ES2755732T3 - Anticuerpos anti IL-36R - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: a) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. nº: 80; y b) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. nº: 87, Id. de Sec. nº: 88 o Id. de Sec. nº: 89.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti IL-36R
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha enviado en formato ASCII a través de EFS-Web y se incorpora por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 12 de noviembre de 2012, se llama 09-0583wO.txt y tiene un tamaño de 147.390 bytes.
Campo técnico de la invención
Esta invención generalmente se refiere a anticuerpos anti-IL-36R para uso diagnóstico y terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse en composiciones farmacéuticas y kits que comprenden tales compuestos. Los anticuerpos son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos, por ejemplo, enfermedades inmunológicas, inflamatorias, autoinmunes, fibróticas y respiratorias en humanos.
Antecedentes de la invención
La familia de citocinas IL-1 está compuesta por 11 ligandos diferentes, a saber, IL-1a (también denominado IL-1F1), IL-ip (IL-1F2), antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra o IL-1 F3), IL-18 (IL-1F4), IL-1F5 a IL-1F10 e IL-1 F11 (o IL-33). Se sabe que IL-1a e IL-1p inducen actividades proinflamatorias al unirse al receptor de IL-1 tipo I (IL-1RI) y al reclutamiento del co-receptor común la proteína accesoria del receptor de IL-1 (IL-1RAcP), mientras que IL-1Ra actúa como un inhibidor competitivo de la unión de IL-1 a IL-1RI, ejerciendo así actividad antiinflamatoria. Numerosos estudios describieron que IL-18 es una citocina proinflamatoria que es un inductor de IFN-y, mientras que IL-33 se describió como una citocina inmunoreguladora involucrada en particular en el control de las respuestas Th2. Los nuevos miembros de la familia IL-1, incluidos IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8 e IL-1F9, se identificaron mediante búsquedas en bases de datos de ADN de homólogos de IL-1. En humanos y ratones, todos los genes que codifican estas citocinas se asignan a menos de 300 kb del cromosoma 2q, donde están flanqueados por los genes IL1A, IL1B e IL1RN. IL-1 F6, IL-1F8 e IL-1F9 comparten una homología de secuencia de aminoácidos del 21% al 37% con IL-1 e IL-1Ra, mientras que IL-1F5 muestra una homología de secuencia de aminoácidos del 52% con IL-1Ra, lo que sugiere que IL-1F5 podría representar un antagonista del receptor endógeno.
IL-1F6, IL-1F8 e IL-1F9 se unen a IL-1Rrp2, un receptor de la familia IL-1R, y usan IL-1RAcP como co-receptor para estimular señales intracelulares similares a las inducidas por IL-1, mientras que se demostró que IL-1F5 inhibe la activación de NF-kB inducida por IL-1F9 en células Jurkat T que sobreexpresan IL-1Rrp2. Al igual que IL-1p, todos estos homólogos de IL-1 carecen de un péptido líder y no pueden liberarse a través de la vía secretora convencional, aunque los estudios sugieren que la liberación de agonistas de IL-1Rrp2 puede controlarse mediante mecanismos diferentes a los que regulan la secreción de IL-1p. Para reconocer los efectos biológicos específicos de estas citocinas y reconocer que todas se unen al mismo receptor, recientemente se ha propuesto modificar la nomenclatura de los homólogos de IL-1. Por lo tanto, IL-1Rrp2 ahora se denomina IL-36R y sus ligandos se denominan IL-36a (IL-1F6), IL-36p (IL-1F8) e IL-36y (IL-1F9). Además, IL-1F5, que se ha demostrado que ejerce actividades antagonistas del receptor, se ha renombrado como IL-36Ra.
Los ARN mensajeros para IL-36a, IL-36p e IL-36y se expresan altamente en varios tejidos, particularmente en tejidos epiteliales internos, que están expuestos a patógenos y en la piel. Curiosamente, la expresión de IL-36Ra e IL-36a está significativamente regulada por incremento en los queratinocitos humanos estimulados por IL-1p/TNF-a, y el ARNm de IL-36Ra e IL-36y aumenta mucho en la piel con psoriasis lesional. Además, la producción de proteína IL-36y aumenta en los queratinocitos humanos después de la estimulación de TNF-a e IFN-y. La expresión elevada de ARNm de IL-36a y de proteínas también se describió en la enfermedad renal crónica.
Los ratones transgénicos que sobreexpresan IL-36a en queratinocitos presentan lesiones inflamatorias de la piel que comparten algunas características con la psoriasis. Este fenotipo fue más grave cuando los ratones transgénicos se cruzaron con ratones deficientes en IL-36Ra, lo que respalda una función reguladora de IL-36Ra in vivo. La condición inflamatoria de la piel en el transgénico IL-36a específico de queratinocitos es aún más similar a la psoriasis humana si los ratones se tratan con 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol, que se asemeja a la enfermedad humana histológica, molecular y en su respuesta a la terapéutica. Además, la piel con lesión psoriásica humana trasplantada en ratones inmunodeficientes se normaliza cuando los ratones se tratan con anticuerpo anti-IL-36R, argumentando que se requiere el eje IL-36 para mantener el fenotipo lesional en la piel psoriásica humana (Blumberg H. et al., J. Immunol 2010; 185: 4354-4362). Tomados en conjunto, estos datos indican que los ligandos de IL-36R, incluidos IL-36a, IL-36p e IL-36y, ejercen efectos proinflamatorios in vitro e in vivo y que IL-36Ra actúa como un antagonista natural, imitando así al sistema IL-1/IL-1 Ra.
Por lo tanto, existe evidencia de que los ligandos de IL-36R están implicados en una serie de afecciones de la enfermedad, y existe la necesidad de nuevos agentes terapéuticos dirigidos a esta vía, en particular para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
Resumen de la invención
El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención aborda la necesidad anterior proporcionando bioterapéuticos, en particular anticuerpos, que se unen a IL-36R. Los anticuerpos de la presente invención bloquean la señalización mediada por ligando IL36 (a, p y/o y). Además, los anticuerpos de la presente invención son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de la inflamación/fibrosis mediada por el epitelio en enfermedades tales como psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerodermia, EPOC y enfermedad renal crónica.
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80; y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 87; una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80; y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 88; o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80; y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 89.
En un aspecto, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención tiene una alta potencia de unión molecular/celular. En una realización, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención se une al IL-36R humano a una Kd <0,1 nM. En otro aspecto, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención, en particular un anticuerpo anti-IL-36R humanizado, se une al IL-36R humano a una Kd <50 pM. En un aspecto, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención se une a células que expresan IL-36R a una CE90 <5 nM.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención tiene una alta potencia de bloqueo funcional basada en células. En un aspecto, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención bloquea los tres ligandos agonistas de IL-36R (a, p, y) a un CI90 á5 nM, en líneas celulares relevantes para la enfermedad y células primarias.
En un aspecto, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención tiene la potencia de unión molecular/celular y la potencia de bloqueo funcional basada en células establecida anteriormente.
En un aspecto adicional, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención tiene una alta selectividad, por ejemplo, una selectividad mayor de 1000 veces contra las líneas celulares negativas para IL-1R1 o IL-36R humano. En otro aspecto, el anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención no se une a las líneas celulares negativas para IL-1 R1 o IL-36R humano.
En la realización uno, el anticuerpo anti-IL-36R o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une al IL-36R humano a una Kd igual o <0,1 nM.
En la realización dos, el anticuerpo anti-IL-36R o su fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la realización uno es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo.
En la realización tres, el anticuerpo anti-IL-36R o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la realización uno o dos es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo.
En la realización cuatro, el anticuerpo anti-IL-36R o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la realización tres se une a la IL-36R humana a una Kd igual o <50 pM.
En la realización cinco, el anticuerpo anti-IL-36R o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones uno a cuatro no se une a la IL-1R1 humana.
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la realización seis, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:
a) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 26 (L-CDR1); la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 104 (L-CDR2); la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 44 (L-CDR3); y
b) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 53 (H-CDR1); la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 62 (H-CDR2); la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 72 (H-CDR3), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80; y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. n°: 87, 88, 89.
En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80; y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 87, o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80; y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 88; o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80; y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 89.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. n°: 118; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. n°: 125, 126 y 127.
En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 125.
En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 126.
En otra realización más, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 127.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención es un anticuerpo monoclonal. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención es un anticuerpo humanizado. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención es un anticuerpo monoclonal humanizado.
En una realización adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, para uso en medicina.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica de acuerdo con la invención, para uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad respiratoria, de un trastorno metabólico, de un trastorno inflamatorio mediado por el epitelio, fibrosis o cáncer.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con la invención, en donde el uso es para el tratamiento de psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, EPOC, asma crónica o espondilitis anquilosante. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con la invención, en donde el uso es para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
En otra realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la invención, en donde la enfermedad es la enfermedad de Crohn.
Otras realizaciones de la invención incluyen:
- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo anti-IL-36R o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la invención, preferiblemente una secuencia de ADN o ARN;
- un polinucleótido aislado de acuerdo con la invención, que codifica (a) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de Sec. n°: 80, y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de Sec. n°: 87, 88 o 89; o (b) una cadena ligera y una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118 y Id. de Sec. n°: 125, respectivamente; Id. de Sec. n°: 118 y Id. de Sec. n°: 126, respectivamente; o Id. de Sec. n°: 118 y Id. de Sec. n°: 127, respectivamente; - un vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención, preferiblemente un vector de expresión, más preferiblemente un vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con la invención en asociación funcional con una secuencia de control de la expresión;
- una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención y/o un vector de acuerdo con la invención;
- un método para la producción de un anticuerpo anti-IL-36R o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la invención, preferiblemente un método de producción recombinante que comprende el uso de un polinucleótido de acuerdo con la invención, y/o de un vector de acuerdo con la invención y/o de una célula huésped de acuerdo con la invención;
- dicho método comprende preferiblemente los pasos (a) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno y (b) recuperar el anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno;
- un kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la invención;
- un kit de diagnóstico de acuerdo con la invención, para usar en un método de diagnóstico in vivo de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, una enfermedad respiratoria, un trastorno metabólico, un trastorno inflamatorio mediado por el epitelio, fibrosis, cáncer, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, EPOC, asma crónica, esponja anquilosante dilitis o enfermedad de Crohn; - un método de diagnóstico ex vivo que comprende el uso del anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la invención;
- un método de diagnóstico ex vivo de acuerdo con la invención, para el diagnóstico de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, una enfermedad respiratoria, un trastorno metabólico, un trastorno inflamatorio mediado por el epitelio, fibrosis, cáncer, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis psoriásica, múltiple esclerosis, artritis reumatoide, EPOC, asma crónica, espondilitis anquilosante o enfermedad de Crohn.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: los ligandos antagonistas de IL-36 (IL-36RA/IL1F5, IL-38/ILF10) inhiben la cascada de señalización.
Figura 2: Los análisis de chips genéticos demuestran que los ligandos IL-36R están regulados positivamente en la piel psoriásica (IL-36 RA, IL-36 a e IL-36 y).
Figura 3: Perfil de expresión utilizando secciones de piel humana. Parafina fijada en formalina embebida con titulaciones de anticuerpos usando el anticuerpo 33D10
Figura 4: Método para evaluar el grosor epidérmico de secciones de piel humana
Descripción de la invención
Esta invención se refiere a anticuerpos anti-IL-36R. En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención son para uso diagnóstico y terapéutico, por ejemplo, en humanos.
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a IL-36R, en particular IL-36R humano. La presente invención también se refiere a anticuerpos humanizados que se unen a IL-36R. En realizaciones específicas, la secuencia de estos anticuerpos humanizados se ha identificado en base a las secuencias de ciertos anticuerpos líder de ratón.
Sin desear vincularse a esta teoría, se cree que los anticuerpos anti-IL-36R o sus fragmentos de unión a antígeno se unen a la IL-36R humana y, por lo tanto, interfieren con la unión de los agonistas de IL-36, y al hacerlo bloquean al menos parcialmente la cascada de señalización de la IL-36R a mediadores inflamatorios. Esto se ilustra en la Figura 1.
En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención son para uso en modelos de enfermedad humana. IL-36R también se conoce como IL-1RL2 e IL-1Rrp2. Se ha informado que los ligandos agonistas de IL-36 (a, p o y) inician la cascada de señalización activando el receptor de IL-36 que luego forma un heterodímero con la proteína accesoria del receptor de IL-1 (IL-1 RAcP). Los ligandos antagonistas de IL-36 (IL-36RA/IL1F5, IL-38/ILF10) inhiben la cascada de señalización (ver figura 1).
En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención tiene una alta potencia de unión molecular/celular. En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención se une al IL-36R humano a una Kd <0,1 nM. En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención, en particular un anticuerpo anti-IL-36R humanizado, se une al IL-36R humano a una Kd <50 pM. En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención se une a células que expresan IL-36R a una CE90 <5 nM.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención tiene una alta potencia de bloqueo funcional basada en células. En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención bloquea los tres ligandos agonistas de IL-36R (a, p, y) a un CI90 á5 nM, en líneas celulares relevantes para la enfermedad y células primarias.
En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención tiene la potencia de unión molecular/celular y la potencia de bloqueo funcional basada en células expuesta anteriormente.
En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención es un anticuerpo humanizado. En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención es un anticuerpo monoclonal. En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención es un anticuerpo de longitud completa. En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humanizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado de longitud completa.
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención reconoce el "epítopo de antígeno IL-36R" específico o el "epítopo IL-36R". Como se usa en el presente documento, estos términos se refieren a una molécula (por ejemplo, un péptido) o un fragmento de una molécula capaz de inmunoreactividad con un anticuerpo anti-IL-36R.
Los epítopos son más comúnmente proteínas, oligopéptidos cortos, imitadores de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión a anticuerpos del antígeno IL-36R), o combinaciones de los mismos. Se cree que el tamaño mínimo de un epítopo de péptido o polipéptido para un anticuerpo es de aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos de péptidos o polipéptidos contienen, por ejemplo, al menos siete aminoácidos o, por ejemplo, al menos nueve aminoácidos o, por ejemplo, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 aminoácidos. Dado que un anticuerpo puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan ser contiguos y, en algunos casos, incluso pueden no estar en la misma cadena peptídica. Los epítopos pueden determinarse mediante diversas técnicas conocidas en la técnica, tales como cristalografía de rayos X, espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HXMS), mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de exploración de alanina y métodos de detección de péptidos.
La estructura generalizada de anticuerpos o inmunoglobulina es bien conocida por los expertos en la materia. Estas moléculas son glucoproteínas heterotetraméricas, típicamente de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas y típicamente se conocen como anticuerpos de longitud completa. Cada cadena ligera se une covalentemente a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro para formar un heterodímero, y la molécula heterotetramérica se forma a través de un enlace disulfuro covalente entre las dos cadenas pesadas idénticas de los heterodímeros. Aunque las cadenas ligera y pesada están unidas por un enlace disulfuro, el número de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas varía según el isotipo de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en el extremo amino un dominio variable (Vh), seguido de tres o cuatro dominios constantes (Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4), así como una región bisagra entre Ch1 y Ch2. Cada cadena ligera tiene dos dominios, un dominio variable aminoterminal (Vl) y un dominio constante carboxiterminal (Cl). El dominio VL se asocia de forma no covalente con el dominio Vh, mientras que el dominio Cl está comúnmente unido covalentemente al dominio Chi a través de un enlace disulfuro. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663). Los dominios variables también se denominan aquí como regiones variables.
