DE69323765T2

DE69323765T2 - Säugetier-rezeptoren für interleukin 10 (il-10)

Info

Publication number: DE69323765T2
Application number: DE69323765T
Authority: DE
Inventors: J. Fernando Menlo Park Ca 94025 Bazan; Chuan-Chu Westfield Nj 07090 Chou; Alice Suk-Yue Milpitas Ca 95035 Ho; Di-Hwei Palo Alto Ca 94306 Hsu; Ying Mountain View Ca 94040 Liu; Kevin W. Palo Alto Ca 94306 Moore; Jimmy C. Edison New Jersey 08820 Tan
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1992-12-10
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 1999-07-22
Anticipated expiration: 2013-12-08
Also published as: HK1008830A1; GR3030038T3; AU5734094A; CA2151141A1; US5985828A; CA2151141C; US5789192A; DK0673420T3; EP0673420B1; IL107951A; IL107951A0; US5863796A; DE69323765D1; US6423500B1; ATE177147T1; CN1090326A; JP3135576B2; MY109045A; EP0673420A1; JPH07509613A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Nucleinsäuren und Polypeptide, die charakteristisch für Rezeptoren für Säuger-Interleukin-10 sind, und insbesondere auf ihre Verwendung bei der Herstellung von Reagentien, die für die Diagnose oder Behandlung verschiedener, mit dem Rezeptor zusammenhängender medizinischer Zustände geeignet sind.

Hintergrund der Erfindung

Aktivierte hämatopoetische Zellen sezernieren zahlreiche Proteine, von denen einige Cytokine genannt werden. Cytokine spielen eine Vielzahl wichtiger Rollen bei der Regulation von Immunreaktionen durch Steuern der Vermehrung, Differenzierung und der Effektorfunktionen von Immunzellen.
Die Wirkungen von Cytokinen werden typischerweise durch spezifische Rezeptormoleküle vermittelt, die man auf den Zielzellen findet. Die Struktur und der Wirkungsmechanismus dieser Rezeptoren auf den Zielzellen werden nicht gut verstanden, obwohl bekannt ist, daß viele aus wenigstens zwei getrennten Polypeptidketten bestehen.
Eine Kette, die typischerweise die α-Kette genannt wird, kann ihren Cytokin-Liganden mit geringer Affinität binden. Diese Wechselwirkung kann zur Übertragung eines Signals an die Zelle führen oder auch nicht. Eine weitere Kette, die als die β- Kette bezeichnet wird, verleiht, wenn sie mit der α-Kette assoziiert ist, der Bindung des heterodimeren Rezeptors an das Cytokin eine höhere Affinität. Die β-Kette für sich weist gewöhnlich keine wesentliche Ligandenbindungsaffinität auf.
Die dimere Form des Rezeptors ist in der Lage, als Folge der Anbindung eines Liganden, z. B. Cytokins, ein Signal in die Zelle zu übertragen.
Ein Cytokin, das die Synthese mehrerer anderer Cytokine hemmt, wird Interleukin-10 (IL-10) genannt. Siehe Fiorentino et al., J. Exptl. Med. 170: 2081 (1989), und Mosmann et al., Immunol. Today 12: A49-A53 (1991). Sowohl das Maus- als auch das Human- Gegenstück wurden isoliert. Siehe Moore et al., Science 248: 1230 (1990), und Vieira et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 1172 (1991).
Ein Human-virales Analogon, das entweder als vIL-10 oder als BCRF1 bekannt ist, wurde beschrieben; es hat viele charakteristische Aktivitäten mit der natürlichen Human-Form gemeinsam. Siehe Hsu et al., Science 250: 830 (1990). Ein anderes virales Homologes von einem Pferde-Herpes-Virus wurde beschrieben. Siehe Rode et al., Viral Genes 7: 111 (1993).
Wegen der biologischen Bedeutung von IL-10, und da IL-10 wirkt, indem es zuerst an zelluläre Rezeptoren bindet, besteht ein Bedürfnis nach isolierten Komponenten solcher Rezeptoren und nach Materialien und Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Komponenten.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse, indem sie Nucleinsäuren und Proteinsequenzen von Komponenten eines Rezeptors für IL-10 bereitstellt.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird also ein isoliertes Säuger-Rezeptorprotein oder Fragment davon bereitgestellt, das spezifisch IL-10 bindet und eine Sequenzhomologie von 50-100% mit einem Human-Polypeptid, das durch SEQ ID NO: 2 definiert ist, oder einem Maus-Polypeptid, das durch SEQ ID NO: 4 definiert ist, aufweist.
