaño de interés en electroforesis en gel de agarosa y, usando el kit de extracción en gel rápido QIA (marca registrada) (QIAGEN), se obtuvo el ADNc de sCDH3 de interés.
Para insertar este ADNc de sCDH3 en un vector de expresión pEF4/myc-HisB, el ADN se digirió con dos tipos de enzimas de restricción Kpnl y Xbal, y luego se insertó en pEF4/myc-HisB que también había sido digerido con Kpnl y Xbal según un método habitual que usa ADN ligasa T4, para obtener un vector de expresión pEF4-sCDH3-myc-His.
(2) Expresión de proteína CDH3 soluble
El día anterior a la transfección, se sembraron las células CHO (8 * 105) en una placa con un diámetro de 10 cm según los protocolos incluidos con el reactivo de transfección FuGENE (marca registrada) 6 (Roche Diagnostics), y luego se cultivaron durante la noche. Después de esto, se mezclaron 8 |ig del vector de expresión pEF4-CDH3-myc-His y 16 |il del reactivo FuGENE 6 en 400 |il de medio RPMI1640 libre de suero (SIGMA-ALDRICH), y se dejó la mezcla obtenida en la habitación temperatura durante 15 minutos. Después de esto, se añadió la mezcla de reacción al cultivo celular, para realizar la transfección. Dos días después de la transfección, se llevó a cabo la clonación mediante dilución limitativa usando un reactivo selectivo (Zeocin).
Se seleccionaron células CHO que expresan CDH3 soluble según un método de inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo monoclonal anti-c-Myc (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). Se intentó seleccionar una línea celular que fuera capaz de secretar una gran cantidad de CDH3 soluble en el sobrenadante del cultivo y que pudiera crecer favorablemente. Como resultado, se obtuvo una línea celular CHO que expresa CDH3 soluble (EXZ1702). Usando tres frascos rotativos que tenían cada uno un área de cultivo de 1.500 cm2, se cultivó la línea celular CHO que expresa CDH3 soluble seleccionada (EXZ1702) durante 72 horas en 333 ml de un medio libre de suero CHO-S-SFM-II (Invitrogen) por frasco rotativo. Después de esto, se recuperó un sobrenadante de cultivo. Se obtuvo una proteína CDH3 soluble a partir del sobrenadante del cultivo recuperado según la cromatografía de afinidad usando una columna HP HisTrap (marca registrada) (GE Healthcare Biosciences) y cromatografía de filtración en gel usando una columna Superdex (marca registrada) de 200 pg (GE Healthcare Biosciences).
Ejemplo 3: producción de anticuerpo anti-CDH3 de ratón
(1) Producción de anticuerpo monoclonal usando proteína CDH3 soluble como inmunógeno
Se mezclaron 50 |ig de una proteína CDH3 soluble disuelta en una solución salina normal y Titer-MAX Gold (marca registrada) (TiterMax) en volúmenes iguales. Se inyectó la mezcla obtenida en la cavidad abdominal e hipodermis de cada ratón MRL/lpr (Japan SLC, Inc.), para realizar la inmunización inicial. Se llevaron a cabo la segunda inmunización y las posteriores inmunizaciones mezclando una proteína CDH3 soluble (cantidad de proteína: 25 |ig) que se había preparado de la misma manera tal como se describió anteriormente con Titer-MAX gold y luego inyectando la mezcla obtenida en la cavidad abdominal e hipodermis del ratón. Tres días después de la inmunización final, se prepararon de manera aséptica las células esplénicas a partir del ratón y luego se fusionaron las células esplénicas con células de mieloma de ratón SP2/O-Ag14 o P3-X63-Ag8.653 según un método habitual (método del polietilenglicol).
(2) Selección de hibridomas que producen anticuerpos anti-CDH3 de ratón
Se seleccionó un anticuerpo anti-CDH3 de ratón mediante citometría de flujo usando una línea celular CHO (EXZ1501) que expresa CDH3 de longitud completa. Específicamente, la línea celular CHO (EXZ1501) que expresaba CDH3 de longitud completa se trató con EDTA-PBS 2 mM, de modo que se retiró de la placa de cultivo. Después de esto, se suspendieron las células en una disolución de FACS (PBS que contenía BSA al 1%, EDTA 2 mM y NaN3 al 0,1%) a una densidad celular de 1 * 106 células/ml. Se sembró esta suspensión celular en una placa de 96 pocillos hasta una cantidad de 50 ^l/pocillo, y luego se añadió a la misma un sobrenadante de cultivo de hibridomas, de modo que reaccionaron a 4°C durante 60 minutos. Después de esto, se lavó la disolución de reacción con una disolución de FACS (200 |il/pocillo) dos veces, y luego se añadió al resultante F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón marcado con AlexaFluor 488 (Invitrogen). Luego, se hizo reaccionar la mezcla a 4°C durante 30 minutos. Después de esto, se lavó la disolución de reacción dos veces con una disolución de FACS y luego se sometió a citometría de flujo, para seleccionar hibridomas que se hicieron reaccionar con las células CHO que expresan CDH3.
En las figuras 2A a 2C se muestran los resultados de reacción típicos obtenidos de las reacciones de un anticuerpo obtenido de los hibridomas mencionados anteriormente con células CHO que expresan CDH3 (EXZ1501), con células CHO como línea celular parental y con una línea celular de carcinoma bronquioalveolar humano NCI-H358. Se confirmó que todos los hibridomas seleccionados reaccionaron con células CHO que expresan CDH3 (EXZ1501) y NCI-H358, y no reaccionaron con células CHO. La figura 2D muestra los resultados de la citometría de flujo realizada en un anticuerpo de ratón (anticuerpo n.°: PPAT-076-44M) que se purificó a partir de hibridomas derivados del n.° de registro NITE BP-1536.
Ejemplo 4: expresión de ARNm de CDH3 en tejidos normales y tejidos cancerosos
Se recuperaron muestras de tejidos humanos normales y diversos tipos de tejidos cancerosos según microdisección por captura láser, y luego se preparó el ARN total de cada muestra según un método habitual usando ISOGEN (NIPPON GENE c O., LTD.). Se sometieron 10 ng de cada ARN a análisis de expresión génica según el manual técnico de análisis de expresión (Affymetrix) usando GeneChip U-133B (Affymetrix). Se estableció el valor medio de las puntuaciones de expresión de todos los genes en 100, y luego se buscaron los genes cuya expresión se había promovido en las células cancerosas. Como resultado, se encontró que la expresión de CDH3 tenía un determinado límite en tejidos humanos normales, y que CDH3 se expresaba altamente en cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de páncreas (figuras 3A y 3B). Además, se examinó la expresión de ARNm de CDH3 en varios tejidos de cáncer de páncreas que tenían diferentes grados de diferenciación. Como resultado, independientemente del grado de diferenciación, se encontraron tejidos en los que se observó una alta expresión de ARNm de CDH3 (figura 3C).
Ejemplo 5: expresión de proteína CDH3en tejidos cancerosos observado según tinción inmunohistoquímica
Para confirmar la expresión de la proteína CDH3 en muestras clínicas de cáncer, se llevó a cabo la inmunotinción usando matrices de tejido de muestras de cáncer.
Como tales matrices de tejido de muestras de cáncer, se usaron las de cáncer de páncreas (adenocarcinoma), cáncer de pulmón (adenocarcinoma), cáncer de pulmón (carcinoma de células escamosas) y cáncer de colon (adenocarcinoma), fabricadas por Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd.