Ciertos dominios dentro de los dominios variables difieren ampliamente entre diferentes anticuerpos, es decir, son "hipervariables". Estos dominios hipervariables contienen residuos que están directamente involucrados en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su determinante antigénico específico. La hipervariabilidad, tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada, se concentra en tres segmentos conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDR) o bucles hipervariables (HVL). Las CDR se definen por comparación de secuencias en Kabat et al., 1991, en: Secuencias de proteínas de interés inmunológico, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., Mientras que las HVL (también denominadas en este documento CDR) se definen estructuralmente de acuerdo con la estructura tridimensional del dominio variable, según lo descrito por Chothia y Lesk, 1987, J. Mol . Biol.196: 901-917. Estos dos métodos dan como resultado identificaciones ligeramente diferentes de un CDR. Según lo definido por Kabat, CDR-L1 se coloca en aproximadamente los residuos 24-34, CDR-L2, en aproximadamente los residuos 50-56, y CDR-L3, en aproximadamente los residuos 89-97 en el dominio variable de la cadena ligera; CDR-H1 se coloca en aproximadamente los residuos 31-35, CDR-H2 en aproximadamente los residuos 50-65 y CDR-H3 en aproximadamente los residuos 95-102 en el dominio variable de la cadena pesada. Los números exactos de residuos que abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar rutinariamente qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo. Los CDR1, CDR2, CDR3 de las cadenas pesadas y ligeras, por lo tanto, definen las propiedades únicas y funcionales específicas para un anticuerpo dado.
Las tres CDR dentro de cada una de las cadenas pesada y ligera están separadas por regiones marco (FR), que contienen secuencias que tienden a ser menos variables. Desde el terminal amino hasta el terminal carboxi de los dominios variables de la cadena pesada y ligera, las FR y CDR están dispuestas en el orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La configuración en gran parte de la hoja p de las FR hace que las CDR dentro de cada una de las cadenas estén muy próximas entre sí, así como a las CDR de la otra cadena. La conformación resultante contribuye al sitio de unión al antígeno (ver Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, páginas 647-669), aunque no todos los residuos de CDR están necesariamente involucrados directamente en la unión al antígeno.
Los residuos FR y los dominios constantes de Ig no están directamente implicados en la unión al antígeno, pero contribuyen a la unión al antígeno y/o median la función efectora del anticuerpo. Se cree que algunos residuos de FR tienen un efecto significativo sobre la unión al antígeno de al menos tres formas: al unirse de manera no covalente directamente a un epítopo, al interactuar con uno o más residuos de CDR y al afectar la interfaz entre las cadenas pesadas y ligeras. Los dominios constantes no están directamente involucrados en la unión al antígeno, pero median varias funciones efectoras de Ig, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).
Las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas de vertebrados se asignan a una de dos clases claramente distintas, kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos del dominio constante. En comparación, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de mamíferos se asignan a una de las cinco clases principales , de acuerdo con la secuencia de los dominios constantes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA se dividen además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y H, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de las clases de inmunoglobulinas nativas son bien conocidas.
Los términos "anticuerpo", "anticuerpo anti-IL-36R", "anticuerpo anti-IL-36R humanizado", "anticuerpo epítopo anti-IL-36R humanizado" y "variante de anticuerpo epítopo anti-IL-36R humanizado" "abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos tales como dominios variables y otras porciones de anticuerpos que exhiben una actividad biológica deseada, por ejemplo, la unión de IL-36R El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) se refiere a un anticuerpo que es altamente específico, dirigido contra un único determinante antigénico, un "epítopo". Por lo tanto, el modificador "monoclonal" es indicativo de anticuerpos dirigidos al epítopo idéntico y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Debe entenderse que los anticuerpos monoclonales pueden fabricarse mediante cualquier técnica o metodología conocida en la técnica; incluyendo, por ejemplo, el método de hibridoma (Kohler et al., 1975, Nature 256: 495), o métodos de ADN recombinante conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567), o métodos de aislamiento de monoclonales producidos recombinantemente usando bibliotecas de anticuerpos de fagos, usando técnicas descritas en Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597.
El término "monómero" se refiere a una forma homogénea de un anticuerpo. Por ejemplo, para un anticuerpo de longitud completa, monómero significa un anticuerpo monomérico que tiene dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas.
Los anticuerpos quiméricos consisten en las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo de una especie (por ejemplo, un mamífero no humano como un ratón) y las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de otra especie (por ejemplo, el anticuerpo humano) y puede obtenerse uniendo las secuencias de ADN que codifican las regiones variables del anticuerpo de la primera especie (por ejemplo, ratón) a las secuencias de ADN para las regiones constantes del anticuerpo de la segunda especie (por ejemplo, humano) y transformando un huésped con un vector de expresión que contiene las secuencias enlazadas para permitirle producir un anticuerpo quimérico. Alternativamente, el anticuerpo quimérico también podría ser uno en el que una o más regiones o dominios de la cadena pesada y/o ligera es idéntica, homóloga o una variante de la secuencia correspondiente en un anticuerpo monoclonal de otra clase de inmunoglobulina o isotipo, o de un consenso o secuencia de línea germinal. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que el fragmento de anticuerpo exhiba la actividad biológica deseada de su anticuerpo original, por ejemplo, que se une al mismo epítopo (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N° 4.816.567; y Morrison et al., 1984 , Proc. Natl. Acad. Sci. UsA 81: 6851­ 6855).
Los términos "fragmento de anticuerpo", "fragmento de anticuerpo anti-IL-36R", "fragmento de anticuerpo epítopo anti-IL-36R", "fragmento de anticuerpo anti-IL-36R humanizado", "fragmento de anticuerpo epítopo anti-IL-36R humanizado”, “variante del fragmento de anticuerpo epítopo anti-IL-36R humanizado" se refiere a una porción de un anticuerpo anti-IL-36R de longitud completa, en el que se retiene una región variable o una capacidad funcional, por ejemplo, unión del epítopo IL-36R específico. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv y scFv-Fc, un diacuerpo, un anticuerpo lineal, un anticuerpo de cadena sencilla, un minicuerpo, un diacuerpo formado a partir de fragmentos de anticuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Los anticuerpos de longitud completa pueden tratarse con enzimas tales como papaína o pepsina para generar fragmentos de anticuerpos útiles. La digestión con papaína se usa para producir dos fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el dominio Ch1 de la cadena pesada. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno.
Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la presencia de residuos adicionales que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo en el extremo C-terminal del dominio Ch i. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 son pares de fragmentos Fab' unidos por residuos de cisteína en la región bisagra. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
El fragmento "Fv" contiene un sitio completo de reconocimiento y unión al antígeno que consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno ligero en asociación estrecha, no covalente. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de fijación de antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo.
Un fragmento de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" es una variante de Fv de cadena sencilla que comprende los dominios VH y VL de un anticuerpo donde los dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. La cadena simple Fv es capaz de reconocer y unirse al antígeno. El polipéptido scFv también puede contener opcionalmente un conector polipeptídico colocado entre los dominios Vh y Vl para facilitar la formación de una estructura tridimensional deseada para la unión al antígeno por el scFv (véase, por ejemplo, Pluckthun, 1994, en The Pharmacology of monoclonal Antibodies , Vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269­ 315).
Un "diacuerpo" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl o Vl-Vh). Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90: 6444-6448.
Otros fragmentos de anticuerpos reconocidos incluyen aquellos que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (Vh-Ch1-Vh-Ch1 ) para formar un par de regiones de unión a antígeno. Estos "anticuerpos lineales" pueden ser biespecíficos o monoespecíficos como se describe en, por ejemplo, Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8 (10): 1057­ 1062.
Un "anticuerpo humanizado" o un "fragmento de anticuerpo humanizado" es un tipo específico de anticuerpo quimérico que incluye una variante de secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina, o fragmento del mismo, que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una o más FR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una o más CDR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Esta secuencia de aminoácidos no humana a menudo denominada secuencia de "importación" se toma típicamente de un dominio de anticuerpo de "importación", particularmente un dominio variable. En general, un anticuerpo humanizado incluye al menos las CDR o HVL de un anticuerpo no humano, insertado entre las FR de un dominio variable de cadena ligera o pesada humana. La presente invención describe anticuerpos anti-IL-36R humanizados específicos que contienen CDR derivados de los anticuerpos monoclonales de ratón o CDR humanizados insertados entre las FR de los dominios variables de cadena pesada y ligera de la secuencia de la línea germinal humana. Se entenderá que ciertos residuos de FR de ratón pueden ser importantes para la función de los anticuerpos humanizados y, por lo tanto, algunos de los residuos de dominios variables de la cadena germinal pesada y ligera de la secuencia de la línea germinal humana se modifican para que sean los mismos que los de la secuencia de ratón correspondiente.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R humanizado comprende sustancialmente todos al menos uno, y típicamente dos dominios variables (como los contenidos, por ejemplo, en Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y fragmentos Fv) en los que todas, o sustancialmente todas, las CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y específicamente en el presente documento, todas las CDR son secuencias de ratón o humanizadas como se detalla a continuación y todas, o sustancialmente todas, las FR son de un consenso de inmunoglobulina humana o secuencia de línea germinal. En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R humanizado también incluye al menos una porción de una región Fc de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Normalmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir una o más de las regiones Ch1, bisagra, Ch2, Ch3 y/o Ch4 de la cadena pesada, según sea apropiado.
Se puede seleccionar un anticuerpo anti-IL-36r humanizado de cualquier clase de inmunoglobulinas, que incluyen IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, que incluye IgG1, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgA1 e IgA2. Por ejemplo, el dominio constante puede ser un dominio constante de fijación del complemento donde se desea que el anticuerpo humanizado exhiba actividad citotóxica, y el isotipo es típicamente IgG1. Cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de otro isotipo, por ejemplo, IgG2. Un anticuerpo anti-IL-36R humanizado alternativo puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo de inmunoglobulina, y la selección de dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la habilidad ordinaria en la técnica. En realizaciones específicas, la presente invención proporciona anticuerpos que son anticuerpos IgG1 y, más particularmente, son anticuerpos IgG1 en los que hay una desactivación de las funciones efectoras.
Las FR y CDR, o HVL, de un anticuerpo anti-IL-36R humanizado no necesitan corresponder exactamente a las secuencias parentales. Por ejemplo, uno o más residuos en la CDR de importación, o HVL, o la secuencia FR de consenso o de línea germinal pueden estar alteradas (por ejemplo, mutagenizadas) mediante sustitución, inserción o deleción de manera que el residuo de aminoácido resultante ya no sea idéntico al residuo original en la posición correspondiente en cualquiera de las secuencias parentales, pero el anticuerpo, sin embargo, conserva la función de unirse a IL-36R. Dicha alteración típicamente no será extensa y serán alteraciones conservadoras. Por lo general, al menos el 75% de los residuos de anticuerpos humanizados corresponderán a los del consenso parental o la línea germinal FR y secuencias de CDR importadas, más a menudo al menos el 90%, y con mayor frecuencia más del 95%, o más del 98% o más que 99%
Los residuos de inmunoglobulina que afectan la interfaz entre las regiones variables de la cadena pesada y ligera ("la interfaz Vl-Vh") son aquellos que afectan la proximidad u orientación de las dos cadenas entre sí. Ciertos residuos que pueden estar involucrados en las interacciones entre cadenas incluyen los residuos Vl 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 y 98 y los residuos Vh 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 y 103 (utilizando el sistema de numeración establecido en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). Pat. U.S. n° 6.407.213 también discute que los residuos tales como los residuos Vl 43 y 85, y los residuos Vh 43 y 60 también pueden estar involucrados en esta interacción. Si bien estos residuos están indicados solo para IgG humana, son aplicables en todas las especies. Los residuos de anticuerpos importantes que se espera que participen razonablemente en interacciones entre cadenas se seleccionan para su sustitución en la secuencia de consenso.
Los términos "secuencia de consenso" y "anticuerpo de consenso" se refieren a una secuencia de aminoácidos que comprende el residuo de aminoácido más frecuente en cada ubicación en todas las inmunoglobulinas de cualquier clase particular, isotipo o estructura de subunidad, por ejemplo, un humano dominio variable de inmunoglobulina. La secuencia de consenso puede basarse en inmunoglobulinas de una especie particular o de muchas especies. Se entiende que una secuencia, estructura o anticuerpo de "consenso" abarca una secuencia humana de consenso como se describe en ciertas realizaciones, y se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos de aminoácidos que ocurren con más frecuencia en cada ubicación en todas las inmunoglobulinas humanas de cualquier clase particular, isotipo o estructura de subunidad. Por lo tanto, la secuencia de consenso contiene una secuencia de aminoácidos que tiene en cada posición un aminoácido que está presente en una o más inmunoglobulinas conocidas, pero que puede no duplicar exactamente la secuencia de aminoácidos completa de una sola inmunoglobulina. La secuencia consenso de la región variable no se obtiene de ningún anticuerpo o inmunoglobulina producido naturalmente. Kabat et al., 1991, Secuencias de proteínas de interés inmunológico, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, y sus variantes.
Las secuencias de la línea germinal humana se encuentran naturalmente en la población humana. Una combinación de esos genes de línea germinal genera diversidad de anticuerpos. Las secuencias de anticuerpos de la línea germinal para la cadena ligera del anticuerpo provienen de los genes v y genes j conservados de la línea germinal humana kappa o lambda. De manera similar, las secuencias de la cadena pesada provienen de los genes v, d y j de la línea germinal (LeFranc, M-P y LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).
Como se usa en el presente documento, "variante", "variante anti-IL-36R", "variante anti-IL-36R humanizada" o "variante humanizada anti-IL-36R " se refieren cada uno a un anticuerpo anti-IL-36R humanizado que tiene al menos una CDR murina variable de cadena ligera. Las variantes incluyen aquellas que tienen uno o más cambios de aminoácidos en uno o ambos dominios variables de cadena ligera o cadena pesada, siempre que el cambio de aminoácido no perjudique sustancialmente la unión del anticuerpo a IL-36R.
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes del entorno natural del anticuerpo son aquellos materiales que pueden interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden ser enzimas, hormonas u otros solutos proteicos o no proteicos. En un aspecto, el anticuerpo se purificará con al menos más del 95% de aislamiento en peso de anticuerpo.
Un anticuerpo aislado incluye un anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes en las que se produce, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, se preparará un anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación en la que se elimina el material celular recombinante.
El término "rendimiento de anticuerpos" se refiere a factores que contribuyen al reconocimiento de anticuerpos del antígeno o la efectividad de un anticuerpo in vivo. Los cambios en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden afectar las propiedades del anticuerpo, como el plegamiento, y pueden influir en factores físicos como la tasa inicial de unión del anticuerpo al antígeno (ka), la constante de disociación del anticuerpo del antígeno (kd), la constante de afinidad t del anticuerpo para el antígeno (Kd), conformación del anticuerpo, estabilidad de la proteína y vida media del anticuerpo.
