KR102159109B1 - 항 ｉｌ-36ｒ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 항-IL-36R 결합 화합물, 특히, 신규한 항-IL-36R 항체, 및 치료학적 및 진단학적 방법, 및 이를 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

항 ＩＬ-36Ｒ 항체{ANTI IL-36R ANTIBODIES}
서열 목록
본 출원은, EFS-Web을 통한 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 이에 의해 서열 목록의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 2012년 11월 12일에 생성된 상기 ASCII 카피는, 명칭이 09-0583WO.txt이고, 크기가 147,390 바이트이다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 일반적으로, 진단학적 및 치료학적 용도를 위한 항-IL-36R 항체에 관한 것이다. 당해 항체는, 약제학적 조성물 및 이러한 화합물을 포함하는 키트에 사용할 수 있다. 당해 항체는 각종 질환 또는 장애, 예를 들면, 사람에서의 면역 질환, 염증 질환, 자가면역 질환, 섬유증 질환 및 호흡기 질환의 치료를 위한 방법에 유용하다.
IL-1계열의 사이토카인은, 11개의 상이한 리간드들, 즉, IL-1α(IL-1F1로서도 칭함), IL-1β(IL-1F2), IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra 또는 IL-1F3), IL-18(IL-1F4), IL-1F5 내지 IL-1F10, 및 IL-1F11(또는 IL-33)로 이루어진다. IL-1α 및 IL-1β는, I형 IL-1 수용체(IL-1RI)에의 결합 및 공통의 공동-수용체 IL-1 수용체 액세서리 단백질(IL-1RAcP)의 유입에 대한 염증 유발 활성을 유도하는 것으로 공지되어 있고, 반면에 IL-1Ra는 IL-1RI에의 IL-1 결합의 경쟁적 저해제로서 작용하고, 따라서, 항-염증 활성을 발휘한다. 많은 연구는, IL-18이, IFN-γ의 유도인자인 염증유발성 사이토카인임을 보고하였고, IL-33은, 특히, Th2 반응의 제어에 관여하는 면역조절성 사이토카인으로서 기술되었다. IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, 및 IL-1F9를포함하는 IL-1 계열의 새로운 구성원은, IL-1의 동족체에 대한 DNA 데이터베이스에서의 검색을 통해 확인되었다. 사람 및 마우스에서, 이들 사이토카인을 암호화하는 모든 유전자는 염색체 2q의 300kb 미만으로 맵핑되었고, 여기서, 이들은 IL1A, IL1B, 및 IL1RN 유전자에 의해 플랭킹되었다. IL-1F6, IL-1F8, 및 IL-1F9는 IL-1 및 IL-1Ra와 21% 내지 37%의 아미노산 서열 상동성을 공유하고, 반면에 IL-1F5는 IL-1Ra와 52%의 아미노산 서열 상동성을 나타내고, IL-1F5는 내인성 수용체 길항제를 나타낼 수도 있음을 시사한다.
IL-1F6, IL-1F8, 및 IL-1F9는, IL-1R 계열의 수용체인 IL-1Rrp2에 결합하고, IL-1RAcP를 공동-수용체로서 사용하여 IL-1에 의해 유도된 것과 유사한 세포내 신호를 자극하고, 반면에 IL-1F5는, IL-1Rrp2를 과발현하는 Jurkat T 세포에서의 IL-1F9-유도된 NF-κB 활성화를 저해하는 것으로 나타났다. IL-1β와 유사하게, 이들 IL-1 동족체는, 모두 리더 펩타이드가 결여되어 있고, IL-1Rrp2 작용제의 방출이, IL-1β 분비를 조절하는 메커니즘과 상이한 메커니즘에 의해 제어될 수 있음이 연구에 시사되어 있지만 종래 분비 경로를 통해서 방출될 수 없다. 이들 사이토카인의 특이적 생물학적 효과를 인정하기 위해, 그리고, 이들이 모두 동일한 수용체에 결합함을 인지하기 위해, 최근, IL-1 동족체의 명명법을 개정할 것이 제안되었다. 따라서, IL-1Rrp2는 현재 IL-36R이라고 칭하고, 이의 리간드는 IL-36α(IL-1F6), IL-36β(IL-1F8), 및 IL-36γ(IL-1F9)라고 칭한다. 추가로, 수용체 길항제 활성을 발휘하는 것으로 나타난 IL-1F5는 IL-36Ra라고 재명명하였다.
IL-36α, IL-36β, 및 IL-36γ에 대한 메신저 RNA는, 몇몇의 조직에서, 구체적으로는 병원체에 노출되는 내부 상피 세포에서, 그리고 피부에서 고도로 발현된다. 흥미롭게도, IL-36Ra 및 IL-36α의 발현은, IL-1β/TNF-α 자극된 사람 케라티노사이트에서 유의하게 상향-조절되고, IL-36Ra 및 IL-36γ mRNA는 병변 건선 피부에서 고도로 증가된다. 또한, IL-36γ 단백질 생산은 TNF-α 및 IFN-γ 자극 후의 사람 케라티노사이트에서 향상된다. 또한, 상승된 IL-36α mRNA 및 단백질 발현은 만성 신장 질환에서도 보고되었다.
케라티노사이트에서 IL-36α를 과발현하는 유전자전이 마우스는, 건선과 몇몇 특징을 공유하는 염증성 피부 병변을 나타낸다. 이러한 표현형은, 생체내 IL-36Ra의 조절 기능을 지지하는 IL-36Ra-결핍 마우스와 유전자전이 마우스를 이종교배한 경우에 더욱 중증이었다. 케라티노사이트-특이적 IL-36α 유전자전이 마우스에서의 염증성 피부 병태는, 마우스가 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트로 치료되는 경우에 사람 건선과 더욱 더 유사하고, 조직학적으로, 분자적으로, 그리고, 치료제에 대한 이의 반응에서 사람 질환과 비슷하다. 또한, 면역결핍 마우스에 이식된 사람 건선성 병변 피부는, 마우스를 항-IL-36R 항체로 치료하는 경우에 정상화되고, IL-36 축은 사람 건선 피부에서 병변 표현형을 유지하는데 요구됨이 입증된다. 이들을 함께 고려하면, 이들 데이터는, IL-36α, IL-36β, 및 IL-36γ를 포함하는 IL-36R 리간드가 시험관내에서 및 생체내에서 염증 유발 효과를 발휘함을 나타내고, IL-36Ra가 천연 길항제로서 작용하여 IL-1/IL-1Ra 시스템을 모사함을 나타낸다.
따라서, IL-36 리간드가 다수의 질환 병태에 관여한다는 증거가 존재하고, 특히, 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 이러한 경로를 표적화하는 새로운 치료학적 제제에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 요약
본 발명은, 바이오치료제, 특히, IL-36R에 결합하는 항체를 제공함으로써 상기 요구를 해소한다. 한 양상에서, 본 발명의 항체는 IL-36 리간드-매개된 신호전달(α, β, 및/또는 γ)을 차단한다. 한 양상에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 건선, 염증성 장 질환, 강피증, COPD, 및 만성 신장 질환과 같은 질환에서의 상피-매개된 염증/섬유증의 치료에 유용하다.
한 양상에서, 본 발명은, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 항-IL-36R 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 높은 분자/세포 결합 효력을 갖는다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 사람 IL-36R에 0.1nM 미만의 KD로 결합한다. 추가의 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체, 특히, 사람화된 항-IL-36R 항체는 사람 IL-36R에 50pM 미만의 KD로 결합한다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 IL-36R 발현 세포에 5nM 미만의 EC90으로 결합한다.
다른 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 높은 세포-기반 기능성 차단 효력을 갖는다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는, 질환-관련 세포주 및 1차 세포에서, 3개의 IL-36R 작용성 리간드(α, β, γ) 모두를 5nM 이하의 IC90으로 차단한다.
한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 상기에 제시된 분자/세포 결합 효력 및 세포-기반 기능성 차단 효력을 갖는다.
추가의 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는, 사람 IL-1R1 또는 IL-36R 음성 세포주에 대해, 높은 선택성, 예를 들면, 1000배의 선택성보다 큰 선택성을 갖는다. 추가의 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 사람 IL-1R1 또는 IL-36R 음성 세포주에 결합하지 않는다.
실시형태 1에서, 본 발명은, 사람 IL-36R에 0.1nM 이하의 KD로 결합하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 2에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 3에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이, 사람화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 4에서, 본 발명은, 상기 실시형태 3에 있어서, 사람 IL-36R에 50pM 이하의 KD로 결합하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 5에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 4 중 어느 하나에 있어서, 사람 IL-1R1에 결합하지 않는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 6에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 35, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 또는 140의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 또는 서열번호 111의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 7에서, 본 발명은, 상기 실시형태 6에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 102의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 또는 서열번호 111의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 8에서, 본 발명은, 상기 실시형태 6에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 103의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 또는 서열번호 111의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 9에서, 본 발명은, 상기 실시형태 6에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 104의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 또는 서열번호 111의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 10에서, 본 발명은, 상기 실시형태 6에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 105의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 또는 서열번호 111의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 11에서, 본 발명은, 상기 실시형태 6에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 106의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 또는 서열번호 111의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 12에서, 본 발명은, 상기 실시형태 6에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 140의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 또는 서열번호 111의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 13에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82 또는 서열번호 83 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94 또는 서열번호 95 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 14에서, 본 발명은, 상기 실시형태 13에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이,
서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 15에서, 본 발명은, 상기 실시형태 13에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이,
서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 16에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 45의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 107의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 63의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 73의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 45의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 107의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 64의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 73의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 45의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 54의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 63 또는 서열번호 64의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 73의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 17에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 84, 서열번호 85 또는 서열번호 86 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100 또는 서열번호 101 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 18에서, 본 발명은, 상기 실시형태 17에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이,
서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 19에서, 본 발명은, 상기 실시형태 17에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이,
서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 20에서, 본 발명은, 항체가, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120 또는 서열번호 121 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132 또는 서열번호 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 21에서, 본 발명은, 상기 실시형태 20에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 22에서, 본 발명은, 상기 실시형태 20에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 23에서, 본 발명은, 상기 실시형태 20에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 24에서, 본 발명은, 상기 실시형태 20에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 25에서, 본 발명은, 상기 실시형태 20에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 26에서, 본 발명은, 상기 실시형태 20에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 27에서, 본 발명은, 항체가, 서열번호 122, 서열번호 123 또는 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 137, 서열번호 138 또는 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 28에서, 본 발명은, 상기 실시형태 27에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 29에서, 본 발명은, 상기 실시형태 27에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 30에서, 본 발명은, 상기 실시형태 27에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체를 제공한다.
실시형태 31에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 103의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 32에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 104의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 33에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 45의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 107의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 63의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 73의 아미노산 서열(H-CDR3)
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 34에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
a) 서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 45의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) 서열번호 107의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 64의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 73의 아미노산 서열(H-CDR3)
을 포함하는, 항-IL-36 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 실시형태에서, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 34 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체이다. 한 실시형태에서, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 34 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 사람화된 항체이다. 한 실시형태에서, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 34 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 모노클로날 사람화된 항체이다.
실시형태 35에서, 본 발명은, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
서열번호 21의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 30의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 39의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 48의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 57의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 67의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 22의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 40의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 49의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 58의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 68의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 23의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 41의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 50의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 59의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 69의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 24의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 33의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 42의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 51의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 60의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 70의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 25의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 34의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 43의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 52의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 61의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 71의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 35의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 62의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 45의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 54의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 63의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 73의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 45의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 54의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 64의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 73의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 28의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 37의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 46의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 55의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 65의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 74의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 29의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 38의 아미노산 서열(L-CDR2); 서열번호 47의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 56의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 66의 아미노산 서열(H-CDR2); 서열번호 75의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태 36에서, 본 발명은, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
추가의 실시형태 37에서, 본 발명은, 상기 실시형태들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 실시형태 38에서, 본 발명은, 의약에 사용하기 위한, 상기 실시형태들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 실시형태 39에서, 본 발명은, 용도가 염증성 질환의 치료, 자가면역 질환의 치료, 호흡기 질환의 치료, 대사 장애의 치료, 상피 매개된 염증성 장애의 치료, 섬유증 또는 암의 치료인, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 실시형태 40에서, 본 발명은, 용도가 건선, 염증성 잘 질환, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, COPD, 만성 천식 또는 강직성 척추염의 치료를 위한 것인, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 실시형태 41에서, 본 발명은, 용도가 염증성 장 질환의 치료를 위한 것인, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한 추가의 실시형태 42에서, 본 발명은, 상기 질환이 크론병인, 상기 실시형태 41에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 실시형태 43에서, 본 발명은, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는 질환의 치료 방법으로서, 상기 질환이 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 상피 매개된 염증 장애, 섬유증 및 암으로부터 선택되는, 상기 실시형태 1 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는 질환의 치료 방법을 제공한다.
다른 실시형태 44에서, 본 발명은, 상기 실시형태 43에 있어서, 상기 질환이 건선, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, COPD, 만성 천식 및 강직성 척추염으로부터 선택되는, 방법을 제공한다.
또한 추가의 실시형태 45에서, 본 발명은, 크론병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 실시형태는:
- 본 발명에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 서열, 바람직하게는 DNA 또는 RNA 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드;
- 서열번호 1 내지 서열번호 40 중 하나 이상에 의해 정의되는 서열을 암호화하는, 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드;
- 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터, 보다 바람직하게는 발현 제어 서열과 기능적으로 연결된 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
- 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는, 숙주세포;
- 본 발명에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생산 방법, 바람직하게는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 사용을 포함하는, 재조합적 생산 방법;
- 바람직하게는 (a) 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 방법;
본 발명에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 진단 키트 또는 진단 방법, 또는 이들의 용도;
염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 상피 매개된 염증성 장애, 섬유증, 암, 건선, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, COPD, 만성 천식, 강직성 척추염, 또는 크론병의 진단을 위한, 본 발명에 따른 진단 키트 또는 진단 방법
을 포함한다.
도 1: IL-36 길항제 리간드(IL-36RA/IL1F5, IL-38/ILF10)은 신호전달 캐스케이드를 저해한다.
도 2: 유전자 칩 분석은, 건선성 피부에서 IL-36R 리간드(IL-36RA, IL-36α 및 IL-36γ)가 상향조절됨을 입증한다.
도 3: 사람 피부 섹션을 이용한 발현 프로파일.
항체 33D10을 이용한 항체 적정으로 내포된 포르말린-고정된 파라핀.
도 4: 사람 피부 섹션의 표피 두께를 평가하는 방법.
본 발명은 항-IL-36R 항체에 관한 것이다. 한 양상에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 사람에서 진단학적 및 치료학적 용도를 위한 것이다.
본 발명은, IL-36R, 특히, 사람 IL-36R에 결합하는 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은, IL-36R에 결합하는 사람화된 항체에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 이들 사람화된 항체의 서열은 소정 리드 마우스 항체의 서열에 기초하여 동정되었다.
이러한 이론에 얽매이지 않으면, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 사람 IL-36R에 결합하고, 따라서, IL-36 작용제의 결합을 방해하고, 이렇게 함으로써 IL-36R로부터 염증성 매개인자에의 신호전달 캐스케이드를 적어도 부분적으로 차단하는 것으로 생각된다. 이는 도 1에 의해 설명된다.
한 양상에서, 본 발명의 항체는 사람 질환 모델에서 사용하기 위한 것이다. 또한, IL-36R은 IL-1RL2 및 IL-1Rrp2로서도 공지되어 있다. 작용제 IL-36 리간드(α, β, 또는 γ)는, 이어서 이종이량체를 형성하는 IL-36 수용체를 IL-1 수용체 액세서리 단백질(IL-1RAcP)과 결함시킴으로써 신호전달 캐스케이드를 개시한다고 보고되어 있다. IL-36 길항제 리간드(IL36RA/IL1F5, IL-38/ILF10)는 신호전달 캐스케이드를 저해한다(도 1 참조).
한 양상에서, 본 발명은, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 항-IL-36R 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R은 높은 분자/세포 결합 효력을 갖는다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 사람 IL-36R에 0.1nM 미만의 KD로 결합한다. 추가의 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체, 특히, 사람화된 항-IL-36R 항체는 사람 IL-36R에 50pM 미만의 KD로 결합한다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 IL-36R 발현 세포에 5nM 미만의 EC90으로 결합한다.
다른 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 높은 세포-기반 기능성 결합 효력을 갖는다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는, 질환-관련 세포주 및 1차 세포에서, 3개의 IL-36R 작용성 리간드(α, β, 또는 γ) 모두를 5nM 이하의 IC90으로 차단한다.
한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 분자/세포 결합 효력 및 상기 제시된 세포-기반 기능성 차단 효력을 갖는다.
한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는, 사람화된 항체이다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 모노클로날 항체이다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는 전장 항체이다. 한 양상에서, 본 발명의 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체, 예를 들면, 전장 사람화된 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특이적 "IL-36R 항원 에피토프" 또는 "IL-36R 에피토프"를 인식한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 이들 용어는, 항-IL-36R 항체를 이용하여 면역반응할 수 있는 분자(예를 들면, 펩타이드) 또는 이러한 분자의 단편을 말한다.