Spezielle Beispiele für isolierte Säuger-Rezeptorproteine oder Fragmente, die gemäß der Erfindung bereitgestellt werden, sind Human-IL-10-Rezeptorproteine oder Fragmente, z. B. ein Protein, das eine durch SEQ ID NO: 2 definierte Aminosäuresequenz aufweist, und Maus-IL-10-Rezeptorproteine oder Fragmente, z. B. ein Protein, das eine durch SEQ ID NO: 4 definierte Aminosäuresequenz aufweist. Weitere spezielle Beispiele sind Proteine oder Fragmente, die aus einer löslichen Form eines Human-IL- 10-Rezeptorproteins bestehen, sowie chimärische Rezeptorproteine, die eine extrazelluläre Domäne eines Human-IL-10-Rezeptorproteins, wie es oben spezifiziert ist, wobei die extrazelluläre Domäne spezifisch IL-10 bindet, und eine intrazelluläre Domäne eines Human-IL-4-Rezeptorproteins umfassen.
Die Erfindung stellt weiterhin isolierte oder rekombinante Nucleinsäure bereit, die Säuger-IL-10-Rezeptorproteine oder Fragmente davon codiert, wie sie oben definiert sind, insbesondere eine isolierte oder rekombinante Nucleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an ein Plasmid hybridisiert, das bei der American Type Culture Collection unter der Zugriffsnummer ATCC 69146 oder 69147 hinterlegt ist. Solche rekombinanten Nucleinsäuren können ausgewählt sein aus:
(a) einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 definiert ist;
(b) einer Nucleinsäure, die mit hoher Stringenz an eine Nucleinsäure gemäß Teil (a) zu hybridisieren vermag; oder
(c) einer Nucleinsäure, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ein funktionelles Äquivalent der Nucleinsäure von Teil (a) oder (b) ist.
Spezielle Beispiele umfassen eine isolierte oder rekombinante Nucleinsäure, wie sie oben definiert ist, die wenigstens 35 Nucleotide aufweist und die eine Sequenz umfaßt, die eine Homologie von wenigstens 80% zu einer Sequenz aus dem codierenden Teil von SEQ ID NO: 1 oder 3 aufweist, sowie isolierte oder rekombinante Nucleinsäuren, die eine lösliche Form eines Human-IL-10-Rezeptorproteins codieren. Dazu gehören isolierte oder rekombinante Nucleinsäuren, (i) die ein Protein, das aus den Aminosäureresten 1-216 von SEQ ID NO: 2 besteht, oder ein Protein, das eine Sequenzhomologie von 50-100% dazu aufweist und spezifisch IL-10 bindet, codieren und (11) die ein Protein codieren, das die extrazellulären Segmente aminoproximal zu dem Transmembranhelixsegment, das sich von Rest 217 bis Rest 243 von SEQ ID NO: 2 erstreckt, umfaßt. Solche isolierten oder rekombinanten Nucleinsäuren können ein heterologes Fusionsprotein codieren. Fragmente, die aus einem zusammenhängenden Segment von wenigstens 17 Nucleotiden einer isolierten oder rekombinanten Nucleinsäure, wie sie oben definiert ist, bestehen, bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Die Nucleinsäuren und Fragmente der Erfindung können einen Teil eines rekombinanten Vektors bilden, der zum Transfizieren von Wirtszellen verwendet werden kann. Solche Wirtszellen können gemäß der Erfindung unter Bedingungen, bei denen die Nucleinsäure exprimiert wird, kultiviert werden.
Die Erfindung stellt weiterhin Antikörper (einschließlich monoklonaler Antikörper) oder bindende Fragmente davon gegen ein Rezeptorprotein oder Fragment davon, wie es oben spezifiziert ist, sowie die Verwendung solcher Antikörper oder bindenden Fragmente (i) zur affinitätschromatographischen Isolierung eines Säuger-IL-10-Rezeptorproteins oder (11) zur Verwendung bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Antagonisieren der biologischen Wirkung von IL-10, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine lösliche Form eines Human-IL-10-Rezeptors oder einen Antikörper oder ein bindendes Fragment, wie sie oben definiert sind, umfassen, bereit.
Wie gesagt, werden sowohl eine Human-IL-10-Rezeptor-Komponente als auch ein Maus-Gegenstück als Beispiele genannt, obwohl auch äquivalente Komponenten von anderen Säugerspezies durch ähnliche Verfahren oder auf der Grundlage anderer davon abgeleiteter Eigenschaften gefunden werden können.