El término "epítopo marcado" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo anti-IL-36R fusionado a una "etiqueta de epítopo". Una "etiqueta de epítopo" es un polipéptido que tiene un número suficiente de aminoácidos para proporcionar un epítopo para la producción de anticuerpos, pero está diseñado de tal manera que no interfiere con la actividad deseada del anticuerpo anti-IL-36R humanizado. La etiqueta de epítopo suele ser lo suficientemente única como para que un anticuerpo generado contra la etiqueta de epítopo no reaccione de forma sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos de etiqueta adecuados generalmente contienen al menos 6 residuos de aminoácidos y generalmente contienen de aproximadamente 8 a 50 residuos de aminoácidos, o aproximadamente de 9 a 30 residuos. Los ejemplos de etiquetas de epítopo y el anticuerpo que se une al epítopo incluyen el polipéptido de etiqueta HA de gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; etiqueta c-myc y anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 del mismo (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5 (12): 3610-3616; y la etiqueta de la glucoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3 (6): 547-553). En ciertas realizaciones, la etiqueta de epítopo es un "epítopo de unión al receptor salvaje". Como se usa en el presente documento, el término "epítopo de unión al receptor salvaje" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse con un agente citotóxico. Este es cualquier sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (como I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, y fragmentos de las mismas. Dichos agentes citotóxicos se pueden acoplar a los anticuerpos humanizados de la presente invención usando procedimientos estándar, y usarse, por ejemplo, para tratar a un paciente indicado para terapia con el anticuerpo.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Existen numerosos ejemplos de agentes quimioterapéuticos que podrían conjugarse con los anticuerpos terapéuticos de la presente invención. Los ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfano, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); camptotecina (incluido el análogo sintético topotecan); briostatina; callistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina, auristatinas (incluidos los análogos monometil-auristatina E y monometil-auristatina F); duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, cloromafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina; trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como los antibióticos enedine (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calichemicina gamma1I y calicheamicina fil1, véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186; dinemicina, incluida la dinemicina A; bifosfonatos, como el clodronato; esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromomóforos de antibiótico enedinino cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactorubicina, dactorubicina, dactorubicina, dactorubicina, dactorubicina, dactorubicina, dactorubicina, dactorubicina, dactorubicina L-norleucina, doxorrubicina (Adriamicina ™) (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirubucina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos su ch como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adranales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glucósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; democolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de elliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan lonidamina; maitansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona, mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofurano; spirogermanium; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitabronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (" Ara-C " ); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (Gemzar ™); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina Navelbine ™); novantrona; teniposida; edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometillornitina (DMFO); retinoides como el ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores como antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (SERM), que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (incluido Nolvadex ™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston ™); inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace ™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor ™), letrozol (Femara ™) y anastrozol (Arimidex ™); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Cualquiera o más de estos agentes pueden conjugarse con los anticuerpos humanizados de la presente invención para proporcionar un agente terapéutico útil para el tratamiento de diversos trastornos.
Los anticuerpos también pueden conjugarse con profármacos. Un "profármaco" es una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco original y es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse en la forma más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615a Reunión Belfast y Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery". , En: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (Ed.), Pp. 247-267, Humana Press. Los profármacos útiles incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen lactama p, que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida. profármacos y profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en forma de profármaco incluyen, entre otros, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Para fines de monitorización diagnóstica y terapéutica, los anticuerpos de la invención también pueden conjugarse a un marcador, ya sea un marcador solo o un marcador y un segundo agente adicional (profármaco, agente quimioterapéutico y similares). Un marcador, a diferencia de los otros segundos agentes, se refiere a un agente que es un compuesto o composición detectable y puede conjugarse directa o indirectamente a un anticuerpo humanizado de la presente invención. El marcador en sí mismo puede ser detectable (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable. El anticuerpo anti-IL-36R humanizado marcado puede prepararse y usarse en diversas aplicaciones, incluyendo diagnósticos in vitro e in vivo.
Los anticuerpos de la presente invención pueden formularse como parte de una preparación liposómica para afectar la administración de los mismos in vivo. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lípidos, fósforo. olípidos y/o tensioactivos. Los liposomas son útiles para la administración a un mamífero de un compuesto o formulación, tal como un anticuerpo anti-IL-36R humanizado descrito aquí, opcionalmente, acoplado o en combinación con uno o más agentes y/o marcadores farmacéuticamente activos. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas.
Ciertos aspectos de la presente invención se relacionan con ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente se asocia en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada se distingue de la molécula de ácido nucleico tal como existe en las células naturales.
En varios aspectos de la presente invención, uno o más dominios de los anticuerpos humanizados se expresarán de forma recombinante. Dicha expresión recombinante puede emplear una o más secuencias de control, es decir, secuencias de polinucleótidos necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control adecuadas para su uso en células procariotas incluyen, por ejemplo, secuencias de promotor, operador y sitio de unión a ribosomas. Las secuencias de control eucariotas incluyen, pero no se limitan a, promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. Estas secuencias de control pueden utilizarse para la expresión y producción de anticuerpos anti-IL-36R humanizados en células huésped procariotas y eucariotas.
Una secuencia de ácido nucleico está "operativamente unida" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una presecuencia de ácido nucleico o líder secretora está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está operativamente unido a una secuencia de codificación si está posicionado de manera que facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores son opcionalmente contiguos. La vinculación se puede lograr mediante la ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se pueden usar adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas tales designaciones incluyen la progenie de las mismas. Por lo tanto, los "transformantes" y las "células transformadas" incluyen la célula principal y los cultivos derivados de ellos sin tener en cuenta el número de transferencias.
El término "mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas y similares. Preferiblemente, el mamífero es humano.
Un "trastorno", como se usa en el presente documento, es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con un anticuerpo anti-IL-36R humanizado descrito en el presente documento. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluidas aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos o trastornos no limitantes a tratar en el presente documento incluyen trastornos inflamatorios, angiogénicos, autoinmunes e inmunológicos, trastornos respiratorios, cáncer, neoplasias hematológicas, tumores benignos y malignos, leucemias y neoplasias linfoides.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.
Un trastorno asociado a IL-36R incluye enfermedades y trastornos del sistema inmune, tales como trastornos autoinmunes y trastornos inflamatorios. Dichas afecciones incluyen, entre otras, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES), esclerodermia, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), inflamación pulmonar, asma, púrpura trombocitopénica inmune (PTI), trastornos inflamatorios epiteliales, fibrosis y espondilitis anquilosante.
El término "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un agente en la vena de un paciente animal o humano durante un período de tiempo superior a aproximadamente 15 minutos, generalmente entre aproximadamente 30 a 90 minutos.
El término "bolo intravenoso" o "empuje intravenoso" se refiere a la administración del fármaco en una vena de un animal o humano de manera que el cuerpo recibe el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, generalmente 5 minutos o menos.
El término "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un agente debajo de la piel de un paciente animal o humano, preferiblemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, mediante un suministro relativamente lento y sostenido desde un receptáculo de fármaco. Pellizcar o estirar la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente puede crear el bolsillo.
El término "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco debajo de la piel de un paciente animal o humano, preferiblemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, mediante un suministro sostenido relativamente lento desde un receptáculo de fármaco durante un período de tiempo. tiempo que incluye, entre otros, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión se puede realizar mediante la implantación subcutánea de una bomba de administración de medicamentos implantada debajo de la piel del paciente animal o humano, en donde la bomba administra una cantidad predeterminada de medicamento durante un período predeterminado de tiempo, como 30 minutos, 90 minutos, o un período de tiempo que abarca la duración del régimen de tratamiento.
El término "bolo subcutáneo" se refiere a la administración del fármaco debajo de la piel de un paciente animal o humano, donde el suministro de bolo del fármaco es inferior a aproximadamente 15 minutos; en otro aspecto, menos de 5 minutos, y en otro aspecto, menos de 60 segundos. Incluso en otro aspecto, la administración está dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, donde el bolsillo se puede crear pellizcando o estirando la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se usa para referirse a una cantidad de un agente activo que alivia o mejora uno o más de los síntomas del trastorno que se está tratando. En otro aspecto, la cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a una concentración sérica objetivo que se ha demostrado que es efectiva, por ejemplo, en retrasar la progresión de la enfermedad. La eficacia se puede medir de manera convencional, dependiendo de la condición a tratar.
Los términos "tratamiento" y "terapia" y similares, tal como se usan en el presente documento, pretenden incluir medidas terapéuticas, así como profilácticas o supresoras para una enfermedad o trastorno que conduce a cualquier efecto clínicamente deseable o beneficioso, incluyendo pero no limitado al alivio o alivio de uno o más síntomas, regresión, desaceleración o cese de la progresión de la enfermedad o trastorno. Así, por ejemplo, el término tratamiento incluye la administración de un agente antes o después del inicio de un síntoma de una enfermedad o trastorno, previniendo o eliminando así uno o más signos de la enfermedad o trastorno. Como otro ejemplo, el término incluye la administración de un agente después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad. Además, la administración de un agente después del inicio y después de que los síntomas clínicos se han desarrollado cuando la administración afecta los parámetros clínicos de la enfermedad o trastorno, como el grado de lesión tisular o la cantidad o extensión de metástasis, ya sea que el tratamiento conduzca o no a la mejora de la enfermedad, comprende "tratamiento" o "terapia" como se usa en el presente documento. Además, siempre que las composiciones de la invención, solas o en combinación con otro agente terapéutico, alivien o mejoren al menos un síntoma de un trastorno que se está tratando en comparación con ese síntoma en ausencia del uso de la composición de anticuerpo anti-IL-36R humanizado, el resultado debe considerarse un tratamiento efectivo del trastorno subyacente, independientemente de si se alivian o no todos los síntomas del trastorno.
El término "prospecto" se usa para referirse a instrucciones habitualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, administración, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos.
Anticuerpos
En un aspecto, se describen y presentan en el presente documento anticuerpos anti-IL-36R, en particular anticuerpos anti-IL-36R humanizados, y composiciones y artículos de fabricación que comprenden uno o más anticuerpos anti-IL-36R, en particular uno o más anticuerpos anti-IL-36R humanizados de la presente invención. También se describen agentes de unión que incluyen un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-IL-36, en particular un anticuerpo anti-IL-36R humanizado.
A continuación, se describen regiones variables y CDR de anticuerpos representativos de la presente invención y anticuerpos de referencia:
Secuencias de anticuerpos anti-IL-36R de ratón
Las regiones variables y las CDR de los anticuerpos de referencia y el anticuerpo principal de ratón de los anticuerpos de la presente invención (principal de ratón; anticuerpo 81B4) se muestran a continuación:
Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK)
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH)
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
Secuencias de aminoácidos de la cadena ligera CDR-1 (L-CDR1) > 33D10G1 L-CDR1
TASSSVSSSYLH (Id. de Sec. n°: 21)
> 172C8B 12 L-CDR1
LASQTIGTWLA (Id. de Sec. n°: 22)
> 67E7E8 L-CDR1
LASQTIGTWLG (Id. de Sec. n°: 23)
> 78C8D1 L-CDR1
RSSQNIVHSNGNTYLQ (Id. de Sec. n°: 24)
> 81A1D1 L-CDR1
RASQDIYKYLN (Id. de Sec. n°: 25)
> 81B4E11 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 73C5C10 L-CDR1
KASQDVGTNVL (Id. de Sec. n°: 27)
> 73F6F8 L-CDR1
KASQDVGTNVL (Id. de Sec. n°: 27)
> 76E10E8 L-CDR1
KASQNVGRAVA (Id. de Sec. n°: 28)
> 89A12B8 L-CDR1
LASQTIGTWLG (Id. de Sec. n°: 29)
Secuencias de aminoácidos de la cadena ligera CDR-2 (L-CDR2) > 33D10B12 L-CDR2
STSNLAS (Id. de Sec. n°: 30)
> 172C8B 12 L-CDR2
AATSLAD (Id. de Sec. n°: 31)
> 67E7E8 L-CDR2
RSTTLAD (Id. de Sec. n°: 32)
> 78C8D1 L-CDR2
KVSNRFS (Id. de Sec. n°: 33)
> 81A1D1 L-CDR2
YTSGLHS (Id. de Sec. n°: 34)
> 81B4E11 L-CDR2
RTSNLAS (Id. de Sec. n°: 35)
> 73C5C10 L-CDR2
SASYRHS (Id. de Sec. n°: 36)
> 73F6F8 L-CDR2
SASYRHS (Id. de Sec. n°: 36)
> 76E10E8 L-CDR2
SASNRYT (Id. de Sec. n°: 37)
> 89A12B8 L-CDR2
RATSLAD (Id. de Sec. n°: 38)
Secuencias de aminoácidos de la cadena ligera CDR-3 (L-CDR3) > 33D10B12 L-CDR3
HQHHRSPVT (Id. de Sec. n°: 39)
> 172C8B 12 L-CDR3
QQVYTTPLT (Id. de Sec. n°: 40)
> 67E7E8 L-CDR3
QQLYSAPYT (Id. de Sec. n°: 41)
> 78C8D1 L-CDR3
FQGSHVPFT (Id. de Sec. n°: 42)
> 81A1D1 L-CDR3
QQDSKFPWT (Id. de Sec. n°: 43)
> 81B4E11 L-CDR3
HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 73C5C10 L-CDR3
QQYSRYPLT (Id. de Sec. n°: 45)
> 73F6F8 L-CDR3
QQYSRYPLT (Id. de Sec. n°: 45)
> 76E10E8 L-CDR3
QQYSSYPLT (Id. de Sec. n°: 46)
> 89A12B8 L-CDR3
QQLYSGPYT (Id. de Sec. n°: 47)
Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada CDR-1 (H-CDR1) > 33D10B12 H-CDR1
GNTVTSYWMH (Id. de Sec. n°: 48)
> 172C8B 12 H-CDR1
GYTFTDNYMN (Id. de Sec. n°: 49)
> 67E7E8 H-CDR1
GFNIKDDYIH (Id. de Sec. n°: 50)
> 78C8D1 H-CDR1
GFSLTKFGVH (Id. de Sec. n°: 51)
> 81A1D1 H-CDR1
GFSLSSYEIN (Id. de Sec. n°: 52)
> 81B4E11 H-CDR1
GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 73C5C10 H-CDR1
GFSLTNYAVH (Id. de Sec. n°: 54)
> 73F6F8 H-CDR1
GFSLTNYAVH (Id. de Sec. n°: 54)
> 76E10E8 H-CDR1
GFSLTNYGVH (Id. de Sec. n°: 55)
> 89A12B8 H-CDR1
GFNIKDDYIH (Id. de Sec. n°: 56)
Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada CDR-2 (H-CDR2) > 33D10B12 H-CDR2
EILPSTGRTNYNENFKG (Id. de Sec. n°: 57)
> 172C8B 12 H-CDR2
RVNPSNGDTKYNQNFKG (Id. de Sec. n°: 58)
> 67E7E8 H-CDR2
RIDPANGNTKYAPKFQD (Id. de Sec. n°: 59)
> 78C8D1 H-CDR2
VIWAGGPTNYNSALMS (Id. de Sec. n°: 60)
> 81A1D1 H-CDR2
VIWTGITTNYNSALIS (Id. de Sec. n°: 61)
> 81B4E11 H-CDR2
EINPGNVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 62)
> 73C5C10 H-CDR2
VIWSDGSTDFNAPFKS (Id. de Sec. n°: 63)
> 73F6F8 H-CDR2
VIWSDGSTDYNAPFKS (Id. de Sec. n°: 64)
> 76E10E8 H-CDR2
VIWPVGSTNYNSALMS (Id. de Sec. n°: 65)
> 89A12B8 H-CDR2
RIDPANGNTKYDPRFQD (Id. de Sec. n°: 66)
Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada CDR-3 (H-CDR3) > 33D10B12 H-CDR3
VYFGNPWFAY (Id. de Sec. n°: 67)
> 172C8B 12 H-CDR3
TKNFYSSYSYDDAMDY (Id. de Sec. n°: 68)
> 67E7E8 H-CDR3
SFPNNYYSYDDAFAY (Id. de Sec. n°: 69)
> 78C8D1 H-CDR3
QIYYSTLVDY (Id. de Sec. n°: 70)
> 81A1D1 H-CDR3
GTGTGFYYAMDY (Id. de Sec. n° °: 71)
> 81B4E11 H-CDR3
VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 73C5C10 H-CDR3
KGGYSGSWFAY (Id. de Sec. n°: 73)
> 73F6F8 H-CDR3
KGGYSGSWFAY (Id. de Sec. n°: 73)
> 76E10E8 H-CDR3
MDWDDFFDY (Id. de Sec. n°: 74)
> 89A12B8 H-CDR3
SFPDNYYSYDDAFAY (Id. de Sec. n°: 75)
Secuencias de CDR anti-IL-36R de ratón
A continuación, se muestra un resumen de las secuencias de CDR de los anticuerpos de referencia y el anticuerpo principal de ratón (anticuerpo 81B4) de los anticuerpos de acuerdo con la invención:
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Secuencias de anticuerpos humanizados anti-IL-36R
Se seleccionaron secuencias marco humanas para las derivaciones de ratón en base a la homología del marco, estructura del CDR, residuos canónicos conservados, residuos de empaquetamiento de interfaz conservados y otros parámetros para producir regiones variables humanizadas (ver Ejemplo 5).