에피토프는 가장 일반적인 단백질이고, 짧은 올리고펩타이드, 올리고펩타이드 모사체(즉, IL-36R 항원의 항체 결합 특성을 모사하는 유기 화합물), 또는 이들의 조합이다. 항체에 대한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 4 내지 5개의 아미노산인 것으로 생각된다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는, 예를 들면, 7개 이상의 아미노산, 또는 예를 들면, 9개 이상의 아미노산, 또는 예를 들면, 약 15개 내지 약 20개의 아미노산을 함유한다. 항체는 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 3차원 형태로 인식할 수 있으므로, 에피토프를 포함하는 아미노산은 인접할 필요가 없고, 몇몇의 경우에 동일한 펩타이드 쇄 상에도 존재하지 않을 수 있다. 에피토프는, 당해 분야에 공지되어 있는 각종 기술, 예를 들면, X-선 결정학, 수소/중수소 교환 질량 분광법(HXMS), 부위-지시된 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 및 펩타이드 스크리닝 방법에 의해 측정될 수 있다.
항체 또는 면역글로불린의 일반 구조는 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 이들 분자는, 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 이루어진 전형적으로 150,000달톤의 이종사량체 당단백질이고, 전형적으로 전장 항체로서 나타낸다. 각각의 경쇄는 1개의 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 공유적으로 연결되어 이종이량체를 형성하고, 이종사량체 분자는 이종이량체의 2개의 동일한 중쇄 사이에 공유 디설파이드 연결을 통해 형성된다. 경쇄 및 중쇄는 1개의 디설파이드 결합에 의해 함께 연결되지만, 2개의 중쇄 사이의 디설파이드 연결의 수는 면역글로불린 이소형에 따라 변한다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는, 규칙적인 간격을 둔 쇄내 디설파이드 가교들을 갖는다. 각각의 중쇄는, 아미노-말단에 가변 도메인(VH)을 갖고, 이어서, 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3, 및 CH4)뿐만 아니라 CH1과 CH2 사이에 힌지 영역도 갖는다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인, 아미노-말단 가변 도메인(VL) 및 카복시-말단 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL 도메인은 VH 도메인과 비공유 결합하고, 반면에 CL 도메인은 보통 디설파이드 결합을 통해 CH1 도메인에 공유적으로 연결된다. 특정 아미노산 잔기는, 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다(Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663). 또한, 가변 도메인은 본원에서 가변 영역으로서도 나타낸다.
가변 도메인 내의 소정 도메인은, 상이한 항체들 사이에 크게 상이하고, 즉, "고가변성"이다. 이들 고가변성 도메인은, 특이적 항원성 결정인자에 대한 각각의 특정 항원의 결합 및 특이성에 직접 관여하는 잔기를 함유한다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서의 고가변성은, 상보성 결정 영역(CDR) 또는 고가변성 루프(HVL)로서 공지되어 있는 3개의 분절에서 집중된다. CDR은 문헌[Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]의 서열 비교에 의해 정의되고, 반면에 HVL(본원에 CDR로서도 나타냄)은 문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]에 의해 기술되는 바와 같이 가변 도메인의 3차원 구조에 따라 구조적으로 정의된다. 이들 두 방법은 약간 상이한 동정의 CDR을 초래한다. 캐뱃에 의해 정의되는 바와 같이, 경쇄 가변 도메인에서, CDR-L1은 약 잔기 24 내지 34에 위치하고, CDR-L2는 약 잔기 50 내지 56에 위치하고, CDR-L3은 약 잔기 89 내지 97에 위치하며; 중쇄 가변 도메인에서, CDR-H1은 약 잔기 31 내지 35에 위치하고, CDR-H2는 약 잔기 50 내지 65에 위치하고, CDR-H3은 약 잔기 95 내지 102에 위치한다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당해 분야 숙련가는, 어떤 잔기가, 주어진 항체의 가변 영역 아미노산 서열에 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다. 따라서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 주어진 항체에 대해 특이적인 독특하고 기능적인 특성을 정의한다.
각각의 중쇄 및 경쇄 내의 3개의 CDR은, 가변성이 보다 적은 경향이 있는 서열을 포함하는 프레임워크 영역(FR)으로 분리된다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지, FR 및 CDR은 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. FR의 큰 β-시트 입체배치는, 각각의 쇄 내의 CDR을 각각의 다른 쇄에, 그리고 다른 쇄로부터의 CDR에 매우 가깝게 한다. 얻어진 입체배좌는 항원 결합 부위에 기여하지만[참조: Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669], 모든 CDR 잔기가 필수적으로 항원 결합에 직접 관여하는 것은 아니다.
FR 잔기 및 Ig 불변 도메인은 항원 결합에 직접 관여하는 것은 아니지만, 항원 결합에 기여하고/하거나 항체 이펙터 기능을 중재한다. 몇몇의 FR 잔기는, 적어도 3개의 방식으로 항원 결합에 대한 유의한 효과를 갖는 것으로 생각된다: 에피토프에의 직접적인 비공유 결합에 의한 방식, 하나 이상의 CDR 잔기와의 상호작용에 의한 방식, 및 중쇄와 경쇄 사이의 계면에 영향을 미치는 방식. 불변 도메인은 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 각종 Ig 이펙터 기능, 예를 들면, 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC), 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 의존적 세포 식세포작용(ADCP)에서의 항체의 참여를 매개한다.
척추동물 면역글로불린의 경쇄는, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2개의 분명히 별개인 클래스들인 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나에 배정된다. 비교에 의해, 포유동물 면역글로불린의 중쇄는, 불변 도메인의 서열에 따라 5개의 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 중 하나에 배정된다. IgG 및 IgA는 서브클래스(이소형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분된다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ라고 칭한다. 본래 면역글로불린의 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 익히 공지되어 있다.
용어 "항체", "항-IL-36R 항체", "사람화된 항-IL-36R 항체", "사람화된 항-IL-36R 에피토프 항체", 및 "변이체 사람화된 항-IL-36R 에피토프 항체"는 특이적으로 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다특이적 항체(예를 들면, 이특이적 항체), 및 바람직한 생물학적 활성, 예를 들면, IL-36R 결합을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 용어 "모노클로날 항체"(mAb)는, 단일 항원성 결정인자인 "에피토프"에 대해 지시되는 고도로 특이적인 항체를 말한다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 동일한 에피토프에 대해 지시된 항체를 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 구성되지 않는다. 모노클로날 항체는, 예를 들면, 하이브리도마 방법((Kohler et al., 1975, Nature 256:495), 또는 당해 분야에 공지되어 있는 재조합 DNA 방법(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 또는 문헌[Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597]에 기술되어 있는 기술을 이용한, 파지 항체 라이브러리를 이용하여 재조합적으로 생산된 모노클로날의 단리 방법을 포함하는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 기술 또는 방법에 의해 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
용어 "단량체"는 항체의 동종 형태를 말한다. 예를 들면, 전장 항체에 대해, 단량체는, 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 갖는 단량체 항체를 의미한다.
키메라 항체는, 1종(예를 들면, 비사람 포유동물, 예를 들면, 마우스) 유래의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및 다른 종(예를 들면, 사람)의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어지고, 키메라 항체는, 제1종(예를 들면, 마우스) 유래의 항체의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 제2종(예를 들면, 사람) 유래의 항체의 불변 영역에 대한 DNA 서열에 연결시키고, 숙주를, 연결된 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시켜 키메라 항체의 생산을 가능하게 함으로써 수득될 수 있다. 또한, 대안으로, 키메라 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 영역 또는 도메인이 다른 면역글로불린 클래스 또는 이소형 유래의 또는 컨센서스 또는 생식선 서열 유래의 모노클로날 항체에서 상응하는 서열, 또는 이의 변이체와 동일하거나, 이와 상동성인 것일 수 있다. 키메라 항체는, 이러한 항체의 단편을 포함할 수 있고, 단, 항체 단편은 모 항체의 바람직한 생물학적 특성, 예를 들면, 동일한 에피토프에의 결합을 나타낸다(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 참조).
용어 "항체 단편", "항-IL-36R 항체 단편", "항-IL-36R 에피토프 항체 단편", "사람화된 항-IL-36R 항체 단편", "사람화된 항-IL-36R 에피토프 항체 단편", "변이체 사람화된 항-IL-36R 에피토프 항체 단편"은, 가변 영역 또는 기능적 수행능력(functional capability), 예를 들면, 특이적 IL-36R 에피토프 결합이 유지되는, 전장 항-IL-36R 항체의 부분을 말한다. 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 디아바디, 직선상 항체, 단일쇄 항체, 미니바디, 항체 단편으로부터 형성된 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
전장 항체를 파파인 또는 펩신과 같은 효소로 처리하여 유용한 항체 단편을 생성시킬 수 있다. 파파인 소화는, "Fab" 단편이라고 칭하는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 항체 단편 및 잔여 "Fc" 단편을 생산하는데 사용된다. 또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인도 포함한다. 펩신 처리는, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 수득한다.
Fab' 단편은, CH1 도메인의 C-말단에 항체 힌지 영역 유래의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 추가의 잔기의 존재에 있어 Fab 단편과 상이하다. F(ab')2 항체 단편은, 힌지 영역에서 시스테인 잔기에 의해 연결된 Fab' 단편의 쌍이다. 항체 단편의 다른 화학적 결합도 공지되어 있다.
"Fv" 단편은, 밀착된 비공유 결합으로의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진 완전한 항원-인식 및 결합 부위를 포함한다. 이러한 입체 배치에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR들이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 정의한다. 총체적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv 변이체이고, 여기서, 상기 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재한다. 단일쇄 Fv는 항원을 인식하고 결합할 수 있다. 또한, scFv 폴리펩타이드는, scFv에 의해 결합하는 항원에 대한 바람직한 3차원 구조의 형성을 가능하게 하기 위해, VH와 VL 도메인 사이에 위치하는 폴리펩타이드 링커도 임의로 포함할 수 있다(예를 들면, Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 참조).
"디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 소 항체 단편을 말하고, 이 단편은, 동일한 폴리펩타이드 쇄에서 경쇄 가변 도메인(V.sub.L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V.sub.H)(V.sub.H-V.sub.L 또는 V.sub.L-V.sub.H)을 포함한다. 디아바디는, 예를 들면, 문헌[Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]에 보다 완전히 기술되어 있다.
다른 인식된 항체 단편으로는, 1쌍의 항원 결합 영역을 형성하기 위해 1쌍의 탠덤 Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 항체 단편이 포함된다. 이들 "직선상 항체"는, 예를 들면, 문헌[Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기술되어 있는 바와 같이 이특이적이거나 일특이적일 수 있다.
"사람화된 항체" 또는 "사람화된 항체 단편"은, 소정 항원에 결합할 수 있고 실질적으로 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 FR 및 실질적으로 비사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 면역글로불린 아미노산 서열 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 특정 유형의 키메라 항체이다. 종종 "임포트(import)" 서열로서도 나타내는 이러한 비사람 아미노산 서열은 전형적으로 "임포트" 항체 도메인, 특히 가변 도메인으로부터 취한다. 일반적으로, 사람화된 항체는 적어도 사람 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR들 사이에 삽입된 비사람 항체의 CDR 또는 HVL을 포함한다. 본 발명은, 마우스 모노클로날 항체로부터 유도된 CDR 또는 사람 생식선 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR들 사이에 삽입된 사람화된 CDR을 포함하는, 특이적 사람화된 항-IL-36R 항체를 기술한다. 소정 마우스 FR 잔기는 사람화된 항체의 기능에 중요할 수 있고, 따라서, 소정 사람 생식선 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 잔기는 상응하는 마우스 서열과 동일한 것으로 변형된다는 것이 이해될 것이다.
다른 양상에서, 사람화된 항-IL-36R 항체는, 적어도 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 전부를 실질적으로 포함하고(Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, 및 Fv 단편에 함유됨), 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR들은 비사람 면역글로불린의 CDR에 상응하고, 구체적으로 본원에서 모든 CDR은 본원에 상세히 설명되는 바와 같은 마우스 또는 사람화된 서열이고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 사람 면역글로불린 컨센세스 또는 생식선 서열의 FR이다. 다른 양상에서, 사람화된 항-IL-36R 항체는, 또한, 전형적으로 사람 면역글로불린의 면역글로불린 Fc 영역의 적어도 일부를 포함한다. 통상적으로, 항체는 경쇄 및 적어도 중쇄의 가변 도메인도 포함할 것이다. 또한, 항체는 적절하게 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 CH4 영역을 포함할 수 있다.
사람화된 항-IL-36r 항체는, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 클래스의 면역글로불린, 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함하는 임의의 이소형으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 도메인은 보체 고정 불변 도메인일 수 있고, 여기서, 사람화된 항체는 세포독성 활성을 나타내고, 이소형은 전형적으로 IgG1인 것이 바람직하다. 여기서, 이러한 세포독성 활성은 바람직하지 않고, 불변 도메인은 다른 이소형, 예를 들면, IgG2일 수 있다. 대안의 사람화된 항-IL-36R 항체는 하나 초과의 면역글로불린 클래스 또는 이소형 유래의 서열을 포함할 수 있고, 특정 불변 도메인을 선택하여 바람직한 이펙터 기능을 최적화하는 것은 당해 분야 숙련가의 능력 내이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은, IgG1 항체인, 보다 구체적으로는 이펙터 기능의 녹-아웃이 존재하는 IgG1 항체인, 항체를 제공한다.
사람화된 항-IL-36R 항체의 FR 및 CDR, 또는 HVL은 모 서열에 정확하게 상응할 필요는 없다. 예를 들면, 임포트 CDR, 또는 HVL, 또는 컨센서스 또는 생식선 FR 서열 내의 하나 이상의 잔기는, 얻어진 아미노산 잔기가 어느 하나의 모 서열 내의 상응하는 위치에서 본래 잔기와 더 이상 동일하지 않지만, 그럼에도 불구하고 IL-36R에의 결합 기능을 유지하도록, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변경(예를 들면, 돌연변이화)될 수 있다. 이러한 변경은 전형적으로 광범위하지 않을 것이고, 보존적 변경일 것이다. 일반적으로 75% 이상, 보다 종종 90% 이상, 가장 빈번하게는 95% 초과, 또는 98% 초과, 또는 99% 초과의 사람화된 항체 잔기가 모 컨센서스 또는 생식선 FR 및 임포트 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다.
중쇄와 경쇄 가변 영역 사이의 계면("VL-VH 계면")에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기는, 서로에 대한 2개의 쇄의 근접성 또는 배향에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기이다. 쇄간 상호작용에 관여할 수 있는 소정 잔기로는 VL 잔기 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, 및 98, 및 VH 잔기 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100, 및 103가 포함된다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987]에 제시된 넘버링 시스템 이용). 또한, 미국 특허 제6,407,213호는, VL 잔기 43 및 85, 및 VH 잔기 43 및 60과 같은 잔기들이 이러한 상호작용에도 관여할 수 있음을 논의한다. 이들 잔기는 사람 IgG의 경우만을 나타내지만, 이들은 종간에 적용될 수 있다. 쇄간 상호작용에 관여할 것으로 상당히 기대되는 중요한 항체 잔기는 컨센서스 서열에의 치환에 대해 선택된다.
용어 "컨세서스 서열" 및 "컨센서스 항체"는, 임의의 특정 클래스, 이소형, 또는 서브유닛 구조의 모든 면역글로불린에서의 각각의 위치, 예를 들면, 사람 면역글로불린 가변 도메인에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 말한다. 컨센서스 서열은 특정 종의 면역글로불린 또는 다수의 종의 면역글로불린에 기초할 수 있다. "컨센서스" 서열, 구조, 또는 항체는, 소정 실시형태에 기술되는 바와 같은 컨센서스 사람 서열을 포함하고, 임의의 특정 클래스, 이소형, 또는 서브유닛 구조의 모든 사람 면역글로불린에서의 각각의 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 컨센서스 서열은, 각각의 위치에, 하나 이상의 공지의 면역글로불린에 존재하는 아미노산을 갖는, 아미노산 서열을 포함하지만, 이는 임의의 단일 면역글로불린의 전체 아미노산 서열을 정확하게 복사하지 않을 수 있다. 가변 영역 컨센서스 서열은, 임의의 자연적으로 생산된 항체 또는 면역글로불린(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), 및 이들의 변이체로부터 수득되지 않는다.
사람 생식선 서열은 사람 집단에서 자연적으로 발견된다. 이들 생식선 유전자의 조합은 항체 다양성을 생성시킨다. 항체의 경쇄에 대한 생식선 항체 서열은 보존된 사람 생식선 카파 또는 람다 v-유전자 및 j-유전자로부터 유래한다. 유사하게, 중쇄 서열은 생식선 v-, d- 및 j-유전자로부터 유래한다(LeFranc, M-P, and LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).
본원에서 사용된 바와 같은 "변이체", "항-IL-36R 변이체", "사람화된 항-IL-36R 변이체", 또는 "변이체 사람화된 항-IL-36R"은 각각 적어도 경쇄 가변 뮤린 CDR을 갖는 사람화된 항-IL-36R 항체를 말한다. 변이체로는 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 중 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 것이 포함되고, 단, 아미노산 변화는 실질적으로 IL-36R에 대한 항체의 결합을 손상시키지 않는다.