Man wird sich also darüber im klaren sein, daß die vorliegende Erfindung rekombinante oder isolierte Nucleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, die eine Homologie zu einer Sequenz aufweist, die einen Säugerrezeptor für IL-10 codiert, ein Fragment davon oder einen einzigartigen Teil davon bereitstellt. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Nucleinsäuren Desoxyribonucleinsäure umfassen, isoliert werden, weiterhin eine regulatorische Sequenz von der 5'- oder 3'-Sequenz in der Nachbarschaft eines Gens, das einen Rezeptor für IL-10 codiert, umfassen oder operabel mit einem genetischen Regulationselement verknüpft sein. In alternativen Ausführungsformen haben die Rezeptoren, Fragmente oder Teile davon eine biologische Wirkung, z. B. ein Merkmal eines Rezeptors für IL-10, oder sind solche eines Säugers einschließlich Maus oder Mensch.
In besonderen Ausführungsformen sind die Nucleinsäuren in der Lage, mit hoher Stringenz an SEQ ID NO: 1 oder 3 zu hybridisieren, oder sie werden unter Verwendung einer Sonde isoliert, die mit hoher Stringenz an ein Human-Rezeptor-Gen für IL-10 hybridisiert. Die Erfindung umfaßt auch Nucleinsäuren, die an diese Sequenzen zu hybridisieren vermögen, z. B. solche, die Mutationen enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Nucleotidsubstitutionen, Nucleotiddeletionen, Nucleotidinsertionen und Inversionen von kurzen Nucleotidsequenzen besteht. Alternative Ausführungsformen umfassen rekombinante Nucleinsäuren, die operabel mit einem genetischen Regulationselement verknüpft sind, z. B. einem prokaryontischen Promotor element oder einem eukaryontischen Expressionsregulationselement einschließlich eines viralen Promotors.
Verschiedene Ausführungsformen umfassen Expressionsvektoren zum Exprimieren von DNA, die einen Rezeptor für. IL-10 codiert, oder Fragmenten davon oder Vektoren, die diese Sequenzen sowie einen Selektionsmarker umfassen. Die Erfindung umfaßt auch Wirtszellen, die einen Expressionsvektor umfassen, der in der Lage ist, diese Rezeptoren zu exprimieren. Bevorzugte Ausführungsformen von Wirtszellen umfassen Prokaryonten einschließlich Gram-negativer und Gram-positiver Bakterien einschließlich E. coli, niedere Eukaryonten einschließlich Hefen sowie höhere Eukaryonten einschließlich Tierzellen, wie Säuger- und Primatenzellen einschließlich solcher des Menschen. Vorzugsweise wird der Rezeptor aus einem Human-Rezeptor für IL-10 oder einem Maus-Rezeptor für IL-10 ausgewählt. Weitere Ausführungsformen umfassen Nucleinsäuren, die weiterhin ein zweites Protein oder Polypeptid codieren, z. B. wenn das zweite Polypeptid mit dem Rezeptor oder einem Fragment davon verschmolzen wird. Die Erfindung umfaßt weiterhin subzelluläre Strukturen, Zellen oder Organismen, die diese Nucleinsäuren umfassen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem Proteine oder Polypeptide, die von diesen DNA-Sequenzen codiert werden, vorzugsweise solche, die im wesentlichen frei von anderen Protein- oder zellulären Kontaminanten sind als den von einem rekombinanten Wirt abgeleiteten. Die Rezeptorproteine oder -polypeptide werden häufig die eines Säugers sein, einschließlich Maus oder Mensch, und können eine Aminosäuresequenz, wie man sie in SEQ ID NO: 2 oder 4 findet, oder eine allele oder Speziesvariante davon oder einen einzigartigen Teil davon aufweisen. Die Rezeptorproteine oder -polypeptide können an einen festen Träger gebunden sein, im wesentlichen rein sein oder in einer pharmazeutisch annehmbaren Form mit oder ohne zusätzliche Träger oder Arzneimittelhilfsstoffe vorliegen. Die Erfindung entwirft auch Fusionsproteine oder -polypeptide, einschließlich solcher, die weiterhin eine Sequenz von einem zweiten Rezeptorprotein umfassen. Weitere Ausführungsformen umfassen subzelluläre Strukturen, Zellen oder Organismen, die solche Rezeptorproteine oder -polypeptide umfassen.