WO2014126198A1 - 抗ｃｄｈ３ヒト化抗体、その薬剤コンジュゲート、及びそれらの使用 - Google Patents

抗ｃｄｈ３ヒト化抗体、その薬剤コンジュゲート、及びそれらの使用 Download PDF

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WO2014126198A1
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chain variable
antibody
humanized antibody
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石井　敬介
克之 見供
克志 甲田
富美子 野村
容子 粥川
正 松浦
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株式会社ペルセウスプロテオミクス
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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to an anti-CDH3 humanized antibody and an immune complex thereof, particularly a drug conjugate thereof.
  • the present invention further relates to methods of using anti-CDH3 humanized antibodies and immune complexes thereof.
  • Cancer is an important disease that occupies the top causes of death, but its therapeutic needs have not yet been met.
  • cancer treatment with molecular targeted drugs that design and treat drugs targeting specific molecules specifically expressed in cancer cells Has been actively studied.
  • CDH3 P-cadherin
  • CDH3 is a membrane protein discovered as a molecule that is involved in cell adhesion with homophilicity in a calcium-dependent manner (Yoshida and Takeichi, Cell 28: 217-224, 1982 (Non-patent Document 1)).
  • a protein having a cadherin repeat consisting of about 110 amino acid residues having high homology to each other is called a cadherin superfamily, and CDH3 belongs to its main member.
  • ADCC Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity
  • ADC Antibody Drug Conjugate
  • compositions used in ADC include bacterial protein toxins such as diphtheria toxin, plant protein toxins such as ricin, low molecular weight toxins such as auristatin, maytansinoid, calicheamicin, and derivatives thereof.
  • the drug bound to the antibody circulates in the blood and accumulates in the target tumor, and then has a medicinal effect. Release of the drug outside the tumor site (withdrawal from the antibody) is not always preferable because there is a risk of causing side effects. That is, it is preferable that the drug bound to the antibody is designed to be released from the antibody after being taken into the cell.
  • a radioimmunotherapy drug has been developed in which a radioactive substance is bound to an antibody for treatment, and Zevalin (generic name) is used as a drug in which a radioactive substance 90Y (yttrium) or 111In (indium) is bound to a chimerized anti-CD20 antibody.
  • Zevalin generic name
  • 90Y yttrium
  • 111In indium
  • Ibritumomab Chiuxetane is on the market.
  • an administration antibody that may generate an antibody against a heterologous immunoglobulin (eg, human anti-mouse antibody, HAMA), etc. It is desirable that its own immunogenicity be minimal or not at all, and it would be beneficial to make drug conjugates utilizing such antibodies.
  • a heterologous immunoglobulin eg, human anti-mouse antibody, HAMA
  • CDR complementarity determining region
  • FR Framework region
  • the humanized antibody CDR sequence derived from a heterologous organism such as a mouse and the FR sequence derived from a human are preferably 100% identical to the original amino acid sequence, Amino acid residue substitution aimed at maintaining the binding to the antigen during the chimerization process is routinely attempted. It is also preferable to make genetic engineering modifications for the purpose of maintaining affinity within the range that maintains the binding to CDH3 and does not extremely increase its immunogenicity, and consists of CDR and FR combined by humanization.
  • the degree of sequence homology to the original sequence is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or higher, or 100% identical.
  • Such a partially modified antibody is considered to be an antibody that maintains the properties of the CDR derived from the original hybridoma in the sense that it specifically binds to a specific epitope of CDH3.
  • the use of the humanized antibody thus obtained minimizes its immunogenicity, and is further used for treatment of diseases as an immunocomplex having a strong cytotoxicity such as ADC. It can be a clear benefit for the patient receiving the dose.
  • additional drugs to treat various cancers such as lung cancer, colon cancer, and breast cancer.
  • Agents that are particularly useful for this purpose include anti-CDH3 humanized antibody drug conjugates that are significantly less toxic but have beneficial therapeutic efficacy.
  • the present invention solves the problem of providing an anti-CDH3 humanized antibody drug conjugate that creates a less immunogenic anti-CDH3 humanized antibody and uses it to more efficiently kill CDH3-expressing cancer cells. It was an issue that should be done.
  • the present inventors have improved affinity by combining a CDR sequence defined from an antibody that specifically recognizes CDH3 and various human-derived FR sequences.
  • Anti-CDH3 humanized antibody drug that produces anti-CDH3 humanized antibody with less immunogenicity by introducing an appropriate amino acid mutation to kill cancer cells expressing CDH3 more efficiently Successful creation of the conjugate has led to the completion of the present invention.
  • the complementarity determining region sequence derived from the heavy chain variable region of an antibody produced by a cell having the accession number NITE BP-1536 (hereinafter, this mouse antibody is designated as antibody number: PPAT-076-44M) ( Hereinafter, CDR-H1, H2, H3) and a light chain variable region-derived complementarity determining region sequence (hereinafter, CDR-L1, L2, L3), and the framework region sequence is heavy chain variable region is heavy chain human
  • An anti-CDH3 humanized antibody is provided that is a subgroup III consensus framework sequence, wherein the light chain variable region comprises a light chain human kappa subgroup I consensus framework sequence.
  • CDR-H1, H2, and H3 are SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, and SEQ ID NO: 58, respectively, and CDR-L1, L2, and L3 are SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, and Comprising the SEQ ID NO: 61, the framework region sequence is a heavy chain variable region is a heavy chain human subgroup III consensus framework sequence, and the light chain variable region is a light chain human kappa subgroup I consensus framework sequence.
  • An anti-CDH3 humanized antibody is provided.
  • the complementarity determining region sequence (CDR-H1, H2, H3) derived from the heavy chain variable region of the antibody produced by the cell having the deposit number NITE BP-1536 and the complementarity derived from the light chain variable region
  • An anti-CDH3 humanized antibody comprising a sequence derived from a human germline comprising a decision region sequence (CDR-L1, L2, L3) and a framework region sequence selected under optimal alignment Provided.
  • CDR-H1, H2, and H3 are SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, and SEQ ID NO: 58, respectively, and CDR-L1, L2, and L3 are SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, and SEQ ID NO:
  • An anti-CDH3 humanized antibody comprising a sequence derived from the human germline comprising number 61 and the framework region sequence selected under optimal alignment is provided.
  • the present invention further provides an anti-CDH3 humanized antibody having a sequence homology of at least 90% with the above-mentioned anti-CDH3 humanized antibody and capable of recognizing CDH3.
  • an anti-CDH3 humanized antibody in which one to several amino acids in the above-described antibody framework region are substituted with other amino acids and can recognize CDH3.
  • anti-CDH3 humanization in which one to several amino acids at the boundary with the framework region in the antibody complementarity-determining region sequences described above are substituted with other amino acids and can recognize CDH3.
  • An antibody is provided.
  • the amino acid to be substituted is the 55th amino acid by Kabat numbering in the light chain variable region.
  • the amino acid to be substituted is an amino acid at least one selected from positions 49, 71, or 78 by Kabat numbering in the heavy chain variable region.
  • the amino acid at position 55 by Kabat numbering in the light chain variable region is substituted with alanine.
  • the amino acid at position 71 by Kabat numbering in the heavy chain variable region is substituted with lysine.
  • the amino acid at position 78 by Kabat numbering in the heavy chain variable region is substituted with valine.
  • the amino acid at position 49 by Kabat numbering in the heavy chain variable region is substituted with alanine.
  • the antibody has a substitution of an amino acid residue at position 49 with alanine, an amino acid residue at position 71 with lysine, and an amino acid residue at position 78 with valine by Kabat numbering in the heavy chain variable region. And one or more substitutions selected from substitution of the amino acid residue at position 55 with alanine by Kabat numbering in the light chain variable region.
  • any of the following antibodies is provided.
  • an anti-CDH3 humanized antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 in the heavy chain variable region and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 in the light chain variable region;
  • the antibody of the present invention has the ability to bind to CDH3.
  • the antibody of the present invention is Fab, F (ab ′) 2 or scFv.
  • CDH3 is human CDH3.
  • CDH3 is the extracellular region of SEQ ID NO: 2 (corresponding to 1 to 654 amino acids of SEQ ID NO: 2).
  • an immune complex in which the above-mentioned anti-CDH3 humanized antibody, a fragment thereof or a partial sequence thereof, and a chemotherapeutic agent or a radioactive substance are linked.
  • the chemotherapeutic agent is a cytotoxic substance.
  • the cytotoxic substance is maytansinoid or a derivative thereof, or auristatin or a derivative thereof.
  • the cytotoxic substance is maytansinoid or a derivative thereof selected from DM1, DM3 or DM4, or auristatin or a derivative selected from MMAE or MMAF.
  • an average of 1 to 7 DM1s are bound per molecule of an anti-CDH3 humanized antibody, a fragment thereof or a partial sequence thereof. This average drug binding number does not affect antibody affinity.
  • the anti-CDH3 humanized antibody, a fragment or a partial sequence thereof and a chemotherapeutic agent are linked via a linker.
  • the anti-CDH3 humanized antibody, a fragment or a partial sequence thereof and a chemotherapeutic agent are linked via an intramolecular disulfide bond of the Fc region of the antibody, or the Fc region of the antibody is genetically engineered. Modified and linked.
  • the linker is a divalent reactive crosslinking reagent.
  • the linker is N-succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC), N -Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate) (LC-SMCC), ⁇ -maleimidoundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), ⁇ -maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ⁇ -maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), N- ( ⁇ -maleimidoacetoxy) Succini
  • the linker is cleaved by a protease.
  • the linker comprises at least one or more of valine-citrulline (Val-Cit), alanine-phenylalanine (ala-phe), and paraaminobenzoic acid (PABA).
  • the cytotoxic performance is enhanced by humanization of the framework region sequence of the antibody variable region.
  • the present invention further provides a medicament for treating a disease characterized by overexpression of CDH3, comprising the above-described immune complex.
  • the disease characterized by CDH3 overexpression is cancer.
  • the cancer is colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, lung cancer, invasive bladder cancer, pancreatic cancer, brain metastatic cancer, thyroid cancer, head and neck squamous cell carcinoma, esophagus Squamous cell carcinoma, lung squamous cell carcinoma, cutaneous squamous cell carcinoma, melanoma, breast cancer, lung adenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma, pancreatic squamous cell carcinoma, colon squamous cell carcinoma, or gastric squamous cell carcinoma, prostate cancer, osteosarcoma Or selected from soft tissue sarcomas.
  • the medicament of the present invention is used as an antitumor agent.
  • the present invention further provides a method for treating a disease characterized by overexpression of CDH3, comprising administering the above-described immune complex to a patient.
  • the present invention further provides the use of an immune complex as described above for the manufacture of a medicament for treating a disease characterized by overexpression of CDH3.
  • Anti-CDH3 humanized antibody is expected to have reduced immunogenicity as compared to its original antibody.
  • a humanized antibody is composed of an appropriate combination of the CDR sequence of the original antibody and a human-derived FR sequence. If this does not show affinity with the antigen, an attempt to restore affinity can also be made by introducing amino acid mutations into the antibody variable region.
  • an anti-CDH3 humanized antibody that specifically binds to CDH3 can be obtained.
  • the thus obtained immune complex comprising the anti-CDH3 humanized antibody of the present invention and a chemotherapeutic agent linked to a cancer cell expressing CDH3 as compared with an antibody that does not bind a chemotherapeutic agent.
  • the immune complex formed by linking the anti-CDH3 humanized antibody of the present invention and a chemotherapeutic agent also has an affinity compared to the anti-CDH3 chimerized antibody described in WO2013 / 150623 (Patent Document 6). It exhibits enhanced cytotoxic activity compared to an immunoconjugate comprising an anti-CDH3 chimerized antibody and a chemotherapeutic agent linked. Therefore, by administering the immunoconjugate of the present invention to a patient having cancer cells that express CDH3, a high anticancer effect can be exerted, and a reduction in its own immunogenicity can also be achieved.
  • the immune complex of the present invention is useful as an anticancer agent.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry in which a human CDH3 forced expression cell line was reacted with a commercially available anti-human CDH3 antibody.
  • A CHO cells
  • B CDH3 forced expression CHO cells.
  • C Lung cancer-derived cell line NCI-H358.
  • a anti-CDH3 antibody 0.01 ug / mL
  • b anti-CDH3 antibody 0.1 ug / mL
  • c anti-CDH3 antibody 1 ug / mL
  • FIG. 2 shows the flow cytometry results of the obtained antibody. Three examples of typical flow cytometry results of the obtained antibody group are shown in AC.
  • C Lung cancer-derived cell line NCI-H358.
  • c Anti-CDH3 antibody 1 ug / mL.
  • D shows the results of flow cytometry of a mouse antibody (PPAT-076-44M) purified from a hybridoma derived from the accession number NITE BP-1536. The right-side peak in each figure of D shows a negative control using an isotype-matched antibody, and the left-side peak shows the result of measuring PPAT-076-44M at 10 ug / mL.
  • FIG. 3 shows the expression results of CDH3 mRNA in various tumor tissues.
  • A Normal tissue
  • B Various cancer tissues
  • C Degree of pancreatic cancer differentiation
  • FIG. 4 shows the expression results of CDH3 in various human tumor tissues.
  • FIG. 5 shows the results of flow cytometry in which each CDH3 antibody was reacted.
  • the cell lines used are A: lung cancer-derived cell line NCI-H358, B: CHO cells, C: CDH3 forced expression CHO cells. The peak on the left side of each figure represents the negative control.
  • FIG. 6 shows the structure of DM1SMe.
  • FIG. 7 shows the cytotoxicity test results of the CDH3 antibody drug conjugate.
  • FIG. 8 shows animal test results (HCC1954 breast cancer model) using CDH3 antibody drug conjugates (drug binding to PPAT-076-44Hb and PPAT-076-44Hd).
  • FIG. 9 shows dose-dependence of animal test results (HCC70 breast cancer model) using CDH3 humanized antibody drug conjugate (drug binding to PPAT-076-44Hb) and chimerized antibody drug conjugate (PPAT-076-44C). Comparison results with drug binding) are shown.
  • FIG. 10 shows the dose-dependence of animal test results (HCC70 breast cancer model) with CDH3 humanized antibody drug conjugate (drug binding to PPAT-076-44Hd) and chimerized antibody drug conjugate (PPAT-076-44C). Comparison results with drug binding) are shown.
  • FIG. 11 shows animal test results (OKa-C-1 lung cancer model) using a CDH3 humanized antibody drug conjugate (drug binding to PPAT-076-44Hd).
  • FIG. 12 shows the expression result of CDH3N terminal partial length protein.
  • A CBB staining (right lane is an expression product, left lane is a molecular weight marker).
  • B Western blot (M: size marker, 1: commercial CDH3 antibody (BD BIOSCIENCE), 2: commercial CDH3 antibody (R & D Systems), 3: no antibody).
  • FIG. 13 shows the measurement results of ELISA using the CDH3N terminal partial length protein as a solid phase.
  • FIG. 14 shows the affinity comparison results of PPAT-076-44Hd (humanized antibody) and its parent antibodies PPAT-076-44M (mouse antibody) and PPAT-076-44C (chimerized antibody).
  • FIG. 15 shows the relative affinities of CDH3 antibody drug conjugates with different mean drug binding numbers (DAR) and non-drug bound antibodies.
  • FIG. 16 shows CDH3 expression in a tumor-bearing tumor tissue part of a mouse tumor-bearing model used in animal tests.
  • the present invention relates to anti-CDH3 humanized antibodies and methods of use thereof.
  • the anti-CDH3 humanized antibody of the present invention is provided by combining a CDR sequence defined from an antibody that specifically recognizes CDH3 and various appropriate human-derived FR sequences, and further suitable for improving the affinity. It is provided by introducing an amino acid mutation.
  • the antibodies of the invention bind to CDH3 expressed on the cell surface.
  • the antibodies of the invention bind to an epitope within the CDH3 region.
  • the antibody of the present invention binds to CDH3 expressed on the surface of human cells, particularly preferably binds to CDH3 expressed on the surface of cancer cells.
  • an antibody of the invention may be a humanized antibody fragment selected from Fab, Fab′-SH, Fv, scFv or (Fab ′) 2 fragments.
  • Such antibodies can be used as antibody drug conjugates by, for example, efficiently binding to chemotherapeutic agents via various linkers.
  • the antibody of the present invention can also bind to a toxin via any spacer sequence. That is, according to the present invention, there is provided an anti-CDH3 humanized antibody drug conjugate that efficiently kills cancer cells.
  • CDH3 or a partial peptide thereof can be used as an antigen for producing the antibody of the present invention.
  • soluble CDH3 protein corresponding to the CDH3 extracellular region corresponding to amino acids 1 to 654 of SEQ ID NO: 2 can be used, but is not limited thereto.
  • the antibody of the present invention is a humanized monoclonal antibody.
  • a hybridoma is obtained through immunization of a mouse as a material for obtaining a humanized monoclonal antibody.
  • Such materials can be obtained by various methods well known in the art. For example, it can be obtained by the method described below, but is not limited thereto.
  • CDH3 or a partial peptide thereof is first administered to a mouse as an antigen.
  • the dose per animal is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 ⁇ g when an adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks.
  • antibody-producing cells are collected 1 to 60 days, preferably 1 to 14 days after the final immunization day.
  • Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • a hybridoma cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • myeloma cells generally available mouse-derived cell lines that have drug selectivity to HAT medium and the like can be used. For example, P3X63-Ag. 8).
  • Cell fusion is performed by using 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 antibody-producing cells and 2 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 6 in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 medium.
  • animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 medium.
  • Individual / mL myeloma cells can be mixed and a fusion reaction can be performed in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation.