"단리된" 항체는, 자연 환경의 구성성분으로부터 동정 및 분리되고/되거나 회수된 것이다. 항체의 자연 환경의 오염물질 구성성분은, 항체의 진단학적 또는 치료학적 용도를 방해할 수 있는 물질이고, 이는 효소, 호르몬, 또는 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질일 수 있다. 한 양상에서, 항체는 항체의 중량에 따라 95% 이상의 단리로 정제될 것이다.
단리된 항체는, 항체의 자연 환경의 하나 이상의 구성성분은 존재하지 않을 것이므로, 생산되는 재조합체 세포 내의 제자리의(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는, 재조합체 세포 물질이 제거되는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "항체 성능"은, 항원의 항체 인식 또는 생체내에서의 항체의 유효성에 기여하는 인자를 말한다. 항체의 아미노산 서열에서의 변화는 항체 특성, 예를 들면, 폴딩에 영향을 미칠 수 있고, 물리적 인자, 예를 들면, 항원에 대한 항체 결합의 개시율(ka), 항원으로부터의 항체의 해리 상수(kd), 항원에 대한 항체의 친화도 상수(Kd), 항체의 입체배좌, 단백질 안정성, 및 항체의 반감기에 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "에피토프 태그된"은, "에피토프 태그"에 융합된 항-IL-36R 항체를 말한다. "에피토프 태그"는, 항체 생산을 위한 에피토프를 제공하기에 충분한 수의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드이지만, 사람화된 항-IL-36R 항체의 바람직한 활성에 간섭하지 않도록 고안된다. 에피토프 태그는 일반적으로 충분히 고유하여 에피토프 태그에 대해 생성된 항체는 다른 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않는다. 적합한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 함유하고, 일반적으로 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기, 또는 약 9개 내지 30개의 잔기를 함유한다. 에피토프 태그 및 에피토프에 결합하는 항체의 예로는 flu HA 태그 폴리펩타이드 및 이의 항체 12CA5(Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616); 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 이의 항체(Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553)가 포함된다. 소정 실시형태에서, 에피토프 태그는 "재생 수용체 결합 에피토프(salvage receptor binding epitope)"이다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "재생 수용체 결합 에피토프"는, IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 관여하는 IgG 분자(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 말한다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 세포독성 제제에 접합될 수 있다. 이는, 세포의 기능을 저해하거나 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 임의의 물질이다. 당해 용어는, 방사성 동위원소(예를 들면, I131, I125, Y90, 및 Re186), 화학치료제, 및 독소, 예를 들면, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 및 이들의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 세포독성 제제는 표준 절차를 이용하여 본 발명의 사람화된 항체에 커플링되어, 예를 들면, 항체를 이용한 치료요법이 권고된 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
"화학치료제"는, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 본 발명의 치료학적 항체와 접합될 수 있는 화학치료제의 다수의 예가 존재한다. 이러한 화학치료제의 예로는, 티오테파 및 사이클로스포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판, 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트리메틸롤멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(구체적으로 뷸라타신 및 뷸라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(아도젤레신, 카르젤레신, 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴, 아우리스타틴, (유사체 모노메틸-아우리스타틴 E 및 모노메틸-아우리스타틴 F 포함); 듀오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 클로람부실, 클로마파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴과 같은 질소 머스타드; 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로스우레아; 에네디인 항생제(예를 들면, 칼리키아마이신, 특히, 칼리키아마이신 감마 1I 및 칼리키아마이신 phiI1, 예를 들면, 문헌[Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186] 참조); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라마이신; 및 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생체 크로모모포어), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린,블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(AdriamycinTM)(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라신(5-FU)과 같은 항-대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티빈, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 옥시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 멥피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드라날; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데모콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존, 미토크산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 독소, 베르라쿠린 A, 로리딘 A, 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미타브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드; 예를 들면, 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 독세탁셀(TAXOTERE® Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈(GemzarTM); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈브라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈(NavelbineTM); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈; 및 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체가 포함된다. 이러한 정의에는, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하도록 작용하는 항-호르몬제, 예를 들면, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM)도 포함되고, 이들로는, 예를 들면, 타목시펜(NolvadexTM 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(FarestonTM); 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는, 효소 아로마타제를 저해하는 아로마타제 저해제, 예를 들면, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트(MegaceTM), 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸(RivisorTM), 레트로졸(FemaraTM), 및 아나스토로졸(ArimidexTM); 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 유도체가 포함된다. 이들 제제 중 임의의 하나 이상은 본 발명의 사람화된 항체에 접합되어 각종 장애의 치료에 유용한 치료학적 제제를 제공한다.
또한, 항체는 프로드럭에도 접합될 수 있다. "프로드럭"은, 모 약물에 비교하여 종양 세포에 대한 세포독성이 보다 적고, 효소적으로 활성화되거나 보다 활성 형태로 전환될 수 있는, 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태이다. 예를 들면, 문헌[Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press]을 참조한다. 유용한 프로드럭으로는 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 설페이트-함유 프로드럭, 펩타이드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형된 프로드럭, 글리코실화된 프로드럭, β-락탐-함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드럭, 및 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 보다 활성인 세포독성 불포함 약물로 전환될 수 있는 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 프로드럭이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기술된 화학치료제가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
진단학적뿐만 아니라 치료학적 모니터링 목적을 위해, 본 발명의 항체는 표지, 표지 단독 또는 표지와 추가의 제2 제제(프로드럭, 및 화학치료제 등) 중 어느 하나에도 접합될 수 있다. 다른 제2 제제와 구별되는 표지는, 검출가능한 화합물 또는 조성물이고 본 발명의 사람화된 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있는 제제를 말한다. 표지는 표지 자체(예를 들면, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지)로 검출가능할 수 있거나, 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉진할 수 있다. 표지된 사람화된 항-IL-36R 항체가 제조될 수 있고, 시험관내 및 생체내 진단을 포함하는 각종 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는, 생체내에서의 항체의 전달에 영향을 미치기 위해서, 리포솜 제제의 부분으로서 제형화될 수 있다. "리포솜"은 각종 형태의 지질 및/또는 계면활성제로 이루어진 작은 소포체이다. 리포솜은, 포유동물에 화합물 또는 제형, 예를 들면, 하나 이상의 약제학적 활성제 및/또는 표지에 임의로 커플링되거나 이들과의 조합으로의 본원에 개시되는 사람화된 항-IL-36R 항체를 전달하는데 유용하다. 리포솜의 구성성분은, 일반적으로, 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게 2층 형성으로 배열된다.
본 발명의 소정 양상은, 본 발명의 사람화된 항체의 하나 이상의 도메인을 암호화하는 단리된 핵산에 관한 것이다. "단리된" 핵산 분자는, 동정되고 하나 이상의 오염물질 핵산 분자로부터 분리되는 핵산 분자이고, 이는, 항체 핵산의 천연 공급원과 통상적으로 관련되어 있다. 단리된 핵산 분자는, 천연 세포에 존재하므로 핵산 분자와 구별된다.
본 발명의 각종 양상에서, 사람화된 항체의 하나 이상의 도메인은 재조합적으로 발현될 것이다. 이러한 재조합체 발현은 하나 이상의 제어 서열, 즉, 특정 숙주 유기체에서의 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다. 원핵 세포에서 사용하기에 적합한 제어 서열로는, 예를 들면, 프로모터, 오퍼레이터, 및 리보솜 결합 부위 서열이 포함된다. 진핵 세포 제어 서열로는, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 제어 서열은, 원핵 및 진핵 숙주 세포에서의 사람화된 항-IL-36R 항체의 발현 및 생산에 사용될 수 있다.
핵산 서열은, 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이는 경우에 "작동가능하게 연결된다". 예를 들면, 핵산 전서열 또는 분비 리더는, 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는, 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 암호화 서열에 작동적으로 연결되거나; 리보솜 결합 부위는, 번역이 용이해지도록 위치되는 경우에 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결되어 있는 DNA 서열이, 인접하고, 분비 리더의 경우에는 인접하며 판독 프레임 내에 존재함을 의미한다. 연결은, 간편한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성될 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양액"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 명칭은 모두 이들의 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는, 전이의 수와 관계없이, 1차 대상체 세포 및 이로부터 유도된 배양액을 포함한다.
치료 목적을 위한 용어 "포유동물"은, 사람, 사육된 동물 및 가축, 및 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 및 소 등을 포함하는, 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 말한다. 바람직하게, 포유동물은 사람이다.
본원에 사용된 바와 같은 "장애"는, 본원에 기술되는 사람화된 항-IL-36R 항체로의 치료로부터 유익할 수 있는 임의의 병태이다. 이는, 포유동물이 의문의 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료되는 장애의 비제한적 예로는 염증성 장애, 혈관신생 장애, 자가면역 장애 및 면역 장애, 호흡기 장애, 암, 혈액학적 악성 종양, 양성 및 악성 종양, 백혈병 및 림프 악성 종양이 포함된다.
용어 "암" 및 "암성"은, 전형적으로 비조절 세포 성장을 특징으로 하는, 포유동물에서의 생리학적 병태를 말하거나 이를 기술한다. 암의 예로는, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
IL-36R-관련 장애로는 면역계의 질환 및 장애, 예를 들면, 자가면역 장애 및 염증성 장애가 포함된다. 이러한 병태로는 류마티스 관절염(RA), 전신 홍반성 낭창(SLE), 강피증, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 건선성 관절염, 염증성 장 질환(예를 들면, 궤양성 대장염 및 크론병), 폐 염증, 천식, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 상피 염증 장애, 섬유증 및 강직성 척추염이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
용어 "정맥내 주입"은, 대략 15분 초과, 일반적으로 대략 30 내지 90분의 시간에 걸쳐서 동물 또는 사람 환자의 정맥에의 제제의 도입을 말한다.
용어 "정맥내 볼루스" 또는 "정맥내 푸시"는, 신체가 대략 15분 이하, 일반적으로 5분 이하 내에 약물을 수용하도록 하는 동물 또는 사람의 정맥에의 약물 투여를 말한다.
용어 "피하 투여"는, 상대적으로 느리고 지속적인 약물 리셉터클로부터의 전달에 의한, 동물 또는 사람 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 아래 조직 사이의 포켓 내에의 제제의 도입을 말한다. 아래 조직으로부터의 핀칭 또는 드로잉이 포켓을 생성시킬 수 있다.
용어 "피하 주입"은, 30분 이하, 또는 90분 이하를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 시간 동안, 상대적으로 느리고 지속적인 약물 리셉터클로부터의 전달에 의한, 동물 또는 사람 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 아래 조직 사이의 포켓 내에의 약물의 도입을 말한다. 임의로, 주입은, 동물 또는 사람 환자의 피부 아래에 이식되는 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있고, 여기서, 상기 펌프는 소정량의 약물을 소정 시간, 예를 들면, 30분, 90분 또는 치료 용법의 길이에 걸친 시간 동안 전달한다.
용어 "피하 볼루스"는, 동물 또는 사람 환자의 피부 아래에의 약물 투여를 말하고, 여기서, 볼루스 약물 전달은 대략 15분 미만이고; 다른 양상에서는 5분 미만이며, 또 다른 양상에서는 60초 미만이다. 또 다른 양상에서, 피부와 아래 조직 사이의 포켓 내에 투여되고, 여기서, 포켓은, 아래 조직으로부터의 핀칭 또는 드로잉에 의해 생성될 수 있다.
용어 "치료학적 유효량"은, 치료되는 장애의 증상 중 하나 이상을 완화하거나 개선하는 활성 제제의 양을 나타내기 위해 사용된다. 다른 양상에서, 치료학적 유효량은, 예를 들면, 질환 진행을 늦추는데 유효한 것으로 나타난 표적 혈청 농도를 말한다. 효능은 치료되는 병태에 따라 종래 방식으로 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료" 및 "치료요법" 등은, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개선 또는 완화, 질환 또는 장애의 진행의 퇴행, 서행 또는 중지를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 임의의 임상학적으로 바람직하거나 이로운 효과를 초래하는, 질환 또는 장애에 대한 치료학적 및 예방학적 또는 억제성 조치를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 용어 치료는, 질환 또는 장애의 증상의 개시 이전에 또는 이후에 제제를 투여하는 것, 이에 의해 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후를 예방하거나 제거하는 것을 포함한다. 다른 예로서, 당해 용어는, 질환의 증상에 대처하기 위해서 질환의 임상학적 징후 후에 제제를 투여하는 것을 포함한다. 추가로, 투여가, 질환 또는 장애의 임상학적 매개변수, 예를 들면, 조직 손상 정도 또는 전이량 또는 전이 정도, 치료가 질환의 개선을 초래하는지의 여부에 영향을 미치는, 개시 후 및 임상학적 증상 후의 제제의 투여는 가 개발되었고, 이는 본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료요법"을 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은, 단독으로 또는 다른 치료학적 제제와의 조합으로, 사람화된 항-IL-36R 항체 조성물 사용의 부재시의 증상에 비교하여, 치료되는 장애의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 개선시키고, 그 결과는, 장애의 모든 증상이 경감되는지의 여부에 관계없이 기저 장애의 효과적인 치료인 것으로 여겨져야 한다.
용어 "패키지 삽입물"은, 치료학적 생성물의 사용에 관한 표시, 용도, 투여, 금지사항 및/또는 주의사항에 대한 정보를 포함하는, 치료학적 생성물의 시판 패키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 나타내기 위해 사용된다.
항체
한 양상에서, 본원에는 항-IL-36R 항체, 특히, 사람화된 항-IL-36R 항체, 및 하나 이상의 항-IL-36R 항체, 특히, 본 발명의 하나 이상의 사람화된 항-IL-36R 항체를 포함하는 조성물 및 제조 물품이 기술 및 개시되어 있다. 또한, 항-IL-36R 항체, 특히, 사람화된 항-IL-36R 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 결합제도 기술되어 있다.
본 발명의 대표적인 항체의 가변 영역 및 CDR은 하기에 개시된다:
항-IL-36R 마우스 항체 서열
본 발명의 대표적인 마우스 리드 항체(마우스 리드)의 가변 영역 및 CDR은 하기에 나타낸다:
Figure 112019107141389-pat00001
Figure 112019107141389-pat00002
Figure 112019107141389-pat00003
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Figure 112019107141389-pat00009
항-IL-36R 마우스 CDR 서열
리드 마우스 항체의 CDR 서열의 요약을 하기에 나타낸다:
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Figure 112019107141389-pat00011
Figure 112019107141389-pat00012
항-IL-36R 사람화된 항체 서열
사람 프레임워크 서열을 프레임워크 상동성, CDR 구조, 보존된 정규 잔기, 보존된 계면 팩킹 잔기, 및 다른 매개변수에 기초하여 마우스 리드로부터 선택하여 사람화된 가변 영역을 생산하였다(실시예 5 참조).
항체 81B4 및 73C5로부터 유도된 대표적인 사람화된 가변 영역은 하기에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00013
Figure 112019107141389-pat00014
Figure 112019107141389-pat00015
Figure 112019107141389-pat00016
상기에 나타낸 항체 81B4 및 73C5로부터 유도된 사람화된 가변 영역 유래의 CDR 서열은 하기에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00017
Figure 112019107141389-pat00018
Figure 112019107141389-pat00019
Figure 112019107141389-pat00020
Figure 112019107141389-pat00021
Figure 112019107141389-pat00022
한 양상에서, 본 발명의 가변 영역은 불변 영역에 연결된다. 예를 들면, 본 발명의 가변 영역은 하기에 나타낸 불변 영역에 연결되어 항체의 중쇄 또는 경쇄를 형성한다.
Figure 112019107141389-pat00023
본 발명의 대표적인 경쇄 및 중쇄 서열은 하기에 나타낸다(불변 영역에 연결된 항체 81B4 및 73C5로부터 유도된 사람화된 가변 영역).
Figure 112019107141389-pat00024
Figure 112019107141389-pat00025
Figure 112019107141389-pat00026
Figure 112019107141389-pat00027
Figure 112019107141389-pat00028
Figure 112019107141389-pat00029
상기 열거된 CDR은, 쵸티아 넘버링 시스템(Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948)을 이용하여 정의한다.
한 양상에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 상기에 제시된 바와 같은 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명의 항체는, 상기에 제시된 바와 같은 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 한 양상에서, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역, 예를 들면, 카파 또는 람다 불변 영역에 융합된다. 한 양상에서, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역, 예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 특히, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4에 융합된다.
본 발명은, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 B1)를 제공한다.
본 발명은, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 B2)를 제공한다.
본 발명은, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 B3)를 제공한다.
본 발명은, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 B4)를 제공한다.
본 발명은, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 B5)를 제공한다.
본 발명은, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 B6)를 제공한다.
본 발명은, 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 C3)를 제공한다.
본 발명은, 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 C2)를 제공한다.
본 발명은, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-IL-36R 항체(항체 C1)를 제공한다.
본 발명의 대표적인 항체는 하기에 나타낸다.