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Herstellung von Rezeptorproteinen oder -polypeptiden bereit, die das Kultivieren einer Zelle, die eine beschriebene Nucleinsäure umfaßt, in einem Nährmedium und das Exprimieren der Rezeptorproteine oder -polypeptide in der Zelle umfassen. Verschiedene alternative Ausführungsformen umfassen weiterhin einen Schritt des Reinigens der Rezeptorproteine oder -polypeptide, wobei die Rezeptorproteine oder -polypeptide in das Medium sezerniert und aus diesem gereinigt werden und wobei der Rezeptor der eines Säugers einschließlich Maus oder Mensch ist. Die Erfindung stellt auch Rezeptoren bereit, die nach diesen Verfahren hergestellt werden und ein posttranslationales Modifikationsmuster aufweisen, das sich von dem im normalen nativen Rezeptor unterscheidet, z. B. eine Glycosylierung, Alkylierung und Carboxylierung. Der Rezeptor kann in einer Zellinie hergestellt werden, die einen Rezeptor exprimiert, der ein unnatürliches Rezeptor-Glycosylierungsmuster aufweist. Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zum Diagnostizieren eines medizinischen Zustands, der durch eine unpassende IL-10-Reaktion gekennzeichnet ist, in einem Wirt bereit, umfassend das In- Kontakt-Bringen einer Probe von dem Wirt mit einem spezifischen Bindungsreagens, das an (i) eine Nucleinsäure, die einen Rezeptor für IL-10 oder ein Fragment davon codiert, oder an (ii) einen Rezeptor für IL-10 oder ein Fragment davon bindet, und das Messen des Ausmaßes der Bindung des Reagens an die Probe. In verschiedenen Alternativen ist das Bindungsreagens eine Nucleinsäuresonde für ein Gen, das den Rezeptor oder ein Fragment davon codiert, ein Antikörper, der einen Rezeptor für IL-10 oder ein Fragment davon erkennt, oder ein Ligand, Agonist oder Antagonist für einen Rezeptor für IL-10. Vorzugswei se ist der Rezeptor der eines Säugers einschließlich Maus oder Mensch.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Durchmustern nach einer Verbindung bereit, die Bindungsaffinität zu einem Rezeptor für IL-10 aufweist, umfassend das Herstellen eines isolierten oder rekombinanten Rezeptors nach einem der beschriebenen Verfahren und das Testen auf Bindung der Verbindung an den Rezeptor, wodurch Verbindungen identifiziert werden, die eine definierte Bindungsaffinität zu diesem aufweisen. Vorzugsweise ist die Verbindung ein Ligand, Agonist oder Antagonist für diese Rezeptoren.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Proteine und Polypeptide bereit, die z. B. frei von Proteinen sind, mit denen sie natürlicherweise assoziiert sind, und die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zu einem Fragment eines Rezeptors für IL-10 homolog ist. Typischerweise ist der Rezeptor der eines Säugers einschließlich Maus oder Mensch, und spezielle Ausführungsformen haben die Sequenz SEQ ID NO: 2 oder 4.
Die Erfindung umfaßt rekombinante oder im wesentlichen reine Polypeptide, die einen Bereich umfassen, der eine wesentliche Identität zu einer Aminosäuresequenz eines Rezeptors für IL-10 aufweist. Besondere Ausführungsformen umfassen Polypeptide mit einer Sequenz, die aus SEQ ID NO: 2 und 4 ausgewählt ist, oder Polypeptide, die an einen festen Träger gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene Antikörper bereit, die eine Bindungsaffinität zu einem rekombinanten Rezeptor für IL-10 oder einem Fragment davon aufweisen. Bevorzugte Ausführungsformen sind Antikörper gegen den Rezeptor für IL-10 und können entweder neutralisierende oder nichtneutralisierende Antikörper sein, die mit einer toxischen Struktureinheit verschmolzen oder mit einer Markerstruktureinheit einschließlich eines Radionuklids konjugiert sind. Bindungsfrag mente, wie Fab und FV, werden ebenfalls bereitgestellt. Vorzugsweise bindet der Antikörper oder das Fragment an einen Rezeptor eines Säugers einschließlich Maus oder Mensch.