Se sometió un portaobjetos de cada matriz de tejido a un tratamiento de desparafinización y luego se activó en Tris 10 mM EDTA 1 mM (pH 9,0) a 95°C durante 40 minutos. Se desactivó la peroxidasa endógena usando un reactivo de bloqueo incluido con el kit ENVISION+ (Dako), y luego se hizo reaccionar con un anticuerpo anti-CDH3610227 (BD BIOSCIENCE) y con un anticuerpo anti-HBs Hyb-3423 usado como control negativo en una concentración de 5 |ig/ml a 4°C durante la noche. Después de esto, se separó mediante un procedimiento de lavado la disolución de anticuerpo y luego se hizo reaccionar la matriz con un reactivo de anticuerpo secundario de polímero incluido con el kit ENVISION+ a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de esto, se llevó a cabo el desarrollo del color con un reactivo colorante incluido con el kit ENVISION+ y luego se realizó la tinción nuclear con una disolución de hematoxilina-eosina.
En la figura 4 se muestran los resultados. Las células cancerosas se tiñeron con el anticuerpo anti-CDH3, pero las células normales no se tiñeron con el mismo.
Ejemplo 6: purificación de ARN a partir de hibridomas
Se aisló ARN citoplásmico de células de hibridoma de ratón que producían el anticuerpo contra CDH3 de acuerdo con el método descrito en Gough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic r Na from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, págs. 93-95 (1988) (documento no de patente 10) (en la que se usó otro tampón TNE (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5; Np-40 al 1%; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0) en la presente operación, en vez del tampón de lisis descrito en el artículo de estudio mencionado anteriormente). Como procedimiento operativo específico, se suspendieron células de hibridoma (5 * 106) en 0,2 ml de un tampón TNE para disolver la membrana celular en el mismo, y luego se eliminó el núcleo celular mediante centrifugación. A aproximadamente 0,2 ml del sobrenadante de citoplasma obtenido, se le añadieron 0,2 ml de un tampón de extracción (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; NaCl 0,35 M; SDS al 1% (p/v); EDTA 10 mM, pH 8,0; urea 7 M). Se extrajo la mezcla obtenida con fenol y cloroformo, y luego se añadió glucógeno (Roche; n.° de cat. 901393) como portador a la disolución de ARN obtenida. Se precipitó la mezcla de reacción con etanol. Posteriormente, se añadieron de 10 a 50 |il de agua destilada estéril al precipitado de ARN, dando como resultado una concentración de ARN citoplasmático de 0,5 a 2 |ig/|il, de modo que el precipitado se disolvió en el mismo.
Ejemplo 7: construcción de una biblioteca de ADNc a partir de ARN preparado a partir de hibridomas
Para sintetizar el ADNc monocatenario, se añadieron de 0,5 a 3 |ig del ARN citoplásmico preparado anteriormente a una disolución de reacción que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 8,3 (temperatura ambiente); KCl 75 mM; MgCh 3 mM; DTT 10 mM, 100 ng de cebador aleatorio, dNTP 0,5 mM y 200 unidades de Superscript II (transcriptasa inversa, Invitrogen) para preparar 20 |il de una mezcla de reacción, y luego se incubó la mezcla de reacción a 42°C durante 50 minutos. La biblioteca de ADNc así sintetizada se usó directamente como molde en un método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Ejemplo 8: amplificación de genes que codifican para las regiones variables del anticuerpo anti-CDH3 de ratón mediante el método de PCR
Para determinar las secuencias de las regiones variables del anticuerpo anti-CDH3 de ratón, usando la biblioteca de ADNc obtenida en el ejemplo 7 como molde, se amplificaron los genes de la región variable del anticuerpo anti-CDH3 de ratón mediante un método de PCR. Los cebadores usados en el presente documento se sintetizaron todos por Hokkaido System Science Co., Ltd. La amplificación génica se llevó a cabo usando las combinaciones mencionadas a continuación.
A. Cebadores de PCR para el gen que codifica para la región variable de cadena ligera de ratón
Usando dos tipos de conjuntos de cebadores, concretamente, (1) un cebador de PCR que tiene homología con una porción de FR1 en el extremo terminal 5', y 4 conjuntos de cebadores que tienen homología con un gen de la cadena J en una cadena ligera de ratón en el extremo terminal 3', y (2) conjuntos de cebadores que tienen homología con una porción de señal de cadena ligera en el extremo terminal 5' (7 conjuntos de cebadores), y un cebador con una porción de KC en el extremo terminal 3' (cebador antisentido de KVL), se aisló el ADN de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón a partir del ADNc mediante una reacción en cadena de la polimerasa. Las secuencias de los cebadores son tal como se muestran a continuación.
Cabe señalar que, en las secuencias de nucleótidos, M indica A o C; R indica A o G; W indica A o T; S indica C o G; Y indica C o T; K indica G o T; V indica A, C o G; H indica A, C o T; D indica A, G o T; B indica C, G o T; y N indica A, C, G o T.
(1) 4 conjuntos de cebador sentido para la clonación de la región variable de cadena ligera de ratón
Se sintetizaron 17 tipos de cebadores sentido y 3 tipos de cebadores inversos con referencia a “Phage Display -A Laboratory Manual-, Barbas Burton Scott Silverman” PROTOCOLO 9.5 (documento no de patente 11).
Cebador sentido de VK (porción de FR1, una mezcla de los siguientes 17 cebadores)
5'-GAYATCCAGCTGACTCAGCC-3' (código degenerado 2): SEQ ID NO: 5
5'-GAYATTGTTCTCWCCCAGTC-3' (código degenerado 4): SEQ ID NO: 6
5'-GAYATTGTGMTMACTCAGTC-3' (código degenerado 8): SEQ ID NO: 7
5'-GAYATTGTGYTRACACAGTC-3' (código degenerado 8): SEQ ID NO: 8
5'-GAYATTGTRATGACMCAGTC-3' (código degenerado 8): SEQ ID NO: 9
5'-GAYATTMAGATRAMCCAGTC-3' (código degenerado 16): SEQ ID NO: 10
5'-GAYATTCAGATGAYDCAGTC-3' (código degenerado 12): SEQ ID NO: 11
5'-GAYATYCAGATGACACAGAC-3' (código degenerado 4): SEQ ID NO: 12
5'-GAYATTGTTCTCAWCCAGTC-3' (código degenerado 4): SEQ ID NO: 13
5'-GAYATTGWGCTSACCCAATC-3' (código degenerado 8): SEQ ID NO: 14
5'-GAYATTSTRATGACCCARTC-3' (código degenerado 16): SEQ ID NO: 15
5'-GAYRTTKTGATGACCCARAC-3' (código degenerado 16): SEQ ID NO: 16
5'-GAYATTGTGATGACBCAGKC-3' (código degenerado 12): SEQ ID NO: 17
5'-GAYATTGTGATAACYCAGGA-3' (código degenerado 4): SEQ ID NO: 18
5'-GAYATTGTGATGACCCAGWT-3' (código degenerado 4): SEQ ID NO: 19
5'-GAYATTGTGATGACACAACC-3' (código degenerado 2): SEQ ID NO: 20
5'-GAYATTTTGCTGACTCAGTC-3' (código degenerado 2): SEQ ID NO: 21
Antisentido J (4 conjuntos de cebadores)
Cebador antisentido J1/J2 (1)
5'-GGSACCAARCTGGAAATMAAA-3' (código degenerado: 8): SEQ ID NO: 22
Cebador antisentido J4 (2)
5'-GGGACAAAGTTGGAAATAAAA-3':SEQ ID NO: 23
Cebador antisentido J5 (3)
5'-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3':SEQ ID NO: 24
Una mezcla de cebadores antisentido J1/J2, J4, y J5 (4)
(2) 7 conjuntos de cebadores para la clonación del cebador sentido de VK de la región variable de la cadena ligera de ratón (porción del péptido señal, en el que la secuencia de nucleótidos se modificó basándose en el conjunto de cebadores de Ig de ratón de Novagen (Novagen; Merck, n.° de cat, de manera que los sitios de restricción se eliminaron de allí)
Conjunto de cebadores sentido A
5'-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3': SEQ ID NO: 25
Conjunto de cebadores sentido B
5'-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3': SEQ ID NO: 26
Conjunto de cebadores sentido C
5'-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3': SEQ ID NO: 27
Conjunto de cebadores sentido D (una mezcla de los siguientes dos cebadores)
5'-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3': SEQ ID NO: 28
5'-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3': SEQ ID NO: 29
Conjunto de cebadores sentido E (una mezcla de los siguientes tres cebadores)
5'-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3': SEQ ID NO: 30
5'-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3': SEQ ID NO: 31
5'-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3': SEQ ID NO: 32
Conjunto de cebadores sentido F (se usó una mezcla de los siguientes cuatro tipos de cebadores)
5'-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3': SEQ ID NO: 33
5'-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3': SEQ ID NO: 34
5'-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3': SEQ ID NO: 35
5'-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3': SEQ ID NO: 36
Conjunto de cebadores sentido G (se usó una mezcla de los siguientes cuatro tipos de cebadores)
5'-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3': SEQ ID NO: 37
5'-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3': SEQ ID NO: 38
5'-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3': SEQ ID NO: 39
5'-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3': SEQ ID NO: 40
Cebador antisentido KVL
5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3': SEQ ID NO: 41
B. Cebadores de PCR para el gen que codifica para la región variable de la cadena pesada de ratón
Usando un cebador que tenga homología con una porción de señal de cadena pesada de ratón (4 conjuntos de cebadores) en el extremo terminal 5' y un cebador que tenga homología con una porción de KC en el extremo terminal 3', o usando 1 conjunto de cebadores que tenga homología con una porción de FR1 en el extremo terminal 5' y dos tipos de conjuntos de cebadores que tienen homología con la región constante de una cadena pesada de ratón (IGHC) en el extremo terminal 3', se aisló el ADN de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón a partir del ADNc mediante una reacción en cadena de la polimerasa . Las secuencias de los cebadores son las siguientes. (3) Cebadores para la clonación de la región variable de cadena pesada de ratón
Cebador sentido de VH (porción de señal: 4 conjuntos de cebadores, diseñada con referencia a la tabla 2.12.2 mostrada en Current Protocols in Immunology (John Wiley y Sons, Inc.), unidad 2.12 Cloning, Expression, and Modification of Antibody V Regions).