[표 A]
Figure 112019107141389-pat00030
Figure 112019107141389-pat00031
Figure 112019107141389-pat00032
[표 B]
Figure 112019107141389-pat00033
Figure 112019107141389-pat00034
본 발명의 항체는, 각종 질환 또는 장애, 예를 들면, 사람에서의 면역학적 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 호흡기 질환의 치료 방법에 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 항체는, 건선, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선성 관절염의 치료 방법에 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 만성 폐색성 폐 장애(COPD) 또는 천식의 치료 방법에 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 강피증, 수장족저 농포증, 범발성 농포성 건선, 당뇨병성 신장병증, 낭창성 신염, 강피증, 강직성 척추염, IL-36 수용체 길항제 자가면역 질환에서의 결핍증(DITRA), IL-1 수용체 길항제 자가면역 질환에서의 결핍증(DIRA) 또는 크라이오피린 관련된 주기성 증후군(CAPS)의 치료 방법에 유용하다.
몇몇의 양상에서, 사람화된 항체는 차단 활성을 나타내고, 이에 의해, IL-36 수용체에 대한 IL-36 리간드의 결합을 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 감소시킨다. IL-36 수용체에 대한 IL-36 리간드의 결합을 차단하는 항체의 능력은, 당해 분야에 공지되어 있는 경쟁 결합 검정을 이용하여 측정할 수 있다. 대안으로, 항체의 차단 활성은 IL-36의 생물학적 효과, 예를 들면, IL-8, IL-6, 및 GM-CSF의 생산을 평가함으로써 측정하여 IL-36에 의해 매개되는 신호전달이 저해되는지의 여부를 결정할 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 바람직한 생물물리학적 특성을 갖는 사람화된 항-IL-36R 항체를 제공한다. 한 양상에서, 본 발명의 사람화된 항-IL-36R 항체는, 완충액 중에 90% 이상의 단량체 형태로, 또는 92% 이상의 단량체 형태로, 또는 95% 이상의 단량체 형태로 존재한다. 추가의 양상에서, 본 발명의 사람화된 항-IL-36R 항체는 완충액 중에 90% 이상의 단량체 형태로, 또는 92% 이상의 단량체 형태로, 또는 95% 이상의 단량체 형태로 1개월 동안 또는 4개월 동안 잔존한다.
한 양상에서, 본 발명의 사람화된 항체는 항체 B1, 항체 B2, 항체 B3, 항체 B4, 항체 B5, 항체 B6, 항체 C1, 항체 C2, 또는 항체 C3이다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 115의 경쇄 서열 및 서열번호 125의 중쇄 서열을 포함한다(항체 B1). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 11의 경쇄 서열 및 서열번호 126의 중쇄 서열을 포함한다(항체 B2). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 115의 경쇄 및 서열번호 127의 중쇄 서열을 포함한다(항체 B3). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 118의 경쇄 서열 및 서열번호 125의 중쇄 서열을 포함한다(항체 B4). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 118의 경쇄 서열 및 서열번호 126의 중쇄 서열을 포함한다(항체 B5). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 118의 경쇄 서열 및 서열번호 127의 중쇄 서열을 포함한다(항체 B6). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 124의 경쇄 서열 및 서열번호 138의 중쇄 서열을 포함한다(항체 C1). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 123의 경쇄 서열 및 서열번호 139의 중쇄 서열을 포함한다(항체 C2). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 123의 경쇄 서열 및 서열번호 138의 중쇄 서열을 포함한다(항체 C3).
추가의 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 115의 경쇄 서열 및 서열번호 125의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 B1). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 115의 경쇄 서열 및 서열번호 126의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 B2). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 115의 경쇄 서열 및 서열번호 127의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 B3). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 118의 경쇄 서열 및 서열번호 125의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 B4). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 118의 경쇄 서열 및 서열번호 126의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 B5). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 118의 경쇄 서열 및 서열번호 127의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 B6). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 124의 경쇄 서열 및 서열번호 138의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 C1). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 123의 경쇄 서열 및 서열번호 139의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 C2). 다른 실시형태에서, 본 발명의 사람화된 항체는 서열번호 123의 경쇄 서열 및 서열번호 138의 중쇄 서열로 이루어진다(항체 C3).
몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항-IL-36R 항체의 항원-결합 단편, 예를 들면, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 사람화된 항-IL-36R 항체는, 항체 B1, 항체 B2, 항체 B3, 항체 B4, 항체 B5, 항체 B6, 항체 C1, 항체 C2, 또는 항체 C3으로부터 유도된 잔기의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 사람 IL-36R에 대해, 본 발명의 항체, 예를 들면, 본원에 기술되어 있는 항체 B1, 항체 B2, 항체 B3, 항체 B4, 항체 B5, 항체 B6, 항체 C1, 항체 C2, 또는 항체 C3와 경쟁적으로 결합하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. IL-36R에 경쟁적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 능력은, 당해 분야에 공지되어 있는 경쟁 결합 검정을 이용하여 측정할 수 있다.
사람화된 항-IL-36R 항체는 임의로 컨센서스 또는 생식선 프레임워크 영역 내에 특이적 아미노산 치환을 포함한다. 이들 프레임워크 위치에서의 아미노산 잔기의 특이적 치환은, 사람 생식선 프레임워크 영역에의 CDR 또는 HVL의 "직접적인 교환(swap)"에 의해 형성된 사람화된 항체에서 입증된 것에 비하여, 결합 친화성 및/또는 안정성을 포함하는 항체 성능의 각종 양상을 향상시킬 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 다른 모노클로날 항체를 기술한다. 몇몇의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 11 내지 서열번호 20 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 다른 모노클로날 항체를 기술한다. 사람 컨센서스 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR에 이러한 CDR을 위치시키는 것은 본 발명의 유용한 사람화된 항체를 수득할 것이다.
특히, 본 발명은, 서열번호 1/서열번호 11, 서열번호 2/서열번호 12, 서열번호 3/서열번호 13, 서열번호 4/서열번호 14, 서열번호 5/서열번호 15, 서열번호 6/서열번호 16, 서열번호 7/서열번호 17, 서열번호 8/서열번호 18, 서열번호 9/서열번호 19, 서열번호 10/서열번호 20의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역의 조합을 갖는 모노클로날 항체를 제공한다. 이러한 가변 영역은 사람 불변 영역과 조합될 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 76 내지 서열번호 86 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 다른 사람화된 항체를 기술한다. 몇몇의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 87 내지 서열번호 101 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 다른 사람화된 항체를 기술한다. 특히, 본 발명은, 서열번호 77/서열번호 89, 서열번호 80/서열번호 88, 서열번호 80/서열번호 89, 서열번호 77/서열번호 87, 서열번호 77/서열번호 88, 서열번호 80/서열번호 87, 서열번호 86/서열번호 100, 서열번호 85/서열번호 100의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역의 조합을 갖는 모노클로날 항체를 제공한다. 이러한 가변 영역은 사람 불변 영역과 조합될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 77의 CDR, 및 서열번호 77의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 89의 CDR, 및 서열번호 89의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 80의 CDR, 및 서열번호 80의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 88의 CDR, 및 서열번호 88의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 80의 CDR, 및 서열번호 80의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 89의 CDR, 및 서열번호 89의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 77의 CDR, 및 서열번호 77의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 87의 CDR, 및 서열번호 87의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 77의 CDR, 및 서열번호 77의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 88의 CDR, 및 서열번호 88의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 80의 CDR, 및 서열번호 80의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 87의 CDR, 및 서열번호 87의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 86의 CDR, 및 서열번호 86의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 100의 CDR, 및 서열번호 100의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 85의 CDR, 및 서열번호 85의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 101의 CDR, 및 서열번호 101의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 85의 CDR, 및 서열번호 85의 가변 도메인 경쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 100의 CDR, 및 서열번호 100의 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는, 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 항-IL-36R 항체는, 사람화된 모노클로날 항체이다.
몇몇의 특정 실시형태에서, 본원에 개시되는 사람화된 항-IL-36R 항체는, 뮤린 모노클로날 항체 또는 본원에 개시되는 바와 같은 사람화된 항체의 CDR 또는 HVL 및 사람 생식선 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR을 포함하는, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 추가의 양상에서, 본 발명은, 서열번호 21 내지 서열번호 29 중 어느 하나의 경쇄 CDR1(L-CDR1) 서열; 서열번호 30 내지 서열번호 38 중 어느 하나의 경쇄 CDR2(L-CDR2) 서열; 서열번호 39 내지 서열번호 47 중 어느 하나의 경쇄 CDR3(L-CDR3) 서열; 서열번호 48 내지 서열번호 56 중 어느 하나의 중쇄 CDR1(H-CDR1) 서열; 서열번호 57 내지 서열번호 66 중 어느 하나의 중쇄 CDR2(H-CDR2) 서열; 및 서열번호 67 내지 서열번호 75 중 어느 하나의 중쇄 CDR3(H-CDR3) 서열을 포함하는 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 양상에서, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 상기 열거된 L-CDR1, 상기 열거된 L-CDR2, 및 상기 열거된 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 상기 열거된 H-CDR1, 상기 열거된 H-CDR2, 및 상기 열거된 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은,
a) 각각 서열번호 21, 서열번호 30, 서열번호 39, 서열번호 48, 서열번호 57, 및 서열번호 67의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
b) 각각 서열번호 22, 서열번호 31, 서열번호 40, 서열번호 49, 서열번호 58, 및 서열번호 68의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
c) 각각 서열번호 23, 서열번호 32, 서열번호 41, 서열번호 50, 서열번호 59, 및 서열번호 69의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
d) 각각 서열번호 24, 서열번호 33, 서열번호 42, 서열번호 51, 서열번호 60, 및 서열번호 70의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
e) 각각 서열번호 25, 서열번호 34, 서열번호 43, 서열번호 52, 서열번호 61, 및 서열번호 71의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
f) 각각 서열번호 26, 서열번호 35, 서열번호 44, 서열번호 53, 서열번호 62, 및 서열번호 72의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
g) 각각 서열번호 27, 서열번호 36, 서열번호 45, 서열번호 54, 서열번호 63, 및 서열번호 73의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
h) 각각 서열번호 27, 서열번호 36, 서열번호 45, 서열번호 54, 서열번호 64, 및 서열번호 74의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
i) 각각 서열번호 27, 서열번호 36, 서열번호 45, 서열번호 54, 서열번호 64, 및 서열번호 73의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
j) 각각 서열번호 28, 서열번호 37, 서열번호 46, 서열번호 55, 서열번호 65, 및 서열번호 74의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
k) 각각 서열번호 29, 서열번호 38, 서열번호 47, 서열번호 56, 서열번호 66, 및 서열번호 75의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은,
a) 각각 서열번호 26, 서열번호 103, 서열번호 44, 서열번호 53, 서열번호 62, 및 서열번호 72의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
b) 각각 서열번호 26, 서열번호 104, 서열번호 44, 서열번호 53, 서열번호 62, 및 서열번호 72의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
c) 각각 서열번호 27, 서열번호 36, 서열번호 45, 서열번호 107, 서열번호 63, 및 서열번호 73의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열; 또는
d) 각각 서열번호 27, 서열번호 36, 서열번호 45, 서열번호 107, 서열번호 64, 및 서열번호 73의 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열
을 포함하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 양상에서, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 상기 열거된 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3 조합을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 상기 열거된 H-CDR1, H-CDR2 및 L-CDR3 조합을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 예시 면역글로불린 사이에 전환된 CDR 영역(즉, 예를 들면, 마우스 항체 또는 이로부터 유도된 사람화된 항체 중 하나의 1개 또는 2개의 CDR을 다른 마우스 항체 또는 이로부터 유도된 사람화된 항체 유래의 유사한 CDR로 전환시킴)을 갖는 키메라 항체는, 유용한 항체를 수득할 수 있음이 고려된다.
소정 실시형태에서, 사람화된 항-IL-36R 항체는 항체 단편이다. 각종 항체 단편은 일반적으로 상기에 논의되었고, 항체 단편의 생산을 위해 개발된 기술이 존재한다. 단편은, 온전한 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도될 수 있다(예를 들면, 문헌[Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; 및 Brennan et al., 1985, Science 229:81] 참조). 대안으로, 단편은, 재조합체 숙주 세포에서 직접 생산될 수 있다. 예를 들면, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(예를 들면, 문헌[Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167] 참조). 다른 접근법에 의해, F(ab')2 단편은 재조합체 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은, 본원에 기술되는 CDR, 특히, 본원에 기술되는 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3의 조합들 중 하나를 포함하는 항체 단편을 제공한다. 추가의 양상에서, 본 발명은, 본원에 기술되는 가변 영역, 예를 들면, 본원에 기술되는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 조합들 중 하나를 포함하는 항체 단편을 제공한다.
소정 실시형태는, 서열번호 115 또는 서열번호 118 중 어느 하나의 경쇄 서열을 서열번호 125, 서열번호 126, 또는 서열번호 127의 중쇄 서열과의 조합으로 포함하는, 사람화된 항-IL-36R 항체의 F(ab')2 단편을 포함한다. 이러한 실시형태는, 이러한 F(ab')2를 포함하는 온전한 항체를 포함할 수 있다.
소정 실시형태는, 서열번호 123 또는 서열번호 124 중 어느 하나의 경쇄 서열을 서열번호 138 또는 서열번호 139의 중쇄 서열과의 조합으로 포함하는, 사람화된 항-IL-36R 항체의 F(ab')2 단편을 포함한다. 이러한 실시형태는, 이러한 F(ab')2를 포함하는 온전한 항체를 포함할 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은, 이펙터 기능을 매개하는 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은, IL-36R 발현 표적 세포에 대해, 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 반응을 제공할 수 있다. 이펙터 도메인(들)은, 예를 들면, Ig 분자의 Fc 영역일 수 있다.
항체의 이펙터 도메인은 임의의 적합한 척추동물 종 및 이소형 유래일 수 있다. 상이한 동물 종 유래의 이소형은, 이펙터 기능을 매개하는 능력이 상이할 수 있다. 예를 들면, CDC 및 ADCC/ADCP를 매개하는 사람 면역글로불린의 능력은 일반적으로 각각 IgM≒IgG1≒IgG3>IgG2>IgG4 및 IgG1≒IgG3>IgG2/IgM/IgG4의 순서로 존재한다. 뮤린 면역글로불린은 일반적으로 각각 CDC 및 ADCC/ADCP를 IgM≒IgG3>>IgG2b>IgG2a>>IgG1 및 IgG2b>IgG2a>IgG1>>IgG3의 순서로 매개한다. 다른 예에서, 뮤린 IgG2a는 뮤린 IgG2a는 ADCC를 매개하고, 한편, 뮤린 IgG2a 및 IgM 둘 다는 CDC를 매개한다.
항체 변형
사람화된 항-IL-36R 항체 및 제제는, 사람화된 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이펙터 기능에 대해 암의 치료시 항체의 유효성을 향상시키도록 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 변형은 Fc 영역에의 시스테인 잔기(들)의 도입이고, 이에 의해 이러한 Fc 영역에서 쇄간 디설파이드 결합 형성이 가능하게 된다. 이로써 생성된 동종이량체 항체는, 향상된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및/또는 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 예를 들면, 문헌[Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; 및 Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922]을 참조한다. 향상된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는, 또한, 문헌[Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565]에 기술되어 있는 바와 같은 이종이기능성 교차-링커를 이용하여 제조될 수도 있다. 대안으로, 항체는, 이원 Fc 영역을 함유하도록 조작하여 항체의 보체 용해 및 ADCC 능력을 향상시킬 수 있다. 문헌[Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230]을 참조한다.
항체의 Fc 영역의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써 ADCC를 지지하는 능력이 향상된 항체가 생성되었다. 이는, CH2 도메인 내의 아스파라긴 잔기인 N297에서의 항체 글리코실화가, ADCC에 대한 전제조건인 IgG와 Fcγ 수용체 사이의 상호작용에 관여하기 때문에 가능하다. 숙주 세포주는, 글리코실화가 변경된, 예를 들면, 이분성(bisecting) N-아세틸글루코사민이 증가되거나 퓨코스가 감소된 항체를 발현하도록 조작되었다. 퓨코스 감소는, 이분성 N-아세틸글루코사민의 존재를 증가시키는 것보다 더 큰 ADCC 활성에 대한 향상을 제공한다. 또한, 저 퓨코스 항체에 의한 ADCC의 향상은 FcγRIIIa V/F 다형성과는 독립적이다.
항체의 Fc 영역의 아미노산 서열을 변형시키는 것은 ADCC를 향상시키기 위한 글리코실화 조작에 대한 대안이다. Fcγ 수용체에 대한 사람 IgG1 상의 결합 부위는 광범위한 돌연변이 분석에 의해 측정되었다. 이는, FcγRIIIa에 대한 결합 친화도를 증가시키고 시험관내 ADCC를 향상시키는 Fc 돌연변이를 갖는 사람화된 IgG1 항체를 생성하였다. 추가로, Fc 변이체는, 결합 특성, 예를 들면, 다른 FcγR 수용체에 대한 결합이 변화되지 않거나 감소된 특정 FcγR 수용체에 대한 향상된 결합의 다수의 상이한 순열을 이용하여 수득되었다.