Las regiones variables humanizadas representativas derivadas de los anticuerpos 81B4 (anticuerpo principal de ratón de los anticuerpos de la invención) y 73C5 (anticuerpo de referencia) se muestran a continuación.
Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VK)
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH)
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
Las secuencias de CDR de las regiones variables humanizadas derivadas de los anticuerpos 81B4 y 73C5 mostradas arriba se representan a continuación.
Secuencias de aminoácidos de L-CDR1
> 81B4vK32_3 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 81B4vK32_105 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 81B4vK32_116 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 81B4vK32_127 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 81B4vK32_138 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 81B4vK32_140 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 81B4vK32_141 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 81B4vK32_147 L-CDR1
TASSSVSSSYFH (Id. de Sec. n°: 26)
> 73C5vK39_2 L-CDR1
KASQDVGTNVL (Id. de Sec. n°: 27)
> 73C5vK39_7 L-CDR1
KASQDVGTNVL (Id. de Sec. n°: 27)
> 73C5vK39_15 L-CDR1
KASQDVGTNVL (Id. de Sec. n°: 27) Secuencias de aminoácidos de L-CDR2
> 81B4vK32_3 L-CDR2 (Id. de Sec. n°: 102) RTSTLAS
> 81B4vK32_105 L-CDR2 (Id. de Sec. n°: 103) RTSILAS
> 81B4vK32_116 L-CDR2 (Id. de Sec. n°: 104) RTSRLAS
> 81B4vK32_127 L-CDR2 (Id. de Sec. n°: 104) RTSRLAS
> 81B4vK32_138 L-CDR2 (Id. de Sec. n°: 104) RTSRLAS
> 81B4vK32_140 L-CDR2 (Id. de Sec. n°: 105) RTSQLAS
> 81B4vK32_141 L-CDR2 (Id. de Sec. n°: 106) RTSKLAS
> 81B4vK32_147 L-CDR2 (Id. de Sec. n°: 140) > 73C5vK39_2 L-CDR2
SASYRHS (Id. de Sec. n°: 36)
> 73C5vK39_7 L-CDR2
SASYRHS (Id. de Sec. n°: 36)
> 73C5vK39_15 L-CDR2
SASYRHS (Id. de Sec. n°: 36)
Secuencias de aminoácidos de L-CDR3
> 81B4vK32_3 L-CDR3
HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 81B4vK32_105 L-CDR3
HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 81B4vK32_116 L-CDR3
HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 81B4vK32_127 L-CDR3
HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 81B4vK32_138 L-CDR3
HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 81B4vK32_140 L-CDR3 HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 81B4vK32_141 L-CDR3 HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 81B4vK32_147 L-CDR3 HQFHRSPLT (Id. de Sec. n°: 44)
> 73C5vK39_2 L-CDR3 QQYSRYPLT (Id. de Sec. n°: 45)
> 73C5vK39_7 L-CDR3 QQYSRYPLT (Id. de Sec. n°: 45)
> 73C5vK39_15 L-CDR3 QQYSRYPLT (Id. de Sec. n°: 45) Secuencias de aminoácidos de H-CDR1 > 81B4vH33_49 H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 81B4vH33_85T H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 81B4vH33_90 H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 81B4vH33_93 H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 81B4vH50_22 H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 81B4vH50_30 H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 81B4vH51_13 H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 81B4vH51_15 H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 81B4vH52_83 H-CDR1 GYSFTSSWIH (Id. de Sec. n°: 53)
> 73C5vH46_4 H-CDR1 GFSLTDYAVH (Id. de Sec. n°: 107) > 73C5vH46_19 H-CDR1 GFSLTDYAVH (Id. de Sec. n°: 107) > 73C5vH46_40 H-CDR1 GFSLTDYAVH (Id. de Sec. n°: 107) > 73C5vH47_65 H-CDR1 GFSLTDYAVH (Id. de Sec. n°: 107) > 73C5vH47_77 H-CDR1 GFSLTDYAVH (Id. de Sec. n°: 107) > 73C5vH58_91 H-CDR1 GFSLTDYAVH (Id. de Sec. n°: 107) Secuencias de aminoácidos de H-CDR2 > 81B4vH33 49 H-CDR2 EINPGNVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 62) > 81B4vH33 85T H-CDR2 EINPGNVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 62) > 81B4vH33 90 H-CDR2 EINPGNVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 62) > 81B4vH33 93 H-CDR2 EINPGNVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 62) > 81B4vH50 22 H-CDR2 EILPGVVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 108) > 81B4vH50 30 H-CDR2 EINPGAVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 109) > 81B4vH51 13 H-CDR2 EINPGLVRTNYNE NF (Id. de Sec. n°: 110) > 81B4vH51 15 H-CDR2 EINPGAVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 109) > 81B4vH52 83 H-CDR2 EINPGSVRTNYNENF (Id. de Sec. n°: 111) > 73C5vH46_4 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (Id. de Sec. n°: 64) > 73C5vH46_19 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (Id. de Sec. n°: 64) > 73C5vH46_40 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (Id. de Sec. n°: 64) > 73C5vH47_65 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (Id. de Sec. n°: 64) > 73C5vH47_77 H-CDR2 VIWSDGSTDFNAPFKS (Id. de Sec. n°: 63) > 73C5vH58_91 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (Id. de Sec. n°: 64) Secuencias de aminoácidos de H-CDR3 > 81B4vH33_49 H-CDR3 VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 81B4vH33_85T H-CDR3 VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 81B4vH33_90 H-CDR3 VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 81B4vH33_93 H-CDR3 VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 81B4vH50_22 H-CDR3 VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 81B4vH50_30 H-CDR3 VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72) > 81B4vH51_13 H-CDR3
VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 81B4vH51_15 H-CDR3
VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 81B4vH52_83 H-CDR3
VFYGEPYFPY (Id. de Sec. n°: 72)
> 73C5vH46_4 H-CDR3
KGGYSGSWFAY (Id. de Sec. n°: 73)
> 73C5vH46_19 H-CDR3
KGGYSGSWFAY (Id. de Sec. n°: 73)
> 73C5vH46_40 H-CDR3
KGGYSGSWFAY (Id. de Sec. n°: 73)
> 73C5vH47_65 H-CDR3
KGGYSGSWFAY (Id. de Sec. n°: 73)
> 73C5vH47_77 H-CDR3
KGGYSGSWFAY (Id. de Sec. n°: 73)
> 73C5vH58_91 H-CDR3
KGGYSGSWFAY (Id. de Sec. n°: 73)
En un aspecto, una región variable de la presente invención está unida a una región constante. Por ejemplo, una región variable de la presente invención está unida a una región constante que se muestra a continuación para formar una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo.
Figure imgf000025_0001
Secuencias representativas de la cadena ligera y la cadena pesada de la presente invención (cadena ligera: Id. de Sec. n°: 118; cadena pesada: Id. de Sec. n°: 125, 126 y 127) y las secuencias de referencia se muestran a continuación (regiones variables humanizadas derivadas de los anticuerpos 81B4 y 73C5 unidos a regiones constantes).
Secuencias de aminoácidos de cadena ligera
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Secuencias de aminoácidos de cadena pesada
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Las CDR enumeradas anteriormente se definen usando el sistema de numeración Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948).
En un aspecto, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 87, 88 y 89. En un aspecto, una región variable de la cadena ligera de la invención se fusiona a una región constante de la cadena ligera, por ejemplo, una región constante kappa o lambda. En un aspecto, una región variable de la cadena pesada de la invención se fusiona a una región constante de la cadena pesada, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, en particular, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
En este documento se describe un anticuerpo anti-IL-36R que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 115; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 125 (Anticuerpo B1).
También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-IL-36R que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 115; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 126 (Anticuerpo B2).
También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-IL-36R que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 115; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 127 (Anticuerpo B3).
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 125 (Anticuerpo B4).
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 126 (Anticuerpo B5).
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 127 Anticuerpo B6). (continuación)> 73C5vH47_77 Cadena pesada> 73C5vH58_91 Cadena pesada
En este documento se describe un anticuerpo anti-IL-36R que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 123; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 138 (Anticuerpo C3).
También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-IL-36R que comprende ing una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 123; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 139 (Anticuerpo C2).
También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-IL-36R que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 124; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 138 (Anticuerpo C1)
Los anticuerpos representativos de la presente invención (anticuerpos B4, B5 y B6) y los anticuerpos de referencia (B1-3 y C1-3) se muestran a continuación.
Tabla A._______ ____________________________________________________________________________________ | Anticuerpos | Secuencias de cadena ligera | Secuencias de cadena pesada ~
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Tabla B
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
Los anticuerpos de la presente invención son útiles en métodos para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos, por ejemplo, enfermedades inmunológicas, inflamatorias, autoinmunes y enfermedades respiratorias en humanos. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención son útiles en métodos para el tratamiento de psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o artritis psoriásica. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención son útiles en métodos para el tratamiento del trastorno pulmonar obstructivo crónico (EPOC) o asma. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención son útiles en métodos para el tratamiento de esclerodermia, pustulosis palmoplantar, psoriasis pustular generalizada, nefropatía diabética, nefritis lúpica, esclerodermia, espondilitis anquilosante, deficiencia en la enfermedad autoinmune antagonista del receptor de IL-36 (DITRA), deficiencia en la enfermedad autoinmune del antagonista del receptor de IL-1 (DIRA) o síndromes periódicos asociados a la criopirina (CAPS).
En algunos aspectos, el anticuerpo humanizado muestra actividad de bloqueo, por lo que disminuye la unión del ligando de IL-36 al receptor de IL-36 en al menos 45%, en al menos 50%, en al menos 55%, en al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95%. La capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión del ligando de IL-36 al receptor de IL-36 se puede medir usando ensayos de unión competitiva conocidos en la técnica. Alternativamente, la actividad de bloqueo de un anticuerpo se puede medir evaluando los efectos biológicos de IL-36, como la producción de IL-8, IL-6 y GM-CSF para determinar si la señalización mediada por el receptor de IL-36 está inhibida.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-IL-36R humanizado que tiene propiedades biofísicas favorables. En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R humanizado de la presente invención está presente en al menos un 90% de forma de monómero, o en al menos un 92% de forma de monómero, o en al menos un 95% de forma de monómero en un tampón. En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-36R humanizado de la presente invención permanece en al menos un 90% de forma de monómero, o en al menos un 92% de forma de monómero, o en al menos un 95% de forma de monómero en un tampón durante un mes o por cuatro meses
En un aspecto, un anticuerpo humanizado de la presente invención es el Anticuerpo B4, el Anticuerpo B5 o el Anticuerpo B6. Por consiguiente, en una realización, un anticuerpo humanizado de la presente invención comprende la secuencia de la cadena ligera de Id. de Sec. n°: 118 y la secuencia de la cadena pesada de Id. de Sec. n°: 125 (Anticuerpo B4). En otra realización, un anticuerpo humanizado de la presente invención comprende la secuencia de cadena ligera de Id. de Sec. n°: 118 y la secuencia de cadena pesada de Id. de Sec. n°: 126 (Anticuerpo B5). En otra realización, un anticuerpo humanizado de la presente invención comprende la secuencia de cadena ligera de Id. de Sec. n°: 118 y la secuencia de cadena pesada de Id. de Sec. n°: 127 (Anticuerpo B6). En una realización adicional, un anticuerpo humanizado de la presente invención consiste en la secuencia de cadena ligera de Id. de Sec. n°: 118 y la secuencia de cadena pesada de Id. de Sec. n°: 125 (Anticuerpo B4). En otra realización, un anticuerpo humanizado de la presente invención consiste en la secuencia de cadena ligera de Id. de Sec. n°: 118 y la secuencia de cadena pesada de Id. de Sec. n°: 126 (Anticuerpo B5). En otra realización, un anticuerpo humanizado de la presente invención consiste en la secuencia de cadena ligera de Id. de Sec. n°: 118 y la secuencia de cadena pesada de Id. de Sec. n°: 127 (Anticuerpo B6).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-36R humanizados, que incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como regiones variables de cadena pesada y ligera, comprenden una secuencia de aminoácidos de los residuos derivados del Anticuerpo B4, Anticuerpo B5 o Anticuerpo B6.
Los anticuerpos anti-IL-36R humanizados pueden incluir sustituciones de aminoácidos específicas en las regiones de consenso o marco de la línea germinal. La sustitución específica de residuos de aminoácidos en estas posiciones marco puede mejorar varios aspectos del rendimiento del anticuerpo, incluida la afinidad y/o estabilidad de la unión, por encima de lo demostrado en los anticuerpos humanizados formados por “ intercambio directo” de CDR o HVL en las regiones marco de línea germinal humana.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales con las combinaciones de regiones variables de cadena ligera y variable de Id. de Sec. n°: 80/88, 80/89 o 80/87. Dichas regiones variables se pueden combinar con regiones constantes humanas.
En este documento se describe un anticuerpo anti-IL-36R o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:
a) una secuencia L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 21, 30, 39, 57 y 67, respectivamente; o
b) una secuencia L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 22, 31, 40, 49 58 y 68, respectivamente; o
c) una secuencia L-CDR1 L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 23, 32, 41, 50 59 y 69, respectivamente; o
d) una secuencia L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 24, 33, 42, 51 60 y 70, respectivamente; o
e) una secuencia L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 25, 34, 43, 52 61 y 71, respectivamente; o
f) una secuencia L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 26, 35, 44, 53 62 y 72, respectivamente; o
g) una secuencia L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 27, 36, 45, 54 63 y 73, respectivamente; o
h) una secuencia L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 27, 36, 45, 54 64 y 74, respectivamente; o
i) una secuencia L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 27, 36, 45, 54 64 y 73, respectivamente; o
j) una secuencia L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 28, 37, 46, 55 65 y 74, respectivamente; o
k) una secuencia L-CDR1 L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 29, 38, 47, 56 66 y 75, respectivamente.
El anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención comprende: una secuencia L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 de Id. de Sec. n°: 26, 104, 44, 53, 62 y 72, respectivamente.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-36R humanizado es un fragmento de anticuerpo. Generalmente se han discutido varios fragmentos de anticuerpos anteriormente y hay técnicas que se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos pueden derivarse a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biofysical Methods 24: 107-117; y Brennan et al., 1985, Science 229: 81). Alternativamente, los fragmentos se pueden producir directamente en células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (véase, por ejemplo, Cárter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167). Por otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el profesional experto. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona fragmentos de anticuerpos que comprenden una de las combinaciones de regiones variables de cadena ligera y regiones variables de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80 y de Id. de Sec. n°: 87, 88 u 89, respectivamente.
Ciertas realizaciones incluyen un fragmento F(ab')2 de un anticuerpo anti-IL-36R humanizado que comprende una secuencia de cadena ligera de Id. de Sec. n°: 118 en combinación con una secuencia de cadena pesada de Id. de Sec. n°: 125, 126 o 127. Dichas realizaciones pueden incluir un anticuerpo intacto que comprende tal F(ab')2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo incluye una región constante que media la función efectora. La región constante puede proporcionar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o respuestas de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra una célula diana que expresa IL-36R. Los dominios efectores pueden ser, por ejemplo, una región Fc de una molécula de Ig.
El dominio efector de un anticuerpo puede ser de cualquier especie de animal vertebrado e isotipo adecuados. Los isotipos de diferentes especies animales difieren en las capacidades para mediar las funciones efectoras. Por ejemplo, la capacidad de la inmunoglobulina humana para mediar CDC y ADCC/ADCP generalmente está en el orden de IglVNgG1“ IgG3>IgG2>IgG4 e IgG1“ IgG3>IgG2/IgM/IgG4, respectivamente. Las inmunoglobulinas murinas median CDC y ADCC/ADCP generalmente en el orden de IgM“ IgG3 >> IgG2 b> IgG2 a >> IgG1 e IgG2 b> IgG2 a> IgG1 >> IgG3 murinas, respectivamente. En otro ejemplo, la IgG2 a murina media ADCC mientras que la IgG2 a murina y la IgM median CDC.
Modificaciones de anticuerpos
Los anticuerpos y agentes anti-IL-36R humanizados pueden incluir modificaciones del anticuerpo anti-IL-36R humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora, para mejorar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Dicha modificación es la introducción de residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor destrucción de células mediadas por el complemento y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Véase, por ejemplo, Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176: 1191-1195; y Shopes, 1992, J. Immunol. 148: 2918-2922. Los anticuerpos homodiméricos que tienen una actividad antitumoral mejorada también se pueden preparar usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado para contener regiones Fc duales, mejorando la lisis del complemento y las capacidades de ADCC del anticuerpo. Véase Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.
Se han generado anticuerpos con capacidad mejorada para soportar ADCC modificando el patrón de glicosilación de su región Fc. Esto es posible ya que la glucosilación de anticuerpos en el residuo de asparagina, N297, en el dominio Ch2 está implicada en la interacción entre los requisitos previos de los receptores IgG y Fcy para ADCC. Las líneas de células huésped se han diseñado para expresar anticuerpos con glucosilación alterada, como N-acetilglucosamina bisectante o fucosa reducida. La reducción de fucosa proporciona una mayor mejora de la actividad de ADCC que el aumento de la presencia de N-acetilglucosamina bisectante. Además, la mejora de ADCC por anticuerpos bajos en fucosa es independiente del polimorfismo FcYRIIIa V/F.
La modificación de la secuencia de aminoácidos de la región Fc de los anticuerpos es una alternativa a la ingeniería de glicosilación para mejorar la ADCC. El sitio de unión en IgG1 humana para los receptores de Fcy se ha determinado mediante un amplio análisis mutacional. Esto condujo a la generación de anticuerpos IgG1 humanizados con mutaciones Fc que aumentan la afinidad de unión por FcYRIIIa y aumentan ADCC in vitro. Además, se han obtenido variantes de Fc con muchas permutaciones diferentes de propiedades de unión, por ejemplo, unión mejorada a receptores FcyR específicos con unión inalterada o disminuida a otros receptores FcyR.
Otro aspecto incluye inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo humanizado o fragmentos del mismo conjugados con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos del mismo), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden usarse para formar inmunoconjugados útiles incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfasarcina , Proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos y similares. Una variedad de radionucleidos está disponible para la producción de anticuerpos a n ti-IL -36 R hum anizados radioconjugados. Los ejem plos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re.
Los conjugados del anticuerpo a n ti-IL -36 R hum anizado y el agente citotóxico o quimioterapéutico pueden prepararse mediante métodos conocidos, usando una variedad de agentes de acoplam iento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N -succin im id il-3 -(2-p irid ild itio l)(SPD P ), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de im idoésteres (como dimetil adipimidato H C L), ésteres activos (como disuccinim idil suberato), aldehídos (como glutareldehído), com puestos de b is-azido (como bis(p-azidobenzoil)hexanodiam ina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoilo)-etilendiamina), d iisocianatos (como tolueno 2,6 -diisocianato) y com puestos de flúor bis-activo (como 1,5 -d iflu o ro -2 ,4 -dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., 1987, S c ie n ce 238: 1098. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-m etildietilen triam inopentaacético m arcado con carbono 14 (M X-D T P A ) es un agente quelante ejem plar para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Los conjugados también pueden formarse con un enlazador escindible.
Los anticuerpos a nti-IL -36 R hum anizados descritos en el presente documento también pueden form ularse como inm unoliposom as. Los liposom as que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., 1985, Proc. Natl. A cad. Sci. U S A 82: 3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. A cad. Sci. U S A 77: 4030; y las patentes U .S. n ° 4.485.045 y 4.544.545. Los liposom as que tienen un tiempo de circulación mejorado se describen, por ejemplo, en la patente de EE .U U . n° 5 ,013 ,556.
S e pueden generar liposom as particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una com posición lipídica que com prende fosfatidilcolina, colesterol y derivatizado de P E G d fosfatidiletanolam ina (P E G -P E ). Los liposom as se extruyen a través de filtros de tam año de poro definido para producir liposom as con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab de un anticuerpo divulgado en el presente documento pueden conjugarse con los liposom as como se describe en Martin et al., 1982, J. Biol. C hem 257: 286-288 a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (como la doxorrubicina) está opcionalm ente contenido dentro del liposoma. V é a se , por ejemplo, G abizo n et al., 1989, J. National C a n c e r Inst. 81 (19): 1484.
Los anticuerpos descritos y divulgados en el presente documento también se pueden usar en procedimientos de A D E P T (terapia con profárm acos enzim áticos dirigidos por anticuerpos) conjugando el anticuerpo con una enzim a activadora de profárm acos que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidílico), en un m edicam ento activo contra el cáncer. V é a n se , por ejemplo, los docum entos W O 81 /01145 , W o 88/07378 y la patente de EE .U U . N ° 4.975.278. El componente enzim ático del inm unoconjugado útil para A D E P T es una enzim a capaz de actuar sobre un profármaco de tal m anera que lo convierta en su forma citotóxica m ás activa. La s enzim as esp ecíficas que son útiles en A D E P T incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa a lcalina para convertir profárm acos que contienen fosfato en fárm acos libres; arilsulfatasa para convertir profárm acos que contienen sulfato en fárm acos libres; citosina d esa m ina sa para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el m edicam ento contra el cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa serratia, term olisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), para convertir los profárm acos que contienen péptidos en fárm acos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, para convertir profárm acos que contienen sustituyentes D -am inoácidos; enzim as de corte de carbohidratos tales como pgalactosidasa y neuram inidasa para convertir profárm acos glicosilados en fárm acos libres; p-lactam asa para convertir fárm acos derivados con p -lactam as en fárm acos libres; y penicilina am id asas, tales como penicilina V am id asa o penicilina G am idasa, para convertir fárm acos derivados en sus nitrógenos de am ina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivam ente, en fárm acos libres. Alternativamente, los anticuerpos que tienen actividad enzim ática ("abzimas") se pueden u sar para convertir los profárm acos en fárm acos activos libres (véase, por ejemplo, M assey, 1987, Nature 328: 457-458). Los conjugados de anticuerpo-abzim a se pueden preparar por métodos conocidos para el sum inistro de la abzim a a una población de célu las tum orales, por ejemplo, uniendo covalentem ente la enzim a a los reactivos de reticulación heterobifuncional/anticuerpo a n ti-IL -36 R hum anizado discutidos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que com prenden al m enos la región de unión al antígeno de un anticuerpo descrito en el presente documento unido al m enos a una porción funcionalm ente activa de una enzim a como se describió anteriormente pueden construirse usando técnicas de A D N recom binante (véase, por ejemplo, Neuberger et al., 1984, Nature 312 : 604-608).
En ciertas realizaciones, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo a nti-IL -36 R hum anizado, en lugar de un anticuerpo intacto, por ejemplo, para aum entar la penetración en el tejido. Puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para aum entar su vida media en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión al receptor sa lva je en el fragmento de anticuerpo. En un método, la región apropiada del fragmento de anticuerpo se puede alterar (por ejemplo, mutar), o el epítopo se puede incorporar en un m arcador peptídico que luego se fusiona con el fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el medio, por ejemplo, mediante sín tesis de A D N o de péptidos. V é a se , por ejemplo, W O 96/32478.
En otras realizaciones, también se incluyen m odificaciones covalentes del anticuerpo a n ti-IL -36 R hum anizado. Las m odificaciones covalentes incluyen la modificación de residuos de cisteinilo, residuos de histidilo, residuos de lisinilo y amino terminal, residuos de arginilo, residuos de tirosilo, grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo), residuos de glutaminilo y asparaginilo, o residuos de serilo o treonilo. Otro tipo de modificación covalente implica el acoplam iento quím ico o enzim ático de glucósidos al anticuerpo. D ich as m odificaciones pueden realizarse por síntesis quím ica o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si corresponde. Se pueden introducir otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos amino o carboxi terminales.
La eliminación de cualquier porción de carbohidrato presente en el anticuerpo puede realizarse química o enzimáticamente. La desglicosilación química está descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys 259: 52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118: 131. La escisión enzimática de las porciones de carbohidratos en los anticuerpos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138: 350.
Otro tipo de modificación covalente útil comprende unir el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera establecida en una o más de las patentes de EE.UU. n° 4.640.835, patente de EE.UU. n° 4.496.689, patente de EE.UU. n° 4.301.144, patente de EE.UU. n° 4.670.417, patente de EE.UU. n° 4.791.192 y la patente de EE.UU. n° 4.179.337.
Humanización y variantes de secuencia de aminoácidos
Las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-IL-36R se pueden preparar mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo anti-IL-36R, o mediante síntesis de péptidos. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-IL-36R de los ejemplos aquí descritos. Cualquier combinación de deleciones, inserciones y sustituciones se realiza para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo anti-IL-36R humanizado o variante, como cambiar el número o la posición de los sitios de glucosilación.
Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anti-IL-36R que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de exploración de alanina", como lo describen Cunningham y Wells (Science, 244: 1081-1085 (1989)). Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutral o cargado negativamente (típicamente alanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno IL-36R. Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego se refinan mediante la introducción de variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no tiene que estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, se realiza un escaneo de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes de anticuerpo expresado anti-IL-36R se seleccionan para la actividad deseada.
Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de amino y/o carboxilo terminal que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-IL-36R fusionado a un marcador de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-IL-36R incluyen una fusión al extremo N o C del anticuerpo anti-IL-36R de una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-IL-36R eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de la FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 5 bajo el título de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares", o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos seleccionados.
TABLA C:
Residuo original Sustituciones ejemplares Sustituciones preferidas
Ala (A) val; leu ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gin; his; asp, lys; arg gln
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gln (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gln asp
Gly (G) ala ala
His (H) arg; asn; gln; lys; arg
Ilie (I) leu; val; reunió; ala; phe; norleucina leu
Leu (L) ile; norleucina; val; reunió; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) tyr; leu val; ile; ala; tyr
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) phe; trp; thr; ser phe
Val (V) leu; ile; reunió; phe ala; norleucina; leu
En química de proteínas, se acepta generalmente que las propiedades biológicas del anticuerpo se pueden lograr seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gin, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Cualquier residuo de cisteína que no esté involucrado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo anti-IL-36R humanizado o variante también puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula, prevenir la reticulación aberrante o proporcionar puntos de conjugación a un compuesto citotóxico o citostático. Por el contrario, pueden agregarse enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).
Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para un mayor desarrollo tendrá propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitución es la maduración por afinidad utilizando la presentación en fagos. Brevemente, varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo, 6­ 7 sitios) están mutados para generar todas las sustituciones de amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se muestran de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes mostradas en fagos se seleccionan luego por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión). Para identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede realizar la mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y la IL-36R humana. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas aquí. Una vez que se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a selección como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para un mayor desarrollo.
Otro tipo de variante de aminoácidos del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por "alterar" se entiende eliminar una o más porciones de carbohidratos encontrados en el anticuerpo, y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.
En algunas realizaciones, puede ser deseable modificar los anticuerpos de la invención para añadir sitios de glicosilación. La glucosilación de anticuerpos está típicamente unida a N o unida a O. Unido a N se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5- hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Por lo tanto, para glicosilar una proteína dada, por ejemplo, un anticuerpo, la secuencia de aminoácidos de la proteína está diseñada para contener una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición o la sustitución por uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-IL-36R se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que ocurren naturalmente) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis por casete de una versión variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-IL-36R.
Polinucleótidos, vectores, células huésped y métodos recombinantes
Otras realizaciones abarcan polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia que codifica un anticuerpo anti-IL-36R humanizado, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo humanizado. Los polinucleótidos aislados pueden codificar cualquier forma deseada del anticuerpo anti-IL-36R incluyendo, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa, Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, de cadena sencilla moléculas de anticuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Algunas realizaciones incluyen polinucleótidos aislados que comprenden secuencias que codifican la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. n°: 80 y región variable de la cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 87-89. Algunas realizaciones incluyen polinucleótidos aislados que comprenden secuencias que codifican la cadena ligera de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. n°: 118 y la cadena pesada de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de las Id. de Sec. n°: 125-127.
En un aspecto, la secuencia o secuencias de polinucleótidos aisladas codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera y cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118 e Id. de Sec. n°: 126, respectivamente; Id. de Sec. n°: 118 e Id. de Sec. n°: 127, respectivamente; o Id. de Sec. n°: 118 e Id. de Sec. n°: 125.
Los polinucleótidos que comprenden una secuencia que codifica un anticuerpo anti-IL-36R humanizado o un fragmento o cadena del mismo pueden fusionarse a una o más secuencias reguladoras o de control, como se conoce en la técnica, y pueden estar contenidos en vectores de expresión adecuados o célula huésped como se conoce en la técnica. Cada una de las moléculas de polinucleótidos que codifican los dominios variables de la cadena pesada o ligera pueden fusionarse independientemente a una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio constante, como un dominio constante humano, que permite la producción de anticuerpos intactos. Alternativamente, los polinucleótidos, o porciones de los mismos, pueden fusionarse entre sí, proporcionando una plantilla para la producción de un anticuerpo de cadena única.
Para la producción recombinante, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se inserta en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Están disponibles muchos vectores adecuados para expresar el anticuerpo recombinante. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.