5'-ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3' (código degenerado 32): SEQ ID NO: 42
5'-ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3' (código degenerado 8): SEQ ID NO: 43
5'-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3': SEQ ID NO: 44
5'-ATGGRCAGRCTTACWTYY-3' (código degenerado 32): SEQ ID NO: 45
(4) Cebadores para la clonación de la región variable de cadena pesada de ratón
Cebador sentido de VH (porción de FR1, diseñado modificando la secuencia de nucleótidos del cebador sentido descrito en Tan et al., Journal of Immunology; 169, pág. 1119 (2002) (documento no de patente 14))
5'-SAGGTSMARCTKSAGSAGTCWGG-3' (código degenerado 256): SEQ ID NO: 46
Cebador antisentido de VH (cebador antisentido común en (3) y (4), que se diseñó degenerando la secuencia de nucleótidos de manera que puede aparearse con todas las isoformas de IgG de ratón)
5'-CASCCCCATCDGTCTATCC-3' (código degenerado 6): SEQ ID NO: 47
Ejemplo 9: determinación de secuencias de las regiones variables de anticuerpo anti-CDH3 de ratón
Se amplificó la región variable en cada una de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo monoclonal anti-CDH3 de ratón mediante un método de PCR empleando un dispositivo DNA Engine (Bio-Rad), usando los cebadores mostrados en el ejemplo 8. Se incorporó el fragmento de ADN amplificado en un vector de subclonación pGEM (Promega) y luego se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN en este vector usando cebadores universales T7, SP6.
Se muestran a continuación, entre las regiones variables del anticuerpo anti-CDH3 de ratón así secuenciado (anticuerpo n.°: PPAT-076-44M) derivado del hibridoma de ratón que tiene el n.° de registro NITE BP-1536, secuencias de aminoácidos correspondientes a las CDR.
SLTSYGVH: SEQ ID NO: 56 (CDR-H1)
GVIWSGGSTD: SEQ ID NO: 57 (CDR-H2)
ARNSNNGFAY: SEQ ID NO: 58 (CDR-H3)
NIYSNLA: SEQ ID NO: 59 (CDR-L1)
LLVYAAKN: SEQ ID NO: 60 (CDR-L2)
QHFYDTPWT: SEQ ID NO: 61 (CDR-L3)
Cabe señalar que CDR-H1, H2 y H3 indican secuencias de la CDR que constituyen cadenas pesadas de anticuerpos individuales, y que CDR-L1, L2 y L3 indican secuencias de la CDR que constituyen cadenas ligeras de anticuerpos individuales.
Las secuencias de nucleótidos de las regiones variables tanto de cadena ligera como cadena pesada del anticuerpo se buscaron en IMGT/V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg). Después de esto, se confirmó que el gen del anticuerpo seguramente podría clonarse.
Ejemplo 10: construcción de vector de expresión transitoria para anticuerpo anti-CDH3
Con respecto a los genes que codifican para las regiones V de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo anti-CDH3 clonado de ratón, se diseñó un gen, con el que se conectó un gen que codifica para una región Ck humana, para un vector de expresión de cadena ligera quimérico, y se diseñó un gen, con el que se conectó un gen que codifica para una región Cg1 humana, para un vector de expresión de cadena pesada quimérico. Luego, se sintetizó artificialmente mediante GenScript los genes de anticuerpos quiméricos de cadena ligera y cadena pesada de longitud completa así diseñados. A ambos extremos del gen, se añadieron sitios de enzimas de restricción (NheI en el lado del extremo 5’ y EcoRI en el lado del extremo 3’).
Por tanto, se sintetizó un anticuerpo quimérico anti-CDH3 derivado de células que tienen el n.° de registro NITE BP-1536 (a continuación en el presente documento denominado anticuerpo n.° PPAT-076-44C, en el que el anticuerpo tiene las mismas secuencias de la región variable de cadena pesada y cadena ligera que las de PPAT-076-44M) y luego se usó para el vector de expresión de anticuerpos quiméricos.
Las células que tienen el n.° de registro NITE BP-1536 se depositaron en el Depósito de Microorganismos de Patentes (NPMD) del Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (NITE) (2-5-8, Kazusa Kamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japón, código postal: 292-0818) el 13 de febrero de 2013 (la solicitud de transferencia a una deposición internacional: 24 de enero de 2014; recibo n.° NITE ABP-1536).
Para la humanización, una región correspondiente a FR se reemplaza con una secuencia de FR derivada de humanos, y se llevó a cabo la síntesis artificial de un anticuerpo de longitud completa de la misma manera tal como se describió anteriormente. Como secuencia de aminoácidos de la región correspondiente a FR, se usaron secuencias de entramado de consenso humano (SEQ ID NO: 62 a 69) o secuencias de entramado de línea germinal (SEQ ID NO: 72 a 79). Se diseñó la secuencia de entramado de línea germinal introduciendo la secuencia de nucleótidos del anticuerpo clonado anti-CDH3 de ratón en IMGT/V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg) y luego seleccionando una secuencia que tiene la mayor similitud. Además, también se llevó a cabo la sustitución de la secuencia de aminoácidos que correspondía a una reducción en la afinidad (remodelación).
Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada o cadena ligera de los anticuerpos humanizados anti-CDH3 usados en el presente documento se muestran a continuación.
Los anticuerpos n.° PPAT-076-44Ha, PPAT-076-44Hb, PPAT-076-44Hc y PPAT-076-44Hd tienen la misma secuencia de la CDR que la del anticuerpo n.° PPAT-076-44M.