다른 양상은, 세포독성제, 예를 들면, 화학치료요법제, 독소(예를 들면, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)에 접합된 사람화된 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 면역접합체를 포함한다.
이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료요법제는 상기에 기술되어 있다. 유용한 면역접합체를 제조하는데 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄슈도모나스 아에루기노사 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센 등이 포함된다. 방사성 접합된 사람화된 항-IL-36R 항체의 생산을 위해 다양한 방사성 핵종이 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re가 포함된다.
사람화된 항-IL-36R 항체 및 세포독성제 또는 화학치료요법제의 접합체는, 다양한 이기능성 단백질 커플링제, 예를 들면, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체(예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들면, 디석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들면, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들면, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여, 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., 1987, Science 238:1098]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지도니 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은, 항체에 대한 방사성 뉴클레오타이드의 접합을 위한 예시 킬레이트제이다. 또한, 접합체는 절단가능한 링커를 이용하여 형성될 수 있다.
또한, 본원에 개시되는 사람화된 항-IL-36R 항체는 면역리포솜으로서도 제형화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포솜은, 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 의해, 예를 들면, 문헌[Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호]에 기술되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포솜은 예를 들면, 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)를 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜을 정의된 공극 크기의 필터를 통해 압출하여 바람직한 직경을 갖는 리포솜을 수득한다. 본원에 개시되는 항체의 Fab' 단편은, 디설파이드 쇄간 반응을 통해, 문헌[Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288]에 기술되어 있는 리포솜에 접합될 수 있다. 화학치료요법제(예를 들면, 독소루비신)는 임의로 리포솜 내에 포함된다. 예를 들면, 문헌[Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81(19):1484]을 참조한다.
또한, 본원에 기술 및 개시되는 항체는, 이 항체를 프로드럭을 전환시키는 프로드럭-활성화 효소(예를 들면, 펩티딜 화학치료요법제)에 접합시킴으로써, ADEPT(Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy: 항체-지시된 효소 프로드럭 치료요법) 절차에도 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[WO 81/01145, WO 88/07378, 및 미국 특허 제4,975,278호]을 참조한다. ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 구성성분은, 보다 활성인 세포독성 형태로 전환되도록 하는 방식으로 프로드럭에 작용할 수 있는 효소이다. ADEPT에 유용한 특정 효소로는, 포스페이트-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키기 위한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키기 위한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물로 전환시키기 위한 시토신 데아미나제, 5-플루오로우라실; 펩타이드-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키기 위한 프로테아제, 예를 들면, 세라티아 프로테아제, 써모라이신, 서브틸리신, 카복시펩티아제, 및 카텝신(예를 들면, 카텝신 B 및 카텝신 L); D-아미노산 치환체 함유 프로드럭을 전환시키기 위한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화된 프로드럭을 유리 약물로 전환시키기 위한 탄수화물-절단 효소, 예를 들면, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키기 위한 β-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 그룹을 갖는 아민 니트로겐에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키기 위한 페니실린 아미다제, 예를 들면, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 대안으로, 효소 활성을 갖는 항체("항체효소(abzyme)")를 사용하여 프로드럭을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다(예를 들면, 문헌[Massey, 1987, Nature 328: 457-458] 참조). 항체-항체효소 접합체는, 종양 세포 집단에 항체효소를 전달하기 위한 공지의 방법에 의해, 예를 들면, 상기 논의된 사람화된 항-IL-36R 항체/이종이기능성 가교결합 시약에 효소를 공유결합시킴으로써 제조될 수 있다. 대안으로, 상기 기술된 효소의 적어도 기능적으로 활성인 부분에 연결된 본원에 개시되는 항체의 항원 결합 영역을 적어도 포함하는 융합 단백질은, 재조합 DNA 기술(예를 들면, 문헌[Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608] 참조)을 이용하여 작제될 수 있다.
소정 실시형태에서, 예를 들면, 조직 침투를 증가시키기 위해, 온전한 항체보다는 사람화된 항-IL-36R 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들면, 재생 수용체 결합 에피토프를 항체 단편에 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 한 방법에서, 항체 단편의 적절한 영역이 변경(예를 들면, 돌연변이)될 수 있거나, 에피토프가 펩타이드 태그에 포함되고, 이어서, 상기 펩타이드 태그가, 예를 들면, DNA 또는 펩타이드 합성에 의해, 말단에서 또는 중간에서 항체 단편에 융합될 수 있다. 예를 들면, WO96/32478을 참조한다.
다른 실시형태에서, 사람화된 항-IL-36R 항체의 공유 변형도 포함된다. 공유 변형으로는 시스테이닐 잔기, 히스티딜 잔기, 라이시닐 및 아미노-말단 잔기, 아르기닐 잔기, 티로실 잔기, 카복실 잔기 그룹(아스파르틸 또는 글루타밀), 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기, 또는 세릴, 도는 트레오닐 잔기의 변형이 포함된다. 다른 유형의 공유 변형은 항체에 화학적으로 또는 효소적으로 커플링하는 글리코사이드를 포함한다. 이러한 변형은, 적용가능한 경우, 화학적 합성에 의해 또는 항체의 효소적 또는 화학적 개열에 의해 이루어질 수 있다. 항체의 공유 변형의 다른 유형은, 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 아미노- 또는 카복시-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 제제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입될 수 있다.
항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 데글리코실화는 문헌[Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131]에 기술되어 있다. 항체 상의 탄수화물 부분의 효소적 절단은 문헌[Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350]에 기술되어 있는 각종 엔도-글리코시다제 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다.
유용한 공유 변형의 다른 유형은, 각종 비단백질성 중합체들 중 하나, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 항체를 문헌[미국 특허 제4,640,835호, 미국 특허 제4,496,689호, 미국 특허 제4,301,144호, 미국 특허 제4,670,417호, 미국 특허 제4,791,192호 및 미국 특허 제4,179,337호] 중 하나 이상에 제시된 방식으로 연결시키는 것을 포함한다.
사람화 및 아미노산 서열 변이체
항-IL-36R 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항-IL-36R 항체 DNA에 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체로는, 예를 들면, 본원의 예시의 항-IL-36R 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어져 최종 작제물에 도달하고, 단, 최종 작제물은 바람직한 특성을 갖는다. 또한, 아미노산 변화는, 사람화된 또는 변이체 항-IL-36R 항체의 번역-후 과정도 변경할 수 있고, 예를 들면, 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킨다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항-IL-36R 항체의 소정 잔기 또는 영역의 유용한 동정 방법은, 문헌[Cunningham and Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 칭한다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹은 동정되고(예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(전형적으로 알라닌)에 의해 대체되어 IL-36R 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 이들 아미노산 위치는, 치환 부위에 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개선된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 사전에 결정되지만, 돌연변이 자체의 특성은 사전에 결정될 필요는 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에서 알라닌 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 항-IL-36R 항체 변이체를 바람직한 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은, 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 에피토프 태그에 융합된 항-IL-36R 항체가 포함된다. 항-IL-36R 항체 분자의 다른 삽입 변이체는, 항-IL-36R 항체의 N- 또는 C-말단에의 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 융합을 포함한다.
다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는, 제거된 항-IL-36R 항체 분자 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖고, 이의 위치에 삽입된 상이한 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발을 위해 가장 흥미로운 부위로는 초가변성 영역이 포함되지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 5에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, "예시 치환"이라고 칭하거나 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술되는 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물은 스크리닝된다.
[표 C]
Figure 112019107141389-pat00035
단백질 화학에서, 항체의 생물학적 특성은, (a) 치환 구역에서의 폴리펩타이드 골격의 구조, 예를 들면, 시트 또는 나선 입체배좌, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 항체의 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성될 수 있음이 일반적으로 허용된다. 자연 발생 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기초하여 그룹으로 나뉜다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 소수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환함을 수반할 것이다.
또한, 사람화된 또는 변이체 항-IL-36R 항체의 적절한 입체배좌를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 개선시키거나, 이상 가교결합을 방지하거나, 또는 세포독성 또는 세포분열억제성 화합물에 확실한 접합점을 제공할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 항체에 부가되어 항체의 안정성을 개선할 수 있다(특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
한 유형의 치환 변이체는 모 항체(예를 들면, 사람화된 또는 사람 항체)의 하나 이상의 초가변성 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위한 선택된 얻어진 변이체(들)은, 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방식은, 파지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇의 초가변성 영역 부위(예를 들면, 6 내지 7 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체는, 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에의 융합과 같이 섬유상 파지 입자로부터의 1가의 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체는 이들의 생물학적 특성(예를 들면, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변성 영역 부위를 동정하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변성 영역 잔기를 동정할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 항체와 사람 IL-36R 사이의 접촉점을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는, 본원에서 상세히 설명되는 기술에 따른 치환을 위한 후보물이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝되고, 추가의 개발을 위해, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 변이체의 다른 유형은 항체의 본래 글리코실화 패턴을 변경한다. "변경한다"는, 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/시키거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가함을 의미한다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명의 항체를 변형시켜 글리코실화 부위를 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은, 아스파라긴 잔기의 측쇄에의 탄수화물 모이어티의 부착을 말한다. 트리펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내의 이들 트리펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 강력한 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는, 하이드록시아미노산에의 당, 예를 들면, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스 중 하나의 부착을 나타내지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 사용할 수 있다. 따라서, 주어진 단백질, 예를 들면, 항체를 글리코실화하기 위해, 단백질의 아미노산 서열을 상기에 기술된 트리펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하도록 조작한다(N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한, 본래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 변경이 이루어질 수도 있다(O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항-IL-36R 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는, 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법에 의해 제조된다. 이들 방법으로는, 천연 공급원으로부터의 단리(천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 이전에 제조된 변이체 또는 비변이체 버젼의 항-IL-36R 항체의 올리고뉴클레오타이드-매개된(또는 부위-지시된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
다른 실시형태는, 사람화된 항-IL-36R 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포, 및 사람화된 항체의 생산을 위한 재조합 기술을 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들면, 전장 모노클로날 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 직선상 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로 이루어진 다특이적 항체를 포함하는, 항-IL-36R 항체의 임의의 바람직한 형태를 암호화할 수 있다.
몇몇의 실시형태는, 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇의 실시형태는, 서열번호 11 내지 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
몇몇의 실시형태는, 서열번호 76 내지 서열번호 86 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇의 실시형태는, 서열번호 87 내지 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
몇몇의 실시형태는, 서열번호 114 내지 서열번호 124 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 항체의 경쇄를 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇의 실시형태는, 서열번호 125 내지 서열번호 139의 아미노산 서열을 갖는 항체의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
한 양상에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)은, 각각 서열번호 115 및 서열번호 127; 각각 서열번호 118 및 서열번호 126; 각각 서열번호 118 및 서열번호 127; 각각 서열번호 115 및 서열번호 125; 각각 서열번호 115 및 서열번호 126; 각각 서열번호 118 및 서열번호 125; 각각 서열번호 124 및 서열번호 138; 각각 서열번호 123 및 서열번호 139; 각각 서열번호 123 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.
사람화된 항-IL-36R 항체 또는 이의 단편 또는 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(들)는 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같은 하나 이상의 조절 또는 제어 서열에 융합될 수 있고, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같은 적합한 발현 벡터 또는 숙주 세포에 포함될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 분자는, 불변 도메인, 예를 들면, 사람 불변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 독립적으로 융합되어 온전한 항체의 생산을 가능하게 할 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 부분은 함께 융합되어 단일쇄 항체의 생산을 위한 템플레이트를 제공할 수 있다.
재조합적 생산을 위해, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 클로닝(DNA의 증폭)을 위해 또는 발현을 위해, 복제가능한 벡터에 삽입된다. 재조합 항체를 발현하기 위한 다수의 적합한 벡터를 이용할 수 있다. 벡터 구성성분으로는 일반적으로 하기 중 하나 이상이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 신호 서열, 복제의 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
또한, 사람화된 항-IL-36R 항체는, 상기 항체가, 이종 폴리펩타이드, 예를 들면, 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 특이적 절단 부위를 갖는, 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드와 융합되는, 융합 폴리펩타이드로서 생산될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은, 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된(즉, 신호 펩타이드에 의해 절단된) 이종 신호 서열이다. 사람화된 항-IL-36R 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 원핵 신호 서열에 의해 치환될 수 있다. 신호 서열은, 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 지질단백질, 및 가열-안정성 장내독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비의 경우, 본래 신호 서열은, 예를 들면, 효모 전환효소 알파-인자로부터 수득된 리더(사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 산성 포스파타제, 씨. 알비칸스 글루코아밀라제, 또는 WO 90/13646에 기술되어 있는 신호 서열로 치환될 수 있다. 포유동물 세포에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 gD 신호도 사용할 수 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNASMS 사람화된 항-IL-36R 항체를 암호화하는 DNA에 대해 판독 프레임 내에서 라이게이션된다.
발현 및 클로닝 벡터는, 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제하는 것을 가능하게 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 상기 서열은, 벡터가 숙주 염색체 DNA를 독립적으로 복제하는 것을 가능하게 하고 복제의 기원 또는 자가 복제 서열을 포함하는 서열이다. 이러한 서열은 각종 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 익히 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원은 대부분의 그램-음성 박테리아, 2-υ에 적합하다. 플라스미드 기원은 효모에 대해 적합하고, 각종 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, 및 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 구성성분의 기원은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기원은 조기 프로모터를 포함하므로 이것이 전형적으로 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는, 발현의 확인을 용이하게 하기 위한 선택가능한 마커를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택가능한 마커 유전자는, 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하거나, 또는 대안으로 보체 영양요구성 결핍증이거나, 또는 다른 대안으로 복합 배지에 존재하지 않는 특정 영양성분, 예를 들면, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자를 공급한다.
선택 스킴의 한 예시는 숙주 세포의 성장을 막기 위한 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환되는 상기 세포는, 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하므로, 선택 용법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예시는 약물 네오마이신, 마이코페놀산, 및 하이그로마이신을 사용한다. 표유동물에 대해 통상의 선택가능한 마커는, 사람화된 항-IL-36R 항체를 암호화하는 핵산을 흡수하기에 적합한 세포의 동정을 가능하게 하는 마커, 예를 들면, DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II(예를 들면, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 및 오르니틴 데카복실라제 등이다. DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지 중의 형질전환체 모두를 배양함으로써, DHFR 선택 유전자로 형절전환된 세포가 우선 동정된다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우의 적절한 숙주 세포는, DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주(예를 들면, DG44)이다.
대안으로, 항-IL-36R 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 다른 선택가능한 마커, 예를 들면, 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포(특히, 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는, 선택가능한 마커, 예를 들면, 아미노글리코시딕 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대한 선택 제제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
숙주 세포로서의 효모 세포에서 재조합적 생산이 수행되는 경우, 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 TRP1 유전자(Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39)는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있다. TRP1 유전자는, 트립토판에서 성장하는 능력이 결여되어 있는 효모의 돌연변이 스트레인, 예를 들면, ATCC 제44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다(Jones, 1977, Genetics 85:12). 이어서, 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는, 트립토판의 부재시의 성장에 의해 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2p-결핍 효모 스트레인, 예를 들면, ATCC 20,622 및 38,626은, LEU2 유전자를 갖는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.
추가로, 1.6㎛ 환형 플라스미드 pKD1로부터 유도된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안으로, 재조합 소 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템은 케이. 락티스(K. lactis)로 보고되었다(Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). 산업적 스트레인의 클루이베로마이세스에 의한 성숙 재조합 사람 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터도 개시되어 있다(Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).
발현 및 클로닝 벡터는, 일반적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되는 프로모터를 포함하고, 항-IL-36R 항체 또는 이의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된다. 원핵 숙주와의 사용에 적합한 프로모터로는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들면, tac 프로모터가 포함된다. 또한, 다른 공지의 박테리아 프로모터도 적합하다. 또한, 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는, 사람화된 항-IL-36R 항체를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 Shine-Dalgarno(S.D.) 서열을 포함할 것이다.
다수의 진핵 프로모터 서열가 공지되어 있다. 사실상, 모든 진핵 유전자는, 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT가 풍부한 영역을 갖는다. 다수의 유전자의 전사의 출발로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은, N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는, 암호화 서열의 3' 말단에의 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열 모두는 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주와 사용하기 위한 적합한 프로모팅(promoting) 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들면, 엔올라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.
유도가능한 프로모터는, 성장 조건에 의해 제어된 전사의 추가의 이점을 갖는다. 이들로는 알콜 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사와 관련된 유도체 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 사용에 관여하는 효소에 대한 효모 프로모터 영역이 포함된다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 사람화된 항-IL-36R 항체 전사는, 예를 들면, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예를 들면, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 가열-충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어되고, 단, 이러한 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 상용성이다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는, 복제의 SV40 바이러스 기원도 포함하는 SV40 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 사람 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 이용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기술되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스 유래의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서의 사람 p-인터페론 cDNA의 발현을 개시하는 문헌[Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601]도 참조한다. 대안으로, 라우스(Rous) 육종 바이러스 장 말단 반복을 프로모터로서 사용할 수 있다.