Außerdem stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung eines Wirtes bereit, der einen medizinischen Zustand hat, der durch eine unpassende IL-10-Reaktion gekennzeichnet ist, oder der eine anormale Expression eines Rezeptors für IL-10 aufweist, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die (a) einen Antikörper, der an einen Rezeptor für IL-10 oder ein Fragment davon bindet, (b) einen Liganden, Agonisten oder Antagonisten für einen Rezeptor für IL-10 oder (c) einen ligandbindenden Rezeptor oder ein Fragment davon für IL-10 umfaßt, an den Wirt. In einer Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon. In anderen wird der Agonist oder Antagonist nach einem Verfahren ausgewählt, bei dem man eine Zielverbindung mit (a) einem isolierten oder rekombinanten Rezeptor für IL-10 oder (b) einem ligandbindenden Fragment des Rezeptors in Kontakt bringt und die Zielverbindung mit einem isolierten oder rekombinanten Rezeptor für IL-10 oder einem ligandbindenden Fragment des Rezeptors identifiziert und die Zielverbindung auf der Basis der Wirkungen des In-Kontakt-Bringens identifiziert.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Bewertung der Bindungsaffinität einer Testverbindung zu einem Rezeptor für IL-10 bereit, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen (a) einer Probe, die den Rezeptor oder ein Fragment davon enthält, mit einer markierten Verbindung mit bekannter Affinität zu dem Rezeptor und (b) der Testverbindung und das Messen der Menge der gebundenen markierten Verbindung umfaßt, wobei die Menge umgekehrt proportional zu der Menge der Testverbindung ist, die an den Rezeptor gebunden hat. Vorzugsweise ist der Rezeptor der eines Säugers einschließlich Maus oder Mensch. Eine alternative Ausführungsform ist ein Verfahren zum Modulieren der biologischen Aktivität eines Rezeptors für IL-10, umfassend das In-Kontakt-Bringen des Rezeptors mit einer Zusammensetzung, die aus einem Antikörper, der an den Rezeptor bindet, einem Liganden, Agonisten oder Antagonisten für einen Rezeptor für IL-10 und einem ligandbindenden Fragment eines Rezeptors für IL-10 ausgewählt ist.
Die Erfindung stellt außerdem geeignete Reagentien in Kitform bereit. Zum Beispiel stellt sie einen Kit bereit, der geeignet ist (a) zum Quantifizieren eines Rezeptors für IL-10 oder (b) zum Bestimmen der Bindungsaffinität einer Testprobe zu einem Rezeptor für IL-10, wobei der Kit eine markierte Verbindung, die Bindungsaffinität für den Rezeptor aufweist, und eine Einrichtung zum Messen der gebundenen markierten Verbindung umfaßt.
Verschiedene Ausführungsformen umfassen Kits, die weiterhin einen rekombinanten Rezeptor umfassen, wobei die markierte Verbindung ein Ligand für den Rezeptor ist, einschließlich IL-10, wobei die Verbindung ein Antikörper ist, wobei die Einrichtung zum Messen eine feste Phase zum Immobilisieren des Rezeptors ist oder wobei die feste Phase ein Abfangmolekül enthält. Die Erfindung stellt außerdem einen Kit zum Bestimmen eines Antikörpers gegen einen Rezeptor für IL-10 in einer Probe bereit, der den Rezeptor und eine Antikörpernachweiseinrichtung umfaßt. In einer Ausführungsform ist der Rezeptor an einen festen Träger gebunden. Kits, die DNA-Sonden zur Verwendung bei der Bestimmung von z. B. Human-IL-10-mRNA enthalten, werden ebenfalls bereitgestellt.
Die Erfindung stellt außerdem Verbindungen bereit, von denen bekannt ist, daß sie die Aktivität eines Rezeptors für IL-10 modulieren, und die nach einem Verfahren ausgewählt werden, bei dem man die Verbindung mit einem isolierten oder rekombinanten Rezeptor für IL-10 oder einem Fragment davon in Kontakt bringt und die Wirkung des In-Kontakt-Bringens auf die biologische Aktivität bewertet.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zum Modulieren einer biologischen Wirkung von IL-10 bereit, umfassend einen Schritt des Störens biologischer Mechanismen, z. B. der Signalübertragung eines Cytokin-Rezeptors der Klasse 2, z. B. eines Interferonrezeptors. Sie stellt außerdem Verfahren zum Modulieren einer biologischen Wirkung eines Rezeptors der Klasse 2, z. B. eines Interferons, bereit, umfassend einen Schritt des Störens biologischer Mechanismen eines IL-10-Rezeptors.