Los anticuerpos n.° PPAT-076-44Ha y PPAT-076-44Hb comprenden una secuencia de entramado de consenso humano como FR, mientras que los anticuerpos n.° PPAT-076-44Hc y PPAT-076-44Hd comprenden, como FR, una secuencia de línea germinal humana que es la más similar al anticuerpo de ratón original. Además, PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd comprenden la sustitución de secuencias de aminoácidos, como también se describe a continuación.
Anticuerpo n.°; PPAT-076-44Ha (que tiene la región variable de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 48 y la región variable de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 49) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWS GGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNSNNGFAYW GQGTLVTVSS: SEQ ID NO: 48 (región variable de cadena pesada) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAAKNLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFYDTPWTFGQGTKVEIK: SEQ
ID N O : 49 (regiones variables de cadena ligera)
Anticuerpo n.°; PPAT-076-44Hb (que tiene la región variable de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 50 y la región variable de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 51)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWVAVIWSG GSTDYADSVKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNSNNGFAYWG QGTLVTVSS: SEQ ID NO: 50 (región variable de cadena pesada)
(G49A, R71K y L78V se sustituyen con respecto a SEQ ID NO: 48) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAAKNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFYDTPWTFGQGTKVEIK: SEQ ID NO: 51 (región variable de cadena ligera)
(Q55A se sustituye con respecto a SEQ ID NO: 49)
Anticuerpo n.°; PPAT-076-44Hc (que tiene la región variable de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 52 y la región variable de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 53) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWS GGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNSNNGFAYW GQGTLYTVSS: SEQ ID NO: 52 (región variable de cadena pesada) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAAKNLE SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFYDTPWTFGQGTKVEIK: SEQ ID NO: 53 (región variable de cadena ligera)
Anticuerpo n.°; PPAT-076-44Hd (que tiene la región variable de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 54 y la región variable de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 55) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWS GGSTDYADSVKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNSNNGFAYW GQGTLVTVSS: SEQ ID NO: 54 (región variable de cadena pesada)
(R71K y L78V se sustituyen con respecto a SEQ ID NO: 52) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAAKNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFYDTPWTFGQGTKVEIK: SEQ ID NO: 55 (región variable de cadena ligera)
(E55A se sustituye con respecto a SEQ ID NO: 53)
Después de completar la conversión de la secuencia de aminoácidos, con respecto a un gen artificialmente sintético que había sido diseñado para tener una secuencia deseada, se insertó un gen de la región variable de cadena pesada en el vector pCXN3, en el que se había incorporado un gen de la región constante derivado de IgG1 humana, y se insertó un gen de la región variable de cadena ligera en un vector pCXN3, en el que se había incorporado un gen de la región constante derivado de la cadena k humana, para construir un vector de expresión de cadena ligera de anticuerpo humanizado anti-CDH3 (o anticuerpo quimérico) y un vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo humanizado anti-CDH3 (o anticuerpo quimérico).
Ejemplo 11: expresión transitoria y purificación del anticuerpo anti-CDH3
(1) Expresión transitoria del anticuerpo anti-CDH3
Para la expresión transitoria de un anticuerpo anti-CDH3, se usó FreeStyle (Life Technologies, Inc.). El día anterior, se subcultivaron las células flotantes para la transferencia de genes, 293-F (Life Technologies, Inc.). El día de la transfección, para la expresión de un tipo de anticuerpo, se prepararon 400 ml de una suspensión celular, que se había ajustado para tener una densidad celular de 1 x 106 células/ml. Se suspendió un total de 200 |ig de un plásmido (100 |ig del vector de expresión de cadena pesada del anticuerpo y 100 |ig del vector de expresión de cadena ligera del anticuerpo) en OptiPRO SFM, para preparar la disolución (I). Posteriormente, se añadieron 200 |il de reactivo MAX a 8 ml de OptiPRO SFM para preparar la disolución (II). Se mezcló la disolución (I) con la disolución (II) y luego se dejó en reposo la disolución mixta a temperatura ambiente durante de 10 a 20 minutos. Se añadió un total de 16 ml de esta disolución de reacción a 400 ml de medio de expresión 293 en el cual se suspendieron células 293-F, y luego se cultivó la mezcla obtenida durante de 6 a 7 días a 37°C en el 8% de CO2, usando un agitador de cultivo celular TAITEC BioShaker BR-43FL. Después del cultivo durante de 6 a 7 días, se recuperó un sobrenadante de cultivo que comprendía cada anticuerpo recombinante y luego se sometió a purificación.
(2) Purificación del anticuerpo anti-CDH3
Se purificó una proteína de anticuerpo IgG contenida en el sobrenadante del cultivo mediante una columna de afinidad Ab-Capcher ExTra (ProteNova Co., Ltd.), usando AKTAprime (GE Healthcare Biosciences). Se sometió la fracción de pico obtenida a filtración en gel, usando una columna Sephacryl S-300 que se había equilibrado con PBS de Dulbecco usado como disolvente, de modo que se purificó adicionalmente. Se calculó la cantidad de proteína de anticuerpo IgG purificada usando un coeficiente de absorción. Se calculó el coeficiente de absorción del anticuerpo IgG sometiendo la secuencia total de aminoácidos de cada anticuerpo a EXPASY ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/).
Ejemplo 12: cuantificación de anticuerpo mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Se midió un sobrenadante de cultivo de las células CHO transfectadas mediante ELISA y se confirmó que se había producido un anticuerpo quimérico. Para detectar el anticuerpo quimérico, se recubrió una placa con anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H L) (que había sido absorbido previamente contra IgG de ratón, conejo, bovino y ratón) (COSMO BIO: AQI, n.° de cat. A- 110UD). Después del bloqueo, se sometió el sobrenadante de cultivo obtenido de células CHO capaces de producir anticuerpo quimérico anti-CDH3 a diluciones en serie y luego se añadió a cada pocillo. Después de que la placa había sido sometida a incubación y lavado, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H L) (que previamente había sido absorbido contra IgG de ratón, conejo, bovino y ratón) - HRP (COSMO BIO: AQI, n.° de cat. A-110UD) a la placa. Después de la incubación y el lavado, se añadió una disolución colorante de TMB a la placa (AR BROWN CO., LTD., cat. TM4999). Se llevó a cabo incubación adicional, luego se terminó la reacción y luego se midió la absorbancia a 450 nm. Se usó IgG humana purificada como patrón.
Ejemplo 13: actividad de unión del anticuerpo
Se evaluaron los anticuerpos que tienen las secuencias mostradas en el ejemplo 10 mediante citometría de flujo, en cuanto a la actividad de unión.
Se trató una línea celular que se usaría como diana de reacción (una línea celular NCI-H358 que se había confirmado que expresaba CDH3 en un nivel alto) con EDTA-PBS 2 mM, de modo que se extrajeron las células de una placa de cultivo, y luego se suspendieron las células obtenidas en una disolución de FACS hasta una densidad celular de 1 * 106 células/ml. Se sembró esta suspensión celular en una placa de 96 pocillos, lo que dio como resultado una cantidad de 50 |il/pocillo, y luego se añadió el anticuerpo quimérico purificado a la placa para dar como resultado una concentración de 10 |ig/ml, seguido por la realización de una reacción a 4°C durante 60 minutos. Después de esto, se lavó la mezcla de reacción con una disolución de FACS (150 ^l/pocillo) dos veces y luego se añadieron 4 |ig/ml de F(ab')2 de cabra anti-IgG humana marcado con AlexaFlour488 (Invitrogen) al resultante. Se hizo reaccionar la mezcla obtenida a 4°C durante 30 minutos. Después de esto, se lavaron las células con una disolución de FACS dos veces y luego se sometieron a citometría de flujo.