재조합 발현 벡터에 사용될 수 있는 다른 유용한 요소는, 보다 높은 진핵생물에 의해, 사람화된 항-IL-36R 항체를 암호화하는 DNA의 전사를 증가시키는데 사용되는 인핸서 서열이다. 다수의 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자로부터 공지되어 있다(예를 들면, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스 유래의 인핸서가 사용된다. 그 예로는 복제 기원의 후측 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 요소의 개선의 설명을 위한 문헌[Yaniv, 1982, Nature 297:17-18]도 참조한다. 인핸서는, 사람화된 항-IL-36R 항체-암호화 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
또한, 진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 사람, 또는 다른 다세포 유기체 유래의 유핵 세포)에 사용된 발현 벡터는, 전사의 종결을 위해, 그리고 mRNA를 안정화시키기 위해 필요한 서열도 포함할 수 있다. 이러한 서열은, 통상적으로, 5' 및 때때로 3'의 원핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은, 항-IL-36R 항체를 암호화하는 mRNA의 비번역 부분에 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 분절을 포함한다. 하나의 유용한 전사 종결 구성성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 이에 개시된 발현 벡터를 참조한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항-IL-36R 항체는 CHEF 시스템을 이용하여 발현될 수 있다. (예를 들면, 미국 특허 제5,888,809호를 참조하고, 이의 개시는 본원에 인용에 의해 포함된다.)
본원에서 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현하는데 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 상기 기술된 보다 높은 진핵생물 세포이다. 이러한 목적을 위한 적합한 원핵생물로는 진정 세균, 예를 들면, 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세아에, 예를 들면, 에스케리키아, 예를 들면, 이. 콜라이, 엔테로박터, 어위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면, 살모넬라 티피뮤리움, 세라티아, 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스, 및 시겔라, 및 바실러스, 예를 들면, 비. 서브틸리스 및 비. 리케니포르미스(예를 들면, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시되어 있는 비. 리케니포르미스 41 P), 슈도모나스, 예를 들면, 피. 아에루기노사, 및 스트렙토마이세스가 포함된다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294(ATCC 31,446)이지만, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110(ATCC27,325)과 같은 다른 스트레인이 적합하다. 이들 예시는 제한되기 보다는 설명을 위한 것이다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예를 들면, 섬유상 진균 또는 효모도 사람화된 항-IL-36R 항체-암호화 벡터에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시아에, 또는 통상의 베이커의 효모는, 보다 낮은 진핵생물 숙주 미생물 중에서도 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 속, 종, 및 스트레인의 수는 통상적으로 이용가능하고, 본원에서 유용하며, 예를 들면, 스키조사카로마이세스 폼베; 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들면, 케이. 락티스, 케이. 프라길리스(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(ATCC 16,045), 케이, 위커라미(ATCC 24,178), 케이. 왈티(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(ATCC 36,806), 케이, 써모톨러란스, 및 케이 마르시아누스; 야로위아(EP 402,226); 피키아 파스토르스(EP 183,070); 칸디다; 트리코더마 레에시아(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사; 슈반니오마이세스, 예를 들면, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스; 및 섬유상 진균, 예를 들면, 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움, 및 아스퍼질러스 숙주, 예를 들면, 에이. 니둘란스, 및 에이. 나이거이다.
글리코실화된 사람화된 항-IL-36R 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 비척추동물 세포의 예로는, 예를 들면, 다수의 배큘로바이러스 스트레인 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(애벌레), 아에데스 아에깁티(모기), 아에데스 알보픽투스(모기), 드로소필라 멜라노가스테르(초파리) 및 봄빅스 모리(누에)와 같은 숙주 유래의 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포를 포함하는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 스트레인이 공공으로 이용가능하고, 예를 들면, 오토그라파 칼리포르니카 NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 스트레인이 있고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포에 대해 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 페뉴니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양액도 또한 숙주로서 사용할 수 있다.
다른 양상에서, 사람화된 항-IL-36R의 발현은 척추동물 세포에서 수행된다. 배양액(조직 배양액)에서의 척추동물 세포의 증식은 통상의 절차가 되었고, 이 기술은 널이 이용가능하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는, SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651), 사람 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양액에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포(Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59)), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR1(CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; e.g., DG44), 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), 마우스 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587), 사람 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442), 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 세포(Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad, Sci. 383: 44-68), MRC 5 세포, FS4 세포, 및 사람 간암 세포주(Hep G2)가 있다.
숙주 세포는, 사람화된 항-IL36R 항체 생산을 위해 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도거나 형질전환체를 선택하거나 바람직한 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 종래 영양성분 배지에서 배양된다.
본원에 기술되는 사람화된 항-IL-36R 항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들면, Ham's F10(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), 최소 필수 배지((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.)), 및 둘베코 변형 이글 배지((DMEM), Sigma-Aldrich Co.)는 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌들[Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, 미국 특허 제4,767,704호, 미국 특허 제4,657,866호, 미국 특허 제4,927,762호, 미국 특허 제4,560,655호, 미국 특허 제5,122,469호, WO 90/103430, 및 WO 87/00195] 중 하나 이상에 기술되어 있는 배지 중 하나를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 이들 배지 중 어느 하나에는, 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예를 들면, 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충액(예를 들면, HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들면, 겐타마이신), 미량 요소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 또한, 다른 보충제는, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, 및 pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 이전에 사용된 조건이고, 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는, 주변 세포질 공간에서 세포내적으로 생산되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내적으로 생산되는 경우, 제1 단계로서 단백질을 방출하기 위해 세포를 파괴할 수 있다. 미립자 잔해, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 어느 하나는, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. 문헌[Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167]은, 이. 콜라이의 주변 세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차를 기술한다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산 나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지에 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 우선 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 농축시킨다. 프로테아제 저해제, 예를 들면, PMSF는 단백질분해를 저해하기 위해 상기 단계들 중 어느 하나에 포함될 수 있고, 항생제는 부정성 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다. 각종 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 항체를 단리할 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있고, 전형적인 정제 기술은 친화성 크로마토그래피이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은, 종, 및 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 이소형에 의존한다. 단백질 A를 이용하여 사람 감마1, 감마2, 또는 감마4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제할 수 있다(예를 들면, 문헌[Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13] 참조). 단백질 G는, 모든 마우스 이소형 및 사람 감마3에 대해 추천된다(예를 들면, 문헌[Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575] 참조). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들면, 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은, 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더욱 신속한 유속 및 더욱 짧은 프로세싱 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제에 유용하다. 또한, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들면, 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피(예를 들면, 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전도 회수되는 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들)에 따르면, 목적하는 항체 및 오염물질을 포함하는 혼합물을 약 2.5 내지 4.5의 pH의 용출 완충액을 이용하여 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행할 수 있고, 전형적으로는 저염 농도(예를 들면, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행된다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)에 의해 나타내어지는 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부(예를 들면, 가변 영역을 암호화하는 부분)에 대해, 본원에 정의된 바와 같은 저, 중, 및 고 엄격 조건(stringency condition) 하에 하이브리드화하는 핵산도 포함된다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 전형적으로 15개 이상(예를 들면, 20, 25, 30 또는 50개)의 뉴클레오타이드 길이이다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은, 항-IL-36R 폴리펩타이드(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역) 또는 이의 보체를 암호화하는 핵산의 일부 또는 전부의 서열과 80% 이상, 예를 들면, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 동일하다. 본원에 기술된 유형의 하이브리드화 핵산은, 예를 들면, 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들면, PCR 프라이머, 또는 진단용 프로브로서 사용될 수 있다.
비치료학적 용도
본원에 기술된 항체는 친화성 정제 제제로서 유용하다. 이러한 프로세스에서, 항체는, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 방법을 이용하여, 단백질 A 수지와 같은 고체상 상에 고정화시킨다. 고정화된 항체를, 정제되는 IL-36R 단백질(또는 이의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 그 후에, 고정화된 항체에 결합되는 IL-36R 단백질을 제외한 샘플 중의 물질 모두를 실질적으로 제거할 것인 적합한 용매로 지지체를 세척한다. 최종적으로, 항체로부터 IL-36R 단백질을 방출할 것인 적합한 다른 용매로 지지체를 세척한다.
또한, 항-IL-36R 항체, 예를 들면, 사람화된 항-IL-36R 항체는, IL-36R 단백질을 검출하고/하거나 정량하기 위한 진단 검정, 예를 들면, 특정 세포, 조직, 또는 혈청에서의 IL-36R 발현의 검출에도 유용하다. 항-IL-36R 항체는, 예를 들면, 주어진 치료 및/또는 예방 용법의 효능을 측정하기 위한 임상학적 시험 절차의 부분으로서 질환의 발병 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단학적으로 사용될 수 있다. 검출은, 항-IL-36R 항체를 커플링함으로써 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 각종 효소, 보결분자 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사활성 물질, 각종 양전자 방출 단층촬영을 이용한 양전자 방출 금속, 및 비방사활성 상자성(paramagnetic) 금속 이온이 포함된다. 예를 들면, 본 발명에 따른 진단제로서 사용하기 위한 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 관한 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다.
항-IL-36R 항체는, IL-36R-관련 장애(예를 들면, IL-36R의 이상 발현을 특징으로 하는 장애)의 진단 방법에 또는 대상체가 IL-36R-관련 장애를 발병하는 증가된 위험을 갖는지의 여부를 측정하기 위한 방법에 사용할 수 있다. 이러한 방법은, 대상체 유래의 생물학적 샘플을 IL-36R 항체와 접촉시키는 것, 및 IL-36R에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 포함한다. "생물학적 샘플"은, 개체, 세포주, 조직 배양액, 또는 IL-36R을 잠재적으로 발현하는 세포의 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플인 것으로 의도된다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
몇몇의 실시형태에서, 상기 방법은, 대조군 샘플(IL-36R-관련 장애를 갖지 않는 대상체)에 대해 환자 샘플에서의 IL-36R의 수준을 비교하여 환자가 IL-36R-관련 장애를 갖거나 IL-36R-관련 장애를 발병할 위험이 있는지의 여부를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 예를 들면, 항체를 검출가능한 모이어티로 표지화하는 것은 진단 목적에 이로울 것이다. 방사성 동위원소, 형광 표지, 및 효소 기질 표지 등을 포함하는 다수의 검출가능한 표지가 이용가능하다. 표지는, 각종 공지의 기술을 이용하여 항체와 간접적으로 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 3개의 넓은 범주의 상기 언급된 표지 중 어느 하나는 아비딘과 접합될 수 있으므로, 표지는 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안으로, 표지와 항체의 간접적 접합을 달성하기 위해, 항체를 소 합텐(예를 들면, 디곡신)과 접합시킬 수 있고, 상이한 유형의 상기 언급된 표지들 중 하나를 항-합텐 항체(예를 들면, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 따라서, 표지와 항체의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
예시 방사성 동위원소 표지로는 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I가 포함된다. 항체는 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs]에 기술되어 있는 방법을 이용하여, 방사성 동위원소로 표지화될 수 있다. 방사활성은, 예를 들면, 섬광 계수(scintillation counting)에 의해 측정할 수 있다.
예시 형광 표지로는 희토 킬레이트(rare earth chelate)(유로퓸 킬레이트)로부터 유도된 표지가 포함되거나, 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린, 및 텍사스 레드를 이용할 수 있다. 형광 표지는, 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Immunology]에 개시되어 있는 공지의 기술을 통해 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광측정계를 이용하여 정량화할 수 있다.
다양한 널리 특징확인된 효소-기질 표지가 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 검토를 위해 미국 특허 제4,275,149호 참조). 효소는, 일반적으로, 각종 기술을 이용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변경을 촉진한다. 예를 들면, 변경은 분광광도법으로 측정할 수 있는 기질에서의 색 변화일 수 있다. 대안으로, 효소는, 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술은 상기에 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 이어서, 예를 들면, 화학발광측정계를 이용하여 측정되거나 형광 억셉터에 에너지를 기증할 수 있는 광을 방출할 수 있다.
효소 표지의 예로는 루시페라제, 예를 들면, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들면, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로환 옥시다제(예를 들면, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 및 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다. 효소를 항체에 접합시키기 위한 기술은, 예를 들면, 문헌[O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예로는, 예를 들면, 기질로서의 하이드로겐 퍼옥시다제와 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)(여기서, 상기 하이드로겐 퍼옥시다제는 염료 전구체, 예를 들면, 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB)를 산화시킨다); 발색성 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼리성 포스파타제(AP); 및 발색성 기질, 예를 들면, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제 또는 형광원성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제와 β-D-갈락토시다제(β-D-Gal)가 포함된다.
다수의 다른 효소-기질 조합이 당해 분야 숙련가에 의해 이용가능하다. 이들의 일반적인 검토를 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 미국 특허 제4,318,980을 참조한다.
다른 실시형태에서, 비표지되고, 사람화된 항-IL-36R 항체에 결합하는 표지된 항체로 검출되는, 사람화된 항-IL-36R 항체를 사용한다.
본원에 기술되는 항체는 임의의 공지의 검정 방법, 예를 들면, 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]을 참조한다.
항-IL-36R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 IL-36 수용체에 대한 리간드의 결합을 저해할 수 있다. 이러한 방법은, 세포(예를 들면, 포유동물 세포) 또는 세포 환경에 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여함을 포함하고, 이에 의해 IL-36 수용체에 의해 매개된 신호전달이 저해된다. 이들 방법은 시험관내에서 또는 생체내에서 수행할 수 있다. "세포 환경"은 조직, 배지, 또는 세포 주위의 세포외 매트릭스임이 의도된다. 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 항체 또는 단편이, 세포의 외부 및 세포의 주위의 IL-36R 분자에 결합하고, 따라서, 이의 수용체에 대한 IL-36 리간드의 결합을 방지할 수 있는 방식으로, 세포의 세포 환경에 투여된다.
진단 키트
항-IL-36R 항체는 진단 키트, 즉, 소정량의 시약과 진단 검정을 수행하기 위한 지침서가 패키징된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는, 기질 및 효소에 의해 요구되는 공동인자, 예를 들면, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액(예를 들면, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제도 포함될 수 있다. 각종 시약의 상대적 양은 광범위하게 변할 수 있어 검정의 민감성을 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중의 농도를 제공한다. 시약은, 용해시 적절한 농도의 시약 용액을 제공할 것인 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.
치료학적 용도
다른 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 사람화된 항-IL-36R 항체는, 본원에 기술되어 있는 IL-36R의 발현과 관련된 각종 장애의 치료에 유용하다. IL-36R 관련 장애를 치료하는 방법은, 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 사람화된 항-IL-36R 항체를 투여함을 포함한다.
사람화된 항-IL-36R 항체 또는 제제는, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여되고, 필요에 따라, 국소 면역억제제 치료, 병변내 투여(이식 전에 항체와 이식절편을 관류시키거나 또는 접촉시킴을 포함)된다. 사람화된 항-IL-36R 항체 또는 제제는, 예를 들면, 주입으로서 또는 볼루스로서 투여될 수 있다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 사람화된 항-IL-36R 항체는, 특히, 항체의 용량을 감소시키면서, 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 한 양상에서, 투약은, 투여가 간단한지 또는 만성인지의 여부에 따라, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적절한 용량은, 상기 정의된 바와 같은 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료학적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상학적 병력, 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량 등의 각종 인자에 의존할 것이다. 항체는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1mg/kg 내지 20mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 15mg/kg)의 항체는, 예를 들면, 1회 이상의 별도의 투여에 의한 또는 연속적 주입에 의한, 환자에게의 투여를 위한 개시 후보 용량이다. 전형적인 1일 용량은, 상기 언급된 인자들에 따라, 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 치료를 질환 증상이 바람직하게 억제될 때까지 지속한다. 그러나, 다른 용량 용법이 유용할 수 있다. 이러한 치료요법의 진행은 종래 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 예시 투약 용법은 WO 94/04188에 개시되어 있는 용법이다.
용어 "억제"는, 본원에서 "개선" 및 "완화"와 동일한 문맥으로 사용되어 질환의 하나 이상의 특징을 경감시키는 것을 의미한다.
항체 조성물은, 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 투약, 및 투여될 것이다. 이러한 문맥에서 고려하기 위한 인자로는, 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상학적 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴링, 및 의료인에게 공지되어 있는 다른 인자들이 포함된다. 투여되는 항체의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려에 의해 지배될 것이고, 이는 IL-36R 발현과 관련된 장애를 예방하거나, 개선하거나, 치료하는데 필요한 최소량이다.