Beschreibung der Erfindung

Auf alle hier zitierten Literaturstellen wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Die vorliegende Erfindung stellt Aminosäure- und DNA-Sequenzen für Säuger-IL-10-Rezeptor-Untereinheiten bereit, zum Beispiel Human- und Maus-IL-10-Rezeptor-Untereinheiten. Diese Sequenzen wurden erhalten, indem man Pools von Zellen, die cDNA- Expressionsbibliotheksprodukte enthielten, auf spezifische Bindung an IL-10 durchmusterte. So erzeugte Rezeptor-Ligand- Komplexe waren chemisch vernetzt, und es wurden Verfahren angewendet, um Nucleinsäuren zu isolieren, die die Bindungsproteine codieren.
Die rekombinanten Nucleinsäuren und isolierten oder gereinigten Nucleinsäuren sind im wesentlichen homolog zu einer Sequenz, die eine IL-10-Rezeptor-Untereinheit oder ein Fragment davon codiert. Nucleinsäuren, die Fusions-Polypeptide codieren, werden ebenfalls in Betracht gezogen, ebenso wie Vektoren, transformierte Wirtszellen und Organismen, die solche Nucleinsäuren umfassen. Rekombinante und isolierte oder gereinigte IL-10-Rezeptor-Untereinheiten oder Fragmente davon, die von solchen Nucleinsäuren abgeleitet sind, bilden ebenfalls einen Teil dieser Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikörper bereit, die spezifisch für Epitope auf den Rezeptor-Untereinheiten sind. Dazu gehören Antikörper, die spezifisch an Epitope binden, die den Rezeptoren für IL-10 von verschiedenen Spezies gemeinsam sind, oder Epitope, die einzigartig für Rezeptoren von einer einzigen Art sind.
Kits, die diese Materialien umfassen, sind ebenfalls mit eingeschlossen. Die verschiedenen Nucleinsäuren, Polypeptide und Antikörper in den Kits können für verschiedene diagnostische oder therapeutische Zwecke verwendet werden.
Die verschiedenen Materialien können in Verfahren zum Behandeln von Säugern verwendet werden, insbesondere solcher, die an einer unerwünschten Rezeptorfunktion leiden, z. B. Autoimmunkrankheiten, unangebrachte Immunreaktionen der T-Helferzellenklasse 2, unangebrachte Funktion von MHC der Klasse II, unterdrückte Immunfunktionen, die mit Monocyten oder Makrophagen zusammenhängen, septische oder toxische Schockreaktionen und durch intrazelluläre Erreger vermittelte Krankheiten. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung wirksamer Mengen der Materialien oder das In-Kontakt-Bringen biologischer Proben mit diesen.
Die Materialien der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um für die Rezeptoren spezifische Agonisten und Antagonisten auszuwählen und auf diese zu durchmustern. Zum Beispiel können lösliche Formen der Rezeptor-Untereinheiten, denen die Cytoplasma- und/oder die Transmembrandomäne fehlt, hergestellt und durch Standardverfahren auf festen Trägern immobilisiert sowie zum spezifischen Binden von Liganden verwendet werden. So können Liganden identifiziert werden, die spezifisch an die extzrazellulären Bindungstellen oder an die intrazelluläre Domäne des IL-10-Rezeptors binden. Von besonderem Nutzen sind Liganden, die mehrere Rezeptortypen der Klasse, zu der IL-10-Rezeptoren gehören, d. h. Rezeptortypen der Klasse 2, beeinflussen. Rezeptoren der Klasse 2 werden unten ausführlicher beschrieben.
Es können auch Antikörper hergestellt werden, die spezifisch an die Liganden-Erkennungsstellen oder an andere Bereiche der Rezeptoren binden. Die Rezeptor-Untereinheiten oder Fragmente davon oder synthetische Polypeptide mit Sequenzen, die Teilsequenzen der Untereinheiten entsprechen, können bei herkömmlichen Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper als Antigene verwendet werden.
Die Beschreibungen unten sind in erster Linie entweder auf einen Maus- oder einen Human-IL-10-Rezeptor gerichtet, aber die meisten Eigenschaften, sowohl strukturelle als auch biologische, werden diesen und anderen Säuger-Gegenstücken, z. B. von der Ratte, dem Schwein, Schaf, der Ziege usw., gemeinsam sein. Daher können bei Befolgung der hier offenbarten Verfahren auch analoge Verwendungen und Materialien erhalten werden, die von anderen Spezies abgeleitet sind. Diese anderen Spezies können andere warmblütige Arten sein, wie Vögel oder Primaten.
Es werden hier Standardverfahren verwendet, wie sie z. B. beschrieben sind in Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Wu et al. (Hrsg.), 1989, "Recombinant DNA Methodology" aus Methods in Enzymology, Academic Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.), Vol. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; oder Ausubel et al., 1987 und Ergänzungsbände, Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York.