Como resultado, se encontró que los anticuerpos humanizados (PPAT-076-44Ha y PPAT-076-44Hc) tenían una reactividad débil con una línea celular de cáncer que expresa CDH3 (NCI-H358). Además, se encontró que los anticuerpos sometidos a la remodelación (PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd) tenían una fuerte reactividad con NCI-H358 (figura 5A). Además, PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd no reaccionaron con células CHO, pero estos anticuerpos reaccionaron con células CHO que se vieron obligadas a expresar CDH3, ya que reaccionaron con la línea celular NCI-H358 (figuras 5B y 5C).
Tal como se describió anteriormente, en la humanización de un anticuerpo de ratón derivado de PPAT-076-44M, una secuencia que se consideró una secuencia de la CDR se combinó con una secuencia de entramado de consenso o derivada de línea germinal humana, para obtener un anticuerpo que presentara actividad de unión, aunque la actividad no fue suficiente. Por consiguiente, se supone que la secuencia de la CDR mencionada anteriormente sería una secuencia razonable. Dado que la actividad de unión del anticuerpo humanizado derivado de PPAT-076-44M se recupera realizando la remodelación, se respalda la idea de que algunos residuos de aminoácido desempeñan un papel importante para el mantenimiento de la estructura.
Ejemplo 14: síntesis del fármaco
Se preparó DM1 SMe tal como se describe en la patente estadounidense n.° 5.208.020 (documento de patente 10) y la patente estadounidense n.° 6.333.410 B1 (documento de patente 11). Se externalice la síntesis de DM1 SMe a SYNSTAR JAPAN CO., LTD. En la figura 6 se muestra la fórmula estructural de la misma.
Ejemplo 15: Preparación de un anticuerpo unido a fármaco
1. Tratamiento de reducción de fármaco unido
Se mezclaron entre sí 0,78 mg de DM1 SMe disueltos en 300 |il de etanol, 180 |il de tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 7,5) y 20 |il de una disolución de TCEP (Bond Breaker, Thermo Fisher Scientific KK) y luego se hizo reaccionar la mezcla obtenida en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 30 minutos o más, de modo que se redujo el fármaco.
Se purificó el fármaco reducido mediante HPLC, y luego se eliminó por destilación el disolvente. Se disolvió el residuo en dimetilacetamida hasta una concentración de 10 mg/ml.
2. Preparación de un anticuerpo tratado con maleimida
Se añadió sulfo-SMCC (PIERCE) a un anticuerpo 1 mg/ml a una razón molar de 30:1 o mayor, y luego se hizo reaccionar la mezcla obtenida a 30°C durante 1 hora.
Para eliminar una cantidad excesiva de agente reticulante, se sometió el producto de reacción a un tratamiento de desalinización con una columna de desalinización que se había equilibrado con fosfato de potasio 50 mM, NaCl 50 mM y EDTA 2 mM (pH 6,5) (ZebaSpinColumn, Thermo Fisher Scientific KK).
3. Modificación de un anticuerpo con fármaco
Se hizo reaccionar un anticuerpo tratado con maleimida 1 mg/ml con un agente reductor que era 1,7 veces mayor que el número de grupos maleimida unidos en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 50 mM y EDTA 2 mM (pH 6,5) a temperatura ambiente durante la noche. Posteriormente, se eliminó una cantidad excesiva de fármaco de la mezcla de reacción mediante filtración en gel.
Ejemplo 16: cuantificación de cantidad de fármaco unida al anticuerpo
Se determinó el número de fármacos unidos por anticuerpo midiendo la absorbancia a 252 nm y 280 nm. Se llevó a cabo la determinación con referencia a los métodos descritos en J. Med. Chem. 49, 4392-4408 (2006) (documento no de patente 12) y Methods. Mol. Biol. 525, págs. 445-67 (2009) (documento no de patente 21), usando también los coeficientes de absorción descritos en las publicaciones mencionadas anteriormente (eAb280 = 223,000 M'1cirr1, eAb252 = 82,510 M - W , 8DM1280 = 5,180 M 'W y e D M W = 26,160 M 'W ) .
Ejemplo 17: prueba de citotoxicidad
Se evaluaron la citotoxicidad y la especificidad de un anticuerpo unido a un fármaco, usando un reactivo de medición del crecimiento celular (Dojindo Laboratories, kit de ensayo de recuento celular 8) en el que se utilizó WST-8 como sustrato cromogénico.
Específicamente, se permitió que diversos tipos de líneas celulares de cáncer coexistieran con un conjugado fármacoanticuerpo humanizado en cualquier cantidad dada, y luego se incubó la mezcla obtenida a 37°C durante 3 días en un ambiente con el 5% de CO2. Como medio, se usó un medio predeterminado para cada línea celular, al que se había añadido FBS. Después de esto, se añadió el reactivo de medición del crecimiento celular al resultante y luego se dejó la mezcla obtenida. Posteriormente, se midió la absorbancia A450/620. El valor de absorbancia obtenido de un pocillo, al que sólo se le había añadido la línea celular cancerosa y no se habían añadido anticuerpos, se fijó al 100% y se indicó el valor relativo obtenido como el porcentaje de supervivencia celular.
En la figura 7A, se usó NCI-H358 como línea celular, y como conjugados anticuerpo-fármaco, se usaron PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd, a cada uno de los cuales se unió un fármaco. Ambos conjugados anticuerpo-fármaco presentaron citotoxicidad.
En la figura 7B, se usó HCC1954 como línea celular, y como conjugado anticuerpo-fármaco, se usó PPAT-076-44Hd al que se unió un fármaco. En la figura 7C, se usó HCC70 como línea celular, y como conjugado anticuerpo-fármaco, se usó PPAT-076-44Hd al que se unió un fármaco. Dado que ambas de estas líneas celulares expresan CDH3, el conjugado de fármaco de PPAT-076-44Hd presenta citotoxicidad.
En la figura 7D, se usaron las líneas celulares mostradas en la tabla 1 a continuación, y como conjugado anticuerpo fármaco, se usó PPAT-076-44Hd al que se unió un fármaco. Se unió el fármaco a cada anticuerpo mediante el método descrito en el ejemplo 15. Los valores de la señal de ARNm de las líneas celulares mostradas en la tabla 1 eran valores promedio obtenidos de la base de datos pública (https://cabig-stage.nci.nih.gov/community/caA rray_GSKdata/). Se examinaron las líneas celulares que tenían valores de señal pequeños (NCIH1930 y SW962) como controles negativos de expresión de CDH3. Las líneas celulares que expresan c DH3 se inhibieron en términos de crecimiento celular, independientemente del tipo de carcinoma.
Todos los conjugados de fármaco usados en el presente documento tenían DAR de 3 a 4.
[Tabla 1]
Tabla 1: líneas celulares usadas en la prueba y enfermedades de las líneas celulares
Figure imgf000024_0001
Ejemplo 18: pruebas en animales que tienen cáncer HCC1954 usando anticuerpos humanizados
Se confirmaron los efectos reductores de tumores de los conjugados anticuerpo-fármaco usando anticuerpos humanizados (PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd) usando modelos de xenoinjerto, en los que se había trasplantado la línea celular de cáncer de mama HCC1954.
Las razones de fármaco con respecto a anticuerpo (DAR) de los dos conjugados anticuerpo-fármaco cuantificadas mediante el método del ejemplo 16 fueron PPAT-076-44Hb (DAR 3,69) y PPAT-076-44Hd (DAR 3,51).
Para portar cáncer, en primer lugar, se disolvió un anticuerpo anti-asialo GM1 (WAKO 014-09801) en 1 ml de agua destilada Otsuka y luego se añadieron 4 ml de solución salina Otsuka a la disolución hasta una cantidad total de 5 ml. Después de esto, se administraron por vía intraperitoneal 100 |il de la disolución obtenida a cada ratón. Posteriormente, se cultivó HCC1954 en un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, y luego se trasplantó el cultivo en una cantidad de 5 x 106 células/ratón en la hipodermis de la parte derecha de la pared abdominal de un ratón SCID (hembra, CLEA Japan, Inc.).