  • the hybridoma can be obtained by culturing a selective medium. After appropriately diluting the cell suspension with, for example, fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, seed the cells on a microtiter plate at about 3 ⁇ 10 5 cells / well, add selective medium to each well, and then add appropriate selective medium. Replace and culture. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected, and a hybridoma producing an antibody that binds to CDH3 can be screened by enzyme immunoassay, radioimmunoassay or the like. Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally, a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell can be established.
  • an established hybridoma is used as a material
  • humanization of an antibody derived therefrom can be achieved by a known method. Specifically, a DNA sequence designed to link CDRs of a mouse antibody and a framework region (FR) of a human antibody was PCR-prepared from several oligonucleotides prepared so as to have a portion overlapping the terminal portion. Synthesize by the method. The obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding a human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (EP239400 (Patent Document 7), International Publication WO96 / 02576). Gazette (patent document 8) etc.).
  • Complementarity determining region are particularly distinct in variable regions between antibodies and represent sequence regions that play a vital role in determining the specificity of the antibody.
  • the amino acid residues belonging to this region are thought to contain many residues that are directly related to the binding and specificity to the antigen, and there are 3 regions each in the light chain and heavy chain variable regions.
  • CDRs are described by Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, et al., 19). Mol. Biol .; 196, p901 (1987) (Non-patent Document 16)).
  • the CDR defined by Kabat generally has the light chain variable region located near residues 24-34, residues 50-56, residues 89-97, and heavy chain variable regions near residues 31-35 , Located in the vicinity of residues 50-65 and 95-102, but not all residues in this region are directly involved in antigen binding. It is not exactly the same.
  • the numbering system when amino acid residue numbers are indicated in the present specification follows Kabat numbering.
  • the appropriate human FR sequence is selected in a timely manner.
  • the selected human FR sequence is a sequence containing a light chain variable region or a heavy chain variable region obtained from a human consensus framework sequence.
  • the human consensus framework sequence is an FR sequence representing the most commonly occurring amino acid residue in the human immunoglobulin light chain or heavy chain variable region.
  • the human immunoglobulin light or heavy chain variable region sequence is selected from a subgroup of variable region sequences. According to Kabat et al., The light chain variable region is light chain human kappa subgroup I and the heavy chain variable region is heavy chain human subgroup III.
  • the light chain human kappa subgroup I consensus sequence includes at least a part or all of the following sequences, and a part of each sequence of FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-L4: Or it is comprised in the form where CDR sequence was inserted in all.
  • DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ SEQ ID NO: 62 (FR-L1)
  • WYQQKPGKAPK SEQ ID NO: 63 (FR-L2)
  • LQSGVPSRFSGGSGTDFLTTISSLQPEDFATYYC SEQ ID NO: 64 (FR-L3)
  • FGQGTKVEIK SEQ ID NO: 65 (FR-L4)
  • the heavy chain human subgroup III consensus sequence comprises at least part or all of the following sequences, part of each of FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4 sequences or The entire structure is composed of CDR sequences.
  • EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF SEQ ID NO: 66 (FR-H1)
  • WVRQAPGKGLEWV SEQ ID NO: 67 (FR-H2)
  • YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC SEQ ID NO: 68 (FR-H3)
  • WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 69 (FR-H4)
  • the above human consensus framework sequences are composed of amino acid residues that appear most frequently in each subgroup.
  • framework sequences derived from the human germline selected under optimal alignment can also be used. This corresponds to the fact that human consensus framework sequences may not always be appropriate for antibody humanization and is known as the best-fit method.
  • a mouse antibody variable region sequence is screened against a known published human variable region sequence library.
  • a human variable region sequence that is closest to the sequence can be used as a human framework sequence derived from the germline of a humanized antibody (Sims et al., J. Immunol .; 151, p2296 (1993) (non-patent document). Reference 17), Chothia et al., J. Mol. Biol .; 196, p901 (1987) (Non-patent document 18), Tempest et al., Biotechnology; 9, p266 (1991) (Non-patent document 19)).
  • the light chain germline sequence includes at least a part or all of the following sequences, and a part or all of each sequence of FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-L4 is a CDR sequence: It is composed in the form of being sandwiched.
  • DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ SEQ ID NO: 72 (FR-L1)
  • WYQQKPGKAPK SEQ ID NO: 73 (FR-L2)
  • LESGVPSRFSGSGSGTDFLTTISSLQPEDFATYYC SEQ ID NO: 74 (FR-L3)
  • FGQGTKVEIK SEQ ID NO: 75 (FR-L4)
  • the heavy chain germline sequence includes at least part or all of the following sequences, and part or all of each of the FR-H1, FR-H2, FR-H3, and FR-H4 sequences is a CDR sequence: It is composed in the form of being sandwiched.
  • QVQLVESGGGGVQPGRSLRLSCCAASGF SEQ ID NO: 76 (FR-H1)
  • WVRQAPGKGLEWV SEQ ID NO: 77 (FR-H2)
  • YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC SEQ ID NO: 78 (FR-H3)
  • WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 79 (FR-H4)
  • FR sequence selected by any method is suitable for humanization depends on the combination with each antibody clone CDR sequence and the appropriate three-dimensional structure for the antigen to be bound. Judgment can be made based on whether or not it has been maintained.
  • the position of the amino acid residue to be substituted differs depending on the target antibody, and in many cases, it is not specified until actual expression.
  • 55 of the light chain variable region in which substitution is performed in a relatively large number of documents eg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 89, p4285 (1992)). It was intended to improve the reduction in affinity by substituting amino acid residues at one or more positions selected from positions 49, 71, and 78 of the heavy chain variable region.
  • the position, combination, and type of amino acid residue after substitution are arbitrary, and are not limited thereto.
  • Many hosts for producing antibodies are of mammalian origin, but those skilled in the art can appropriately select a specific host cell system most suitable for the gene product to be expressed.
  • Common host cell lines include CHO-derived cell lines (Chinese hamster ovary cell line), CV1 (monkey kidney line), COS (derivative of CV1 that carries SV40T antigen), SP2 / 0 (mouse myeloma), P3x63-Ag3 .653 (mouse myeloma), 293 (human kidney), and 293T (a derivative of 293 that carries the SV40T antigen), and the like.
  • the host cell system can be obtained from various manufacturers, the American Tissue Culture Collection (ATCC), or a paper publication organization described in the literature.
  • ATCC American Tissue Culture Collection
  • a CHO-derived cell line or SP2 / 0, which is preferably dgfr gene deficient can be used (Urland, G. et al., Somat. Cell. Mol. Genet .; 12, p5555 (1986). (Non-patent document 4), and Schulman, M. et al., Nature; 276, p269 (1978) (non-patent document 5)).
  • the host cell line is DHFR deficient CHO.
  • Transfection of the plasmid into the host cell can be performed using any technique. Specific methods include transfection (including calcium phosphate method, DEAE method, lipofection, and electroporation), a method of introducing DNA using an envelope such as Sendai virus, microinjection, retrovirus virus, adeno Examples include, but are not limited to, infection using virus vectors such as viruses (Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9 Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wis.). Most preferred is the introduction of the plasmid into the host by electroporation.
  • these antibodies recognize CDH3, they may be monovalent antibodies, bivalent antibodies, and multivalent antibodies, and may be low molecular weight antibodies such as antibody fragments (fragments), modified antibodies, and the like.
  • an Fc part may be fused to an antibody fragment or a low molecular weight antibody, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, ScFv (single chain Fv), Diabody, and the like.
  • a gene encoding these antibodies may be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell.
  • an immune complex in which a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic substance is bound to the antibody, that is, an antibody drug conjugate (ADC).
  • ADC antibody drug conjugate
  • the immune complex of the present invention can injure cancer cells, for example, by contacting with a cancer cell expressing CDH3.
  • chemotherapeutic agents used in the present invention include duocarmycin, duocarmycin analogs and inducers, CC-1065, duocarmycin analogs based on CBI, and duocarmycins based on MCBI.
  • the immune complex in the present invention can be prepared by binding the chemotherapeutic agent and the antibody by a known method.
  • the antibody and the chemotherapeutic agent may be directly bonded via a linking group or the like possessed by themselves, or may be indirectly bonded via a linker or other substance.
  • linking group when the drug is directly bonded examples include a disulfide bond using an SH group and a bond via maleimide.
  • the intramolecular disulfide bond in the Fc region of the antibody and the disulfide bond of the drug are reduced, and both are bonded by a disulfide bond.
  • Another method is to introduce cysteine into the antibody by genetic engineering.
  • the linker preferably has one or more functional groups that react with the antibody or drug or both.
  • functional groups include amino groups, carboxyl groups, mercapto groups, maleimide groups, pyridinyl groups, and the like.
  • linkers include N-succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC), N Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate) (LC-SMCC), ⁇ -maleimidoundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), ⁇ -maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ⁇ -maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), N- ( ⁇ -maleimidoacetoxy)- Cuccinimide ester (SM
  • a peptide linker such as valine-citrulline (Val-Cit) or alanine-phenylalanine (ala-phe) may be combined with paraaminobenzoic acid (PABA). You may use it combining each timely.
  • a peptide linker such as valine-citrulline (Val-Cit) or alanine-phenylalanine (ala-phe) may be combined with paraaminobenzoic acid (PABA). You may use it combining each timely.
  • PABA paraaminobenzoic acid
  • a so-called immunotoxin in which a toxin is chemically or genetically bound to an antibody can be mentioned.
  • the toxin used include, but are not limited to, diphtheria toxin A chain, Pseudomonas endotoxin, ricin A chain, abrin A chain, modexin A chain, gelonin, and saporin.
  • a radioactive substance can be bound to the antibody.
  • the radioactive substance is preferably a cytotoxic radioactive metal when used as a cancer therapeutic agent, and is preferably a non-cytotoxic radioactive metal when used as a cancer diagnostic agent.
  • cytotoxic radioactive metals examples include yttrium 90 (90Y), rhenium 186 (186Re), rhenium 188 (188Re), copper 67 (67Cu), iron 59 (59Fe), strontium 89 (89Sr), and gold 198. (198Au), mercury 203 (203Hg), lead 212 (212Pb), dysprosium 165 (165Dy), ruthenium 103 (103Ru), bismuth 212 (212Bi), bismuth 213 (213Bi), holmium 166 (166Ho), samarium 153 (153Sm) ), Lutetium 177 (177Lu) and the like.
  • 90Y, 153Sm, and 177Lu are preferable from the viewpoints of half-life, radiation energy, easy labeling reaction, labeling rate, and complex stability, but are not limited thereto.
  • non-cytotoxic radioactive metals used for diagnostic agents include technesium 99m (99mTc), indium 111 (111In), indium 113m (113mIn), gallium 67 (67Ga), gallium 68 (68Ga), and thallium 201 (201Tl).
  • Chromium 51 (51Cr), cobalt 57 (57Co), cobalt 58 (58Co), cobalt 60 (60Co), strontium 85 (85Sr), mercury 197 (197Hg), and copper 64 (64Cu) are preferably used. It is not limited to.
  • the antibody is reacted with a metal chelate reagent and then reacted with the radioactive metal element to form a complex.
  • a radioactive metal element is bound via a metal chelating reagent.
  • metal chelating reagents used for such complex formation include (1) 8-hydroxyquinoline, 8-acetoxyquinoline, 8-hydroxyquinaldine, oxyquinoline sulfate, O-acetyloxin, O-benzoyloxin, Op-nitrobenzoyloxins, quinoline derivatives having a quinoline skeleton such as norfloxacin, ofloxacin, enoxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin, tosufloxacin, fleroxacin, sparfloxacin and the like; (2) chloranilic acid, aluminone , Thiourea, pyrogallol, cuperone, bismuthiol (II), galloyl gallic acid, thiolide, 2-mercaptobenzothiazole, tetraphenylarsonium chloride, etc .; (3) ethylenediamine Tetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) and
  • isothiocyanobenzyl DOTA, methylisothiocyanobenzyl DTPA, and cyclohexylisothiocyanobenzyl DTPA are easy to introduce metal chelates into antibodies, labeling rate, complex stability, etc. preferable.
  • the binding of the radioactive metal element to the antibody can be performed according to a conventional method.
  • the reaction can be performed by reacting an antibody with a metal chelating reagent, preparing a labeling precursor in advance, and then reacting with a radioactive metal element.
  • the immune complex provided by the present invention can appropriately contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent, etc. in order to cope with maintaining a stable state of the drug.
  • the immune complex of the present invention can be formulated, for example, as an injection.
  • the dose of the immunoconjugate of the present invention depends on the patient's symptom level, age and body weight, administration method and the like, and the weight of the antibody as the active ingredient is usually in the range of about 10 ng to about 100 mg / kg body weight. It is.
  • the disease that can be treated with the immune complex of the present invention is not particularly limited as long as CDH3 is expressed in the cell.
  • Example 1 Establishment of CDH3-expressing CHO cell line In order to obtain a cell line for screening an anti-CDH3 antibody, a CHO cell expressing full-length CDH3 was established.
  • (1) Preparation of CDH3 gene expression vector In order to insert the full-length human CDH3 DNA shown in SEQ ID NO: 1 into the mammalian expression vector pEF4 / myc-HisB (Invitrogen), two types of restriction enzymes KpnI (Takara Bio) and XbaI (Takara) Biotechnology) at 37 ° C.
  • CDH3 full-length expression CHO clones were selected by Western blotting using an anti-c-Myc monoclonal antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As a result, the CDH3 full-length expression CHO cell line with high expression and good growth ( EXZ1501) was obtained.
  • FIG. 1 shows the results of measurement of this cell line, parental CHO cell, and NCI-H358 lung cancer cell line in which CDH3 expression has been confirmed and a commercially available anti-CDH3 antibody (R & D SYSTEMS) using a flow cytometer.
  • Soluble CDH3 (sCDH3) protein lacking the C-terminal transmembrane region and the subsequent region was produced for use as an immunogen for producing anti-CDH3 antibody.
  • sCDH3 cDNA a portion corresponding to CDH3 extracellular region (corresponding to 1-2010 of SEQ ID NO: 1, hereinafter referred to as sCDH3 cDNA) using CDH3 full-length cDNA as a template PCR reaction was performed using a primer (CGCGGGTACCATGGGGCTCCCTCGT: SEQ ID NO: 3) and a reverse primer (CCGTCTAGATAACCCTCCCTTCAGGGTCC: SEQ ID NO: 4). The reaction was carried out using KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) at 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 90 seconds under 30 cycles of reaction conditions.
  • KOD-Plus Toyobo Co., Ltd.
  • this sCDH3 cDNA was treated with two types of restriction enzymes KpnI and XbaI and then treated with KpnI and XbaI using p4 / myc-HisB using T4 DNA ligase.
  • the insertion was performed according to the method to obtain the expression vector pEF4-sCDH3-myc-His.
  • Soluble CDH3-expressing CHO cells were selected by Western blotting using an anti-c-Myc monoclonal antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As a result of selecting a cell line with a large amount of secretion into the culture supernatant and good growth, a soluble CDH3-expressing CHO cell line (EXZ1702) was obtained.
  • the selected soluble CDH3-expressing CHO cell line (EXZ1702) uses 3 roller bottles with a culture area of 1,500 cm 2 , and 333 mL of serum-free medium CHO-S-SFM-II (Invitrogen) per roller bottle. The culture supernatant was collected for 72 hours.
  • the obtained culture supernatant is soluble by affinity chromatography using a HisTrap (registered trademark) HP column (GE Healthcare Bioscience) and gel filtration chromatography using a Superdex (registered trademark) 200 pg column (GE Healthcare Bioscience).
  • Type CDH3 protein was obtained.
  • Example 3 Production of Anti-CDH3 Mouse Antibody (1) Production of Monoclonal Antibody Using Soluble CDH3 Protein as Immunogen 50 ⁇ g of soluble CDH3 protein and Titer-MAX Gold (registered trademark) dissolved in physiological saline ( Titermax Co., Ltd.) was mixed in an equal volume, and MRL / lpr mice (Japan SLC Co., Ltd.) were injected intraperitoneally and subcutaneously to perform initial immunization. The second and subsequent immunizations were carried out by mixing the similarly prepared soluble CDH3 protein equivalent to the amount of 25 ⁇ g protein and Titer-MAX Gold and injecting them intraperitoneally and subcutaneously.
  • Soluble CDH3 Protein As Immunogen 50 ⁇ g of soluble CDH3 protein and Titer-MAX Gold (registered trademark) dissolved in physiological saline ( Titermax Co., Ltd.) was mixed in an equal volume, and MRL / lpr mice (Japan SLC Co
  • mice Three days after the final immunization, spleen cells were aseptically prepared from mice, and cell fusion with mouse myeloma cells SP2 / O-Ag14 or P3-X63-Ag8.653 was carried out by the polyethylene glycol method according to a conventional method.
  • FIGS. 2A-C show the results of flow cytometry of a mouse antibody (antibody number: PPAT-076-44M) purified from a hybridoma derived from the accession number NITE BP-1536.
  • Example 4 Expression of CDH3 mRNA in normal tissues and cancer tissues
  • Total RNA was extracted from samples collected from normal human tissues and various cancer tissues by laser microdissection method using ISOGEN (Nippon Gene) according to a standard method. Prepared. Gene expression of each RNA of 10 ng was analyzed using GeneChip U-133B (Affymetrix) according to Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). When an average expression score of all genes was set to 100 and a gene whose expression is enhanced in cancer cells was searched for, CDH3 expression was limited in normal human tissues, and expression was high in lung cancer, colon cancer and pancreatic cancer (Fig. 3A, B). Further, when the expression of CDH3 mRNA in pancreatic cancer tissues having different degrees of differentiation was examined, tissues with high expression were recognized regardless of the degree of differentiation (FIG. 3C).