Um Nucleinsäuren zu erhalten, die IL-10-Rezeptor-Untereinheiten codieren, wurden cDNA-Bibliotheken aufgebaut, wobei man Messenger-RNA (mRNA) verwendete, die aus Zellen isoliert worden war, die auf IL-10 ansprachen. Eine als BJAB bezeichnete B-Zellinie wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek menschlichen Ursprungs herzustellen, und Mast- sowie Makrophagen- Zellinien, die als MC/9 bzw. J774 bezeichnet wurden, wurden zur Herstellung von cDNA verwendet, die von Mäusen stammte.
Mehrere Modifikationen und einzigartige Techniken mußten verwendet werden, um Probleme zu überwinden, die mit der Isolierung von cDNA-Klonen durch Expressionsklonieren verbunden sind. Insbesondere war es notwendig, eine geeignete Zellinie zu identifizieren, von der die cDNA-Bibliothek hergestellt werden konnte, die die gewünschte IL-10-bindende Aktivität codiert. Es war außerdem wichtig, festzustellen, ob IL-10 an klonisolierte Expressionsprodukte binden konnte, und eine Zellinie für die Expression auszuwählen, die eine niedrige Hintergrund-IL-10-Bindungsaktivität aufwies.
Das als Ligand verwendete IL-10 (die Wörter "IL-10" und "Ligand" werden unten in derselben Bedeutung verwendet) wurde durch Hinzufügen einer N-terminalen Verlängerung modifiziert, die ein Mittel lieferte, um einen vernetzten Ligand-Rezeptor- Komplex nachzuweisen. Die verwendete Verlängerung war ein FLAG-Peptid, das von einem Antikörper spezifisch erkannt wurde, obwohl stattdessen auch andere Verlängerungen hätten verwendet werden können. Siehe Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204 (1988). Es war nicht bekannt, ob die Verlängerung die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung stören würde oder ob alle beobachteten Wechselwirkungen zwischen IL-10 und Bindungsprotein physiologisch relevant sein würden.
Durch die Verwendung der Verlängerung war es möglich, Zellen nachzuweisen, die eine Rezeptorkomponente exprimierten, und Zellen, die einen vernetzten Komplex auf ihrer Oberfläche besaßen, durch Affinitätsmethoden zu immobilisieren. Beide Verfahren wurden angewendet, um die IL-10-Rezeptor-Untereinheiten anzureichern und ihre Identität zu überprüfen.
Nachdem cDNAs für Rezeptor-Untereinheiten von Maus- und Human- Zellen hergestellt worden waren, wurden sie sequenziert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die tatsächlich sequenzierten unglycosylierten Rezeptor-Untereinheiten, allele Varianten des Proteins und verschiedene metabolische Varianten, z. B. posttranslationale Modifikationen, die von verschiedenen Zelltypen erzeugt werden, einschließlich natürlicher Zellen und in rekombinanten Expressionssystemen verwendeter Wirtszellen. Verschiedene Glycosylierungsvarianten und durch posttranslationale Modifikation entstandene Varianten können erzeugt werden, indem man geeignete Quellzellen wählt.
Die vollständige Nucleotidsequenz der Human-IL-10-Rezeptor- Untereinheit (IL-10R) und die vorausgesagte Aminosäuresequenz sind durch SEQ ID NO: 1 bzw. 2 definiert. Die Maus-Nucleotidsequenz und die daraus vorausgesagte Aminosäuresequenz sind durch SEQ ID NO: 3 bzw. 4 definiert. Das Startcodon in SEQ ID NO: 3 beginnt bei Base 61.
Die Human-Sequenz wurde von einem als SW8.1 bezeichneten Klon abgeleitet, der am 4. Dezember 1992 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC), in einem Plasmid hinterlegt wurde und die Zugriffsnummer ATCC 69146 erhielt. Ein hydrophobes membrandurchspannendes Segment scheint den Aminosäuren 217-243 der Human-Rezeptor-Komponente zu entsprechen. Ein lösliches bindendes Fragment würde also einem, das sich etwa von Rest 1 bis 216 erstreckte, oder einem kürzeren entsprechen.
Die Maus-Sequenz wurde von einem als pMR29 bezeichneten Klon abgeleitet, der am 4. Dezember 1992 bei der ATCC, in einem Plasmid hinterlegt wurde und die Zugriffsnummer ATCC 69147 erhielt.