Se llevó a cabo la prueba en 5 ratones de cada grupo. Se administró el anticuerpo en la vena caudal de cada ratón a una dosis de 5 mg/kg, una vez a la semana, dos veces en total. En la figura 8 se muestran los resultados obtenidos midiendo el volumen tumoral. Tal como se muestra en la figura 8, el conjugado anticuerpo-fármaco que comprende el anticuerpo humanizado presentó un alto efecto antitumoral.
Ejemplo 19: prueba en animales que tienen cáncer HCC70 usando anticuerpos humanizados (1)
Se confirmaron los efectos reductores de tumores de los conjugados anticuerpo-fármaco usando el anticuerpo humanizado (PPAT-076-44Hb) o el anticuerpo quimérico (PPAT-076-44C) usando modelos de xenoinjerto, en los que se había trasplantado la línea celular de cáncer de mama HCC70.
Los DAR de los dos conjugados anticuerpo-fármaco fueron PPAT-076-44Hb (DAR 2,90) y PPAT-076-44C (DAR 3,07).
Para portar cáncer, en primer lugar, se disolvió un anticuerpo anti-asialo GM1 (WAKO 014-09801) en 1 ml de agua destilada Otsuka y luego se añadieron 4 ml de solución salina Otsuka a la disolución hasta una cantidad total de 5 ml. Después de esto, se administraron por vía intraperitoneal 100 |il de la disolución obtenida a cada ratón. Posteriormente, se cultivó HCC70 en un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, y luego se trasplantó el cultivo en una cantidad de 5 x 106 células/ratón en la hipodermis de la parte derecha de la pared abdominal de un ratón SCID (hembra, CLEA Japan, Inc.).
Se llevó a cabo la prueba en 5 ratones de cada grupo. Se usó el conjugado de anticuerpo humanizado en una dosis de 0,6, 3,0 o 15 mg/kg, se usó el conjugado de anticuerpo quimérico en una dosis de 3,0 mg/kg y se usó el anticuerpo humanizado no unido a fármaco (desnudo) en una dosis de 15 mg/kg. Se administró cada uno de estos anticuerpos una vez a la semana, dos veces en total. En la figura 9 se muestran los resultados obtenidos midiendo el volumen tumoral. Tal como se muestra en la figura 9, el conjugado anticuerpo-fármaco que comprende el anticuerpo humanizado presentó repetidamente un efecto antitumoral que fue mayor que el del conjugado anticuerpo-fármaco que comprende el anticuerpo quimérico.
Ejemplo 20: prueba en animales que tienen cáncer HCC70 usando anticuerpo humanizado (2)
Se confirmaron los efectos reductores de tumores de los conjugados anticuerpo-fármaco que comprende el anticuerpo humanizado (PPAT-076-44Hd) o el anticuerpo quimérico (PPAT-076-44C) usando modelos de xenoinjerto, en los que se había trasplantado la línea celular de cáncer de mama HCC70.
Se llevó a cabo el portado del cáncer de la misma manera que en el ejemplo 19. Se usó conjugado de anticuerpo humanizado a una dosis de 0,6, 3,0 o 15 mg/kg, se usó el conjugado de anticuerpo quimérico a una dosis de 3,0 mg/kg, y se usó el anticuerpo humanizado no unido al fármaco (desnudo) a una dosis de 15 mg/kg. Se administró cada uno de estos anticuerpos a través de la vena caudal de cada ratón, una vez a la semana, dos veces en total. Se llevó a cabo la prueba en 5 ratones de cada grupo. Los DAR de los dos conjugados de anticuerpo-fármaco fueron PPAT-076-44C (DAR 3,07) y PPAT-076-44Hd (DAR 2,98).
En la figura 10 se muestran los resultados obtenidos midiendo el volumen tumoral. Tal como se muestra en la figura 10, el anticuerpo humanizado presentó un alto efecto antitumoral como resultado de la unión del fármaco al anticuerpo, y podría confirmarse un efecto antitumoral dependiente de la dosis. Además, como en el caso del ejemplo 19, el anticuerpo humanizado volvió a presentar un efecto antitumoral superior que el del anticuerpo quimérico, cuando se administraron a la misma dosis (3,0 mg/kg).
Ejemplo 21: prueba en animales que tienen cáncer OKa-C-1 usando anticuerpo humanizado
Se confirmó el rendimiento del conjugado anticuerpo-fármaco de la presente invención para suprimir el crecimiento de un tumor usando modelos de xenoinjerto, en los que se había trasplantado la línea celular de cáncer de pulmón OKa-C-1 (National Institute of Biomedical Innovation, JCRB1343). Para portar cáncer, se cultivó la línea celular de cáncer de pulmón OKa-C-1 en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, y luego se trasplantó el cultivo obtenido en una cantidad de 6,5 x 106 células/ratón en la hipodermis de la parte derecha de la pared abdominal de un ratón SCID (hembra, CLEA Japan, Inc.). Se administró el conjugado de anticuerpo humanizado a cada ratón a una dosis de 15 mg/kg, a través de la vena caudal del mismo, una vez a la semana, dos veces en total. Se llevó a cabo la prueba en 3 ratones de cada grupo. En el presente documento, se usó PPAT-076-44Hd como anticuerpo humanizado, y se unió un fármaco a cada anticuerpo mediante el método descrito en el ejemplo 15. Se cuantificó la razón promedio de fármaco con respecto a anticuerpo (DAR) por molécula de anticuerpo individual mediante el método descrito en el ejemplo 16. Como resultado, se encontró que el DAR era 3,04. En la figura 11 se muestran los resultados obtenidos midiendo el volumen tumoral. Tal como se muestra en la figura 11, se confirmó que el presente conjugado anticuerpofármaco presentaba un alto efecto antitumoral en la línea celular de cáncer de pulmón OKa-C-1, así como en la línea celular de cáncer de mama, como resultado de la unión del fármaco al anticuerpo humanizado.
Ejemplo 22: expresión de proteína CDH3 de longitud parcial del extremo N-terminal
(1) Construcción de vector de expresión para proteína CDH3 de longitud parcial del extremo N-terminal
Para confirmar la reactividad del anticuerpo contra CDH3 obtenido, se unió la región N-terminal de un antígeno de CDH3 a la porción de Fc de IgG2a de ratón, para preparar una proteína de fusión. La secuencia de ADNc de la proteína de fusión es tal como se muestra en SEQ ID NO: 70, y la secuencia de aminoácidos de la misma es tal como se muestra en SEQ ID NO: 71. Como péptido señal, se usó la de una cadena k de anticuerpo. Para la subclonación, se añadió el sitio Nhel de la enzima de restricción al lado 5 principal, y el sitio EcoRI se añadió al lado 3 principal (sintetizado por GenScript, EE.UU.). Después de esto, se incorporó el resultante en un vector de expresión de mamífero pCAGGS que había sido digerido por NheI y EcoRI, o en pCAGGS-DHFR en el que se había incorporado un gen DHFR de ratón para amplificación génica.
(2) Expresión y purificación de proteína CDH3 de longitud parcial del extremo N-terminal
Para la expresión transitoria, se utilizó FreeStyle (Life Technologies, Inc.). Como células para la producción de la proteína, se usó 293-F (Life Technologies, Inc.). Como reactivo de transferencia génica, se usó el reactivo de transfección FreeStyle Max (Life Technologies, Inc.). Las células 293F, en las que se había introducido un gen de antígeno soluble de fusión Fc, se produjeron realizando un cultivo durante de 4 a 7 días, usando un agitador TAITEC capaz de controlar la concentración de CO2. Se purificó la proteína de fusión producida con una columna Protein A Sepharose (ProteNova Co., Ltd.). En la figura 12A se muestra una vista del antígeno purificado y expresado de manera transitoria que se tiñó con CBB, y en la figura 12B se muestra una imagen teñida de un anticuerpo contra CDH3 disponible comercialmente (BD BIOSCIENCE y R & D Systems) usado como anticuerpo primario. Como anticuerpo marcado secundario, se usó F(ab')2 anti-IgG de ratón-HRP (IgG de cabra) (CAPPEL n.° 55553).