  • Example 5 Expression of CDH3 protein in cancer tissue by immunohistochemical staining
  • immunostaining was performed on a cancer specimen tissue array.
  • the cancer cell tissue array is manufactured by Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd., pancreatic cancer (adenocarcinoma), lung cancer (adenocarcinoma), lung cancer (squamous cell carcinoma) and colon cancer (glandular gland). Cancer).
  • Each tissue array slide was deparaffinized and activated with 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 9.0) at 95 ° C. for 40 minutes. After inactivation of endogenous peroxidase with a blocking reagent attached to ENVISION + Kit (Dako), anti-CDH3 antibody 610227 (BD BIOSSCENCE) and anti-HBs antibody Hyb-3423 at a concentration of 5 ⁇ g / mL as a negative control The reaction was allowed to proceed overnight at 4 ° C. After washing off the antibody solution, it was reacted with the polymer secondary antibody reagent attached to ENVISION + Kit for 30 minutes at room temperature.
  • RNA present in the cytoplasm was extracted from Gough, Rapid and quantitative of cytoplasmic RNA, and 95% of biosmale cells. 1988) (Non-Patent Document 10), but instead of the lysis buffer described in this paper, another TNE buffer 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 8.0 was used).
  • TNE buffer 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 8.0 was used.
  • 5 ⁇ 10 6 hybridoma cells were suspended in 0.2 mL of TNE buffer to dissolve the cell membrane, and then cell nuclei were removed by centrifugation.
  • RNA precipitate was dissolved by adding 10-50 ⁇ L of sterile distilled water so that the cytoplasmic RNA concentration was 0.5-2 ⁇ g / ⁇ L.
  • Example 7 Preparation of cDNA library from RNA prepared from hybridoma
  • cytoplasmic RNA prepared as described above was added to 50 mM Tris-HCl, pH 8.3 (room temperature ); 75 mM KCl; 3 mM MgCl 2 ; 10 mM DTT, 100 ng random primer, 0.5 mM dNTP, 200 units of Superscript II (reverse transcriptase, Invitrogen) was prepared and incubated at 42 ° C. for 50 minutes did.
  • the cDNA library thus synthesized was directly used as a template for the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Example 8 Amplification of gene encoding anti-CDH3 mouse antibody variable region by PCR method To determine the sequence of the anti-CDH3 mouse antibody variable region, the cDNA library obtained in Example 7 was used as a template to perform anti-CDH Gene amplification of the CDH3 mouse antibody variable region was performed. All primers were synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd., and the combinations were as described below.
  • PCR primer for mouse light chain variable region coding gene PCR primer having homology with the FR1 portion at the 5 ′ end and 4 set primers (1) having homology with the J chain gene in the mouse light chain at the 3 ′ end, or 5 By polymerase chain reaction using two types of primer sets, a primer set (2) having homology to the light chain signal portion (7 set primers) at the 'end and the KC portion (KVL antisense primer) at the 3' end, Mouse immunoglobulin light chain variable region DNA was isolated from the cDNA.
  • the primer sequences were as follows: In the nucleotide sequence, M is A or C, R is A or G, W is A or T, S is C or G, Y is C or T, K is G or T, V is A or C or G, H represents A or C or T, D represents A or G or T, B represents C or G or T, and N represents A or C or G or T, respectively.
  • Mouse light chain variable region cloning 4 set sense primer “Page Display-A Laboratory Manual-, Barbas Burton Scott Silverman” PROTOCOL 9.5 (Non-patent Document 11) with reference to 17 types of Prime Primer and Reverse Pr species Synthesized.
  • VK sense primer (FR1 part, mixture of the following 17 primers) 5′-GAYATCCAGCTGACTCAGCC-3 ′ (degeneracy 2): SEQ ID NO: 5 5′-GAYATTGTTCTCWCCCAGTC-3 ′ (degeneracy 4): SEQ ID NO: 6 5′-GAYATTGTGMTMACTCAGTC-3 ′ (degree of degeneracy 8): SEQ ID NO: 7 5′-GAYATTTGTGYTRACACAGTC-3 ′ (degeneracy 8): SEQ ID NO: 8 5′-GAYATTGTRATGACMCAGTC-3 ′ (degree of degeneracy 8): SEQ ID NO: 9 5′-GAYATTTMAGATRAMCCAGTC-3 ′ (degree of degeneracy 16): SEQ ID NO: 10 5′-GAYATTCAGATGAYDCAGTC-3 ′ (degeneracy 12): SEQ ID NO: 11 5′-GAYATYCAGATGACACAGAC-3 ′ (degree of degen
  • J antisense (4 sets primer) J1 / J2 antisense primer (1) 5′-GGSACCAARCTGGAAATMAA-3 ′ (degeneracy: 8): SEQ ID NO: 22 J4 antisense primer (2) 5′-GGGACAAAGTTGGGAAATAAA-3 ′: SEQ ID NO: 23 J5 antisense primer (3) 5′-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3 ′: SEQ ID NO: 24 J1 / J2, J4, J5 antisense primer mixture (4)
  • PCR primer for mouse heavy chain variable region coding gene Primer having homology with mouse heavy chain signal part (4 set primers) at 5 'end and primer having homology with KC part at 3' end, or FR1 at 5 'end
  • Variable region DNA was isolated.
  • the primer sequences were as follows:
  • 5′-ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3 ′ (degeneracy: 32): SEQ ID NO: 42 5′-ATGRACTTCGGGGYTGAGCTKGGTTTTT-3 ′ (degeneracy: 8): SEQ ID NO: 43 5′-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTTCT-3 ′: SEQ ID NO: 44 5′-ATGGRCACGRCCTTACWTYY-3 ′ (degeneracy: 32): SEQ ID NO: 45
  • VH antisense primer (designed by degenerate base sequence so that it can be annealed with the antisense primer common to (3) and (4), all isoforms of mouse IgG).
  • 5′-CASCCCCCATCDGTCTATCC-3 ′ (degeneracy: 6): SEQ ID NO: 47
  • Example 9 Sequencing of variable region of anti-CDH3 mouse antibody
  • the variable regions of the anti-CDH3 mouse antibody light chain and heavy chain were respectively expressed by PCR using DNA Engine (Bio-Rad) using the primers shown in Example 8. Amplified. The amplified DNA fragment was incorporated into a subcloning vector pGEM (Promega), and the nucleotide sequence was determined using T7 and SP6 universal primers of this vector.
  • pGEM Promega
  • the amino acid sequence corresponding to the CDR is shown below.
  • SLTSYGVH SEQ ID NO: 56 (CDR-H1)
  • GVIWSGGSTD SEQ ID NO: 57 (CDR-H2)
  • ARNSNNGFAY SEQ ID NO: 58 (CDR-H3)
  • NIYSNLA SEQ ID NO: 59 (CDR-L1)
  • LLVYAAKN SEQ ID NO: 60 (CDR-L2)
  • QHFYDTPWT SEQ ID NO: 61 (CDR-L3)
  • CDR-H1, H2, and H3 represent the heavy chain of each antibody
  • CDR-L1, L2, and L3 represent the CDR sequence of each antibody light chain.
  • Example 10 Generation of Transient Expression Vector for Anti-CDH3 Antibody
  • the gene encoding the light chain and heavy chain V regions of the cloned anti-CDH3 mouse antibody encodes the human Ck region for the chimeric light chain expression vector. Genes were designed by connecting genes encoding the human Cg1 region to the chimeric heavy chain expression vector, and these light chain and heavy chain chimeric antibody genes were artificially synthesized in full length by GenScript. Restriction enzyme sites (NheI on the 5 ′ side and EcoRI on the 3 ′ side) were added to both ends.
  • an anti-CDH3 chimerized antibody derived from a cell having the accession number NITE BP-1536 (hereinafter referred to as antibody number PPAT-076-44C.
  • Heavy chain and light chain variable region sequences are provided for use in a chimerized antibody expression vector.
  • the same as PPAT-076-44M was synthesized.
  • the cell having the deposit number NITE BP-1536 was founded on February 13, 2013 at the Center for Patent Microbiology Deposits of the National Institute of Technology and Evaluation (Postal Code 292-0818, 2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). (Request for transfer to international deposit is January 24, 2014: receipt number NITE ABP-1536).
  • the region corresponding to FR was replaced with a human-derived FR sequence, and similarly, full-length artificial synthesis was performed.
  • a human consensus frame sequence SEQ ID NO: 62 to 69
  • a germline frame sequence SEQ ID NO: 72 to 79
  • a high sequence was chosen and designed.
  • amino acid sequence replacement corresponding to the decrease in affinity was also performed.
  • Antibody numbers PPAT-076-44Ha, PPAT-076-44Hb, PPAT-076-44Hc, and PPAT-076-44Hd have the same CDR sequences as antibody number PPAT-076-44M.
  • Antibody numbers PPAT-076-44Ha and PPAT-076-44Hb use human consensus framework sequences for FR, and antibody numbers PPAT-076-44Hc and PPAT-076-44Hd are most similar to mouse antibodies derived from FR Human germline sequences are used. PPAT-076-44Hb and PPAT-076-44Hd introduce amino acid sequence substitutions as described above.
  • Antibody number PPAT-076-44Ha (SEQ ID NO: 48 is the heavy chain variable region, SEQ ID NO: 49 is the light chain variable region) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCCAASGFSLTSSYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNSNNGFAYWGQGTLVTVSS: array number 48 (sequence number 48) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAAAKNLQSGVPSRFSGGSGSDFLTTISSLQPEDFATYYQQHFYDTPWTFGQGTKVEIK: Sequence number 49 (light chain variable region)
  • Antibody number PPAT-076-44Hb (having SEQ ID NO: 50 in the heavy chain variable region and SEQ ID NO: 51 in the light chain variable region) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCCAASGFSLTSSYGVHWVRQAPGKGLEWVAVIWSGGSTDYADSVKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNSNNGFAYWGQGTLVTVSS: array number 50 (G49A, R71K, and L78V are substituted for SEQ ID NO: 48) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAAKNLASGVPPSGSGSGSDTFTTISSLQPEDFATYYCQHFYDTPWTFGQGTKVEIK: Sequence number 51 (light chain variable region) (Q55A is substituted for SEQ ID NO: 49)
  • Antibody number PPAT-076-44Hc (having SEQ ID NO: 52 in the heavy chain variable region and SEQ ID NO: 53 in the light chain variable region)
  • DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAAKNLESGVPSRFSGGSGTDFLTTISSLQPEDFATYYQQHFYDTPWTFGQGTKVEIK Sequence number 53 (light chain variable region)
  • Antibody number PPAT-076-44Hd (having SEQ ID NO: 54 in the heavy chain variable region and SEQ ID NO: 55 in the light chain variable region)
  • DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAAKNLASGVPSRFSGGSGSDFLTTISSLQPEDFATYYQQHFYDTPWTFGQGTKVEIK light chain variable region (E55A is substituted for SEQ ID NO: 53)
  • An artificially synthesized gene designed to have these sequences after amino acid sequence conversion a heavy chain variable region gene into a pCXN3 vector in which a constant region gene derived from human IgG1 is incorporated, and a constant region gene from human ⁇ chain
  • An expression vector in which the light chain variable region gene was inserted into the pCXN3 vector into which was incorporated was constructed, and an anti-CDH3 humanized antibody (or chimerized antibody) light chain expression vector and heavy chain expression vector were obtained.
  • Example 11 Transient expression and purification of anti-CDH3 antibody
  • Transient expression of anti-CDH3 antibody FreeStyle (Life Technologies) was used for the transient expression of anti-CDH3 antibody.
  • 293-F (Life Technologies), a floating cell for gene transfer, was passaged the day before.
  • 400 mL of cell suspension prepared to a cell concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL was prepared for the expression of one kind of antibody.
  • solution (II) 200 ⁇ L of MAX reagent was added to 8 mL of OptiPRO SFM to form a solution (II).
  • Solution (I) and solution (II) were mixed and allowed to stand at room temperature for 10 to 20 minutes.
  • a total of 16 mL of the reaction solution was added to 400 mL of 293 expression medium in which 293-F cells were suspended, and cultured on a cell culture shaker TAITEC BioShaker BR-43FL at 37 ° C. and 8% CO 2 for 6 to 7 days. After 6 to 7 days, the culture supernatant containing each recombinant antibody was collected and purified using this.
  • the IgG antibody protein contained in the culture supernatant was purified with an Ab-Capcher ExTra (Protenova) affinity column using AKTAprime (GE Healthcare). The obtained peak fraction was further purified by gel filtration through a Sephacryl S-300 column equilibrated with Dulbecco's PBS as a solvent. The quantification of the purified IgG antibody protein was calculated using the extinction coefficient. The extinction coefficient of IgG antibody was calculated by using EXPASY's ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) using the total amino acid sequence of each antibody.
  • Example 12 Quantification of antibody by enzyme immunoassay (ELISA) The culture supernatant of the transfected CHO cells was measured by ELISA to confirm that a chimeric antibody was produced. To detect the chimeric antibody, the plates were coated with goat anti-human IgG (H + L) (absorbed against mouse, rabbit, bovine, mouse IgG) (Cosmo Bio: AQI, Cat A-110UD). After blocking, the culture supernatant from anti-CDH3 chimeric antibody-producing CHO cells was serially diluted and added to each well.
  • H + L goat anti-human IgG
  • Example 13 Binding activity of antibody The binding activity of the antibody having the sequence shown in Example 10 was evaluated by flow cytometry.
  • a cell line to be reacted (NCI-H358 cell line in which high expression of CDH3 has been confirmed) is treated with 2 mM EDTA-PBS, and detached from the culture plate, so that the FACS is 1 ⁇ 10 6 cells / mL. Suspended in solution. This cell suspension was seeded in a 96-well plate at 50 ⁇ L / well, and the purified chimeric antibody was added at 10 ⁇ g / mL and reacted at 4 ° C. for 60 minutes.
  • the humanized antibodies (PPAT-076-44Ha, PPAT-076-44Hc) showed a weak reaction in the CDH3-expressing cancer cell line (NCI-H358). Furthermore, strong reactivity was observed with NCI-H358 in the antibodies subjected to Reshape (PPAT-076-44Hb, PPAT-076-44Hd) (FIG. 5A). PPAT-076-44Hb and PPAT-076-44Hd did not react with CHO cells, but CDH3-forced expression CHO cells showed the same reaction as NCI-H358 cell line (FIGS. 5B and 5C).
  • Example 14 Drug Synthesis DM1SMe was prepared as described in US Pat. No. 5,208,020 and US Pat. No. 6,333,410B1. The synthesis was outsourced to Sinstar Japan. Its structural formula is shown in FIG.
  • Example 15 Preparation of drug-bound antibody Reduction treatment of binding agent 0.78 mg of DM1SMe dissolved in 300 ⁇ L of ethanol, 180 ⁇ L of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) and 20 ⁇ L of TCEP Solution (Bond Breaker, Thermo Fisher Scientific) were mixed, and under nitrogen atmosphere The reaction was carried out at room temperature for 30 minutes or more to reduce the drug.
  • the reducing agent was purified using HPLC, and then the solvent was distilled off and dissolved in dimethylacetamide so as to be 10 mg / mL.
  • Example 17 Cytotoxicity test The cytotoxicity and specificity of drug-bound antibodies were evaluated using a cell proliferation assay reagent (Dojindo Laboratories, Cell counting assay kit-8) using WST-8 as a chromogenic substrate. . That is, various cancer cell lines and humanized antibody drug conjugates were allowed to coexist in any amount and incubated at 37 ° C. for 3 days in a 5% CO 2 environment. The medium was determined according to each cell line to which FBS was added. Then, after adding the cell proliferation measurement reagent, the absorbance of A450 / 620 was measured, and the relative value when the absorbance value obtained from the well in which only the cancer cell line was not added with the antibody was taken as 100% was the cell. Expressed as survival rate.
  • FIG. 7A NCI-H358 was used as the cell line, and PPAT-076-44Hb and PPAT-076-44Hd were combined with the drug as antibody drug conjugates. Both antibody drug conjugates were cytotoxic.
  • FIG. 7B HCC1954 is used as a cell line and a drug is bound to PPAT-076-44Hd as an antibody drug conjugate.
  • FIG. 7C a drug is bound to HCC70 as a cell line and PPAT-076-44Hd is used as an antibody drug conjugate. What was done was used. Since both cell lines express CDH3, the drug conjugate of PPAT-076-44Hd is cytotoxic.
  • FIG. 7A NCI-H358 was used as the cell line, and PPAT-076-44Hb and PPAT-076-44Hd were combined with the drug as antibody drug conjugates. Both antibody drug conjugates were cytotoxic.
  • FIG. 7B HCC1954 is used as a cell line and a drug is bound to
  • the cell line described in Table 1 was used, and the antibody drug conjugate used was a drug bound to PPAT-076-44Hd.
  • Each drug was bound by the method described in Example 15.
  • the mRNA signal values of the cell lines described in Table 1 are obtained from the public database (https://cabig-stage.nci.nih.gov/community/caArray_GSKdata/), and the average value is small (NCIH1930, SW962).
  • CDH3 expression negative controls Cell growth in which CDH3 was expressed was inhibited regardless of carcinoma. All drug conjugates used had a DAR of 3-4.
  • Example 18 HCC1954 tumor-bearing animal test using humanized antibody Tumor reduction effect of antibody drug conjugates of humanized antibodies (PPAT-076-44Hb and PPAT-076-44Hd) was transplanted with breast cancer cell line HCC1954 Confirmed with a xenograft model.
  • the drug binding number (DAR) of both antibody drug conjugates determined by the method of Example 16 was PPAT-076-44Hb (DAR3.69) and PPAT-076-44Hd (DAR3.51).