Los anticuerpos anti-IL-36R humanizados también pueden producirse como polipéptidos de fusión, en los que el anticuerpo se fusiona con un polipéptido heterólogo, tal como una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo amino terminal de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia de señal heteróloga seleccionada es típicamente una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del anticuerpo anti-IL-36R humanizado, la secuencia señal puede sustituirse por una secuencia señal procariota. La secuencia señal puede ser, por ejemplo, secuencias líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lipoproteína, enterotoxina II termoestables y similares. Para la secreción en levadura, la secuencia señal nativa puede sustituirse, por ejemplo, con una secuencia líder obtenida del factor alfa de la invertasa de levadura (incluidos los líderes del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces), fosfatasa ácida, glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en WO90/13646. En células de mamíferos, se pueden usar secuencias señal de mamífero así como también líderes secretoras virales, por ejemplo, la señal de herpes simplex gD. El ADN para dicha región precursora se liga en el marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo anti-IL-36R humanizado.
Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas por una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el 2-u. El origen del plásmido es adecuado para la levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV y BPV) son útiles para la clonación de vectores en células de mamíferos. En general, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 generalmente se puede usar solo porque contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen que codifica un marcador seleccionable para facilitar la identificación de la expresión. Los genes marcadores seleccionables típicos codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, o alternativamente, son deficiencias auxotróficas del complemento, o en otras alternativas suministran nutrientes específicos que no están presentes en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilos.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a los medicamentos y, por lo tanto, sobrevive al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los medicamentos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Los marcadores seleccionables comunes para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-36R humanizado, como DHFR (dihidrofolato reductasa), timidina quinasa, metalotioneína-I y -II (como genes de metalotioneína de primates), adenosina desaminasa o descarboxilasa de ornitina y similares. Las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR (por ejemplo, DG44).
Alternativamente, las células huésped (particularmente los huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) se transformaron o co-transformaron con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-IL-36R, la proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable tal como el aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) se puede seleccionar mediante el crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. N ° 4.965.199.
Cuando la producción recombinante se realiza en una célula de levadura como célula huésped, el gen TRP1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39) puede usarse como un marcador seleccionable. El gen TRP1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n° 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de la levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2p como ATCC 20,622 y 38,626 se complementan con plásmidos conocidos que llevan el gen LEU2.
Además, los vectores derivados del plásmido circular pKD1 de 1,6 |im pueden usarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se describió un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8: 135). También se han descrito vectores de expresión estables de múltiples copias para la secreción de albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces (Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9: 968-975).
Los vectores de expresión y clonación generalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente unido a la molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-36R o una cadena polipeptídica del mismo. Los promotores adecuados para usar con huéspedes procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos como el promotor tac. Otros promotores bacterianos conocidos también son adecuados. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el anticuerpo anti-IL-36R humanizado.
Se conocen muchas secuencias promotoras eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases aguas arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases aguas arriba desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Los promotores inducibles tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento. Estos incluyen regiones promotoras de levadura para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas derivadas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levadura también se usan ventajosamente con promotores de levadura.
La transcripción del anticuerpo anti-IL-36R humanizado de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus (tal como Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatible con los sistemas de células huésped.
Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral de replicación de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector se describe en la patente U.S. N ° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente U.S. n° 4.601.978. Ver también Reyes et al., 1982, Nature 297: 598-601, que describe la expresión de ADNc de p-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous puede usarse como promotor.
Otro elemento útil que puede usarse en un vector de expresión recombinante es una secuencia potenciadora, que se usa para aumentar la transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo anti-IL-36R humanizado por eucariotas superiores. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usa un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, 1982, Nature 297: 17-18 para una descripción de elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia que codifica el anticuerpo anti-IL-36R humanizado, pero preferiblemente está ubicado en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles en las regiones no traducidas de 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo anti-IL-36R. Un componente útil de terminación de la transcripción es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver WO94/11026 y el vector de expresión descrito en el mismo. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-36R humanizados pueden expresarse usando el sistema CHEF. (Véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 5.888.809)
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente invención son las células procariotas, levaduras o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos anti-IL-36 humanizados. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es la más utilizada entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, una serie de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y útiles en este documento, como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus hospedadores como A. nidulans y A. niger.
Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-IL-36R humanizado glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos, que incluyen, por ejemplo, numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células huéspedes de insectos permisivas de huéspedes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori (gusano de seda). Una variedad de cepas virales para la transfección están disponibles públicamente por ejemplo, la variante L-1 del VPN de Autographa californica y la cepa Bm-5 del VPN de Bombyx mori, y dichos virus pueden usarse, particularmente para la transfección de células Spodoptera frugiperda.
Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también se pueden utilizar como huéspedes.
En otro aspecto, la expresión de anti-IL-36R humanizado se lleva a cabo en células de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina y las técnicas están ampliamente disponibles. Ejemplos de líneas celulares de mamífero huésped útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, (Graham et al., 1977, J Gen Virol. 36: 59), células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10), células de ovario de hámster chino/-DHFR1 (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 ; por ejemplo, DG44), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23: 243-251), células de riñón de mono (CV1 ATCC c Cl 70), células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34), células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, At CC CRL 1442), células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75), células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065), tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51), células TR1 (Mather et al., 1982, Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68), células MRC 5, Fs 4 células y línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos anti-IL-36R humanizados y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
Las células huésped usadas para producir un anticuerpo anti-IL-36R humanizado descrito en el presente documento pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios disponibles comercialmente como Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) y el medio Eagle modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) es adecuado para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en uno o más de Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44 , Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, Patente U.S. N° 4.767.704, Patente U.S. n° 4.657.866, Patente U.S. n° 4.927.762, Patente U.S. n° 4.560.655, Patente U.S. n° 5.122.469 , WO 90/103430 y WO 87/00195 pueden usarse como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) ), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente están presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir otros suplementos en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las que se usaron previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia.
Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, las células pueden ser interrumpidas para liberar proteínas como primer paso. Los desechos particulados, ya sea células huésped o fragmentos lisados, pueden eliminarse, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167 describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los restos celulares se pueden eliminar por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa como PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. Se puede usar una variedad de métodos para aislar el anticuerpo de la célula huésped.
La composición de anticuerpos preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una técnica de purificación típica. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas gamma1, gamma2 o gamma4 humanas (véase, por ejemplo, Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62: 1-13). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para gamma3 humano (véase, por ejemplo, Guss et al., 1986 EMBO J. 5: 1567-1575). Una matriz a la que se une un ligando de afinidad es con frecuencia agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables, como el vidrio de poro controlado o el poli(estirenovinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio Ch3, la resina Bakerbond ABX ™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía SEPHAROSE ™ en una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y la precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.
Después de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, típicamente realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, aproximadamente 0-0,25 M de sal).
También se describen en el presente documento ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de rigurosidad baja, moderada y alta, como se define en el presente documento, con toda o una porción (por ejemplo, la porción que codifica la región variable) de la secuencia de nucleótidos representada por una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. La porción de hibridación del ácido nucleico de hibridación tiene típicamente al menos 15 (por ejemplo, 20, 25, 30 o 50) nucleótidos de longitud. La porción de hibridación del ácido nucleico de hibridación es al menos 80%, por ejemplo, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98%, idéntica a la secuencia de una porción o la totalidad de un ácido nucleico que codifica un polipéptido anti-IL-36R (por ejemplo, una región variable de cadena pesada o cadena ligera), o su complementario. Los ácidos nucleicos de hibridación del tipo descrito en el presente documento pueden usarse, por ejemplo, como una sonda de clonación, un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR o una sonda de diagnóstico.
Usos no terapéuticos
Los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina de proteína A, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína IL-36R (o fragmento de la misma) para purificar, y luego el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra, excepto la proteína IL-36R, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará la proteína IL-36R del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-IL-36R, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-36R humanizados, también son útiles en ensayos de diagnóstico para detectar y/o cuantificar la proteína IL-36R, por ejemplo, detectar la expresión de IL-36R en células, tejidos específicos. o suero. Los anticuerpos anti-IL-36R se pueden usar de forma diagnóstica para, por ejemplo, controlar el desarrollo o la progresión de una enfermedad como parte de un procedimiento de prueba clínica para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento y/o prevención determinado. La detección se puede facilitar mediante el acoplamiento del anticuerpo anti-IL-36R. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones que utilizan diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnóstico de acuerdo con la presente invención.
Los anticuerpos anti-IL-36R pueden usarse en métodos ex vivo para diagnosticar un trastorno asociado a IL-36R (por ejemplo, un trastorno caracterizado por una expresión anormal de IL-36R) o para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno asociado a IL-36R. Dichos métodos incluyen poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo IL-36R y detectar la unión del anticuerpo a IL-36R. Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, línea celular, cultivo de tejidos u otra fuente de células que potencialmente expresen IL-36R. Los métodos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales de mamíferos son bien conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el método puede comprender además comparar el nivel de IL-36R en una muestra de paciente con una muestra de control (por ejemplo, un sujeto que no tiene un trastorno asociado con IL-36R) para determinar si el paciente tiene un trastorno asociado a IL-36R o está en riesgo de desarrollar ng un trastorno asociado a IL-36R.
Será ventajoso en algunas realizaciones, por ejemplo, para fines de diagnóstico, marcar el anticuerpo con una porción detectable. Están disponibles numerosos marcadores detectables, incluidos radioisótopos, marcadores fluorescentes, marcadores de sustrato enzimático y similares. El marcador se puede conjugar indirectamente con el anticuerpo usando diversas técnicas conocidas. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcadores mencionadas anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y, por lo tanto, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo se puede conjugar con un hapteno pequeño (como digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo digoxina). Por lo tanto, se puede lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
Los m arcadores de radioisótopos ejem plares incluyen 35S, 14C , 125I, 3H y 131I. El anticuerpo puede m arcarse con el radioisótopo, utilizando las técnicas descritas en, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Volúm enes 1 y 2, 1991, Coligen et al., Ed. W iley-Interscience, Nueva York, N.Y., Pubs. La radiactividad se puede medir, por ejemplo, mediante recuento de centelleo.
Los m arcadores fluorescentes ejem plares incluyen m arcadores derivadas de quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y su s derivados, dansilo, lisam ina, ficoeritrina y rojo T e xa s están disponibles. Los m arcadores fluorescentes se pueden conjugar con el anticuerpo mediante técnicas conocidas, como las descritas en por ejemplo Current Protocols in Immunology. La fluorescencia se puede cuantificar usando un fluorímetro.
Existen varios m arcadores de sustrato enzim ático bien caracterizados conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente U .S. n° 4.275.149 para una revisión). La enzim a generalm ente cataliza una alteración quím ica del sustrato crom ogénico que se puede medir utilizando d iversas técnicas. Por ejemplo, la alteración puede ser un cam bio de color en un sustrato que puede m edirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzim a puede alterar la fluorescencia o quim iolum iniscencia del sustrato. La s técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen anteriormente. El sustrato quim iolum iniscente se excita electrónicam ente por una reacción quím ica y luego puede emitir luz que se puede medir, usando un quimioluminómetro, por ejemplo, o dona energía a un receptor fluorescente.
Los ejem plos de m arcadores enzim áticos incluyen luciferasas tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente U .S. N ° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (H R PO ), fosfatasa alcalina, p -g alactosidasa, g lucoam ilasa, lisozim a, sacárido oxidasas (como glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), ox idasas heterocíclicas (como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, m icroperoxidasa y sim ilares. Las técnicas para conjugar enzim as con anticuerpos se describen, por ejemplo, en O 'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzym e-Antibody Conjugates for use in Enzym e Im m unoassay, en Methods in Enzym . (J. Langone y H. Van V un akis, eds.), A cadem ic press, N .Y., 73: 147 -166.
Ejem plos de com binaciones enzim a-sustrato incluyen, por ejemplo: peroxidasa de rábano picante (H R P O ) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de colorante como la ortofenilendiamina (O PD ) o 3,3',5,5'-tetram etil bencidina clorhidrato (TM B); fosfatasa a lcalina (A P) con para-nitrofenil fosfato como sustrato crom ogénico; y p -D -g atactosidasa (p -D -G a l) con un sustrato crom ogénico tal como p-nitrofenilp -D -g alacto sid a sa o sustrato fluorogénico 4-m etilum beliferil-p -D -galactosidasa.
N um erosas otras com binaciones de enzim a-sustrato están disponibles para los expertos en la materia. Para una revisión general de estos, ver la patente U .S. n° 4.275.149 y la patente U .S. n° 4.318.980.
En otra realización, el anticuerpo a nti-IL -36 R hum anizado se usa sin m arcar y se detecta con un anticuerpo m arcado que se une al anticuerpo a nti-IL -36 R hum anizado.
Los anticuerpos descritos en este documento pueden em plearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayo s de unión competitiva, en sayo s sandw ich directos e indirectos y en sayo s de inm unoprecipitación. V é a se , por ejemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A M anual of Techniques, págs. 147 -158 (C R C P ress, Inc. 1987).
El anticuerpo a n ti-IL -36 R o el fragmento de unión al antígeno del mismo puede usarse para inhibir la unión del ligando al receptor de IL-36. D ichos métodos com prenden adm inistrar un anticuerpo a nti-IL -36 R o un fragmento de unión a antígeno del mismo a una célula (por ejemplo, una célula de m amífero) o entorno celular, por lo que se inhibe la señalización m ediada por el receptor de IL-36. Estos métodos pueden realizarse in vitro o in vivo. Por "entorno celular" se entiende el tejido, el medio o la matriz extracelular que rodea una célula. El anticuerpo a n ti-IL -36 R o el fragmento de unión al antígeno del mismo se adm inistra al entorno celular de una célula de tal m anera que el anticuerpo o fragmento se a capaz de unirse a las m oléculas de IL -36 R fuera y alrededor de la célula, evitando a s í unión del ligando IL-36 a su receptor.
Kits de diagnóstico
S e puede usar un anticuerpo a nti-IL -36 R en un kit de diagnóstico, es decir, una com binación em paquetada de reactivos en cantidades predeterm inadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está m arcado con una enzim a, el kit puede incluir sustratos y cofactores requeridos por la enzim a, como un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable. A dem ás, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizadores, tam pones (por ejemplo, un tampón de bloque o tampón de lisis) y sim ilares. Las cantidades relativas de los d iversos reactivos pueden variar am pliam ente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialm ente la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, generalm ente liofilizados, incluidos los excipientes que en la disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.
Usos terapéuticos
En otra realización, un anticuerpo anti-IL-36R humanizado descrito en el presente documento es útil en el tratamiento de diversos trastornos asociados con la expresión de IL-36R como se describe en el presente documento. Un anticuerpo anti-IL36R humanizado para usar en el tratamiento de un trastorno asociado a IL-36R comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-IL-36R humanizado para ser administrado a un sujeto que lo necesite.
El anticuerpo o agente anti-IL-36R humanizado se administrará por cualquier medio adecuado, que incluye administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional (incluyendo perfusión o de otro modo contacto del injerto con el anticuerpo antes del trasplante). El anticuerpo o agente anti-IL-36R humanizado puede administrarse, por ejemplo, como una infusión o como un bolo. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo anti-IL-36R humanizado se administra adecuadamente mediante infusión de pulso, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. En un aspecto, la dosificación se administra mediante inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.
Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá de una variedad de factores tales como el tipo de enfermedad a tratar, como se definió anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.
Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 |ig/kg a 20 mg/kg (por ejemplo, 0,1-15 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar de aproximadamente 1 |ig/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Un régimen de dosificación ejemplar es el descrito en el documento WO 94/04188.
El término "supresión" se usa en el presente documento en el mismo contexto que "mejora" y "alivio" para significar una disminución de una o más características de la enfermedad.