Ejemplo 23: ELISA de fase sólida de proteína CDH3 de longitud parcial del extremo N-terminal
Se diluyó la proteína CDH3 de longitud parcial del extremo N-terminal con PBS a 2,5 |ig/ml, y luego se dispensó la disolución obtenida en una placa de 96 pocillos en una cantidad de 100 ^l/pocillo, y luego se dejó en reposo a 4°C durante la noche. Al día siguiente, se descartó la disolución en cada pocillo y luego se lavó el pocillo con tampón A (Tris-HCl 50 mM/NaCI 150 mM/CaCl2 1 mM/Tween 20 al 0,05% (pH 7,5)). Posteriormente, se preparó una serie de diluciones de una sustancia de prueba (anticuerpo anti-CDH3) y luego se dispensó en la placa en una cantidad de 100 |il/pocillo, seguido por agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de esto, se descartó la disolución y se lavó el pocillo con tampón A. Después de esto, se diluyó un anticuerpo marcado con HRP (anticuerpo de cabra anti-IgG humana-HRP (H L) (absorbido con IgG de ratón, conejo, bovino) (American Qualex International, cat. A-110PD)) 10.000 veces con tampón A, y luego se dispensó en la placa en una cantidad de 100 |il/pocillo, seguido por agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de esto, se lavó la placa con tampón A y luego se añadió una disolución colorante de TMB a la placa en una cantidad de 100 |il/pocillo, seguido por dejarla en reposo en un lugar oscuro durante 15 minutos para que se desarrollara el color. Se añadió una disolución de parada a la placa en una cantidad de 100 |il/pocillo y luego se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de placas. En la figura 13 se muestran los resultados. Como sustancias de prueba, se usaron PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd.
Ejemplo 24: producción de anticuerpo marcado con Alexa488
Se sustituyó un anticuerpo que iba a usarse para el marcado con un tampón de marcado (NaHCO3 50 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,5). Se añadieron 0,5 |il de Alexa488 25 mM (1 mg de Alexa488 disuelto en 62,1 |il de DMF, Life Technologies, Inc.) a 1 mg de un anticuerpo, y se dejó en reposo la mezcla obtenida en condiciones de protección contra la luz a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de esto, se intercambió el tampón con PBS.
Ejemplo 25: prueba de comparación de la afinidad de los anticuerpos (1)
Se confirmó la influencia de la humanización sobre la afinidad llevando a cabo una prueba de competición usando un citómetro de flujo (FACS). Se permitió que coexistieran un anticuerpo de prueba cuya serie de dilución se había preparado, una línea celular que expresaba CDH3 y una determinada cantidad de anticuerpo marcado con Amaxa488 que era competitivo con el anticuerpo de prueba, y se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de esto, se lavó el producto de reacción con una disolución de FACS y luego se llevó a cabo la medición de FACS. A partir del valor medio de GEO de cada concentración de anticuerpo, se calculó el porcentaje inhibidor, cuando el valor medio de GEO de sólo el anticuerpo competitivo se fijó en el 100%, para obtener CI50. El valor de CI50 obtenido se definió como un índice de afinidad.
Como anticuerpo para ser competitivo con el anticuerpo de prueba, se usó un anticuerpo de ratón purificado a partir de un producto producido por las células con el n.° NITE BP-989, que se marcó mediante el método descrito en el ejemplo 24. Como anticuerpos de prueba, se usaron PPAT-076-44Hd, PPAT-076-44C y PPAT-076-44M. En la figura 14 se muestran los resultados. Los anticuerpos de prueba eran todos competitivos con el anticuerpo marcado con Alexa488, pero sus grados competitivos eran diferentes. Se demostró que el anticuerpo humanizado (PPAT-076-44Hd) de la presente solicitud tenía un grado de afinidad mejorado, en comparación con los anticuerpos quiméricos y de ratón.
Ejemplo 26: prueba de comparación de la afinidad de los anticuerpos (2)
Se confirmó la influencia de la razón promedio de fármaco con respecto a anticuerpo (DAR) de la unión del fármaco al anticuerpo humanizado de la presente invención sobre la afinidad mediante la misma prueba de competición usando FACS que en el ejemplo 25. Se preparó el conjugado anticuerpo-fármaco en el intervalo de DAR promedio de 0 a 8 mediante el método descrito en el ejemplo 15. Se cuantificó el DAR mediante el método descrito en el ejemplo 16.
Como línea celular, se usó NCI-H358. Cuando se midieron PPAT-076-44Hb y PPAT-076-44Hd, se usó un anticuerpo de ratón purificado a partir de un producto producido por las células con n.° NITE BP-989, que se marcó con Alexa488 mediante el método descrito en el ejemplo 24. Mediante la misma prueba de competición FACS que la descrita en el ejemplo 25, se calculó cada valor de CI50 como índice de afinidad.
La comparación mostrada en la figura 15 (A: PPAT-076-44Hb, B: PPAT-076-44Hd) se indica con un valor relativo obtenido cuando el valor de CI50 de cada anticuerpo al que no se ha unido un fármaco se define como 1. La figura muestra que la afinidad de ambos anticuerpos humanizados no disminuye por la unión de un fármaco a los anticuerpos.
Ejemplo 27: confirmación de la expresión de CDH3 en líneas modelo que portan cáncer
Para confirmar la expresión de una proteína CDH3 en líneas modelo que portan cáncer, se sometieron a inmunotinción secciones de tejido que portaban cáncer. Se trasplantó cada línea celular en la hipodermis de un ratón, y luego se dejó al ratón durante unos días predeterminados para producir un ratón que tiene cáncer. Se sometieron los tejidos tumorales obtenidos de un ratón que tiene cáncer de este tipo a un tratamiento de desparafinización y luego se activaron los tejidos resultantes en un autoclave a 121°C durante 15 minutos. Después de esto, se inactivó la peroxidasa endógena con metanol que contenía el 0,3% de H2O2, y luego se sometió a un tratamiento de bloqueo con suero de cabra al 10%. Se hicieron reaccionar los tejidos resultantes con el anticuerpo anti-CDH3 610227 (BD BIOSCIENCE) a 4°C durante la noche. Después de lavar la disolución de anticuerpo, se hizo reaccionar el residuo con el segundo reactivo de anticuerpo Histofine Simple Stain MAX-PO a temperatura ambiente durante 1 hora. Se usó un

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo humanizado anti-CDH3 expuesto en uno cualquiera de los siguientes (1) o (2):
(1) un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 50 en la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 51 en la región variable de cadena ligera;
(2) un anticuerpo humanizado anti-CDH3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 54 en la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 55 en la región variable de cadena ligera.
2. Fragmento del anticuerpo humanizado anti-CDH3 según la reivindicación 1, en el que el fragmento tiene capacidad para unirse a CDH3.
3. Inmunocomplejo, en el que el anticuerpo humanizado anti-CDH3 según la reivindicación 1 o el fragmento del mismo según la reivindicación 2, se conjuga con un agente quimioterápico a través de un ligador.
4. Inmunocomplejo según la reivindicación 3, en el que el agente quimioterápico es una sustancia citotóxica y dicha sustancia citotóxica es un maitansinoide o un derivado del mismo, o una auristatina o un derivado de la misma.
5. Inmunocomplejo según la reivindicación 4, en el que la sustancia citotóxica es un maitansinoide seleccionado de DM1, DM3 y DM4, o un derivado del mismo, o una auristatina seleccionada de MMAE y MMAF, o un derivado de la misma.