  • an anti-asialo GM1 antibody (WAKO 014-09801) was dissolved in 1 mL of Otsuka distilled water, and 4 mL of Otsuka saline was added to make a total volume of 5 mL. Administered.
  • HCC1954 was cultured using 10% FBS-containing RPMI1640 medium, and transplanted to 5 ⁇ 10 6 mice / mouse subcutaneously on the right flank of SCID mice (female, CLEA Japan). The test consisted of 5 animals in each group, and was administered at 5 mg / kg once a week for a total of 2 times via the tail vein. The results of measuring the tumor volume are shown in FIG. As shown in FIG. 8, the antibody drug conjugate with the humanized antibody showed high antitumor effect.
  • Example 19 HCC70 cancer-bearing animal test using humanized antibody (1)
  • the tumor reduction effect of the antibody drug conjugates of the humanized antibody (PPAT-076-44Hb) and the chimerized antibody (PPAT-076-44C) was confirmed in a xenograft model in which the breast cancer cell line HCC70 was transplanted.
  • the DAR of both antibody drug conjugates was PPAT-076-44Hb (DAR 2.90), PPAT-076-44C (DAR 3.07).
  • an anti-asialo GM1 antibody (WAKO 014-09801) was dissolved in 1 mL of Otsuka distilled water, and 4 mL of Otsuka saline was added to make a total volume of 5 mL, and then this solution was administered intraperitoneally to 100 uL per mouse. did.
  • HCC70 was cultured using 10% FBS-containing RPMI640 medium, and transplanted to 5 ⁇ 10 6 mice / mouse subcutaneously on the right ventral part of SCID mice (female, CLEA Japan).
  • the test consists of 5 animals in each group, humanized antibody conjugate is 0.6, 3.0 or 15 mg / kg, chimerized antibody conjugate is 3.0 mg / kg, drug-free humanized antibody (Naked) is 15 mg Administration was performed twice a week at each dose of / kg. The results of measuring the tumor volume are shown in FIG. As shown in FIG. 9, the antibody drug conjugate with the humanized antibody repeatedly showed a high antitumor effect as compared with the antibody drug conjugate with the chimerized antibody.
  • Example 20 HCC70 cancer-bearing animal test using humanized antibody (2)
  • the tumor reduction effect of antibody drug conjugates of humanized antibody (PPAT-076-44Hd) and chimerized antibody (PPAT-076-44C) was confirmed in a xenograft model in which the breast cancer cell line HCC70 was transplanted.
  • Carcinogenesis was carried out in the same manner as in Example 19, humanized antibody conjugates were 0.6, 3.0 or 15 mg / kg, chimerized antibody conjugates were 3.0 mg / kg, drug-free humanized antibodies (Naked) ) was administered from the tail vein twice a week at a dose of 15 mg / kg once a week.
  • the test was 5 animals in each group.
  • the DAR of both antibody drug conjugates was PPAT-076-44C (DAR 3.07), PPAT-076-44Hd (DAR 2.98).
  • the results of measuring the tumor volume are shown in FIG.
  • the humanized antibody showed a high antitumor effect by binding the drug, and a dose-dependent antitumor effect was confirmed. Further, at the same dose (3.0 mg / kg), a high antitumor effect was shown again as compared with the antibody drug conjugate of the chimerized antibody as in Example 19.
  • Example 21 Oka-C-1 tumor-bearing animal test using humanized antibody
  • the ability of the antibody-drug conjugate of the present invention to inhibit tumor growth was measured using a lung cancer cell line OKa-C-1 (Incorporated Administrative Agency, Institute of Pharmaceutical Sciences, This was confirmed with a xenograft model transplanted with JCRB 1343).
  • OKa-C-1 was cultured in 10% FBS-containing RPMI1640 medium and transplanted to 6.5 ⁇ 10 6 cells / mouse subcutaneously on the right flank of SCID mice (female, CLEA Japan).
  • the humanized antibody conjugate was administered from the tail vein twice a week at a dose of 15 mg / kg. The test was 3 animals in each group.
  • PPAT-076-44Hd was used as a humanized antibody, and a drug was bound to each by the method described in Example 15.
  • DAR drug binding number
  • Example 22 Expression of CDH3N-terminal partial length protein (1) Preparation of expression vector for CDH3N-terminal partial length protein In order to confirm the reactivity of the obtained CDH3 antibody, the N-terminal region of CDH3 antigen was linked to the Fc portion of mouse IgG2a. A fusion protein was prepared. The cDNA sequence of the fusion protein is shown in SEQ ID NO: 70, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 71. The signal peptide used was that of the antibody ⁇ chain, and for the subcloning, a restriction enzyme site was added to the 5 prime side with NheI, and an EcoRI site was added to the 3 prime side (synthesized by GenScript, USA). This was incorporated into pCAGGS, a mammalian expression vector digested with NheI and EcoRI, or pCAGGS-DHFR into which the mouse DHFR gene was incorporated for gene amplification.
  • pCAGGS a mammalian expression vector digest
  • FIG. 12A shows a CBB staining diagram of an antigen expressed and purified by transient expression
  • FIG. 12B shows a staining image using a commercially available CDH3 antibody (BD BIOSCIENCE and R & D Systems) as a primary antibody.
  • CDH3 antibody BD BIOSCIENCE and R & D Systems
  • Anti Mouse IgG F (ab ′) 2-HRP (goat IgG) was used as the secondary labeled antibody.
  • Example 23 CDH3N terminal partial protein solid phase ELISA
  • the CDH3N terminal partial length protein was adjusted to 2.5 ⁇ g / mL with PBS, dispensed at 100 ⁇ L / well in a 96-well plate, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. On the next day, the solution in the well was discarded and washed with Buffer A: 50 mM Tris-HCl / 150 mM NaCl / 1 mM CaCl 2 /0.05% Tween 20 (pH 7.5). Next, a test substance (anti-CDH3 antibody) was prepared as a dilution series, dispensed at 100 ⁇ L / well, and shaken at room temperature for 1 hour.
  • HRP-labeled antibody HRP-goat anti human IgG (H + L) (absorbed with mouse, rabbit, bovine IgG) (American Qualex International, cat) A10 PD-A110)
  • HRP-goat anti human IgG H + L
  • bovine IgG American Qualex International, cat
  • A10 PD-A110 A 1,000-fold dilution was prepared, dispensed at 100 ⁇ L / well, and shaken at room temperature for 1 hour.
  • TMB color developing solution was added at 100 ⁇ L / well, and color development was performed by allowing to stand for 15 minutes in the dark. Stop solution was added at 100 ⁇ L / well, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader. The results are shown in FIG. PPAT-076-44Hb and PPAT-076-44Hd were used as test substances.
  • Example 24 Preparation of Alexa488-labeled antibody
  • the antibody used for labeling is replaced with a labeling buffer (50 mM NaHCO3, 0.5 M NaCl pH 8.5).
  • a labeling buffer 50 mM NaHCO3, 0.5 M NaCl pH 8.5.
  • To 1 mg of antibody 0.5 ⁇ l of 25 mM Alexa 488 (1 mg dissolved in DMF 62.1 ⁇ l, Life Technology) is added and left at room temperature for 1 hour in the dark. Thereafter, the buffer was replaced with PBS.
  • Example 25 Antibody affinity comparison test (1) The effect of humanization on affinity was confirmed by a competition test using a flow cytometer (FACS). Measurements were made by coexisting with a test antibody that made a dilution series, a cell line expressing CDH3, and a certain amount of Amaxa488-labeled antibody that competed with the test antibody, reacted at room temperature for 1 hour, washed with FACS solution, and then measured by FACS Was done. From the GEO Mean value of each antibody concentration, the inhibition rate when the GEO Mean value of the competitive antibody alone was taken as 100% was calculated to obtain IC50, which was used as an affinity index.
  • FACS flow cytometer
  • a mouse antibody purified from the NITE BP-989 cell product was labeled by the method of Example 24, and PPAT-076-44Hd, PPAT-076-44C, and PPAT-076- were used as test antibodies. 44M was used. The result is shown in FIG. All test antibodies compete with Alexa 488-labeled antibody, but in different degrees, indicating that the affinity of the humanized antibody of the present application (PPAT-076-44Hd) is improved compared to mouse and chimerized antibody. It was done.
  • Example 26 Antibody affinity comparison test (2) The effect of the average drug binding number (DAR) bound to the humanized antibody of the present invention on the affinity was confirmed by a competition test using FACS as in Example 25.
  • Antibody drug conjugates were prepared in the range of average DAR 0-8 by the method described in Example 15. DAR was quantified by the method described in Example 16.
  • NCI-H358 was used, and when PPAT-076-44Hb and PPAT-076-44Hd were measured, a mouse purified from NITE BP-989 cell product labeled with Alexa488 by the procedure of Example 24 as a competitive antibody. Using the antibody, each IC50 value was calculated as an affinity index by the same FACS competition test as shown in Example 25.
  • the comparison shown in FIG. 15 (A: PPAT-076-44Hb, B: PPAT-076-44Hd) represents a relative value with an IC50 value of 1 for each antibody not bound to a drug. All humanized antibodies show that the affinity does not decrease when the drug binds.
  • Example 27 Confirmation of CDH3 expression of cancer-bearing model strain
  • immunostaining of a tumor-bearing tissue section was performed.
  • a tumor tissue obtained from a tumor-bearing mouse that had been transplanted with a cell line subcutaneously for a predetermined number of days was deparaffinized, and activated by autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes.
  • Inactivation of endogenous peroxidase with methanol containing 0.3% H 2 O 2 was followed by blocking with 10% goat serum, followed by reaction with anti-CDH3 antibody 610227 (BD BIOSSCENCE) overnight at 4 ° C.
  • BD BIOSSCENCE anti-CDH3 antibody 610227

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Abstract

　本発明の課題は、より免疫原性の少ない抗ＣＤＨ３ヒト化抗体を作出し、これを用いてＣＤＨ３を発現する癌細胞をより効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲートを提供することである。本発明は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６細胞が産生する抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域配列、及び軽鎖可変領域由来の相補性決定領域配列を含み、かつフレームワーク領域配列が重鎖可変領域が重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列、あるいは最適なアライメントのもとで選択されたヒト生殖系列配列であり、軽鎖可変領域が軽鎖ヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列、あるいは最適なアライメントのもとで選択されたヒト生殖系列配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体に細胞傷害作用を持つ薬剤を結合する事で抗ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲートを提供する。

Description

抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その薬剤コンジュゲート、及びそれらの使用
　本発明は、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、及びその免疫複合体、特にはその薬剤コンジュゲートに関する。さらに本発明は、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体及びその免疫複合体の使用方法に関する。
　癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。
　その標的のひとつとして細胞膜表面抗原であるＣＤＨ３（Ｐ－カドヘリン）が同定された。ＣＤＨ３はカルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である（Ｙｏｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｉｃｈｉ，　Ｃｅｌｌ　２８：２１７－２２４，１９８２（非特許文献１））。相互にホモロジーが高い約１１０アミノ酸残基からなるカドヘリンリピートを持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、ＣＤＨ３はその主要メンバーに属する。
　ある種の癌細胞においてはＣＤＨ３の発現上昇例が報告されており、正常組織と比較して癌組織でのＣＤＨ３の発現が高い癌細胞に対して抗体を用いた癌治療が検討されている（ＷＯ２００２／０９７３９５号公報（特許文献１）、ＷＯ２００７／１０２５２５号公報（特許文献２）、特表２０１１－５２６５８３（特許文献４）、ＷＯ２０１１／０８０７９６　Ａ１（特許文献５））。
　このように特定の抗原を標的とした分子標的薬は、抗体医薬としてすでに多くが実際に上市されており、その多くは抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を主な作用機序としている。しかしながら、その薬効は必ずしも十分なものではなく、より強力な抗癌作用を目指した技術開発も同時に進められている。
　抗体の抗癌作用を増強する有効な手段の一つとして、抗体と強力な毒性を有する物質（毒素）との連結があげられる。毒素はそれ単独で患者に投与すると正常組織にも障害を及ぼし、有効な治療手段とはなり得ない。しかしながら、癌細胞特異的な抗原と結合する抗体と毒素を連結することにより、正常な組織に悪影響を及ぼさず、癌細胞のみ殺傷しえる能力を持つに至る。こうした薬剤は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ、　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と呼ばれる。即ち、毒素は抗体と結合した状態では何ら毒性を示さない。しかし、ある種の抗体は標的とする抗原を発現する細胞に結合するとその細胞内に取り込まれ、リソソームにて分解される。したがって、毒素を結合したその種の抗体が細胞内に取り込まれた後、細胞内で分解される事で毒素が放出され、特定の細胞内部においてのみ毒性が発現し、その効果により細胞は殺傷される。
　ＡＤＣに用いられる薬剤成分には、ジフテリア毒素などの細菌性タンパク質毒素、リシンなどの植物タンパク質毒素、アウリスタチン、メイタンシノイド、カリケアマイシンなどの低分子毒素及びその誘導体が含まれる。
　ＡＤＣにおいて、抗体に結合している薬剤は血液中を循環し、標的とする腫瘍に集積した後に薬効をしめす。腫瘍部位以外での薬剤の放出（抗体からの離脱）は、副作用を生じる危険性があるため必ずしも好ましくはない。つまり、抗体に結合している薬剤は細胞内に取り込まれた後に抗体から離脱する設計が好ましい。
　近年ジェネンテック社はこのような観点から、乳癌治療薬としてすでに上市されているトラスツズマブに非開裂型リンカー（ＳＭＣＣ）を介して毒素を結合した薬剤（開発名：Ｔ－ＤＭ１）を開発し、非常に高い臨床効果を得ている（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．　２０１２　Ｎｏｖ　８；３６７（１９）：１７８３－９１（非特許文献２））。また、開裂性リンカーを介して薬剤成分と連結した抗体薬剤コンジュゲートも開発され、例えばＮＣＡＭ抗原を発現する疾患を対象に、開裂型リンカー（ＳＰＰ）を介して薬剤とＨｕＮ９０１抗体を結合させた抗体薬剤コンジュゲートの開発がＩｍｍｕｎｏＧｅｎ社により進められている。
　また、抗体に放射性物質を結合させ治療に供するような放射性免疫療法薬も開発され、キメラ化抗ＣＤ２０抗体に放射性物質９０Ｙ（イットリウム）あるいは１１１Ｉｎ（インジウム）を結合させた薬剤として、ゼヴァリン（一般名：イブリツモマブチウキセタン）が上市されている。
　なお、当該抗体を薬剤コンジュゲートなどとして用いる時、特に患者への投与期間が長期に及ぶ場合、異種免疫グロブリンに対する抗体（例えばヒト抗マウス抗体、　ＨＡＭＡ）、などを生じさせる可能性がある投与抗体自身の免疫原性は、最小限度あるいは全く無いことが望ましく、そのような抗体を利用して薬剤コンジュゲートを作出することは有益である。
　このような抗体を得る手段として、例えばマウス等の異種生物に由来して取得された抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ、　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）とヒトに由来した抗体のフレームワーク領域（ＦＲ、　Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　Ｒｅｇｉｏｎ）をつなぎ合わせて作出されるヒト化抗体技術が、当業者では常套的に用いられる（特開２００５－０００１６９（特許文献１２）、及び特許第４８３６１４７号（特許文献１３））。しかし、ＣＤＲと組み合わされるＦＲが適切でない場合、親和性の消失、安定性の低下といった望ましくない結果となることもしばしば見られる。こうした事象に対応するため、その設計に移植元となった抗体に由来するアミノ酸残基をフレームワーク領域の該当する位置のアミノ酸残基と置換するｒｅｓｈａｐｅと呼ばれる方法も試みられ、適切な置換を行なう事が出来れば、ヒト化によって生じうる親和性低下の改善が図られることもある（Ｎａｔｕｒｅ；３３２，ｐ３２３（１９８８）（非特許文献３）、及び米国特許６１８０３７０号（特許文献３））。
　このように、当該ヒト化抗体のマウス等の異種生物に由来したＣＤＲ配列とヒトに由来したＦＲ配列は、それぞれその元となったアミノ酸配列と１００％同一であることは好ましいが、ヒト化、キメラ化の過程で抗原との結合を維持を目的としたアミノ酸残基置換は常套的に試みられる。ＣＤＨ３との結合性を維持し、その免疫原性を極端に上げない範囲で、親和性維持を目的に遺伝子工学的な改変を加えることもまた好ましく、ヒト化により組み合わされたＣＤＲ及びＦＲから成る元配列に対する配列相同性の程度は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上、または１００％同一である。このような配列の一部改変した抗体は、ＣＤＨ３の特定のエピトープと特異的に結合性するという意味において、もとのハイブリドーマに由来したＣＤＲの性質をそのまま維持した抗体と考えられる。
　このようにして得られたヒト化抗体を用いることでその免疫原性を最小限に留め、更にＡＤＣのような強力な細胞傷害性を有する免疫複合体として疾患の治療に供することは、その薬剤投与を受ける患者にとって明確な利益となりえる。また当分野では、肺がん、大腸がん、乳癌といった様々な癌を治療するための更なる薬剤に対する需要がある。この目的のために特に有用な薬剤に、有意に毒性が低いが有益な治療的有効性がある抗ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲートが含まれる。
ＷＯ２００２／０９７３９５号公報 ＷＯ２００７／１０２５２５号公報 米国特許６１８０３７０号 特表２０１１－５２６５８３ ＷＯ２０１１／０８０７９６　Ａ１ ＷＯ２０１３／１５０６２３ ＥＰ２３９４００号公報 国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報 特表２００８－５１６８９６号公報 米国特許第５，２０８，０２０号 米国特許第６，３３３，４１０Ｂ１号 特開２００５－０００１６９ 特許第４８３６１４７号
Ｙｏｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｉｃｈｉ，　Ｃｅｌｌ　２８：２１７－２２４，１９８２ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．　２０１２　Ｎｏｖ　８；３６７（１９）：１７８３－９１ Ｎａｔｕｒｅ；３３２，ｐ３２３（１９８８） Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．；１２，ｐ５５５５（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ；２７６，ｐ２６９（１９７８） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；６８（２２），ｐ９２８０（２００８） Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２６（８），ｐ９２５（２００８） Ｂｉｏ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９，ｐ１６７３（２００８） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；６８（１５），ｐ６３００（２００８） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ；１７３，ｐ９３（１９８８） 「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ－」　ＰＲＯＴＯＣＯＬ　９．５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；４９，ｐ４３９２（２００６） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；５２，ｐ１２７（１９９２） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１６９，ｐ１１１９（２００２） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．，　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，　ＭＤ　（１９９１） Ｊ．ＭｏＩ　Ｂｉｏｌ．；１９６，ｐ９０１（１９８７） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１５１，ｐ２２９６（１９９３） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；１９６：ｐ９０１（１９８７）） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；９，ｐ２６６（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；８９，ｐ４２８５（１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；５２５，ｐ４４５（２００９）
　本発明は、より免疫原性の少ない抗ＣＤＨ３ヒト化抗体を作出し、これを用いてＣＤＨ３を発現する癌細胞をより効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲートを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＤＨ３を特異的に認識する抗体から規定されるＣＤＲ配列と、種々のヒト由来ＦＲ配列とを組み合わせることによって、そして親和性を改善するために適切なアミノ酸変異を導入することによって、免疫原性の少ない抗ＣＤＨ３ヒト化抗体を作出し、これを用いてＣＤＨ３を発現する癌細胞をより効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲートを作出することに成功し、本発明を完成するに至った。
　本発明によれば、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６を有する細胞が産生する抗体（以下、このマウス抗体を抗体番号：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍとする）の重鎖可変領域由来の相補性決定領域配列（以下、ＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及び軽鎖可変領域由来の相補性決定領域配列（以下、ＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含み、かつフレームワーク領域配列が重鎖可変領域が重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列であり、軽鎖可変領域が軽鎖ヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が提供される。
　本発明によればさらに、ＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３が、それぞれ配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８であり、ＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３がそれぞれ配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１を含み、かつフレームワーク領域配列が重鎖可変領域が重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列であり、軽鎖可変領域が軽鎖ヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が提供される。
　本発明によればさらに、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６を有する細胞が産生する抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域配列（ＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及び軽鎖可変領域由来の相補性決定領域配列（ＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含み、かつフレームワーク領域配列が最適なアライメントのもとで選択されたヒトの生殖系列に由来する配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が提供される。
　本発明によればさらに、ＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３がそれぞれ配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８であり、ＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３がそれぞれ配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１を含み、かつフレームワーク領域配列が最適なアライメントのもとで選択されたヒトの生殖系列に由来する配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が提供される。
　本発明によればさらに、上記の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体との配列相同性が少なくとも９０％以上であり、かつＣＤＨ３を認識できる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が提供される。
　本発明によればさらに、上記した抗体のフレームワーク領域部分における１から数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換しており、かつＣＤＨ３を認識できる、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が提供される。
　本発明によればさらに、上記した抗体の相補性決定領域配列のうちフレームワーク領域との境界における１から数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換しており、かつＣＤＨ３を認識できる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が提供される。
　好ましくは、置換されるアミノ酸が軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる５５位のアミノ酸である。
　好ましくは、置換されるアミノ酸が重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる４９位、７１位、あるいは７８位から１つ以上が選ばれるアミノ酸である。
　好ましくは、軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる５５位のアミノ酸がアラニンに置換している。
　好ましくは、重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる７１位のアミノ酸がリジンに置換している。
　好ましくは、重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる７８位のアミノ酸がバリンに置換している。
　好ましくは、重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる４９位のアミノ酸がアラニンに置換している。
　好ましくは、上記抗体は、重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる４９位のアミノ酸残基のアラニンへの置換、７１位のアミノ酸残基のリジンへの置換、７８位のアミノ酸残基のバリンへの置換、及び軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる５５位のアミノ酸残基のアラニンへの置換から選択される１以上の置換を有する。
　本発明によれば、以下の何れかの抗体が提供される。
（１）重鎖可変領域に配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域に配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；（抗体番号：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈａ）
（２）重鎖可変領域に配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域に配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；（抗体番号：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ）
（３）重鎖可変領域に配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域に配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；（抗体番号：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｃ）
（４）重鎖可変領域に配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域に配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；（抗体番号：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ）
　好ましくは、本発明の抗体は、ＣＤＨ３との結合能を有する。
　好ましくは、本発明の抗体は、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2、又はｓｃＦｖである。
　本発明によればさらに、ＣＤＨ３との結合能を有する、上記抗体の部分配列が提供される。
　好ましくは、ＣＤＨ３がヒトＣＤＨ３である。
　好ましくは、ＣＤＨ３が配列番号２の細胞外領域（配列番号２の１から６５４アミノ酸に相当する）である。
　本発明によればさらに、上記した抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤又は放射性物質とが連結している、免疫複合体が提供される。
　好ましくは、化学療法剤が、細胞障害性物質である。
　好ましくは、細胞傷害性物質が、メイタンシノイド又はその誘導体、あるいはアウリスタチン又はその誘導体である。
　好ましくは、細胞傷害性物質が、ＤＭ１、ＤＭ３又はＤＭ４から選択されるメイタンシノイド又はその誘導体、あるいはＭＭＡＥあるいはＭＭＡＦから選択されるアウリスタチン又はその誘導体である。
　好ましくは、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列１分子あたり平均１～７個のＤＭ１が結合している。この平均薬剤結合個数は抗体親和性に影響を及ぼさない。
　好ましくは、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤とがリンカーを介して連結している。
　好ましくは、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤とが、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合を介して連結しているか、又は抗体のＦｃ領域を遺伝子工学的に改変して連結している。
　好ましくは、リンカーが、２価反応性架橋試薬である。
　好ましくは、リンカーが、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）　（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－イオド－アセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボンイル（ＰＡＢ）、及びＮ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）から成る群より選択される。
　好ましくは、リンカーがプロテアーゼによって切断される。
　好ましくは、リンカーが、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）、及びパラアミノベンゾイック酸（ＰＡＢＡ）の少なくとも１以上を含む。
　好ましくは、細胞傷害性能が抗体可変領域のフレームワーク領域配列のヒト化によって増強されている。
　本発明によればさらに、上記した免疫複合体を含む、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療するための医薬が提供される。
　好ましくは、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患が癌である。
　好ましくは、癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される。
　好ましくは、本発明の医薬は、抗腫瘍剤として使用する。
　本発明によればさらに、上記した免疫複合体を患者に投与することを含む、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療する方法が提供される。
　本発明によればさらに、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療するための医薬の製造のための、上記した免疫複合体の使用が提供される。
　抗ＣＤＨ３ヒト化抗体は、その元となる抗体と比較して免疫原性の低減が期待される。ヒト化抗体は、元となった抗体のＣＤＲ配列とヒト由来ＦＲ配列の適切な組み合わせにより構成される。もしこれが抗原との親和性を示さない時は、更に抗体可変領域へのアミノ酸変異を導入することで親和性回復の試みもなされる。ＣＤＲ配列と適切なＦＲ配列との組み合わせ、及び必要に応じたアミノ酸変異導入により、ＣＤＨ３と特異的に結合する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が得られる。このようにして得られた本発明の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体は、化学療法剤を結合しない抗体と比較して、ＣＤＨ３を発現する癌細胞に対して強力な細胞傷害活性を示す。更に本発明の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体は、ＷＯ２０１３／１５０６２３（特許文献６）に記載されるような抗ＣＤＨ３キメラ化抗体に比して親和性も向上し、抗ＣＤＨ３キメラ化抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体と比較して、より強力な細胞傷害活性を示す。従って、ＣＤＨ３を発現する癌細胞を有する患者に本発明による免疫複合体を投与することによって、高い抗癌作用を発揮できるとともに、それ自身の免疫原性の低減も達成できる。本発明の免疫複合体は、抗癌剤として有用である。
図１は、ヒトＣＤＨ３強制発現細胞株と市販抗ヒトＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞。Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８。ａ：抗ＣＤＨ３抗体０．０１ｕｇ／ｍＬ、ｂ：抗ＣＤＨ３抗体０．１ｕｇ／ｍＬ、ｃ：抗ＣＤＨ３抗体１ｕｇ／ｍＬ 図２は、取得抗体のフローサイトメトリ結果を示す。取得抗体群の典型的なフローサイトメトリ結果３例をＡ－Ｃに示す。Ａ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８。ａ：抗ＣＤＨ３抗体０．０１ｕｇ／ｍＬ、ｂ：抗ＣＤＨ３抗体０．１ｕｇ／ｍＬ、ｃ：抗ＣＤＨ３抗体１ｕｇ／ｍＬ。Ｄには受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６に由来するハイブリドーマから精製したマウス抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍ）のフローサイトメトリ結果を示す。Ｄの各図右側ピークは、アイソタイプ一致抗体を用いた陰性対照を示し、左側ピークはＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍを１０ｕｇ／ｍＬで測定した結果を示す。 図３は、各種腫瘍組織のＣＤＨ３のｍＲＮＡの発現結果を示す。Ａ：正常組織、Ｂ：各種癌組織、Ｃ：膵臓癌分化度 図４は、各種ヒト腫瘍組織でのＣＤＨ３の発現結果を示す。 図５は、各ＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。使用細胞株はＡ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８、Ｂ：ＣＨＯ細胞、Ｃ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞。各図左側のピークが陰性対照を示す。 図６は、ＤＭ１ＳＭｅの構造を示す。 図７は、ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートの細胞傷害性試験結果を示す。Ａ：ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞株、抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤結合）、Ｂ：ＨＣＣ１９５４細胞株、抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤結合）、Ｃ：ＨＣＣ７０細胞株、抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤結合）、Ｄ：表１に示した細胞株、抗体コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤結合）。 図８は、ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、及びＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤結合）を用いた動物試験結果（ＨＣＣ１９５４乳がんモデル）を示す。 図９は、ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂに薬剤結合）を用いた動物試験結果（ＨＣＣ７０乳がんモデル）による用量依存性、及びキメラ化抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃに薬剤結合）との比較結果を示す。 図１０は、ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤結合）を用いた動物試験結果（ＨＣＣ７０乳がんモデル）による用量依存性、及びキメラ化抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃに薬剤結合）との比較結果を示す。 図１１は、ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲート（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤結合）を用いた動物試験結果（ＯＫａ－Ｃ－１肺がんモデル）を示す。 図１２は、ＣＤＨ３Ｎ末部分長タンパク質の発現結果を示す。Ａ：ＣＢＢ染色（右側レーンが発現産物。左側レーンは分子量マーカー）。Ｂ：ウェスタンブロット（Ｍ：サイズマーカー、１：市販ＣＤＨ３抗体（ＢＤ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）、２：市販ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、３：抗体無し）。 図１３は、ＣＤＨ３Ｎ末部分長タンパク質を固相としたＥＬＩＳＡの測定結果を示す。 図１４は、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ（ヒト化抗体）と、その親抗体であるＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍ（マウス抗体）、及びＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃ（キメラ化抗体）の親和性比較結果を示す。 図１５は、平均薬剤結合数（ＤＡＲ）の異なるＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートと薬剤を結合していない抗体との相対的な親和性を示す。Ａ：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、Ｂ：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ。 図１６は、動物試験で用いたマウス担癌モデルの担癌腫瘍組織部分のＣＤＨ３発現を示す。Ａ：ＨＣＣ１９５４、Ｂ：ＨＣＣ７０、Ｃ：Ｏｋａ－Ｃ－１。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明は、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体及びその使用方法に関する。本発明の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体は、ＣＤＨ３を特異的に認識する抗体から規定されるＣＤＲ配列と種々の適切なヒト由来ＦＲ配列を組み合わせることにより提供され、更には親和性を改善するために適切なアミノ酸変異を導入することにより提供される。一態様では、本発明の抗体は細胞表面に発現されるＣＤＨ３に結合する。一態様では、本発明の抗体はＣＤＨ３領域内のエピトープに結合する。好ましくは、本発明の抗体は、ヒト細胞表面に発現されるＣＤＨ３に結合し、特に好ましくは癌細胞表面に発現されるＣＤＨ３に結合する。一態様では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）2断片から選択されるヒト化抗体断片でもよい。このような抗体は、例えば各種リンカーを介して効率的に化学療法剤と結合することによって、抗体薬剤コンジュゲートとして用いることができる。また本発明の抗体は、任意のスペーサー配列を介して毒素と結合することもできる。即ち、本発明によれば、癌細胞を効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲートが提供される。
　本発明の抗体を作成するための抗原としては、ＣＤＨ３又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、ＣＤＨ３細胞外領域（配列番号２の１から６５４アミノ酸に相当する）に相当する可溶型ＣＤＨ３タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
　本発明の抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。ヒト化モノクローナル抗体を取得するための材料として、本発明ではマウスへの免疫を経てハイブリドーマを取得する。このような材料は当該分野で周知な種々の方法で取得することができる。例えば以下に記載する方法でも得ることが出来るが、これに限定されるものではない。
　ＣＤＨ３特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ樹立のためには、先ずＣＤＨ３又はその部分ペプチドを抗原としてマウスに投与する。１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１～１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１～１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２～５週間間隔で、１～１０回、好ましくは２～５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１～６０日後、好ましくは１～１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
　ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。ミエローマ細胞は、ＨＡＴ培地等への薬剤選択性を有し一般に入手可能なマウス由来の株化細胞を使用することができる。例えば　Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ－１などが挙げられる。
　細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０6～１×１０7個／ｍＬの抗体産生細胞と２×１０5～２×１０6個／ｍＬのミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行うことができる。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００～６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　ハイブリドーマは、選択培地の培養操作により得ることができる。細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０5個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、ＣＤＨ３と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
　樹立したハイブリドーマを材料とすれば、これに由来した抗体のヒト化は既知の方法で達成することができる。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込み、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００号公報（特許文献７）、国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報（特許文献８）など）。
　相補性決定領域（ＣＤＲ）配列は、抗体間の可変領域で特に相違が激しく、その抗体の特異性決定に極めて重要な役割を果たす配列領域を示す。この領域に属するアミノ酸残基は、抗原に対する結合性および特異性に直接的に関わる残基を多く含んでいると考えられ、軽鎖及び重鎖可変領域に各々３領域が存在する。
　ＣＤＲはＫａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．，　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，　ＭＤ　（１９９１）（非特許文献１５））によって配列比較により規定され、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；１９６，ｐ９０１（１９８７）（非特許文献１６））により三次元構造によっても規定される。
　Ｋａｂａｔが規定したＣＤＲは、一般的に軽鎖可変領域は残基２４－３４付近、残基５０－５６付近、残基８９－９７付近に位置し、重鎖可変領域では残基３１－３５付近、残基５０－６５付近、残基９５－１０２付近に位置するとされるが、この領域の全ての残基が抗原結合に直接関与するとは必ずしも限らず、三次元構造から規定されたＣＤＲ領域と完全に一致するという訳では無い。なお、本明細書中にアミノ酸の残基番号が表記される時の番号付与体系はＫａｂａｔのナンバリングに従っている。
　選択されるヒトＦＲ配列は、適時適切なものが選ばれる。本願明細書において、選択されたヒトＦＲ配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列から得られる軽鎖可変領域あるいは重鎖可変領域を含有する配列である。
　ヒトコンセンサスフレームワーク配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖あるいは重鎖可変領域において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すＦＲ配列である。通常、ヒト免疫グロブリン軽鎖あるいは重鎖可変領域配列は、可変領域配列のサブグループから選別される。Ｋａｂａｔ等によると、軽鎖可変領域は軽鎖ヒトκサブグループＩであり、重鎖可変領域が重鎖ヒトサブグループＩＩＩである。
　一実施態様では、軽鎖ヒトκサブグループＩのコンセンサス配列は少なくとも以下の配列の一部あるいは全部が含まれ、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４の各配列の一部あるいは全部にＣＤＲ配列が挟み込まれた形で構成される。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱ：配列番号６２（ＦＲ－Ｌ１）
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫ：配列番号６３（ＦＲ－Ｌ２）
ＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ：配列番号６４（ＦＲ－Ｌ３）
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ：配列番号６５（ＦＲ－Ｌ４）