La composición de anticuerpos se formulará, dosificará y administrará de manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el lugar de entrega del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo a administrar se regirá por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar el trastorno asociado con la expresión de IL-36R.
El anticuerpo no necesita ser, pero opcionalmente, está formulado con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo anti-IL-36R humanizado presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y con las rutas de administración que se usaron anteriormente o aproximadamente del 1 al 99% de las dosis empleadas hasta ahora.
Composiciones farmacéuticas y administración de las mismas.
Una composición que comprende un agente de unión a IL-36R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-36R) puede administrarse a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un trastorno inmunológico, trastorno respiratorio o cáncer. La invención proporciona además el uso de un agente de unión a IL-36R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-36R) en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un cáncer, trastorno respiratorio o trastorno inmunológico. El término "sujeto" como se usa en el presente documento significa cualquier paciente mamífero al que se pueda administrar un agente de unión a IL-36, que incluye, por ejemplo, humanos y mamíferos no humanos, tales como primates, roedores y perros. Los sujetos específicamente destinados al tratamiento incluyen humanos. Los anticuerpos o agentes pueden administrarse solos o en combinación con otras composiciones en la prevención o el tratamiento del trastorno inmunológico, trastorno respiratorio o cáncer. Dichas composiciones que pueden administrarse en combinación con los anticuerpos o agentes incluyen metotrexato (MTX) e inmunomoduladores, por ejemplo, anticuerpos o moléculas pequeñas.
Ejemplos de anticuerpos para usar en tales composiciones farmacéuticas son aquellos que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de Id. de Sec. n°: 80; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de cualquiera de las Id. de Sec.
n°: 87-89.
Otros ejemplos de anticuerpos para usar en tales composiciones farmacéuticas también son aquellos que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de cualquiera de las Id. de Sec. n°: 80 y 88, Id. de Sec. n°: 80 y 89, o Id. de Sec. n°: 80 y 87.
Otros ejemplos de anticuerpos para usar en tales composiciones farmacéuticas son también aquellos que comprenden un anticuerpo humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos de la región de la cadena ligera de la Id. de Sec. n°: 118; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de cualquiera de las Id. de Sec. n°: 125, 126 o 127.
Otros ejemplos de anticuerpos para usar en tales composiciones farmacéuticas son también los que comprenden el anticuerpo B4, el anticuerpo B5 o el anticuerpo B6.
Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar el agente de unión a IL-36R. Los métodos de introducción incluyen, entre otros, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. El agente de unión a IL-36R puede administrarse, por ejemplo, mediante infusión, bolo o inyección, y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos tales como agentes quimioterapéuticos. La administración puede ser sistémica o local. En realizaciones preferidas, la administración es por inyección subcutánea. Las formulaciones para tales inyecciones pueden prepararse, por ejemplo, en jeringas precargadas que pueden administrarse una vez cada dos semanas.
En realizaciones específicas, la composición del agente de unión a IL-36R se administra por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo el implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluida una membrana, como una membrana sialastica o una fibra. Típicamente, cuando se administra la composición, se usan materiales en los cuales el anticuerpo o agente anti-IL-36R no absorbe.
En otras realizaciones, el anticuerpo o agente anti-IL-36R se administra en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar una bomba (véase, por ejemplo, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med.
321: 574). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos. (Ver, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release (Langer y Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen y Ball eds., Wiley, Nueva York, 1984); Ranger y Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Ver también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol.
25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.) Otros sistemas de liberación controlada se discuten, por ejemplo, en Langer, supra.
Un agente de unión a IL-36R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-36R) puede administrarse como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del agente de unión y uno o más ingredientes farmacéuticamente compatibles.
En realizaciones típicas, la composición farmacéutica se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa o subcutánea a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración por inyección son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, el producto farmacéutico también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como la lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolla o una bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando el producto farmacéutico se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina estéril. Cuando el producto farmacéutico se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Además, la composición farmacéutica puede proporcionarse como un kit farmacéutico que comprende (a) un recipiente que contiene un agente de unión a IL-36R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-36R) en forma liofilizada y (b) un segundo recipiente que contiene un diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua estéril) para inyección. El diluyente farmacéuticamente aceptable puede usarse para la reconstitución o dilución del anticuerpo o agente liofilizado anti-IL-36R. Opcionalmente asociado con dicho(s) contenedor(es) puede haber una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, notificación que refleja la aprobación de la agencia de fabricación, uso o venta para la administración humana.
La cantidad del agente de unión a IL-36R (por ejemplo, anticuerpo anti-IL-36R) que es eficaz en el tratamiento o prevención de un trastorno inmunológico o cáncer puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para ayudar a identificar rangos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración y la etapa del trastorno inmunológico o cáncer, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del profesional y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales.
En general, la dosis de un anticuerpo anti-IL-36R o un agente de unión a IL-36R administrado a un paciente con un trastorno inmunológico o cáncer que expresa IL-36R es típicamente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal del sujeto. La dosis administrada a un sujeto es de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto.
Las dosis ejemplares incluyen, pero sin limitación, de 1 ng/kg a 100 mg/kg. En algunas realizaciones, una dosis es de aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg o aproximadamente 16 mg/kg. La dosis puede administrarse, por ejemplo, diariamente, una vez por semana (semanalmente), dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, quincenal o mensualmente, cada dos meses, o cada tres meses. En realizaciones específicas, la dosis es de aproximadamente 0,5 mg/kg/semana, aproximadamente 1 mg/kg/semana, aproximadamente 2 mg/kg/semana, aproximadamente 3 mg/kg/semana, aproximadamente 4 mg/kg/semana, aproximadamente 5 mg/kg/semana, aproximadamente 6 mg/kg/semana, aproximadamente 7 mg/kg/semana, aproximadamente 8 mg/kg/semana, aproximadamente 9 mg/kg/semana, aproximadamente 10 mg/kg/semana, aproximadamente 11 mg/kg/semana, aproximadamente 12 mg/kg/semana, aproximadamente 13 mg/kg/semana, aproximadamente 14 mg/kg/semana, aproximadamente 15 mg/kg/semana o aproximadamente 16 mg/kg/semana. En algunas realizaciones, la dosis varía de aproximadamente 1 mg/kg/semana a aproximadamente 15 mg/kg/semana.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión a IL-36R pueden comprender además un agente terapéutico, conjugado o no conjugado con el agente de unión. El anticuerpo anti-IL-36R o el agente de unión a IL-36R se pueden administrar conjuntamente en combinación con uno o más agentes terapéuticos para uso en el tratamiento o prevención de trastornos inmunológicos o cánceres.
Dicha administración de terapia combinada puede tener un efecto aditivo o sinérgico sobre los parámetros de la enfermedad (por ejemplo, la gravedad de un síntoma, el número de síntomas o la frecuencia de la recaída).
Con respecto a los regímenes terapéuticos para la administración combinatoria, en una realización específica, un anticuerpo anti-IL-36R o un agente de unión a IL-36R debe administrarse simultáneamente con un agente terapéutico. En otra realización específica, el agente terapéutico se debe administrar antes o después de la administración del anticuerpo anti-IL-36R o agente de unión a IL-36R, por al menos una hora y hasta varios meses, por ejemplo, al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un mes o tres meses, antes o después de la administración n del anticuerpo anti-IL-36R o agente de unión a IL-36R.
Artículos de fabricación
En otro aspecto, se incluye un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica. El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-IL-36R humanizado. La etiqueta en o asociada con el envase indica que la composición se usa para tratar la condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la invención.
Los anticuerpos de la presente invención (anticuerpos humanizados B4, B5 y B6 basados en el anticuerpo principal de ratón 81B4) se describen adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Ej empl os
Ejemplo 1: Identificación de anticuerpos anti-IL-36R humano
Se inmunizaron múltiples cepas de ratón con IL-36R humana producida de forma recombinante (ECD - dominio extracelular: aminoácidos 20-332 de Genbank n° acceso NP_003845) y las que generaron una fuerte respuesta de título tomada en la generación tradicional de hibridoma. Los productos de fusión que provocan una fuerte unión a la IL-36R humana (ECD) pero no se unen a la IL-1R1 humana (el miembro de la familia de IL-1R más relacionado) se subclonaron y se volvieron a analizar. Se identificaron múltiples hibridomas para producir anticuerpos monoclonales que unían y neutralizaban la señalización de IL-36R (véanse los ejemplos 2, 3 y 4). Los dominios variables se clonaron a partir de los hibridomas usando conjuntos de cebadores de PCR estándar. Los dominios variables y las CDR específicas de los anticuerpos monoclonales representativos se describen anteriormente. Todos los anticuerpos de ratón se convirtieron en anticuerpos quiméricos que consisten en dominios variables de ratón en dominios constantes humanos (hu IgGIKO/kappa). El hu IgGIKO (knock out) tiene dos mutaciones de reemplazo (Leu234Ala y Leu235Ala) que eliminan la actividad de ADCC y CDC al reducir las funciones efectoras como FcyR y la unión del complemento. Los dominios variables del ratón y los anticuerpos quiméricos son idénticos. Los anticuerpos quiméricos se generan para confirmar la función del anticuerpo y asegurar que se haya obtenido la secuencia de dominio variable correcta.
Ejemplo 2: afinidades de unión molecular de anticuerpos anti-IL-36R de ratón identificados
A) La cinética y las afinidades de unión de los anticuerpos anti-IL-36R que se unen a la IL-36R humana recombinante se midieron usando el Proteon (Bio-Rad, Hercules, CA) usando material generado a partir de hibridoma después de la purificación en una sola columna. Se estimó que las afinidades de unión de todos los ratones que conducen a la activación de IL-36R humana a una sola concentración de recubrimiento superficial de IL-36R es <100 pM. Las afinidades de unión de los anticuerpos de ratón a IL-36R humana se realizan a 7 densidades de superficie diferentes (ajuste global) se muestran en la Tabla 1. La unión de las IgG anti-IL36R quiméricas es equivalente a las derivaciones de ratón correspondientes.
Tabla 1: Afinidad de unión de anticuerpos anti-IL-36R de ratón.
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B) Selectividad molecular sobre IL-36R de ratón e IL-1R1 humana
Los anticuerpos anti-IL-36R de ratón y quiméricos también se inyectaron sobre una IL-36R de ratón o una superficie de IL-1 R1 humana a una concentración de 100 nM. La señal de unión al IL-36R de ratón y al IL-1 R1 humano para estos anticuerpos medidos usando el Octeto Fortebio (Fortebio, Menlo Park, CA) es cero, lo que indica que estos anticuerpos se unen selectivamente al IL-36R humano. La unión de los anticuerpos anti-IL-36R a la IL-36R humana también se analizó en presencia de suero humano al 50% y no se observó ningún efecto significativo del suero sobre la tasa de unión demostrando una alta especificidad.
Ejemplo 3: Potencia de los anticuerpos anti-IL-36R humanos quiméricos y de ratón en ensayos funcionales de humanos y cynomolgus.
Protocolos: Ensayos de liberación de pNFKB/citocina de células NCI/ADR-RES humanas.
Reactivos:
R&D Systems: rh truncada IL36p
R&D Systems: rh truncada IL36y
R&D Systems: rh truncada IL36a:
MA6000 fosfo- NFkB (Ser536) Kit de lisado de células enteras
Meso Scale Diagnostics, LLC
MSD ELISA personalizado humanos ensayo de 4 puntos en 96 pocillos
Meso Scale Diagnostics, LLC
Las células NCI/ADR-RES se colocaron en placas a 45000 células/pocillo, en medio RPMI con suero al 0,25% en una placa de 96 pocillos. Se utilizó una placa para el análisis de pNFKB y otra para la liberación de citocinas. Las placas fueron incubadas durante la noche a 37 °C, 5% de CO2. Los ligandos (IL36a, p o y) y los anticuerpos se diluyeron a la concentración deseada 4x en medios con suero (SS). Se agregaron antagonistas (anticuerpos) a las células antes del ligando. Para pNFKB: las células NCI /- ligando y antagonista se incubaron durante 1 hora, 37 °C, 5% de CO2. Luego se aspiró el medio y las células se lisaron en 100 ml/pocillo de tampón de lisis completo en hielo 30 min. Luego se centrifugó el lisado a 2500 RPM, 20 min, 4 °C, y se transfirió a una placa ELISA para MSD y se analizó el pNFKB según el protocolo del fabricante. Para la liberación de citocinas: 18-24 horas después de la estimulación, los sobrenadantes se transfirieron a una placa ELISA para MSD y se analizaron para detectar citocinas según el protocolo del fabricante.
Protocolo: pNFKB (S536) ELISA MSD para células IL-36R BaF/3 de cynomolgus
Las células IL-36R BaF/3 de cynomolgus se colocaron en placas a 90.000 células/pocillo en medio SS en una placa de 96 pocillos. Se añadieron de 100 |il de medio a pocillos de control. Los antagonistas (anticuerpos) se diluyeron a la concentración deseada 4x y se añadieron 50 |il a cada pocillo. Los ligandos (IL36a, p o y) se diluyeron a la concentración deseada 4x en medio SS y se añadieron 50 |il a cada pocillo (para un volumen final de 200 |il). Las placas se incubaron durante 15 minutos, 37 °C, 5% de CO2. Las placas se centrifugaron brevemente, se aspiraron los medios y las células se lisaron en 100 |il/pocillo de tampón de lisis completo (véase el protocolo MSD pNFKB) y se incubaron en hielo 30 minutos. Los lisados se centrifugaron luego a 2500 RPM, 20 min, 4 °C y se transfirieron a una placa ELISA MSD. Luego se evaluaron los lisados para determinar la actividad de pNFKB usando el kit MSD como se describió anteriormente.
Resultados: los resultados de CI90 para anticuerpos de ratón anti-IL-36R humano en ensayos funcionales humanos (pNFKB y liberación de citocinas) y un ensayo funcional de cynomolgus (pNFkB) con ligandos de IL-36 humanos se muestran en la Tabla 2. Los resultados de CI90 para los anticuerpos anti-IL-36R humanos quiméricos en ensayos funcionales humanos (pNFKB y liberación de citoquinas) y un ensayo funcional de cynomolgus (pNFKB) con ligandos de IL-36 humanos se muestran en la Tabla 3.