항체는, 의문의 장애를 예방하거나 치료하는데 현재 사용되고 있는 하나 이상의 제제와 함께 제형화될 필요는 없지만, 임의로 이와 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은, 제형에 존재하는 사람화된 항-IL-36R23p19 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자들에 의존한다. 이들은, 일반적으로, 앞서 사용된 것과 동일한 용량 및 투여 방식으로, 또는 지금까지 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
약제학적 조성물 및 이의 투여
IL-36R 결합제(예를 들면, 항-IL-36R 항체)를 포함하는 조성물은, 면역 장애, 호흡기 장애 또는 암을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명은, 추가로, 암, 호흡기 장애 또는 면역 장애의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조시 IL-36R 결합제(예를 들면, 항-IL-36R 항체)의 용도를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는, IL-36R 결합제가 투여될 수 있는 임의의 포유동물 환자를 의미하고, 예를 들면, 사람 및 비사람 포유동물, 예를 들면, 영장류, 설치류, 및 개가 포함된다. 본원에 기술된 방법을 이용한 치료에 특이적으로 의도되는 대상체는 사람을 포함한다. 항체 또는 제제는, 면역 장애, 호흡기 장애 또는 암의 예방 또는 치료시에, 단독으로 또는 다른 조성물과의 조합으로 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 제제와 조합으로 투여될 수 있는 당해 조성물로는 메토트렉세이트(MTX) 및 면역조정제, 예를 들면, 항체 또는 소분자가 포함된다.
이러한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 항체의 예는, 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체이다. 또한, 이러한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 항체의 예는, 서열번호 11 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체이다.
또한, 이러한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 항체의 추가의 예는, 서열번호 76 내지 서열번호 86 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체이다. 또한, 이러한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 바람직한 항체는, 서열번호 87 내지 서열번호 101 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체이다.
또한, 이러한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 항체의 추가의 예는, 서열번호 77과 서열번호 89, 서열번호 80과 서열번호 88, 서열번호 80과 서열번호 89, 서열번호 77과 서열번호 87, 서열번호 77과 서열번호 88, 서열번호 80과 서열번호 87, 서열번호 86과 서열번호 100, 서열번호 85와 서열번호 101, 또는 서열번호 85와 서열번호 10 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체이다.
또한, 이러한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 항체의 추가의 예는, 서열번호 115, 서열번호 118, 서열번호 123 또는 서열번호 124 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 사람화된 항체를 포함하는 항체이다. 또한, 이러한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 바람직한 항체는, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 138, 또는 서열번호 139 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 사람화된 항체를 포함하는 항체이다.
또한, 이러한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 항체의 추가의 예는, 항체 B1, 항체 B2, 항체 B3, 항체 B4, 항체 B5, 항체 B6, 항체 C1, 항체 C2 또는 항체 C3을 포함하는 항체이다.
각종 전달 시스템이 공지되어 있어 IL-36R 결합제를 투여하는데 사용할 수 있다. 도입 방법으로는 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. IL-36R 결합제는, 예를 들면, 주입, 볼루스 또는 주사에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제, 예를 들면, 화학치료요법제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 투여는 피하 주사에 의한 것이다. 이러한 주사용 제형은, 예를 들면, 격주마다 1회 투여될 수 있는 사전 충전된 시린지로 제조될 수 있다.
특정 실시형태에서, IL-36R 결합제 조성물은 주사에 의해, 카테터 수단에 의해, 좌제의 수단에 의해, 또는 임플란트의 수단에 의해 투여되고, 임플란트는 다공성, 비-다공성, 또는 시알라스틱막과 같은 막 또는 섬유를 포함하는 교질 물질이다. 전형적으로, 조성물을 투여하는 경우, 항-IL-36R 항체 또는 제제가 흡수되지 않는 물질이 사용된다.
다른 실시형태에서, 항-IL-36R 항체 또는 제제는 제어된 방출 시스템으로 전달된다. 한 실시형태에서, 펌프를 사용할 수 있다. (예를 들면, 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 다른 실시형태에서, 중합체 물질을 사용할 수 있다. (예를 들면, 문헌[Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조). 다른 제어된 방출 시스템이, 예를 들면, 문헌[Langer, supra]에 논의된다.
IL-36R 결합제(예를 들면, 항-IL-36R 항체)는, 치료학적 유효량의 결합제 및 하나 이상의 약제학적 상용성 성분을 포함하는, 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
전형적인 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 일상 절차에 따라 사람에 대한 정맥내 또는 피하 투여용으로 개작된 약제학적 조성물로서 제형화된다. 전형적으로, 주사에 의한 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 약제는, 또한, 가용화제 및 국소 마취제, 예를 들면, 리그노카인을 포함하여 주사 부위에서의 통증을 줄인다. 일반적으로, 성분들은, 활성제의 양을 표시한 앰플 또는 샤쉐트와 같은 용봉된 컨테이너 내에, 별도로 공급되거나 단위 용량 형태, 예를 들면, 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합된다. 약제가 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약제 등급 수 또는 염수를 함유하는 주입병으로 분배될 수 있다. 약제가 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
추가로, 약제학적 조성물은, (a) IL-36R 결합제(예를 들면, 항-IL-36R 항체)를 동결건조 형태로 함유하는 컨테이너, 및 (b) 주사를 위한 약제학적으로 허용되는 희석제(예를 들면, 멸균수)를 함유하는 제2 컨테이너를 포함하는, 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는, 동결건조된 항-IL-36R 항체 또는 제제의 재구성 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 임의로, 이러한 컨테이너(들)와 관련하여, 약제 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 공고가 존재할 수 있고, 이러한 공고는 사람 투여를 위한 제조, 사용, 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한다.
면역 장애 또는 암의 치료 또는 예방에 유효한 IL-36R 결합제(예를 들면, 항-IL-36R 항체)의 양은 표준 임상학적 기술에 의해 측정될 수 있다. 또한, 시험관내 검정은 임의로 최적 용량 범위를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은, 또한, 투여 경로, 및 면역 장애 또는 암의 단계에 의존할 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은, 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다.
일반적으로, 면역 장애 또는 IL-36R 발현 암을 지닌 환자에게 투여되는 항-IL-36R 항체 또는 IL-36R 결합제의 용량은 전형적으로 약 0.1mg/kg 대상체의 체중 내지 약 100mg/kg 대상체의 체중이다. 대상체에게 투여되는 용량은 약 0.1mg/kg 대상체의 체중 내지 약 50mg/kg 대상체의 체중, 약 1mg/kg 대상체의 체중 내지 약 30mg/kg 대상체의 체중, 약 1mg/kg 대상체의 체중 내지 약 20mg/kg 대상체의 체중, 약 1mg/kg 대상체의 체중 내지 약 15mg/kg 대상체의 체중, 또는 약 1mg/kg 대상체의 체중 내지 약 10mg/kg 대상체의 체중이다.
예시 용량으로는 1ng/kg 내지 100mg/kg이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇의 실시형태에서, 용량은 약 0.5mg/kg, 약 1mg/kg, 약 2mg/kg, 약 3mg/kg, 약 4mg/kg, 약 5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 7mg/kg, 약 8mg/kg, 약 9mg/kg, 약 10mg/kg, 약 11mg/kg, 약 12mg/kg, 약 13mg/kg, 약 14mg/kg, 약 15mg/kg 또는 약 16mg/kg이다. 용량은, 예를 들면, 매일, 1주당 1회(매주), 1주당 2회, 1주당 3회, 1주당 4회, 1주당 5회, 1주당 6회, 2주마다, 또는 1개월마다, 2개월마다, 또는 3개월마다 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 용량은 약 0.5mg/kg/주, 약 1mg/kg/주, 약 2mg/kg/주, 약 3mg/kg/주, 약 4mg/kg/주, 약 5mg/kg/주, 약 6mg/kg/주, 7mg/kg/주, 약 8mg/kg/주, 약 9mg/kg/주, 약 10mg/kg/주, 약 11mg/kg/주, 약 12mg/kg/주, 13mg/kg/주, 약 14mg/kg/주, 약 15mg/kg/주, 또는 약 16mg/kg/주이다. 몇몇의 실시형태에서, 용량은 약 1mg/kg/주 내지 약 15mg/kg/주의 범위이다.
몇몇의 실시형태에서, IL-36R 결합제를 포함하는 약제학적 조성물은 추가로, 결합제에 접합되거나 접합되지 않은 치료제를 포함할 수 있다. 항-IL-36R 항체 또는 IL-36R 결합제는, 면역 장애 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 치료제와 조합하여 공동-투여될 수 있다.
이러한 병용 치료요법 투여는, 질환 매개변수(예를 들면, 증상의 중증도, 증상의 수, 또는 재발의 빈도)에 대해 상가 효과 또는 상승 효과를 가질 수 있다.
조합적 투여를 위한 치료 용법에 관해서, 특정 실시형태에서, 항-IL-36R 항체 또는 IL-36R 결합제는 치료제와 동시에 투여된다. 다른 특정 실시형태에서, 치료제는, 항-IL-36R 항체 또는 IL-36R 결합제의 투여 이전에 또는 이후에, 1시간 이상까지, 및 수개월까지, 예를 EFMAUS, 1시간, 5시간, 12시간, 1일, 1주, 1개월, 또는 3개월 이상, 항-IL-36R 항체 또는 IL-36R 결합제의 투여 이전에 또는 이후에 투여된다.
제조 물품
다른 양상에서, 상기 기술된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 포함된다. 제조 물품은 컨테이너 및 표지를 포함한다. 적합한 컨테이너로는, 예를 들면, 병, 바이알, 시린지, 및 시험관이 포함된다. 컨테이너는 각종 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로 이루어질 수 있다. 컨테이너는, 병태를 치료하는데 유효한 조성물을 수용하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들면, 컨테이너는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사기 주사 바늘에 의해 천공가능한 스톱퍼를 갖는 바이알일 수 있다. 조성물 중의 활성제는, 사람화된 항-IL-36R 항체이다. 컨테이너 상의 또는 이와 관련된 라벨은, 조성물이 선택된 병태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 제조 물품은, 약제학적으로 허용되는 완충액, 예를 들면, 포스페이트-완충 염수, 링거액, 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 니들, 시린지, 및 사용지침서와 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 추가로 기술되고, 이는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 항체는 하기 실시예에 추가로 기술된다.
실시예
실시예 1: 항-사람 IL-36R 항체의 동정
다중 마우스 스트레인을, 재조합적으로 생산된 사람 IL-36R(ECD - 세포외 도메인: Genbank 수탁 번호 #NP_003845의 아미노산 20 내지 332) 단백질로 면역화시켰고, 전통적 하이브리도마 생성에 관한 강한 역가 반응을 생성시킨 스트레인이었다. 사람 IL-36R(ECD)에 대한 강한 결합을 유발하지만 사람 IL-1R1(가장 관련된 IL-1R 과 구성원)에 대한 결합은 유발하지 않는 융합 생성물을 서브클로닝하고 재스크리닝하였다. 다중 하이브리도마를 동정하여, 결합되어 IL-36로부터의 신호전달을 중화시킨 모노클로날 항체를 수득하였다(실시예 2, 실시예 3, 및 실시예 4 참조). 표준 PCR 프라이머 세트를 이용하여 하이브리도마로부터 가변 도메인을 클로닝하였다. 대표적인 모노클로날 항체의 가변 도메인 및 특정 CDR은 상기에 기술되어 있다. 마우스 항체는 모두 사람 불변 도메인 상의 마우스 가변 도메인으로 이루어진 키메라 항체(hu IgG1KO / 카파)로 전환시켰다. hu IgG1KO(knock out)는, FcγR 및 보체 결합과 같은 이펙터 기능을 감소시킴으로써 ADCC 및 CDC 활성을 제거하는 2개의 대체 돌연변이(Leu234Ala 및 Leu235Ala)를 갖는다. 마우스 및 키메라 항체의 가변 도메인은 동일하다. 키메라 항체를 생성하여 항체의 기능을 확인하고, 정확한 가변 도메인 서열이 수득되었음을 확실히 한다.
실시예 2: 동정된 마우스 항-사람 IL-36R 항체의 분자 결합 친화도
A) 재조합 사람 IL-36R에 대한 항-IL-36R 항체의 운동역학 및 결합 친화도는, 단일 컬럼 정제에 따른 하이브리도마로부터 생성된 물질을 이용하는 프로테온(Proteon)(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 측정하였다. 단일 IL-36R 표면 코트 농도에서의 사람 IL-36R 수행에 대한 모든 마우스 리드의 결합 친화도는 100pM 미만인 것으로 추정되었다. 7개의 상이한 표면 밀도에서의 사람 IL-36R 수행에 대한 마우스 항체의 결합 친화도(글로벌 피트)는 표 1에 나타낸다. 키메라 항-IL36R IgG의 결합은 각각의 마우스 리드에 대해 등가이다.
Figure 112019107141389-pat00036
B) 마우스 IL-36R 및 사람 IL-1R1에 대한 분자 선택성
또한, 마우스 및 키메라 항-IL-36R 항체를 마우스 IL-36R 또는 사람 IL-1R1 표면에 100nM의 농도로 주사하였다. Fortebio Octet(Fortebio, Menlo Park, CA)를이용하여 측정한 이들 항체에 대한 마우스 IL-36R에의 결합 신호 및 사람 IL-1R1에의 결합 신호는 0이고, 이는 이들 항체가 사람 IL-36R에 선택적으로 결합함을 나타낸다. 또한, 사람 IL-36R에 대한 항-IL-36R 항체의 결합은 50% 사람 혈청의 존재시에 분석하였고, 높은 특이성을 입증하는, 결합 온-레이트(on-rate)에 대한 혈청의 유의한 효과는 관찰되지 않았다.
실시예 3: 기능성 마우스 및 사이노몰거스 검정에서의 마우스 및 키메라 항-사람 IL-36R 항체의 효력
프로토콜: 사람 NCI/ADR-RES 세포 pNFκB/사이토카인 방출 검정
시약:
R&D Systems: 절삭된 rh IL36β
R&D Systems: 절삭된 rh IL36γ
R&D Systems: 절삭된 rh IL36α:
MA6000 포스포-NFκB (Ser536) 전세포 용해물 키트
Meso Scale Diagnostics, LLC
MSD ELISA 커스텀 사람 96-웰 4-스폿 검정
Meso Scale Diagnostics, LLC
NCI/ADR-RES 세포를, 96웰 플레이트 중의 0.25% 혈청을 갖는 RPMI 배지에 45000세포/웰로 플레이팅하였다. 한 플레이트는 pNFκB의 분석에 사용하였고, 다른 플레이트는 사이토카인 방출에 대해 사용하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온배양하였다. 리간드(IL36α, β, γ) 및 항체를 혈청 결핍(SS) 배지에서 4x 바람직한 농도로 희석시켰다. 리간드 이전에 길항제(항체)를 세포에 첨가하였다. pNFκB: NCI 세포 +/- 리간드 및 길항제를 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 항온배양하였다. 이어서, 배지를 통기시켰고, 세포를 빙상의 100ml/웰 완전 용해 완충액에 30분 동안 용해시켰다. 이어서, 용해물을 2500RPM, 20분, 4℃로 원심분리하였고, MSD ELISA 플레이트에 이동시켜 제조업자의 프로토콜에 따라 pNFκB에 대해 검정하였다. 사이토카인 방출의 경우: 자극 후 18 내지 24시간, 상청액을 MSD ELISA로 이동시켜 제조업자의 프로토콜에 따라 사이토카인에 대해 검정하였다.
프로토콜: BaF/3 사이노몰거스 IL-36R 세포에 대한 pNFκB (S536) MSD ELISA
BaF/3 사이노몰거스 IL-36R 세포를, 96웰 플레이트 중의 SS 배지에 90,000세포/웰로 플레이팅하였다. 100ul 배지를 대조군 웰에 첨가하였다. 길항제(항체)를 4x 바람직한 농도로 희석시켰고, 50ml를 각각의 웰에 첨가하였다. 리간드(IL36α, β, γ) 및 항체를 SS 배지에서 4x 바람직한 농도로 희석시켰고, 50ml를 각각의 웰에 첨가하였다(최종 체적 200ml). 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 항온배양하였다. 플레이트를 간략하게 원심분리하였고, 배지를 통기시켰고, 세포를 100ml/웰 완전 용해 완충액에 용해시켰고(MSD pNFκB 프로토콜 참조), 빙상에서 30분 동안 항온배양하였다. 이어서, 용해물을 2500RPM, 20분, 4℃로 원심분리하였고, MSD ELISA 플레이트에 이동시켰다. 이어서, 용해물을 상기 기술된 바와 같은 MSD 키트를 이용하여 pNFκB 활성에 대해 평가하였다.