　一実施態様では、重鎖ヒトサブグループＩＩＩのコンセンサス配列は少なくとも以下の配列の一部あるいは全部が含まれ、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４の各配列の一部あるいは全部にＣＤＲ配列が挟み込まれた形で構成される。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦ：配列番号６６（ＦＲ－Ｈ１）
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ：配列番号６７（ＦＲ－Ｈ２）
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ：配列番号６８（ＦＲ－Ｈ３）
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ：配列番号６９（ＦＲ－Ｈ４）
　以上のヒトコンセンサスフレームワーク配列は、各サブグループで最も高頻度に出現するアミノ酸残基により構成される。
　また、本発明においては、最適なアライメントのもとで選択されたヒトの生殖系列に由来するフレームワーク配列を使用することもできる。これは、ヒトコンセンサスフレームワーク配列が抗体ヒト化において必ずしも適切でない場合も有り得ることに対応し、ベストフィット法として知られる。
　即ち、マウス抗体の可変領域配列を既知の公開されたヒト可変領域配列ライブラリーに対してスクリーニングする。その中で最も配列的に近似したヒト可変領域配列をヒト化抗体の生殖系列に由来したヒトフレームワーク配列として用いることができる（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１５１，ｐ２２９６（１９９３）（非特許文献１７）、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；１９６，ｐ９０１（１９８７）（非特許文献１８）、Ｔｅｍｐｅｓｔら．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；９，ｐ２６６（１９９１）（非特許文献１９））。
　最も配列的に近似した生殖系列配列は、そのようなライブラリーを多数登録したデータベースにおいて元抗体の配列に対するアライメント（例えば、ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎＩｇ））を実施することで確かめることができる。
　一実施態様では、軽鎖生殖系列配列は少なくとも以下の配列の一部あるいは全部が含まれ、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４の各配列の一部あるいは全部にＣＤＲ配列が挟み込まれた形で構成される。
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱ：配列番号７２（ＦＲ－Ｌ１）
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫ：配列番号７３（ＦＲ－Ｌ２）
ＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ：配列番号７４（ＦＲ－Ｌ３）
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ：配列番号７５（ＦＲ－Ｌ４）
　一実施態様では、重鎖生殖系列配列は少なくとも以下の配列の一部あるいは全部が含まれ、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４の各配列の一部あるいは全部にＣＤＲ配列が挟み込まれた形で構成される。
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦ：配列番号７６（ＦＲ－Ｈ１）
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ：配列番号７７（ＦＲ－Ｈ２）
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ：配列番号７８（ＦＲ－Ｈ３）
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ：配列番号７９（ＦＲ－Ｈ４）
　何れかの方法で選ばれたフレームワーク（ＦＲ）配列がヒト化に適当であるかどうかは、各抗体クローンＣＤＲ配列との組み合わせが適切であり、結合を目指す抗原に対して適切な立体構造を維持しえたか否かによって判断することができる。
　もしＣＤＲ配列とヒトに由来したＦＲ領域を挟んで移植することで発現したヒト化抗体が、その配列選択が適切でない場合には親和性が低下することもしばしば起こりえる。これはＦＲ領域中に存在する残基も、その構造維持において重要な役割を果たすものが存在することを意味する。この事象に対応したアミノ酸残基置換を行うことができる。例えば、アライメントの結果、ヒト由来の配列と位置的に相同な場所に存在するマウス抗体由来のアミノ酸と同じ残基へと置換（ｒｅｓｈａｐｅ）することができる。これによりヒト化によって生じた親和性の低下を改善することができる場合がある。
　置換されるべきアミノ酸残基の位置は、対象とする抗体によって異なり、多くの場合、実際に発現させるまで特定されない。以下の実施例においては、比較的多くの文献（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；８９，ｐ４２８５（１９９２）（非特許文献２０））において置換が実施される軽鎖可変領域の５５位、重鎖可変領域の４９位、７１位、及び７８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基を置換することによって、親和性低下に対する向上を図ることが意図されたが、その置換位置、組み合わせ及び置換後のアミノ酸残基の種類は任意であり、これに限定されるものではない。
　抗体を生産するための宿主は哺乳動物起源のものが多いが、当業者であれば、発現したい遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞系を適宜選択することができる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３－Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、２９３（ヒト腎臓）、及び２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）などが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞系は、各種メーカー、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、または文献に記載の論文発表機関から入手することができる。
　宿主細胞系としては、好ましくはｄｇｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株又はＳＰ２／０を使用することができる（Ｕｒｌａｎｄ，　Ｇ．ら、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．；１２，ｐ５５５５（１９８６）（非特許文献４）、およびＳｃｈｕｌｍａｎ，　Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ；２７６，ｐ２６９（１９７８）（非特許文献５））。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。
　宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って実施できる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるが、これらに限定されるものではない（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　９　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎｔｏ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
　これらの抗体は、ＣＤＨ３を認識する限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよく、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。また、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ）、ＤｉａｂｏｄｙなどにＦｃ部分を融合したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
　本発明の抗体の好ましい使用態様としては、抗体に細胞傷害性物質等の化学療法剤を結合させた免疫複合体、即ち、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を挙げることができる。本発明の免疫複合体は、例えばＣＤＨ３を発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。
　本発明で用いられる化学療法剤の例としては、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ－１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ－ドキソルビシン、シアノモルフォリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン－１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、５－ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ－３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ8－アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
　本発明における免疫複合体は、前記の化学療法剤と抗体とを公知の方法により結合することにより作製できる。抗体と化学療法剤は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
　薬剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
　抗体と化学療法剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、，マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。
　リンカーの例としては、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）　（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－イオド－アセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボンイル（ＰＡＢ）、及びＮ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）等があげられるが、これらに限定されるものではない。このリンカーは例えば、パラアミノベンゾイック酸（ＰＡＢＡ）に、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）のようなペプチドリンカーが組み合わさってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。
　薬剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；５２，ｐ１２７（１９９２）（非特許文献１３）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；６８（２２），ｐ９２８０（２００８）（非特許文献６）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２６（８），ｐ９２５（２００８）（非特許文献７）、Ｂｉｏ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９，ｐ１６７３（２００８）（非特許文献８）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；６８（１５），ｐ６３００（２００８）（非特許文献９）、又は特表２００８－５１６８９６号公報（（特許文献９））などに記載の方法に準じて行うことができる。
　本発明の別の実施形態としては、抗体に毒素を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。用いられる毒素としては、例えば、ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、ゲロニン、サポリン等をあげることができるが、これに限定されるものではない。
　更に本発明の別の実施形態として、抗体に放射性物質を結合させることもできる。放射性物質としては、癌治療薬として用いる場合、細胞傷害性放射性金属が好ましく、癌診断薬として用いる場合には細胞非傷害性放射性金属であることが好ましい。
　このような細胞傷害性放射性金属としては、例えばイットリウム９０（９０Ｙ）、レニウム１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム１８８（１８８Ｒｅ）、銅６７（６７Ｃｕ）、鉄５９（５９Ｆｅ）、ストロンチウム８９（８９Ｓｒ）、金１９８（１９８Ａｕ）、水銀２０３（２０３Ｈｇ）、鉛２１２（２１２Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（１６５Ｄｙ）、ルテニウム１０３（１０３Ｒｕ）、ビスマス２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス２１３（２１３Ｂｉ）、ホルミウム１６６（１６６Ｈｏ）、サマリウム１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム１７７（１７７Ｌｕ）などを挙げることができる。これらの放射性金属の中でも、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕが、半減期、放射線エネルギー、容易な標識反応、標識率、錯体の安定性等の点から好ましいが、これらに限定されるものではない。
　一方、診断薬に用いる細胞非傷害性放射性金属としては、テクネシウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、インジウム１１３ｍ（１１３ｍＩｎ）、ガリウム６７（６７Ｇａ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、タリウム２０１（２０１Ｔｌ）、クロム５１（５１Ｃｒ）、コバルト５７（５７Ｃｏ）、コバルト５８（５８Ｃｏ）、コバルト６０（６０Ｃｏ）、ストロンチウム８５（８５Ｓｒ）、水銀１９７（１９７Ｈｇ）、銅６４（６４Ｃｕ）が好適に用いられるが、これらに限定されるものではない。
　これらの放射性金属元素を抗カドヘリン抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して結合している。
　このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８－ヒドロキシキノリン、８－アセトキシキノリン、８－ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ－アセチルオキシン、Ｏ－ベンゾイルオキシン、Ｏ－ｐ－ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２－メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
　これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。
　抗体への放射性金属元素の結合は、常法に従って行うことができる。例えば抗体と金属キレート試薬とを反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。
　なお、本発明により提供される免疫複合体は、その薬剤の安定的な状態を保持に対応するため薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。本発明の免疫複合体は、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の免疫複合体の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
　本発明の免疫複合体により治療されうる疾患はＣＤＨ３がその細胞に発現しているものであれば特に限定されない。例えば、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫などをあげることが出来るが、これに限定されるものではない。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これの目的は例示的なものであって、本発明の内容が実施例によって限定されるものではない。　なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例１：ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株の樹立
　抗ＣＤＨ３抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞を樹立した。
（１）ＣＤＨ３遺伝子発現ベクターの作製
　配列番号１に示す全長ヒトＣＤＨ３ＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）へ挿入するため、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社）及びＸｂａＩ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢへＴ４　ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）により常法に従って挿入し、発現ベクターｐＥＦ４－ＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓを得た。
（２）ＣＤＨ３安定発現株の取得
　ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5細胞のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４－ＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）に混合し１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
　ＣＤＨ３全長発現ＣＨＯのクローン選抜は、抗ｃ－Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果、発現量が高く、かつ増殖が良好なＣＤＨ３全長発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を得た。この細胞株、親株であるＣＨＯ細胞、およびＣＤＨ３発現が確認されているＮＣＩ－Ｈ３５８肺癌細胞株と市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社）のフローサイトメーターによる測定結果を図１に示す。
実施例２：可溶型ＣＤＨ３抗原の作製
　抗ＣＤＨ３抗体作製の免疫原とするため、Ｃ末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型ＣＤＨ３（ｓＣＤＨ３）タンパク質を作製した。
（１）可溶型ＣＤＨ３抗原発現ベクターの作製
　ＣＤＨ３全長ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＣＤＨ３細胞外領域に相当する部分（配列番号１の１－２０１０に相当、以下ｓＣＤＨ３ｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたフォワードプライマー（ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴ：配列番号３）とリバースプライマー（ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣ：配列番号４）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応にはＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒を３０サイクルの反応条件で行った。
　その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約２．０ｋｂｐのバンドを含むゲル断片を切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて、目的のｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを得た。
　このｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢへ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターｐＥＦ４－ｓＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓを得た。
（２）可溶型ＣＤＨ３タンパク質の発現
　ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5個のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４－ｓＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に混合、１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ）を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
　可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞の選抜は、抗ｃ－Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）が得られた。選択された可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）は、培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ－ＩＩ（インビトロジェン社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型ＣＤＨ３タンパク質を得た。
実施例３：抗ＣＤＨ３マウス抗体の作製
（１）可溶型ＣＤＨ３タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
　生理食塩水に溶解した５０μｇの可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ－ＭＡＸ　Ｇｏｌｄ（登録商標）（タイターマックス社）を等量混合し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内および皮下に注射することにより初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当の可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ－ＭＡＸ　Ｇｏｌｄを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４あるいはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３との細胞融合を行った。
（２）抗ＣＤＨ３マウス抗体産生ハイブリドーマの選抜
　抗ＣＤＨ３マウス抗体の選抜は、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を用いたフローサイトメトリで行った。すなわち、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液（１％ＢＳＡ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％ＮａＮ3入りＰＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）2（インビトロジェン社）を加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞との反応が認められるハイブリドーマを選抜した。
　当該ハイブリドーマより得られた抗体と、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）、親株であるＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３が高発現であると確認されているヒト細気管支肺胞上皮癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８との典型的な反応結果を図２Ａ-Ｃに示す。選抜したハイブリドーマ全てが、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）およびＮＣＩ－Ｈ３５８と反応し、ＣＨＯ細胞とは反応しないことを確認した。図２Ｄには受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６に由来するハイブリドーマから精製したマウス抗体（抗体番号：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍ）のフローサイトメトリ結果を示す。
実施例４：正常組織および癌組織でのＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現
　正常ヒト組織および各種癌組織より、レーザーマイクロダイセクション法（Ｌａｓｅｒ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）で回収したサンプルよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い定法に従って全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ各１０ｎｇをＧｅｎｅＣｈｉｐＵ－１３３Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に準じて遺伝子発現を解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ＣＤＨ３は正常ヒト組織では発現が限られ、肺癌、大腸癌、膵臓癌で発現が高かった（図３Ａ、Ｂ）。また、分化度の異なる膵臓癌組織におけるＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現を検討したところ、分化度に関わらず発現が高い組織が認められた（図３Ｃ）。
実施例５：免疫組織化学染色による癌組織でのＣＤＨ３タンパク質の発現
　癌臨床検体でのＣＤＨ３タンパク質の発現を確認するため、癌検体組織アレイで免疫染色を行った。癌細胞組織アレイは、上海芯超生物科技有限公司社（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｏｕｔｄｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）製の、膵癌（腺癌）、肺癌（腺癌）、肺癌（扁平上皮癌）および大腸癌（腺癌）を使用した。
　各組織アレイスライドを脱パラフィン処理し、１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）で９５℃、４０分賦活化を行った。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ（Ｄａｋｏ社）付属のブロッキング試薬にて内在性ペルオキシダーゼの不活性化を行った後、抗ＣＤＨ３抗体６１０２２７（ＢＤ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）、およびネガティブコントロールとして抗ＨＢｓ抗体Ｈｙｂ－３４２３と５μｇ／ｍＬの濃度で４℃一晩反応させた。抗体溶液を洗い流した後に、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属のポリマー二次抗体試薬と室温３０分間反応させた。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属の発色試薬にて発色を行い、ヘマトキシリンエオジン溶液にて核染色を行った。
　図４に結果を示す。癌細胞は抗ＣＤＨ３抗体で染色され、正常細胞は染色されなかった。
実施例６：ハイブリドーマからのＲＮＡの精製
　ＣＤＨ３抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から、細胞質に存在するＲＮＡをＧｏｕｇｈ，　Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｓｍａｌｌ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，　１７３，　ｐ９３－９５　（１９８８）（非特許文献１０）により記載されている方法（ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のＴＮＥ緩衝液　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１％ＮＰ－４０；１５０ｍＭ　ＮａＣｌ；１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を用いた）に従って単離した。具体的な操作方法としては、５×１０6個のハイブリドーマ細胞を０．２ｍＬのＴＮＥ緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約０．２ｍＬ細胞質上清に０．２ｍＬの抽出緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５；０．３５Ｍ　ＮａＣｌ；１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；７Ｍ尿素）を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたＲＮＡ溶液にキャリアとしてグリコーゲン（ロッシュ、Ｃａｔ　Ｎｏ．９０１３９３）を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にＲＮＡ沈殿物を、細胞質ＲＮＡ濃度が０．５～２μｇ／μＬになるように１０～５０μＬの滅菌蒸留水を加えて溶解した。
実施例７：ハイブリドーマから調製したＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製