Tabla 2: Potencia de anticuerpos de ratón en ensayos de células funcionales
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Tabla 3: Potencia de anticuerpos quiméricos en ensayos de células funcionales
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Ejemplo 4: Unión de anticuerpos de ratón anti-IL-36R humana a células que expresan IL-36R humana
Protocolo para la unión de anticuerpos por citometría de flujo
Las células HEK293 transfectadas con células IL-36R o NCI/ADR-RES humanas de longitud completa se pasaron durante 24 horas antes de la tinción. Las células se retiraron de los matraces enjuagando con 10 ml de EDTA 5 mM en PBS, y luego se incubaron a 37 °C durante 10 minutos con 10 ml adicionales de EDTA 5 mM y 2,5 ml de Accumax para eliminar/dispersar las células. Luego, los anticuerpos se diluyeron a las concentraciones especificadas en PBS 2% de BSA, y las células se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo se lavó luego añadiendo 200 |il de PBS y luego se centrifugó. Luego se añadió reactivo secundario a 50 |il por pocillo y las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se lavaron como se indicó anteriormente. Las células se resuspendieron en 200 |il de PBS y se analizaron por citometría de flujo. Las CE50 de unión para los anticuerpos de ratón anti-IL-36R humanos que se unen a los transfectantes HEK de IL-36R humanos se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
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Ejemplo 5: Producción de anticuerpos IL-36R humanizados
Para reducir la inmunogenicidad potencial después de la administración en el hombre, los anticuerpos monoclonales de ratón anti-IL-36R humanos 81B4 y 73C5 se "humanizaron" mediante un proceso de diseño y selección. Las secuencias marco humanas se seleccionaron para las derivaciones de ratón basándose en la homología del marco, la estructura CDR, los residuos canónicos conservados, los residuos de empaquetamiento de la interfaz conservados y otros parámetros. La sustitución específica de residuos de aminoácidos en estas posiciones de marco puede mejorar varios aspectos del rendimiento de los anticuerpos, incluida la afinidad y/o estabilidad de unión, por encima de lo demostrado en los anticuerpos humanizados formados por "intercambio directo" de CDR o HVL en las regiones del marco de la línea germinal humana. Los Fab que mostraron una unión mejor o igual y una expresión mejorada en comparación con el Fab parental quimérico se seleccionaron para caracterización adicional. Las regiones variables humanizadas representativas para el anticuerpo 81B4 y 73C5 se muestran en la sección de especificaciones. De esta manera, del Anticuerpo B1 al Anticuerpo B6 fueron anticuerpos humanizados derivados del anticuerpo de ratón 81B4 (clonado en un esqueleto IgG1 KO humano (KO = knock-out)/kappa. Los anticuerpos B1 a B6 se muestran en la Tabla A. Del anticuerpo C1 al Anticuerpo C3 fueron anticuerpos humanizados derivados del anticuerpo de ratón 73C5 (clonado en un esqueleto humano IgG1-KO (KO = knock-out)/kappa. Los anticuerpos C1 a C3 se muestran en la Tabla C.
Ejemplo 6: Unión de anticuerpos humanizados IL-36R
La cinética y las afinidades de unión de los anticuerpos anti-IL-36R humanizados que se unen a la IL-36R humana recombinante se midieron usando la proteína (Bio-Rad, Hercules, CA). La IL-36R humana se inmovilizó a 5 densidades de superficie diferentes y los resultados se analizaron usando ajuste global (véase la Tabla 5 que muestra los resultados de tres experimentos). La unión de los anticuerpos humanizados a las células NCI/ADR-RES mediante citometría de flujo se midió usando el protocolo descrito en el Ejemplo 4 (Ver Tabla 5 para los valores de CE90 ). Tabla 5 - Afinidades de unión molecular y celular de anticuerpos humanizados anti-IL-36R humanos.
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Ejemplo 7: potencia de los anticuerpos humanizados anti-IL-36R humanos en ensayos humanos funcionales El bloqueo funcional de la señalización con las variantes IL-36R humanizadas de células NCI/ADR-RES humanas se ensayó como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados de CI90 para los anticuerpos anti-IL-36R humanizados en ensayos funcionales humanos (pNFKB y citocina liberación) con ligandos de IL-36 humanos se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6: Potencia [CI90 (nM)] de anticuerpos humanizados en ensayos de células NCI/ADR-RES funcionales humanas
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Ejemplo 8: Potencia de anticuerpos anti-IL-36R en ensayos de queratinocitos primarios humanos funcionales Protocolos: Ensayos de liberación de pNFkB/citocinas epidérmicas primarias de queratinocitos humanos
Las células se sembraron en placas a 30.000 células/pocillo en medio de cultivo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5% de CO2. Luego se realizaron los ensayos como se describe en el Ejemplo 3. Resultados: los resultados de CI90 para anticuerpos anti-IL-36R de ratón, quiméricos y humanizados en ensayos de queratinocitos primarios humanos (liberación de pNFkB e IL-8) estimulados con ligandos de IL-36 humanos se muestran en Tabla 7, Tabla 8 y Tabla 9, respectivamente.
Tabla 7
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Tabla 8: Potencia de los anticuerpos quiméricos anti-IL-36R en ensayos de queratinocitos humanos primarios
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Tabla 9: Potencia de anticuerpos anti-IL-36R humanizados en ensayos de queratinocitos humanos primarios
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Ejemplo 9 Potencia de anticuerpos anti-IL-36R en ensayos de células epiteliales intestinales primarias humanas funcionales
Protocolos: ensayos de liberación de citocinas en células epiteliales intestinales primarias humanas
Las células se colocaron en placas a 30.000 células/pocillo en medio de cultivo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5% de CO2. Luego se realizaron los ensayos como se describe en el Ejemplo 3. Resultados: Los resultados de CI90 para anticuerpos anti-IL-36R de ratón en ensayos de células epiteliales intestinales primarias humanas (liberación de pNFkB e IL-8) estimulados con ligandos de IL-36 humanos se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10: Potencia de anticuerpos de ratón anti-IL-36R en ensayos primarios de células epiteliales intestinales humanas
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Ejemplo 10: Potencia de anticuerpos anti-IL-36R en ensayos funcionales de miofibroblastos intestinales primarios humanos
Protocolos: ensayos de liberación de citocinas en miofibroblastos intestinales primarios humanos pNFKB
Las células se colocaron en placas a 30.000 células/pocillo en medio de cultivo en una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2. Luego se realizaron los ensayos como se describe en el Ejemplo 3.
Resultados: Los resultados de CI90 para anticuerpos anti-IL-36R en ensayos de miofibroblastos intestinales primarios humanos (liberación de pNFkB e IL-8) estimulados con ligandos de IL-36 humanos se muestran en la Tabla 11 y la Tabla 12.
Tabla 11: Potencia de los anticuerpos anti-IL-36R de ratón y quiméricos en ensayos de miofibroblastos intestinales humanos primarios
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Tabla 12: Potencia de los anticuerpos anti-IL-36R humanizados en ensayos de miofibroblastos intestinales humanos primarios
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Ejemplo 11: Potencia de anticuerpos anti-IL-36R en ensayos funcionales de fibroblastos dérmicos primarios humanos Protocolos: Ensayos de liberación de pNFKB/citocinas en fibroblastos dérmicos primarios humanos
Las células se colocaron en placas a 30.000 células/pocillo en medio de cultivo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% de CO2. Luego se realizaron los ensayos como se describe en el Ejemplo 3. Resultados: Los resultados de CI90 para anticuerpos anti-IL-36R en ensayos de fibroblastos dérmicos primarios humanos (liberación de pNFkB e IL-8) estimulados con ligandos de IL-36 humanos se muestran en la Tabla 13 y la Tabla 14.
Tabla 13: Potencia de anticuerpos anti-IL-36R de ratón y quiméricos en ensayos de fibroblastos dérmicos humanos primarios
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Tabla 14: Potencia de anticuerpos anti-IL-36R humanizados en ensayos primarios de fibroblastos dérmicos humanos
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Ejemplo 12: Potencia de anticuerpos anti-IL-36R de ratón en células tubulares proximales primarias humanas funcionales
Protocolo: Ensayos de liberación de pNFKB/citocinas en células tubulares proximales primarias humanas.
Las células se colocaron en placas a 5.000 células/pocillo en medio de cultivo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5% de CO2. Los ensayos se realizaron como se describe en el Ejemplo 3.
Resultados: los resultados de CI90 para anticuerpos anti-IL-36R de ratón, quiméricos y humanizados en ensayos de células tubulares proximales primarias humanas (liberación de IL-8) estimulados con ligandos de IL-36 humanos se muestran en la Tabla 15.
Tabla 15: Potencia de anticuerpos de ratón y humanos anti-IL-36R en ensayos primarios de células tubulares proximales humanas
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Ejemplo 13: Inhibición de la producción de IL-8 a partir de la epidermis humana reconstruida estimulada por IL-36y.
Protocolo de epidermis reconstruida
Los anticuerpos anti-IL-36R (1,5 |ig/ml) se incubaron previamente con epidermis humana reconstruida y se estimularon con IL-36y recombinante humana (20 ng/ml). Se usó IL-1p humana recombinante (20 ng/ml; R&D Systems) como control positivo. Después de 24 horas en cultivo, se recogieron los sobrenadantes celulares y se analizaron para IL-8 (los ensayos para IL-8 se describen en el Ejemplo 3). Las muestras se analizaron por triplicado y el error estándar promedio pg/ml ± se muestra en la tabla a continuación (Tabla 16).
Tabla 16
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Ejemplo 14: La inhibición de la expresión del gen S100A7 y S100A12 inducida por el ligando IL-36 en la epidermis humana reconstruida
La estimulación de la epidermis humana reconstruida con ligandos IL-36 agonsíticos induce la expresión del gen S100A7 y S100A12. S100A7 y S100A12 son genes ubicados dentro del complejo de diferenciación epidérmica.
Protocolo: La epidermis humana reconstruida se incubó con anticuerpos anti-IL-36R (1,5 |ig/ml) y se estimuló con IL-36y recombinante humana (20 ng/ml). Se usó IL-1p humana recombinante (20 ng/ml; R&D Systems) como control positivo. Después de 24 horas en cultivo a 5% de CO2 y 37 °C, se aisló el ARN de la epidermis humana reconstruida y se analizó la expresión génica por reacción en cadena de la transcriptasa-polimerasa inversa en tiempo real. La expresión relativa se calculó utilizando el método 2'ññCt. Las muestras se analizaron por triplicado y la expresión promedio ± error estándar se muestra en la tabla a continuación (Tabla 17).
Tabla 17
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Ejemplo 15: eficacia del anticuerpo anti-IL-36R en el modelo de psoriasis de xenotrasplante
Protocolo: Se obtuvieron biopsias de sangre y piel no lesional de 24 pacientes con psoriasis que fueron diagnosticados clínicam ente por un dermatólogo. La s b iopsias de piel se trasplantaron en ratones NIH-III inm unodeficientes y se les permitió injertar durante un período de cuatro a cinco sem anas.
S e aislaron célu las m ononucleares de sangre periférica (P B M C ) de la sangre recogida de cada donante en el momento de la biopsia para inyección intradérmica en la piel injertada. A ntes de la inyección, las P B M C se estimularon con 1 |ig/m l de enterotoxina estafilocócica B (Toxin Technologies, Florida, E E . UU.) y 80 U/ml de IL -2 recombinante hum ana (Peprotech Inc., Oosterhout, P a ís e s Bajos). La s P B M C autólogas se inyectaron por v ía intradérmica con 7 ,5 x 105 célu las en P B S para sincronizar la inducción de inflamación de la piel y el fenotipo de psoriasis. T res sem a na s después de la inyección de células, se extrajeron las b iopsias de los ratones y se analizaron por histología.
La tinción histológica se realizó en tejido de piel crioconservado de todos los grupos. La s seccio n es transversales diagonales (8 |im), que cubren todas las cap as de la piel, se prepararon como se describe en la Figura 4. Para la evaluación del grosor epidérmico, se seleccionaron al a za r dos seccio n es no seriales del centro de la biopsia y se tiñeron con hem atoxilina-eosina. Posteriormente, las seccio n es se evaluaron con un aumento de 100 veces. A lo largo de toda la biopsia, las longitudes de cresta se midieron en am bas seccio n es usando una cám ara O lym pus D P 71 y el software de im ágenes C e llD (V 2.7, Munster, A lem ania). La longitud de la cresta se define como: la distancia entre el borde superior del estrato granuloso y el fondo de la cresta. La s b iopsias se puntuaron al azar y de forma cegada. Los resultados para el grosor epidérm ico promedio y el grosor epidérm ico máximo para cada grupo de tratamiento se muestran en la Ta b la 18. Los resultados para el cam bio neto en el grosor epidérm ico en cada grupo de tratamiento se m uestran en la Ta b la 19.
Tab la 18
Figure imgf000056_0001
Tab la 19
Figure imgf000056_0002
Ejem plo 16: La inflamación pulm onar subcrónica d esp ués de 3 se m a n a s de exposición al humo de cigarrillos en ratones de tipo sa lva je y ratones knockout homocigotos de receptor 2 sim ilar de interleucina-1
Protocolo: S e expusieron ratones de tipo sa lva je o de tipo receptor 2 sim ilar de interleucina-1 al humo de cigarrillo durante 3 sem a na s para inducir ansiedad pulmonar. La s sem a na s 1 y 2 consistieron en 5 d ías de exposición consecutivos, m ientras que los ratones fueron expuestos durante 4 d ías consecutivos durante la sem ana 3. Los ratones fueron expuestos a 5 cigarrillos cada día con intervalos de exposición de cigarrillos de 24 minutos (16 minutos) y aire fresco (8 minutos). D ieciocho horas después de la exposición final, los ratones fueron lavados con 2 x 0,8 ml de solución salina de H ank (E D T A 0,6 mM). El sobrenadante y el sedim ento celular se recogieron del lavado alveolar bronquial después de la centrifugación durante 10 minutos. El recuento total de célu las de m acrófagos y neutrófilos en el lavado alveolar bronquial para cada grupo de exposición se muestra en la Tab la 20.
Tab la 20
Figure imgf000056_0003

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:
a) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80; y
b) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 87, Id. de Sec. n°: 88 o Id. de Sec. n°: 89.
2. El anticuerpo anti-IL-36R de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 125.
3. El anticuerpo anti-IL-36R de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 126.
4. El anticuerpo anti-IL-36R de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de Sec. n°: 118 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 127.
5. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, para uso en medicina.
7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el uso en medicina es el uso en un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad respiratoria, de un trastorno metabólico, de un trastorno inflamatorio mediado por el epitelio, fibrosis o cáncer.
8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el uso en medicina es el uso en un método para el tratamiento de psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, EPOC, asma crónica o espondilitis anquilosante.
9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el uso en medicina es el uso en un método para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde el uso en medicina es el uso en un método para el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde el uso en medicina es el uso en un método para el tratamiento de la enfermedad de colitis ulcerosa.
12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el uso en medicina es el uso en un método para el tratamiento de la pustulosis palmoplantar.
13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el uso en medicina es el uso en un método para el tratamiento de psoriasis pustular generalizada.
14. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo anti-IL-36R o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, preferiblemente una secuencia de ADN o ARN.
15. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 14, que codifica
(a) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 80, y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 87, 88 o 89; o
(b) una cadena ligera y una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 118 y Id. de Sec. n°: 125, respectivamente; Id. de Sec. n°: 118 y Id. de Sec. n°: 126, respectivamente; o Id. de Sec. n°: 118 y Id. de Sec. n°: 127, respectivamente.
16. Un vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, preferiblemente un vector de expresión, más preferiblemente un vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con la invención en asociación funcional con una secuencia de control de la expresión.
17. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, y/o un vector de acuerdo con la reivindicación 16.
18. Un método para la producción de un anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende el uso de un polinucleótido según la reivindicación 14 o 15, y/o de un vector según la reivindicación 16 y/o de una célula huésped según la reivindicación 17.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende los pasos (a) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno y (b) recuperar el anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno.
20. Un kit de diagnóstico que comprende un anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
21. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 20, para usar en un método de diagnóstico in vivo de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, una enfermedad respiratoria, un trastorno metabólico, un trastorno inflamatorio mediado por el epitelio, fibrosis, cáncer, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, EPOC, asma crónica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn o enfermedad de colitis ulcerosa.
22. Un método de diagnóstico ex vivo que comprende el uso del anticuerpo anti-IL-36R o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
23. El método de diagnóstico ex vivo de acuerdo con la reivindicación 22, para el diagnóstico de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, una enfermedad respiratoria, un trastorno metabólico, un trastorno inflamatorio mediado por el epitelio, fibrosis, cáncer, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, EPOC, asma crónica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn o enfermedad de colitis ulcerosa.
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