결과: 사람 IL-36 리간드를 이용한 사람 기능성 검정(pNFκB 및 사이토카인 방출) 및 사이노몰거스 기능성 검정(pNFκB)에서 마우스 항-사람 IL-36R 항체에 대한 IC90 결과는 표 2에 나타낸다. 사람 IL-36 리간드를 이용한 사람 기능성 검정(pNFκB 및 사이토카인 방출) 및 사이노몰거스 기능성 검정(pNFκB)에서 키메라 항-사람 IL-36R 항체에 대한 IC90 결과는 표 3에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00037
Figure 112019107141389-pat00038
실시예 4: 사람 IL-36R 발현 세포에 대한 마우스 항-사람 IL-36R 항체의 결합
유동 세포측정법에 의한 항체의 결합에 대한 프로토콜
전장 사람 IL-36R 또는 NCI/ADR-RES 세포로 형질감염된 HEK293 세포를 염색하기 전에 24 시간 동안 계대하였다. 세포를 PBS 중의 5mM EDTA 10ml로 세정함으로써 플라스크로부터 제거하였고, 이어서, 세포를 탈군집화/분산시키기 위해, 추가의 10ml의 mM EDTA 및 2.5ml의 Accumax와 함께 37℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 이어서, 항체를 PBS + 2% BSA에서 특정 농도로 희석시켰고, 세포를 실온에서 20분 동안 항온배양하였다. 이어서, 200mldml PBS를 첨가함으로써 과도한 항체를 세척하였고, 이어서, 원심분리하였다. 이어서, 2차 시약을 웰당 50ml로 첨가하였고, 세포를 실온에서 15분 동안 항온배양하였고, 이어서, 상기와 같이 세척하였다. 세포를 200ml의 PBS에 재현탁시켰고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 사람 IL-36R HEK 형질감염체에의 마우스 항-사람 IL-36R 항체 결합에 대한 결합 EC50은 표 4에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00039
실시예 5: 사람화된 IL-36R 항체의 생산
사람에서 투여에 따른 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해, 마우스 항-사람 IL-36R 모노클로날 항체 81B4 및 73C5를 고안 및 스크리닝 프로세스를 통해 '사람화'시켰다. 프레임워크 상동성, CDR 구조, 보존된 정규 잔기, 보존된 계면 패킹 잔기 및 다른 매개변수에 기초하여 사람 프레임워크 서열을 마우스 리드에 대해 선택하였다. 이들 프레임워크 위치에서의 아미노산 잔기의 특이적 치환은, 사람 생식선 프레임워크 영역에의 CDR 또는 HVL의 "직접적인 교환(swap)"에 의해 형성된 사람화된 항체에서 입증된 것에 비하여, 결합 친화도 및/또는 안정성을 포함하는 항체 성능의 각종 양상을 향상시킬 수 있다. 추가의 특징확인을 위해, 키메라 모 Fab와 비교하여 보다 우수하거나 동등한 결합 및 향상된 발현을 나타낸 Fab를 선택하였다. 항체 81B4 및 73C5에 대한 대표적인 사람화된 가변 영역은 명세서 섹션에 나타낸다. 이러한 방식에서, 항체 B1 내지 항체 B6은, 마우스 항체 81B4로부터 유도된 사람화된 항체(사람 IgG1 KO(KO=녹아웃)/카파 골격에 클로닝됨)였다. 항체 B1 내지 항체 B6은 표 A에 나타낸다. 항체 C1 내지 항체 C3은, 마우스 항체 73C5로부터 유도된 사람화된 항체(사람 IgG1 KO(KO=녹아웃)/카파 골격에 클로닝됨)였다. 항체 C1 내지 항체 C3은 표 C에 나타낸다.
실시예 6: 사람화된 IL-36R 항체의 결합
재조합 사람 IL-36R에 대한 사람화된 항-IL-36R 항체의 운동역학 및 결합 친화도는 프로테온(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 측정하였다. 사람 IL-36R을 5개의 상이한 표면 밀도로 고정화하였고, 글로벌 피트를 이용하여 결과를 분석하였다(3개의 실험 결과를 나타내는 표 5 참조). 유동 세포측정법을 통한 NCI/ADR-RES 세포에 대한 사람화된 항체의 결합은 실시예 4에 기술되어 있는 프로토콜을 이용하여 측정하였다(EC90 값에 대해서는 표 5 참조).
Figure 112019107141389-pat00040
실시예 7: 기능성 사람 검정에서의 사람화된 항-사람 IL-36R 항체의 효력
사람 NCI/ADR-RES 세포로부터의 사람화된 IL-36R 변이체를 이용한 신호전달의 기능성 차단을 실시예 3에 기술된 바와 같이 시험하였다. 사람 IL-36 리간드를 이용한 사람 기능성 검정(pNFκB 및 사이토카인 방출)에서의 사람화된 항-사람 IL-36R 항체에 대한 IC90 결과는 표 6에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00041
실시예 8: 사람 1차 케라티노사이트 검정에서의 항-IL-36R 항체의 효력
프로토콜: 사람 1차 표피 케라티노사이트 pNFκB/사이토카인 방출 검정
세포를 96웰 플레이트 중의 배양 배지에 30,000세포/웰로 플레이팅하였고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온배양하였다. 이어서, 실시예 3에 기술된 바와 같이 검정을 수행하였다.
결과: 사람 IL-36 리간드로 자극된 사람 1차 케라티노사이트 검정(pNFκB 및 IL-8 방출)에서의 마우스, 키메라, 및 사람화된 항-IL-36R 항체에 대한 IC90 결과는 각각 표 7, 표 8, 및 표 9에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00042
Figure 112019107141389-pat00043
Figure 112019107141389-pat00044
실시예 9: 기능성 사람 1차 장내 표피 세포 검정에서의 항-IL-36R 항체의 효력
프로토콜: 사람 1차 장내 표피 세포 pNFκB/사이토카인 방출 검정
세포를 96웰 플레이트 중의 배양 배지에 30,000세포/웰로 플레이팅하였고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온배양하였다. 이어서, 실시예 3에 기술된 바와 같이 검정을 수행하였다.
결과: 사람 IL-36 리간드로 자극된 사람 1차 장내 표피 세포 검정(pNFκB 및 IL-8 방출)에서의 마우스 항-IL-36R 항체에 대한 IC90 결과는 표 10에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00045
실시예 10: 기능성 사람 1차 장내 근섬유모세포 검정에서의 항-IL-36R 항체의 효력
프로토콜: 사람, 1차 장내 근섬유모세포 pNFκB/사이토카인 방출 검정
세포를 96웰 플레이트 중의 배양 배지에 30,000세포/웰로 플레이팅하였고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온배양하였다. 이어서, 실시예 3에 기술된 바와 같이 검정을 수행하였다.
결과: 사람 IL-36 리간드로 자극된 사람 1차 장내 근섬유모세포 검정(pNFκB 및 IL-8 방출)에서의 항-IL-36R 항체에 대한 IC90 결과는 표 11 및 표 12에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00046
Figure 112019107141389-pat00047
실시예 11: 기능성 사람 1차 피부 섬유모세포 검정에서의 항-IL-36R 항체의 효력
프로토콜: 사람, 1차 피부 섬유모세포 pNFκB/사이토카인 방출 검정
세포를 96웰 플레이트 중의 배양 배지에 30,000세포/웰로 플레이팅하였고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온배양하였다. 이어서, 실시예 3에 기술된 바와 같이 검정을 수행하였다.
결과: 사람 IL-36 리간드로 자극된 사람 1차 피부 섬유모세포 검정(pNFκB 및 IL-8 방출)에서의 항-IL-36R 항체에 대한 IC90 결과는 표 13 및 표 14에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00048
Figure 112019107141389-pat00049
실시예 12: 기능성 사람 1차 근위 세뇨관 세포 검정에서의 마우스 항-IL-36R 항체의 효력
프로토콜: 사람, 1차 근위 세뇨관 세포 pNFκB/사이토카인 방출 검정
세포를 96웰 플레이트 중의 배양 배지에 5,000세포/웰로 플레이팅하였고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온배양하였다. 이어서, 실시예 3에 기술된 바와 같이 검정을 수행하였다.
결과: 사람 IL-36 리간드로 자극된 사람 1차 근위 세뇨관 세포 검정(pNFκB 및 IL-8 방출)에서의 마우스, 키메라, 및 사람화된 항-IL-36R 항체에 대한 IC90 결과는 표 15에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00050
실시예 13: IL-36γ 자극된 재건된 사람 표피로부터의 IL-8 생산의 저해
프로토콜: 재건된 표피
항-IL-36R 항체(1.5㎍/ml)를 재건된 사람 표피와 함게 예비-항온배양하였고, 사람 재조합체 IL-36γ(20ng/ml)로 자극하였다. 재조합 사람 IL-1β(20ng/ml; R&D Systems)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 배양 24시간 후, 세포 상청액을 수집하였고, IL-8에 대해 검정하였다(IL-8에 대한 검정은 실시예 3에 기술되어 있다). 샘플을 3회 시험하였고, 평균 pg/ml ± 표준 오차는 하기 표(표 16)에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00051
실시예 14: 재건된 사람 표피에서의 IL-36 리간드 유도된 S100A7 및 S100A12 유전자 발현의 저해
작용제 IL-36 리간드를 이용한 재건된 사람 표피의 자극은 S100A7 및 S100A12 유전자 발현을 유도한다. S100A7 및 S100A12는, 표피 분화 복합체 내에 위치하는 유전자이다.
프로토콜: 재건된 사람 표피를 항-IL-36R 항체(1.5㎍/ml)와 함께 항온배양하였고, 사람 재조합 IL-36γ(20ng/ml)로 자극하였다. 재조합 사람 IL-1β(20ng/ml; R&D Systems)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 5% CO2 및 37℃에서의 배양 24시간 후, 재건된 사람 표피로부터 RNA를 단리하였고, 실시간 역 전사효소-폴리머라제 연쇄 반응에 의해 유전자 발현에 대해 검정하였다. 2-ΔΔCt 방법을 이용하여 상대적 발현을 계산하였다. 샘플을 3회 시험하였고, 평균 발현 ± 표준 오차는 하기 표(표 17)에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00052
실시예 15: 건선의 이종이식체 모델에서의 항-I-36R 항체의 효능
프로토콜: 피부과 전문의에 의해 임상학적으로 진단된 24명의 건선 환자들로부터 혈액 및 비병변 피부 생검을 수득하였다. 피부 생검을 면역-결핍 NIH-III 마우스에게 이식하였고, 4 내지 5주의 기간 동안 절편이식하였다.
절편이식된 피부에의 피부내 주사를 위해 생검시에 각각의 공여체로부터 수집된 혈액으로부터 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. 주사 전에, PBMC를 1㎍/ml의 스태필로코커스의 장내독소 B(Toxin Technologies, Florida, USA), 및 80U/ml의 사람 재조합 IL-2(Peprotech Inc., Oosterhout, the Netherlands)로 자극하였다. 자가 PBMC를 PBS 중의 7.5 x 10＾5 세포로 피부내 주사하여 피부 염증 및 건선 표현형의 유도를 동시화하였다. 세포의 주사 3주 후, 마우스로부터 생검을 인출하였고, 조직학에 의해 분석하였다.
모든 그룹의 냉동-보존된 피부 조직에 대해 조직학적 염색을 수행하였다. 모든 피부층에 걸친 사선 횡단면(8㎛)은 도 4에 기술된 바와 같이 제조되었다. 표피 두께의 평가를 위해, 생검의 중앙으로부터 2개의 비연속적 절편을 무작위 선택하였고, 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 후속적으로, 절편을 100배 배율로 평가하였다. 생검의 전체 길이에 걸쳐, 올림푸스 DP71 카메라 및 Cell＾D 이미징 소프트웨어(V2.7, Munster, Germany)를 이용하여 양 절편 둘 다에서 리지(ridge) 길이를 측정하였다. 리지 길이는, 과립층(stratum granulosum)의 상부 에지와 리지의 저부 사이의 거리로서 정의된다. 무작위 및 블라인드 방식으로 생검을 스코어링하였다.
각각의 치료 그룹에 대한 평균 표피 두께 및 최대 표피 두께에 대한 결과는 표 18에 나타낸다. 각각의 치료 그룹에서 표피 두께의 순 변화에 대한 결과는 표 19에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00053
Figure 112019107141389-pat00054
실시예 16: 야생형 및 인터류킨-1 수용체-유사 2 동형접합성 녹아웃 마우스에서 담배 연기 노출 3주 후의 아만성(sub-chronic) 폐 염증
프로토콜: 야생형 또는 인터류킨-1 수용체-유사 2 마우스를 3주 동안 담배 연기에 노출시켜 폐 고통을 유도하였다. 1째주 및 2째주는 5일의 연속 노출일로 구성되었고, 한편, 3째주 동안에는 연속 4일 동안 마우스를 노출시켰다. 마우스를 담배 노출(16분)과 신선한 공기(8분)의 24분 간격으로 5개의 담배에 노출시켰다. 최종 노출 18시간 후, 마우스를 2 x 0.8ml의 행크 염 용액(0.6mM EDTA)으로 세척하였다. 10분 동안의 원심분리 후 기관지 폐포 세척액으로부터 상청액 및 세포 펫렛을 수집하였다. 각각의 노출 그룹에 대한 기관지 폐포 세척액에서의 총 대식세포 및 호중구 세포 수는 표 20에 나타낸다.
Figure 112019107141389-pat00055
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH <120> ANTI IL-36R ANTIBODIES <130> 09-0583 <150> US 61/560,554 <151> 2011-11-16 <150> US 61/644,111 <151> 2012-05-08 <150> US 61/713,713 <151> 2012-10-15 <160> 140 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Val Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln His His Arg Ser Pro 85 90 95 Val Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Phe Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Phe Asn Ile Arg Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Thr Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Phe Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ser Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Ala Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Gly Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Ser Lys Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Asp Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Phe His Arg Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 7 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Val Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Ile Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Val Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Ile Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Thr Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 9 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ala Thr Val Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Arg Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Thr 35 40 45 His Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Met Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys 100 105 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Phe Ser Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Gly Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Val Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Ser Thr Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Met Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Val Tyr Phe Gly Asn Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 12 <211> 125 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Leu Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Thr Lys Asn Phe Tyr Ser Ser Tyr Ser Tyr Asp Asp Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 13 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Phe Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Phe Pro Asn Asn Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Ala Phe Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 14 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Lys Phe 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Pro Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ile Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Arg Ile Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Ile Tyr Tyr Ser Thr Leu Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 15 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Phe Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Ile Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Leu Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Phe Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Val Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Arg Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Val Val Phe Tyr Gly Glu Pro Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 17 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Val His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Phe Asn Ala Pro Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 18 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Val His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Pro Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 19 <211> 117 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 19 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Pro Val Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile His Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Met Asp Trp Asp Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 20 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Lys Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Arg Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Phe Pro Asp Asn Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Ala Phe Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 21 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 133 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Ser Val Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Arg Asn Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Val Phe Tyr Gly Glu Pro Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Pro Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val 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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 137 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 137 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Pro Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 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Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 138 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 138 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Val His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Phe Asn Ala Pro Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Asp Asp Thr Ala 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440 445 Lys <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 140 Arg Thr Ser His Leu Ala Ser 1 5

Claims (22)

  1. (a) 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR1), 서열번호 104의 아미노산 서열(L-CDR2) 및 서열번호 44의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 53의 아미노산 서열(H-CDR1), 서열번호 62의 아미노산 서열(H-CDR2) 및 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항-IL-36R 항체가 IL-36α-, IL-36β- 및 IL-36γ-매개된 신호전달을 차단하는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 사람화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 염증성 질환의 치료, 자가면역 질환의 치료, 호흡기 질환의 치료, 대사 장애의 치료, 상피 매개된 염증 장애의 치료, 섬유증 또는 암의 치료에 유용한 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 건선, 염증성 장 질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 강피증, 쇼그렌 질환, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 관절염, 류마티스 관절염, COPD, 천식, 만성 천식, 당뇨병성 신장병증, 낭창성 신염, 또는 강직성 척추염의 치료에 유용한, 약제학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 염증성 장 질환의 치료에 유용한, 약제학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 크론병 또는 궤양성 대장염 질환의 치료에 유용한, 약제학적 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 수장족저 농포증 또는 범발성 농포성 건선의 치료에 유용한, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는, DNA 또는 RNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제8항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인, 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 발현 제어 서열과 기능적으로 연결된 (functional association), 벡터.
  12. 제8항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  13. 제9항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. (a) 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 제12항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (b) 상기 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생산 방법.
  15. 제8항에 따른 폴리뉴클레오타이드의 사용을 포함하는 재조합적 생산 방법인, 제1항 또는 제2항에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생산 방법.
  16. 제9항에 따른 벡터의 사용을 포함하는 재조합적 생산 방법인, 제1항 또는 제2항에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생산 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 상피 매개된 염증성 장애, 섬유증, 암, 건선, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, COPD, 만성 천식, 강직성 척추염, 크론병 또는 궤양성 대장염 질환의 생체내 진단 방법에 사용하기 위한, 진단 키트.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 사람화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고 생체내 진단에 사용하기 위한 표지에 접합되는, 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제1항 또는 제2항에 따른 항-IL-36R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물이 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 상피 매개된 염증성 장애, 섬유증, 암, 건선, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, COPD, 만성 천식, 강직성 척추염, 크론병 및 궤양성 대장염 질환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 질환의 진단에 유용한, 조성물.
  20. 대상체에서 IL-36R-관련 질환의 진단을 위해 또는 대상체가 IL-36R-관련 질환 발병의 증가된 위험을 갖는지를 결정하기 위해 생물학적 샘플 내에서 IL-36R을 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 제1항 또는 제2항에 따른 항-IL-36R 항체를 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계; (b) IL-36R에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계; 및 임의로 (c) 상기 대상체가 IL-36R-관련 질환에 걸렸는지 또는 IL-36R-관련 질환 발병의 위험이 있는지를 결정하기 위해 상기 샘플 내의 IL-36R의 수준을 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 질환이 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 상피 매개된 염증성 장애, 섬유증, 암, 건선, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, COPD, 만성 천식, 강직성 척추염, 크론병 및 궤양성 대장염 질환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 생물학적 샘플 내에서 IL-36R을 검출하는 방법.
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