　一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように調製した細胞質ＲＮＡの０．５～３μｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．３（室温）；７５ｍＭ　ＫＣｌ；３ｍＭ　ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｎｇのランダムプライマー、０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ、２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（逆転写酵素、インビトロジェン社）を含む２０μＬ反応混合液を調製し、４２℃で５０分間インキュベートした。このように合成したｃＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の鋳型として直接使用した。
実施例８：抗ＣＤＨ３マウス抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
　抗ＣＤＨ３マウス抗体可変領域の配列を決定するため、実施例７で得られたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ＰＣＲ法により抗ＣＤＨ３マウス抗体可変領域の遺伝子増幅を実施した。プライマーは全て北海道システムサイエンス株式会社に合成依頼し、以下に記載するような組み合わせで実施した。
Ａ．マウス軽鎖可変領域コード遺伝子のＰＣＲプライマー
　５’末端においてＦＲ１部分と相同性を有するＰＣＲプライマーと３’末端においてマウス軽鎖内のＪ鎖遺伝子と相同性を有する４セットプライマー（１）、あるいは５’末端において軽鎖シグナル部分（７セットプライマー）と３’末端においてＫＣ部分（ＫＶＬアンチセンスプライマー）と相同性を有するプライマーセット（２）の２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリン軽鎖可変域ＤＮＡを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
　なお、塩基配列において、ＭはＡまたはＣ、ＲはＡまたはＧ、ＷはＡまたはＴ、ＳはＣまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＫはＧまたはＴ、ＶはＡまたはＣまたはＧ、ＨはＡまたはＣまたはＴ、ＤはＡまたはＧまたはＴ、ＢはＣまたはＧまたはＴ、ＮはＡまたはＣまたはＧまたはＴをそれぞれ示す。
（１）マウス軽鎖可変域クローニング４セットセンスプライマー
「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ－，Ｂａｒｂａｓ　Ｂｕｒｔｏｎ　Ｓｃｏｔｔ　Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ」　ＰＲＯＴＯＣＯＬ　９．５（非特許文献１１）を参考にＳｅｎｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　１７種、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　３種を合成した。
ＶＫセンスプライマー（ＦＲ１部分、下記１７プライマーの混合物）
５'-ＧＡＹＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ-３'（縮重度２）：配列番号５
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＷＣＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度４）：配列番号６
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＭＡＣＴＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号７
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＹＴＲＡＣＡＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号８
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＲＡＴＧＡＣＭＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号９
５'-ＧＡＹＡＴＴＭＡＧＡＴＲＡＭＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１０
５'-ＧＡＹＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＹＤＣＡＧＴＣ-３'（縮重度１２）：配列番号１１
５'-ＧＡＹＡＴＹＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ-３'（縮重度４）：配列番号１２
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＷＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度４）：配列番号１３
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＷＧＣＴＳＡＣＣＣＡＡＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号１４
５'-ＧＡＹＡＴＴＳＴＲＡＴＧＡＣＣＣＡＲＴＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１５
５'-ＧＡＹＲＴＴＫＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＲＡＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１６
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＧＫＣ-３'（縮重度１２）：配列番号１７
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＹＣＡＧＧＡ-３'（縮重度４）：配列番号１８
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＷＴ-３'（縮重度４）：配列番号１９
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣ-３'（縮重度２）：配列番号２０
５'-ＧＡＹＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ-３'（縮重度２）：配列番号２１
Ｊアンチセンス（４セットプライマー）
Ｊ１／Ｊ２アンチセンスプライマー（１）
５'-ＧＧＳＡＣＣＡＡＲＣＴＧＧＡＡＡＴＭＡＡＡ-３'（縮重度：８）：配列番号２２
Ｊ４アンチセンスプライマー（２）
５'-ＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ-３'：配列番号２３
Ｊ５アンチセンスプライマー（３）
５'-ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ-３'：配列番号２４
Ｊ１／Ｊ２，Ｊ４，Ｊ５アンチセンスプライマー混合物（４）
（２）マウス軽鎖可変域クローニング７セットプライマー
　ＶＫセンスプライマー（シグナルペプチド部分、ノバジェン社のマウスＩｇ－プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６９８３１－３）を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変）
Ａセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＲＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＹＣＡＧＧＴＣＴＴＴ-３'：配列番号２５
Ｂセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ-３'：配列番号２６
Ｃセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＧＡＧＷＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＳＣＴＧＹＴＡＴＧＧＧＴ-３'：配列番号２７
Ｄセットセンスプライマー（下記２プライマーの混合物）
５'-ＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴ-３'：配列番号２８
５'-ＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ-３'：配列番号２９
Ｅセットセンスプライマー（下記３プライマーの混合物）
５'-ＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＹＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴ-３'：配列番号３０
５'-ＡＴＧＴＧＧＧＧＡＹＣＧＫＴＴＴＹＡＭＭＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧ-３'：配列番号３１
５'-ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣ-３'：配列番号３２
Ｆセットセンスプライマー（下記４プライマーの混合物）
５'-ＡＴＧＡＧＩＭＭＫＴＣＩＭＴＴＣＡＩＴＴＣＹＴＧＧＧ-３'：配列番号３３
５'-ＡＴＧＡＫＧＴＨＣＹＣＩＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＩＲＧ-３'：配列番号３４
５'-ＡＴＧＧＴＲＴＣＣＷＣＡＳＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ-３'：配列番号３５
５'-ＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴ-３'：配列番号３６
Ｇセットセンスプライマー（下記４プライマーの混合物）
５'-ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴ-３'：配列番号３７
５'-ＡＴＧＧＡＴＴＴＷＣＡＲＧＴＧＣＡＧＡＴＴＷＴＣＡＧＣＴＴ-３'：配列番号３８
５'-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧ-３'：配列番号３９
５'-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＴＲＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧ-３'：配列番号４０
ＫＶＬアンチセンスプライマー
５'-ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ-３'：配列番号４１
Ｂ．マウス重鎖可変領域コード遺伝子のＰＣＲプライマー
　５’末端においてマウス重鎖シグナル部分（４セットプライマー）と相同性を有するプライマーと３’末端においてＫＣ部分と相同性を有するプライマー、あるいは５’末端においてＦＲ１部分と相同性を有する１セットのプライマーと３’末端においてマウス重鎖の定常領域（ＩＧＨＣ）と相同性を有する２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリン重鎖可変域ＤＮＡを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
（３）マウス重鎖可変域クローニングプライマー
　ＶＨセンスプライマー（シグナル部分：４セットプライマー、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．），　Ｕｎｉｔ　２．１２　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，　ａｎｄ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｖ　ＲｅｇｉｏｎｓのＴａｂｌｅ　２．１２．２を参考にした）。
５'-ＡＴＧＧＲＡＴＧＳＡＧＣＴＧＫＧＴＭＡＴＳＣＴＣＴＴ-３'（縮重度：３２）：配列番号４２
５'-ＡＴＧＲＡＣＴＴＣＧＧＧＹＴＧＡＧＣＴＫＧＧＴＴＴＴ-３'（縮重度：８）：配列番号４３
５'-ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴ-３'：配列番号４４
５'-ＡＴＧＧＲＣＡＧＲＣＴＴＡＣＷＴＹＹ-３'（縮重度：３２）：配列番号４５
（４）　マウス重鎖可変域クローニングプライマー
　ＶＨセンスプライマー（ＦＲ１部分、Ｔａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１６９，ｐ１１１９（２００２）（非特許文献１４）のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした）。
５'-ＳＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＫＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ-３'（縮重度：２５６）：配列番号４６
　ＶＨアンチセンスプライマー（（３），（４）に共通のアンチセンスプライマー、マウスＩｇＧすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした）。
５'-ＣＡＳＣＣＣＣＡＴＣＤＧＴＣＴＡＴＣＣ-３'（縮重度：６）：配列番号４７
実施例９：抗ＣＤＨ３マウス抗体の可変領域の配列決定
　ＤＮＡ　Ｅｎｇｉｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いたＰＣＲ法により抗ＣＤＨ３マウス抗体軽鎖、重鎖それぞれの可変領域を実施例８に示したプライマーを用いて増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントはサブクローニングベクターｐＧＥＭ（プロメガ社）に組み込んで、このベクターのＴ７，ＳＰ６ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。
　これにより配列決定された受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６であるマウスハイブリドーマに由来する抗ＣＤＨ３マウス抗体（抗体番号：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍ）の可変領域のうち、ＣＤＲに相当するアミノ酸配列を以下に示す。
ＳＬＴＳＹＧＶＨ：配列番号５６（ＣＤＲ－Ｈ１）
ＧＶＩＷＳＧＧＳＴＤ：配列番号５７（ＣＤＲ－Ｈ２）
ＡＲＮＳＮＮＧＦＡＹ：配列番号５８（ＣＤＲ－Ｈ３）
ＮＩＹＳＮＬＡ：配列番号５９（ＣＤＲ－Ｌ１）
ＬＬＶＹＡＡＫＮ：配列番号６０（ＣＤＲ－Ｌ２）
ＱＨＦＹＤＴＰＷＴ：配列番号６１（ＣＤＲ－Ｌ３）
　なお、ＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２及びＨ３はそれぞれ各抗体重鎖を、ＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ各抗体軽鎖を構成するＣＤＲ配列を表す。
　両抗体の軽鎖、および重鎖可変域の塩基配列はＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｍｏｕｓｅＩｇ）で検索して、確かに抗体遺伝子がクローニングできていることを確認した。
実施例１０：抗ＣＤＨ３抗体の一過性発現ベクターの作製
　クローニングされた抗ＣＤＨ３マウス抗体の軽鎖及び重鎖のＶ領域をコードする遺伝子は、キメラ軽鎖発現ベクターにはヒトＣｋ領域をコードする遺伝子を、キメラ重鎖発現ベクターにはヒトＣｇ１領域をコードする遺伝子をそれぞれ接続した遺伝子を設計し、これら軽鎖、重鎖キメラ抗体遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって全長人工合成した。両端には制限酵素部位（５’側にＮｈｅＩ，３’側にＥｃｏＲＩ）を付加した。
　これにより、キメラ化抗体発現ベクターに供するため、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６を有する細胞由来の抗ＣＤＨ３キメラ化抗体（以下、抗体番号ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃとする。重鎖及び軽鎖可変領域配列がＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍと同じ）が合成された。
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６を有する細胞は、２０１３年２月１３日に独立行政法人　製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託されている（国際寄託への移管請求は、２０１４年１月２４日：受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－１５３６）。
　ヒト化に際しては、ＦＲに相当する領域をヒトに由来したＦＲ配列に入れ替え、同様に全長人工合成した。ＦＲに相当する領域のアミノ酸配列は、ヒトコンセンサスフレーム配列（配列番号６２～６９）あるいは生殖系列フレーム配列（配列番号７２～７９）を用いた。生殖系列フレーム配列はクローニングされた抗ＣＤＨ３マウス抗体の塩基配列をＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎＩｇ）に入力し、最も類似度の高い配列を選択して設計した。また、親和性低下に対応したアミノ酸配列の置換（ｒｅｓｈａｐｅ）も実施した。
　今回用いた抗ＣＤＨ３ヒト化抗体の重鎖あるいは軽鎖可変領域のアミノ酸配列を以下に示した。
　抗体番号ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈａ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｃ、およびＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄは、抗体番号ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍと同じＣＤＲ配列を持つ。
　抗体番号ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈａ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂは、ＦＲにヒトコンセンサスフレームワーク配列を用い、抗体番号ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｃ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄは、ＦＲに由来としたマウス抗体に最も類似したヒト生殖系列配列を用いている。また、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄは、付記したようなアミノ酸配列の置換を導入している。
抗体番号；ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈａ（配列番号４８を重鎖可変領域、配列番号４９を軽鎖可変領域に持つ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＳＮＮＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ：配列番号４８（重鎖可変領域）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＩＹＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＹＡＡＫＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＦＹＤＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ：配列番号４９（軽鎖可変領域）
抗体番号；ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ（配列番号５０を重鎖可変領域、配列番号５１を軽鎖可変領域に持つ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＳＮＮＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ：配列番号５０（重鎖可変領域）
（配列番号４８に対してＧ４９Ａ、Ｒ７１Ｋ、Ｌ７８Ｖが置換されている）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＩＹＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＹＡＡＫＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＦＹＤＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ：配列番号５１（軽鎖可変領域）
（配列番号４９に対してＱ５５Ａが置換されている）
抗体番号；ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｃ（配列番号５２を重鎖可変領域、配列番号５３を軽鎖可変領域に持つ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＳＮＮＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ：配列番号５２（重鎖可変領域）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＩＹＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＹＡＡＫＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＦＹＤＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ：配列番号５３（軽鎖可変領域）
抗体番号；ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ（配列番号５４を重鎖可変領域、配列番号５５を軽鎖可変領域に持つ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＳＮＮＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ：配列番号５４（重鎖可変領域）
（配列番号５２に対してＲ７１Ｋ、Ｌ７８Ｖが置換されている）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＩＹＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＹＡＡＫＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＦＹＤＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ：配列番号５５（軽鎖可変領域）
（配列番号５３に対してＥ５５Ａが置換されている）
　アミノ酸配列変換後にこれらの配列を持つように設計した人工合成遺伝子を、ヒトＩｇＧ１由来の定常領域の遺伝子が組み込まれたｐＣＸＮ３ベクターに重鎖可変領域の遺伝子を、ヒトκ鎖由来の定常領域の遺伝子が組み込まれたｐＣＸＮ３ベクターに軽鎖可変領域の遺伝子をそれぞれ挿入した発現ベクターを構築し、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体（またはキメラ化抗体）の軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターを得た。
実施例１１：抗ＣＤＨ３抗体の一過性発現と精製
（１）抗ＣＤＨ３抗体の一過性発現
　抗ＣＤＨ３抗体の一過性発現にはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（ライフテクノロジーズ社）を用いた。遺伝子導入用浮遊細胞である２９３－Ｆ（ライフテクノロジーズ社）は前日に継代した。トランスフェクション当日、一種類の抗体発現には、１ｘ１０6細胞／ｍＬの細胞濃度に調製した４００ｍＬの細胞懸濁液を準備した。これに抗体重鎖発現ベクター１００μｇ及び軽鎖発現ベクター１００μｇの合計２００μｇのプラスミドをＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭに懸濁した溶液（Ｉ）を調製した。次に２００μＬのＭＡＸ　ｒｅａｇｅｎｔを８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭに加えて溶液（ＩＩ）とした。溶液（Ｉ）と溶液（ＩＩ）を混合して室温で１０分から２０分静置した。この合計１６ｍＬの反応液を２９３－Ｆ細胞を懸濁した４００ｍＬの２９３発現培地に加え、６日から７日間３７℃、８％ＣＯ2で細胞培養震盪機ＴＡＩＴＥＣ　ＢｉｏＳｈａｋｅｒ　ＢＲ-４３ＦＬで培養した。６日から７日間後、それぞれの組換え抗体を含む培養上清を回収し、これを用いて精製をおこなった。
（２）抗ＣＤＨ３抗体の精製
　培養上清に含まれるＩｇＧ抗体タンパク質は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いたＡｂ-Ｃａｐｃｈｅｒ　ＥｘＴｒａ（プロテノバ）アフィニティーカラムで精製した。得られたピークフラクションは、溶媒としてダルベッコのＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ-３００カラムによるゲルろ過をして、さらに精製した。精製したＩｇＧ抗体タンパク質の定量は、吸光係数を用いて算出した。ＩｇＧ抗体の吸光係数はＥＸＰＡＳＹのＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）に各抗体の全アミノ酸配列を用いて計算して求めた。
実施例１２：酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による抗体の定量
　遺伝子導入したＣＨＯ細胞の培養上清をＥＬＩＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：ＡＱＩ，　Ｃａｔ　Ａ－１１０ＵＤ）でコートした。ブロックした後、抗ＣＤＨ３キメラ抗体産生ＣＨＯ細胞からの培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）－ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ－１１０ＰＤ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＴＭＢ発色液（エア・ブラウン社、Ｃａｔ．ＴＭ４９９９）を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧを用いた。
実施例１３：抗体の結合活性
　実施例１０に示した配列を持つ抗体は、その結合活性をフローサイトメトリで評価した。
　反応対象となる細胞株（ＣＤＨ３の高発現が確認されているＮＣＩ－Ｈ３５８細胞株）を２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、精製したキメラ抗体を１０μｇ／ｍＬになるように添加し、４℃で６０分間反応させた。ＦＡＣＳ溶液（１５０μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ヒトＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）2（インビトロジェン社）４μｇ／ｍｌを加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施した。
　その結果、ヒト化を実施した抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈａ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｃ）はＣＤＨ３発現癌細胞株（ＮＣＩ-Ｈ３５８）で弱い反応が認められた。更にＲｅｓｈａｐｅを施した抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ）ではＮＣＩ-Ｈ３５８に対し、強い反応性が認められた（図５Ａ）。また、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄは、ＣＨＯ細胞には反応しないが、ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞においてはＮＣＩ-Ｈ３５８細胞株と同じく反応が認められた（図５Ｂ、Ｃ）。
　ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍに由来したマウス抗体のヒト化は、ＣＤＲ配列として規定した配列と、コンセンサスあるいはヒト生殖系列に由来したフレーム配列との組み合わせによって、不十分ながら結合活性を示す抗体を得たことから、ここで規定したＣＤＲ配列は妥当なものであると推定される。なお、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍに由来したヒト化抗体はＲｅｓｈａｐｅを実施することで結合活性が回復することから、いずれかのアミノ酸残基が構造維持に重要な役割を果たしていることが支持される。
実施例１４：薬剤の合成
　ＤＭ１ＳＭｅは、米国特許第５，２０８，０２０号（特許文献１０）および米国特許６，３３３，４１０Ｂ１号（特許文献１１）に記載されたように調製した。合成は株式会社シンスタージャパンに委託した。その構造式を図６に示す。
実施例１５：薬剤結合抗体の調製
１．結合薬剤の還元処理
　エタノール３００μＬで溶解した０．７８ｍｇのＤＭ１ＳＭｅと５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１８０μＬ及びＴＣＥＰ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｎｄ　Ｂｒｅａｋｅｒ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）２０μＬを混合し、窒素雰囲気下、室温で３０分以上反応させ、薬剤を還元した。
　還元薬剤はＨＰＬＣを使用して精製した後に溶媒を留去し、１０ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルアセトアミドに溶解した。
２．マレイミド化抗体の調製
　１ｍｇ／ｍＬ抗体にモル比３０倍過剰となる量のｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（ＰＩＥＲＣＥ社）を加え、３０℃、１時間反応させた。
　過剰な架橋剤を除くため、５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で平衡化した脱塩カラムで脱塩処理（ＺｅｂａＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ、　サーモフィッシャーサイエンティフィック社）した。
３．薬剤による抗体の修飾