6. Inmunocomplejo según la reivindicación 5, en el que un promedio de una a siete moléculas de DM1 se unen a una única molécula del anticuerpo humanizado anti-CDH3, o el fragmento del mismo.
7. Inmunocomplejo según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el ligador se selecciona del grupo que consiste en 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) de N-succinimidilo (LC-SMCC), éster N-succinimidílico del ácido kmaleimidoundecanoico (KMUA), éster N-succinimidílico del ácido y-maleimidabutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido g-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidabenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), 6-(P-maleimidopropionamida)hexanoato de succinimidilo (SMPH), 4-(p-maleimidofenil)butirato de N-succinimidilo (SMPB), isocianato de N-(p-maleimidofenilo) (PMPI), 4(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB) y (4-(2-piridiltio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB).
8. Medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad que se caracteriza por sobreexpresión de CDH3, en el que el medicamento comprende el inmunocomplejo según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que la enfermedad que se caracteriza por la sobreexpresión de CDH3 se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga invasivo, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro metastásico, cáncer de tiroides, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, carcinoma de células escamosas del esófago, carcinoma de células escamosas del pulmón, carcinoma de células escamosas de la piel, melanoma, cáncer mamario, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de células escamosas del cuello uterino, carcinoma de células escamosas del páncreas, carcinoma de células escamosas del colon, carcinoma de células escamosas del estómago, cáncer de próstata, osteosarcoma y sarcoma de tejidos blandos.
ES14751339T 2013-02-15 2014-02-14 Anticuerpo humanizado anti-CDH3, conjugado de fármaco del mismo y utilización del mismo Active ES2829597T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013027386 2013-02-15
JP2013091163 2013-04-24
PCT/JP2014/053473 WO2014126198A1 (ja) 2013-02-15 2014-02-14 抗ｃｄｈ３ヒト化抗体、その薬剤コンジュゲート、及びそれらの使用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2829597T3 true ES2829597T3 (es) 2021-06-01

Family

ID=51354197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14751339T Active ES2829597T3 (es) 2013-02-15 2014-02-14 Anticuerpo humanizado anti-CDH3, conjugado de fármaco del mismo y utilización del mismo

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9644028B2 (es)
EP (1) EP2957632B1 (es)
JP (1) JP6377601B2 (es)
KR (1) KR20150119206A (es)
CN (1) CN105073988A (es)
AU (1) AU2014216959A1 (es)
BR (1) BR112015019328A2 (es)
CA (1) CA2901214A1 (es)
ES (1) ES2829597T3 (es)
HK (1) HK1215959A1 (es)
RU (1) RU2015139147A (es)
SG (1) SG11201506358PA (es)
WO (1) WO2014126198A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015049688A2 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 Suri Technologies Ltd. Patient-specific immunotherapy for treating heterogeneous tumors
RU2729194C2 (ru) 2013-12-27 2020-08-05 Займворкс Инк. Сульфонамидсодержащие связывающие системы для лекарственных конъюгатов
CN108064244B (zh) * 2014-11-14 2021-09-17 诺华股份有限公司 抗体药物缀合物
TW201709932A (zh) * 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
WO2022237874A1 (en) * 2021-05-13 2022-11-17 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Antibody conjugate comprising anti-p-cadherin antibody and uses thereof
WO2025183075A1 (ja) * 2024-02-29 2025-09-04 株式会社ペルセウスプロテオミクス 抗ｃｄｈ３ヒト化抗体及びそれらの使用
WO2025183174A1 (ja) * 2024-03-01 2025-09-04 株式会社ペルセウスプロテオミクス 抗ｃｄｈ３ヒト化抗体と薬物とのコンジュゲート、およびその使用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
HU221385B1 (en) 1994-07-13 2002-09-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reconstituted human antibody against human interleukin-8
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
JP2005522982A (ja) 2001-05-31 2005-08-04 カイロン コーポレイション 癌治療のための標的としてのｐ−カドヘリン
ME01803B (me) * 2004-08-05 2010-12-31 Genentech Inc Humanizovani anti-cmet antagonisti
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
CN101432303A (zh) 2006-02-28 2009-05-13 肿瘤疗法科学股份有限公司 利用抗cdh3抗体的效应物功能来损伤细胞的方法
CN104650230A (zh) * 2008-01-31 2015-05-27 健泰科生物技术公司 抗cd79b抗体和免疫偶联物及使用方法
KR101361905B1 (ko) * 2008-05-16 2014-02-21 제넨테크, 인크. 베타7 인테그린 길항제를 이용한 위장관 염증 장애의 치료를 평가하기 위한 바이오마커의 용도
WO2010001585A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Oncotherapy Science, Inc. Anti-cdh3 antibodies labeled with radioisotope label and uses thereof
CN102753579A (zh) * 2009-05-01 2012-10-24 国立大学法人东京大学 抗钙粘着蛋白抗体
RU2011149798A (ru) * 2009-05-08 2013-06-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-egfl7-антитела и способы их применения
DK2519542T3 (en) 2009-12-28 2019-01-14 Onco Therapy Science Inc ANTI-CDH3 ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF.
HRP20180293T1 (hr) 2010-02-10 2018-03-23 Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd. Anti-kadherin antitijelo obilježeno radioaktivnim metalom
US7866675B2 (en) 2010-04-05 2011-01-11 Hauser Ray L Composite ice blade
JP6006640B2 (ja) 2010-10-29 2016-10-12 株式会社ペルセウスプロテオミクス 高い内在化能力を有する抗ｃｄｈ３抗体
JP2014015396A (ja) * 2010-10-29 2014-01-30 Perseus Proteomics Inc 高い親和性を有する抗ｃｄｈ３抗体
JPWO2012176765A1 (ja) 2011-06-24 2015-02-23 株式会社ペルセウスプロテオミクス 抗ヒトｐ−カドへリン（ｃｄｈ３）遺伝子組み換え抗体
CN104220595A (zh) 2012-04-04 2014-12-17 株式会社英仙蛋白质科学 抗cdh3(p-钙粘着蛋白）抗体的药剂偶联物

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2014126198A1 (ja) 2017-02-02
US9644028B2 (en) 2017-05-09
EP2957632B1 (en) 2020-09-30
CN105073988A (zh) 2015-11-18
EP2957632A4 (en) 2016-10-05
BR112015019328A2 (pt) 2017-08-22
RU2015139147A (ru) 2017-03-21
SG11201506358PA (en) 2015-09-29
AU2014216959A1 (en) 2015-10-01
US20160152703A1 (en) 2016-06-02
JP6377601B2 (ja) 2018-08-22
HK1215959A1 (en) 2016-09-30
CA2901214A1 (en) 2014-08-21
WO2014126198A1 (ja) 2014-08-21
EP2957632A1 (en) 2015-12-23
KR20150119206A (ko) 2015-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6006640B2 (ja) 高い内在化能力を有する抗ｃｄｈ３抗体
ES2829597T3 (es) Anticuerpo humanizado anti-CDH3, conjugado de fármaco del mismo y utilización del mismo
JP6113717B2 (ja) 抗ｃｄｈ３（ｐ−カドヘリン）抗体の薬剤コンジュゲート
JP2018524349A (ja) 抗ｃｄ１２３抗体、ならびにその複合体及び誘導体
WO2012057315A1 (ja) 高い親和性を有する抗cdh3抗体
WO2025183075A1 (ja) 抗ｃｄｈ３ヒト化抗体及びそれらの使用
HK40118181A (en) Conjugate of anti‑cdh3 (p‑cadherin) antibody and drug
HK40034094A (en) Anti-cdh3 antibody having high internalization capacity
HK1261879B (en) Anti-cdh3 antibody having high internalization capacity
HK1261879A1 (en) Anti-cdh3 antibody having high internalization capacity
HK1188222A (en) Anti-cdh3 antibody having high internalization capacity