　１ｍｇ／ｍＬのマレイミド化した抗体と、結合したマレイミド基数の１．７倍に相当する還元薬剤とを５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で、室温にて一晩反応させた。その後、過剰な薬剤をゲルろ過操作により除いた。
実施例１６：抗体薬剤結合量の定量
　抗体当たりの薬剤結合数は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度を測定することで決定した。決定方法は（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９，４３９２－４４０８（２００６））（非特許文献１２）、及びＭｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５、ｐ４４５－６７（２００９）（非特許文献２１））に記載の方法を参考に、吸光係数も記載の値（εAb280=223,000M-1cm-1, εAb252=82,510M-1cm-1, εDM1280=5,180M-1cm-1, εDM1252=26,160M-1cm-1）を用いて行った。
実施例１７：細胞障害試験
　薬剤結合抗体の細胞傷害性と特異性はＷＳＴ－８を発色基質とした細胞増殖測定試薬（同仁化学研究所社，Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ－８）を使用して評価した。
　即ち、各種癌細胞株とヒト化抗体薬剤コンジュゲートを任意の量共存させ、３７℃で３日間、５％ＣＯ2環境下でインキュベートした。培地はＦＢＳを添加した各細胞株所定のものとした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後、Ａ４５０／６２０の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を１００％としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した。
　図７Ａでは、細胞株としてＮＣＩ－Ｈ３５８、抗体薬剤コンジュゲートとしてＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ及びＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤を結合したものを用いた。両抗体の薬剤コンジュゲートともに細胞傷害性を示した。
　図７Ｂでは、細胞株としてＨＣＣ１９５４、抗体薬剤コンジュゲートとしてＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤を結合したものを用い、図７Ｃでは細胞株としてＨＣＣ７０、抗体薬剤コンジュゲートとしてＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤を結合したものを用いた。両細胞株ともにＣＤＨ３が発現するため、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄの薬剤コンジュゲートは細胞傷害性を示す。
　図７Ｄでは、細胞株は表１に記したものを用い、抗体薬剤コンジュゲートとして、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄに薬剤を結合したものを用いた。薬剤は、それぞれ実施例１５に記載した方法で結合した。表１に記した細胞株のｍＲＮＡシグナル値は公開データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｂｉｇ－ｓｔａｇｅ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃａＡｒｒａｙ＿ＧＳＫｄａｔａ／）から平均値を取得し、シグナルの小さなもの（ＮＣＩＨ１９３０，　ＳＷ９６２）はＣＤＨ３発現陰性対照として試験した。ＣＤＨ３が発現する細胞株は癌腫に関わらず、細胞増殖が阻害された。
　いずれの薬剤コンジュゲートもＤＡＲは３～４のものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例１８：ヒト化抗体を用いたＨＣＣ１９５４担癌動物試験
　ヒト化抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、及びＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ）の抗体薬剤コンジュゲートによる腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４を移植したゼノグラフトモデルで確認した。
　実施例１６の方法で定量した両抗体薬剤コンジュゲートの薬剤結合数（ＤＡＲ）は、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ（ＤＡＲ３．６９）、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ（ＤＡＲ３．５１）であった。
　担癌は、まず抗アシアロＧＭ１抗体（ＷＡＫＯ　０１４－０９８０１）を、大塚蒸留水１ｍＬで溶解後、大塚生理食塩水４ｍＬを加えて全量５ｍＬとした後、この溶液をマウス１匹あたり１００ｕＬ腹腔内に投与した。次にＨＣＣ１９５４は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、日本クレア）の右腹側部皮下に５ｘ１０6個／マウスになるように移植した　　　　。
試験は各群５匹とし、５ｍｇ／ｋｇで週に１度、計２回尾静脈より投与を行なった。
 腫瘍体積を測定した結果を図８に示す。図８に示す通りヒト化抗体による抗体薬剤コンジュゲートは高い抗腫瘍効果を示した。
実施例１９：ヒト化抗体を用いたＨＣＣ７０担癌動物試験（１）
　ヒト化抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ）とキメラ化抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃ）の抗体薬剤コンジュゲートによる腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株ＨＣＣ７０を移植したゼノグラフトモデルにて確認した。
　両抗体薬剤コンジュゲートのＤＡＲは、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ（ＤＡＲ２．９０）、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃ（ＤＡＲ３．０７）であった。
　担癌は、抗アシアロＧＭ１抗体（ＷＡＫＯ　０１４－０９８０１）を、大塚蒸留水１ｍＬで溶解後、大塚生理食塩水４ｍＬを加えて全量５ｍＬとした後、この溶液をマウス１匹あたり１００ｕＬ腹腔内に投与した。次にＨＣＣ７０は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ６４０培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、日本クレア）の右腹側部皮下に５ｘ１０6個／マウスになるように移植した。
　試験は各群５匹とし、ヒト化抗体コンジュゲートは０．６、３．０あるいは１５ｍｇ／ｋｇ、キメラ化抗体コンジュゲートは３．０ｍｇ／ｋｇ、薬剤非結合のヒト化抗体（Ｎａｋｅｄ）は１５ｍｇ／ｋｇの各用量で週に１度、計２回投与を行なった。腫瘍体積を測定した結果を図９に示す。図９に示す通り、ヒト化抗体による抗体薬剤コンジュゲートは、キメラ化抗体による抗体薬剤コンジュゲートに比して高い抗腫瘍効果が繰り返し示された。
実施例２０：ヒト化抗体を用いたＨＣＣ７０担癌動物試験（２）
　ヒト化抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ）とキメラ化抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃ）の抗体薬剤コンジュゲートによる腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株ＨＣＣ７０を移植したゼノグラフトモデルにて確認した。
　担癌は実施例１９と同様に行ない、ヒト化抗体コンジュゲートは０．６、３．０あるいは１５ｍｇ／ｋｇ、キメラ化抗体コンジュゲートは３．０ｍｇ／ｋｇ、薬剤非結合のヒト化抗体（Ｎａｋｅｄ）は１５ｍｇ／ｋｇの各用量で週に１度、計２回尾静脈より投与を行なった。試験は各群５匹とした。両抗体薬剤コンジュゲートのＤＡＲは、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃ（ＤＡＲ３．０７）、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ（ＤＡＲ２．９８）だった。
　腫瘍体積を測定した結果を図１０に示す。図１０に示した通り、ヒト化抗体は薬剤を結合する事で高い抗腫瘍効果を示し、用量に依存した抗腫瘍効果が確認された。また同じ投与量（３．０ｍｇ／ｋｇ）においては、実施例１９と同様にキメラ化抗体の抗体薬剤コンジュゲートに比して高い抗腫瘍効果が再度示された。
実施例２１：ヒト化抗体を用いたＯＫａ－Ｃ－１担癌動物試験
　本願発明の抗体薬剤コンジュゲートの腫瘍増殖抑制能を、肺がん細胞株ＯＫａ－Ｃ－１（独立行政法人医薬基盤研究所、ＪＣＲＢ１３４３）を移植したゼノグラフトモデルで確認した。担癌は、ＯＫａ－Ｃ－１を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、日本クレア）の右腹側部皮下に６．５ｘ１０6個／マウスになるように移植した。ヒト化抗体コンジュゲートは１５ｍｇ／ｋｇの用量で週に１度、計２回尾静脈より投与を行なった。試験は各群３匹とした。ここではヒト化抗体としてＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄを使用し、それぞれに実施例１５に記載した方法で薬剤を結合した。各抗体分子当たりの平均薬剤結合数（ＤＡＲ）を実施例１６に記載した方法で定量したところ、ＤＡＲは３．０４だった。腫瘍体積を測定した結果を図１１に示す。図１１に示した通り、ヒト化抗体は薬剤を結合する事で、乳癌細胞株に対するものと同様に高い抗腫瘍効果が確認された。
実施例２２：ＣＤＨ３Ｎ末部分長タンパク質の発現
（１）ＣＤＨ３Ｎ末部分長タンパク質の発現ベクター作製
　取得したＣＤＨ３抗体の反応性を確認するため、ＣＤＨ３抗原のＮ末端領域をマウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分と連結した融合蛋白質を調製した。融合タンパク質のｃＤＮＡ配列は配列番号７０、アミノ酸配列は配列番号７１に記載した。シグナルペプチドは抗体κ鎖のものを使用し、サブクローニングのために制限酵素部位を５プライム側にＮｈｅＩを、３プライム側にＥｃｏＲＩ部位を付加した（米ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で合成）。これをＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで消化した哺乳類用発現ベクターのｐＣＡＧＧＳ、あるいは遺伝子増幅用にマウスＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだｐＣＡＧＧＳ－ＤＨＦＲに組み込んだ。
（２）　ＣＤＨ３Ｎ末部分長タンパク質の発現と精製
　一過性発現はライフテクノロジー社のフリースタイルを用いた。生産細胞にはライフテクノロジー社の２９３Ｆを使用し、遺伝子導入試薬はフリースタイル・マックス・トランスフェクション試薬（ライフテクノロジー社）を用いた。Ｆｃ融合可溶性抗原の遺伝子を導入した２９３Ｆは、ＣＯ2濃度を制御できるタイテック製の震盪機で４～７日間培養して生産した。生産した融合蛋白質はプロテインＡセファロース（プロテノバ社）カラムで精製した。一過性発現で発現・精製した抗原のＣＢＢ染色図を図１２Ａに示し、図１２Ｂに市販ＣＤＨ３抗体（ＢＤ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社、及びＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１次抗体として用いた染色像を示す。２次標識抗体にはＡｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２-ＨＲＰ（ｇｏａｔ　ＩｇＧ）（ＣＡＰＰＥＬ　＃５５５５３）を用いた。
実施例２３：ＣＤＨ３Ｎ末部分長タンパク質固相ＥＬＩＳＡ
　ＣＤＨ３Ｎ末部分長タンパク質をＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬとし、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで分注して、４℃で一晩静置した。翌日、ウェル内の溶液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ：　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／１５０ｍＭ　ＮａＣｌ／１ｍＭ　ＣａＣｌ2／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　（ｐＨ７．５）で洗浄した。次に被検物質（抗ＣＤＨ３抗体）を希釈系列を作って１００μＬ／ウェルで分注し、室温１時間震盪した。溶液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ　Ａで洗浄した後、ＨＲＰ標識抗体（ＨＲＰ－ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　（ａｂｓｏｒｂｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｏｕｓｅ，　ｒａｂｂｉｔ，ｂｏｖｉｎｅ　ＩｇＧ）　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　ｃａｔ．　Ａ－１１０ＰＤ））をｂｕｆｆｅｒＡで１０，０００倍希釈したものを調製し、１００μＬ／ウェルで分注し、室温１時間震盪した。Ｂｕｆｆｅｒ　Ａで洗浄した後、ＴＭＢ発色液を１００μＬ／ウェルで加え、暗所で１５分静置して発色を行った。停止液を１００μＬ／ウェルで加えた後、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１３に示す。披検物質としてＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、及びＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄを用いた。
実施例２４：Ａｌｅｘａ４８８標識抗体の作製
　標識に用いる抗体を標識用緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，　０．５Ｍ　ＮａＣｌ　ｐＨ８．５）に置換する。抗体１ｍｇに対し、２５ｍＭ　　Ａｌｅｘａ４８８（１ｍｇをＤＭＦ６２．１μｌに溶解，　ライフテクノロジー社）０．５μｌを添加して、遮光下室温で１時間静置する。その後、ＰＢＳに緩衝液を交換した。
実施例２５：抗体親和性比較試験（１）
　ヒト化が親和性に及ぼす影響をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いた競合試験で確かめた。測定は希釈系列を作った被験抗体、ＣＤＨ３が発現している細胞株、及び被験抗体と競合する一定量のＡｍａｘａ４８８標識抗体を共存させて、室温１時間反応、ＦＡＣＳ用液で洗浄後、ＦＡＣＳ測定を行なった。各抗体濃度のＧＥＯ　Ｍｅａｎ値から、競合抗体のみのＧＥＯ　Ｍｅａｎ値を１００％とした場合の阻害率を算出してＩＣ５０を求め、これを親和性の指標とした。
　被験抗体と競合する抗体として、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８９細胞産生物から精製したマウス抗体を実施例２４の方法で標識し、被験抗体としてＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｃ、及びＰＰＡＴ－０７６－４４Ｍを用いた。その結果を図１４に示す。被験抗体は全てＡｌｅｘａ４８８標識抗体と競合するがその度合いが異なり、マウス及びキメラ化抗体に比して、本願のヒト化抗体（ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ）の親和性度合いが向上している事が示された。
実施例２６：抗体親和性比較試験（２）
　本願発明のヒト化抗体に結合した平均薬剤結合数（ＤＡＲ）が親和性に及ぼす影響を実施例２５と同じくＦＡＣＳを用いた競合試験で確かめた。抗体薬剤コンジュゲートは、実施例１５に記載した方法で、平均ＤＡＲ０～８の範囲で調製した。ＤＡＲは実施例１６に記載した方法で定量した。
　細胞株はＮＣＩ－Ｈ３５８を用い、ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ及びＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄを測定する時は、競合抗体として実施例２４の手順でＡｌｅｘａ４８８を標識したＮＩＴＥ　ＢＰ－９８９細胞産生物から精製したマウス抗体を用い、実施例２５で示したのと同じＦＡＣＳ競合試験により、親和性の指標として各ＩＣ５０値を算出した。
　図１５（Ａ：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｂ、Ｂ：ＰＰＡＴ－０７６－４４Ｈｄ）に示した比較は、薬剤を結合していない各抗体のＩＣ５０値を１とした相対値を表している。いずれのヒト化抗体も薬剤が結合する事で親和性は低下しない事を示している。
実施例２７：担癌モデル株のＣＤＨ３発現確認
　担癌モデル株のＣＤＨ３タンパク質の発現を確認するため、担癌組織切片の免疫染色を行った。マウス皮下に細胞株を移植して所定日数経過させた担癌マウスから得た腫瘍組織を脱パラフィン処理し、オートクレーブで１２１℃、１５分賦活化を行った。０．３％　Ｈ2Ｏ2を含むメタノールにて内在性ペルオキシダーゼの不活性化、１０％ヤギ血清でブロッキング処理後、抗ＣＤＨ３抗体６１０２２７（ＢＤ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）に４℃一晩反応させた。抗体溶液を洗い流した後に、ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ二次抗体試薬と室温１時間反応させた。ヒストファインＤＡＢ基質キットを添付プロトコールのとおり使ってＤＡＢ発色を行い、ヘマトキシリンエオジン溶液にて核染色を行った。図１６（Ａ：ＨＣＣ１９５４、Ｂ：ＨＣＣ７０、Ｃ：ＯＫａ－Ｃ－１）に結果を示す。担癌腫瘍は細胞膜部分が抗ＣＤＨ３抗体で染色された。

Claims (38)

  1. 受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６を有する細胞が産生する抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域配列（ＣＤＲ-Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及び軽鎖可変領域由来の相補性決定領域配列（ＣＤＲ-Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含み、かつフレームワーク領域配列が重鎖可変領域が重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列であり、軽鎖可変領域が軽鎖ヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  2. 重鎖可変領域の相補性決定領域配列が配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８であり、軽鎖可変領域の相補性決定領域配列が配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１を含み、かつフレームワーク領域配列が重鎖可変領域が重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列であり、軽鎖可変領域が軽鎖ヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  3. 受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１５３６を有する細胞が産生する抗体の重鎖可変領域由来の相補性決定領域配列（ＣＤＲ-Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及び軽鎖可変領域由来の相補性決定領域配列（ＣＤＲ-Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含み、かつフレームワーク領域配列が最適なアライメントのもとで選択されたヒトの生殖系列に由来する配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  4. 重鎖可変領域の相補性決定領域配列が配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８であり、軽鎖可変領域の相補性決定領域配列が配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１を含み、かつフレームワーク領域配列が最適なアライメントのもとで選択されたヒトの生殖系列に由来する配列を含有してなる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  5. 請求項１から４のいずれか１項に記載した抗ＣＤＨ３ヒト化抗体との配列相同性が少なくとも９０％以上であり、かつＣＤＨ３を認識できる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  6. 請求項１から４のいずれか１項に記載した抗体のフレームワーク領域部分における１から数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換しており、かつＣＤＨ３を認識できる、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  7. 請求項１から４のいずれか１項に記載した抗体の相補性決定領域配列のうちフレームワーク領域との境界における１から数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換しており、かつＣＤＨ３を認識できる抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  8. 置換されるアミノ酸が軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる５５位のアミノ酸である、請求項６に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  9. 置換されるアミノ酸が重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる７１位、及び７８位のアミノ酸から選ばれる１つ以上である、請求項６に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  10. 置換されるアミノ酸が重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる４９位のアミノ酸である、請求項７に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  11. 軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる５５位のアミノ酸がアラニンに置換している、請求項６に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  12. 重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる７１位のアミノ酸がリジンに置換している、請求項６に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  13. 重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる７８位のアミノ酸がバリンに置換している、請求項６に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  14. 重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる４９位のアミノ酸がアラニンに置換している、請求項７に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  15. 重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる４９位のアミノ酸残基のアラニンへの置換、７１位のアミノ酸残基のリジンへの置換、７８位のアミノ酸残基のバリンへの置換、及び軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる５５位のアミノ酸残基のアラニンへの置換から選択される１以上の置換を有する、請求項１又は２に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  16. 重鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる７１位のアミノ酸残基のリジンへの置換、７８位のアミノ酸残基のバリンへの置換、及び軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔナンバリングによる５５位のアミノ酸残基のアラニンへの置換から選択される１以上の置換を有する、請求項３又は４に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  17. 以下の何れかの抗体。
    （１）重鎖可変領域に配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域に配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；
    （２）重鎖可変領域に配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域に配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；
    （３）重鎖可変領域に配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域に配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；及び
    （４）重鎖可変領域に配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域に配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体：
  18. ＣＤＨ３との結合能を有する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体の断片。
  19. Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2、又はｓｃＦｖである、請求項１８に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体の断片。
  20. ＣＤＨ３との結合能を有する、請求項１から１９のいずれか１項に記載した抗体の部分配列。
  21. ＣＤＨ３がヒトＣＤＨ３である、請求項１から１７のいずれか１項に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  22. ＣＤＨ３が配列番号２の細胞外領域である、請求項１から１７のいずれか１項に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  23. 請求項１から２２のいずれか１項に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤又は放射性物質とが連結している、免疫複合体。
  24. 化学療法剤が、細胞障害性物質である、請求項２３に記載の免疫複合体。
  25. 細胞傷害性物質が、メイタンシノイド又はその誘導体、あるいはアウリスタチン又はその誘導体である、請求項２４に記載の免疫複合体。
  26. 細胞傷害性物質が、ＤＭ１、ＤＭ３又はＤＭ４から選択されるメイタンシノイド又はその誘導体、あるいはＭＭＡＥあるいはＭＭＡＦから選択されるアウリスタチン又はその誘導体である、請求項２４に記載の免疫複合体。
  27. 抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列１分子あたり平均１～７個のＤＭ１が結合している、請求項２４に記載の免疫複合体。
  28. 抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤とがリンカーを介して連結している、請求項２３から２７の何れか１項に記載の免疫複合体。
  29. 抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤とが、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合を介して連結しているか、又は抗体のＦｃ領域を遺伝子工学的に改変して連結しいる、請求項２３から２７の何れか１項に記載の免疫複合体。
  30. リンカーが、２価反応性架橋試薬である、請求項２８に記載の免疫複合体。
  31. リンカーが、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）　（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－イオド－アセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボンイル（ＰＡＢ）、及びＮ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）から成る群より選択される請求項２８に記載の免疫複合体。
  32. リンカーがプロテアーゼによって切断される、請求項２８に記載の免疫複合体。
  33. リンカーが、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）、及びパラアミノベンゾイック酸（ＰＡＢＡ）の少なくとも１以上を含む、請求項２８に記載の免疫複合体。
  34. 細胞傷害性能が抗体可変領域のフレームワーク領域配列のヒト化によって増強されている、請求項２３に記載の免疫複合体。
  35. 請求項２３から３４の何れか１項に記載の免疫複合体を含む、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療するための医薬。
  36. ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患が癌である、請求項３５に記載の医薬。
  37. 癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される、請求項３６に記載の医薬。
  38. 抗腫瘍剤として使用する、請求項３５から３７の何れか１項に記載の医薬。
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