Der hier verwendete Ausdruck "IL-10-Rezeptor-Untereinheit" umfaßt ein Protein oder Peptid, das eine durch SEQ ID NO: 2 oder 4 definierte Aminosäuresequenz umfaßt oder das von einer durch SEQ ID NO: 1 oder 3 definierten Nucleinsäuresequenz codiert wird. Dieser Ausdruck umfaßt auch Fragmente solcher Proteine oder Polypeptide, die spezifisch IL-10 binden. Solche Fragmente können durch proteolytische Spaltung, chemische Synthese oder rekombinante Verfahren hergestellt werden.
Einige der IL-10-Rezeptor-Untereinheiten dieser Erfindung binden an IL-10, wie Human- oder Maus-IL-10, mit hoher Affinität, z. B. wenigstens etwa 10 nM, gewöhnlich besser als etwa 3 nM, vorzugsweise besser als etwa 1 nM und noch mehr bevorzugt besser als etwa 0,5 nM. Es wird erwartet, daß die Bindungsaffinität eines Multiproteinkomplexes zum Liganden höher ist, wenn zusätzliche Proteinkomponenten mit der hier offenbarten Komponente assoziieren, z. B. eine α-artige Kette.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Proteine oder Peptide, die eine wesentliche Aminosäuresequenzhomologie mit den hier definierten Aminosäuresequenzen aufweisen, schließt jedoch jedes Protein oder Peptid aus, das im wesentlichen die gleiche oder eine geringere Aminosäuresequenzhomologie aufweist als die bekannten Sequenzen von Rezeptor-Untereinheiten für G-CSF, GM-CSF, EPO, TNF, IFN-γ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 oder IL-7.
Einige der Peptide binden kein IL-10, sondern können stattdessen bisher noch nicht charakterisierte intrazelluläre Moleküle binden, die an der Signalübertragung oder anderen Wechselwirkungen mit den Rezeptoren beteiligt sind. Diese Peptide können Aminosäuresequenzen aufweisen, die Sequenzen der intrazellulären oder der Transmembran-Domäne des Rezeptors entsprechen.
Andere Peptide, die keine bekannten Bindefähigkeiten besitzen mögen, werden ebenfalls bereitgestellt. Da sie Aminosäuresequenzen besitzen, die Teilen der Rezeptormoleküle entsprechen, sind diese Peptide z. B. als Antigene für die Herstellung von Antikörpern geeignet.
Aminosäuresequenzhomologie oder -sequenzidentität wird bestimmt, indem man die Übereinstimmung der Reste optimiert, wobei man, falls notwendig, nach Bedarf Lücken einführt. Dies ändert sich, wenn man konservative Substitutionen als Übereinstimmung betrachtet. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: [Glycin, Alanin]; [Valin, Isoleucin, Leucin]; [Asparaginsäure, Glutaminsäure]; [Asparagin, Glutamin]; [Serin, Threonin]; [Lysin, Arginin]; und [Phenylalanin, Tyrosin]. Homologe Aminosäuresequenzen sollen auch natürliche allele und interspezifische Variationen in der jeweiligen Rezeptorsequenz umfassen.
Typische homologe Proteine oder Peptide haben eine Homologie von 50-100% mit den hier definierten Aminosäuresequenzen. Das Ausmaß der Homologie wird wenigstens etwa 50% betragen, im allgemeinen wenigstens 56%, insbesondere wenigstens 62%, häufig wenigstens 67%, insbesondere wenigstens 72%, typischerweise wenigstens 77%, insbesondere wenigstens 82%, gewöhnlich wenigstens 85%, insbesondere wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 93% und noch mehr bevorzugt wenigstens 96% sowie in besonders bevorzugten Ausführungsformen wenigstens 98% oder mehr. Einige homologe Proteine oder Peptide, wie die verschiedenen Rezeptor-Untertypen, werden verschiedene biologische Aktivitäten mit den Komponenten eines Rezeptors für IL-10 gemeinsam haben, z. B. den zur Veranschaulichung dieser Erfindung verwendeten Ausführungsformen.
Der hier verwendete Ausdruck "Biologische Aktivität" ist so definiert, daß er ohne Einschränkung die Bindung an einen Liganden (z. B. IL-10-ähnliches Protein), die Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen die jeweilige Rezeptorkomponente sowie die ligandenabhängige Signalübertragung umfaßt. Eine "auf den Liganden bezogene Aktivität" bezieht sich entweder auf die Ligandenbindung selbst oder auf biologische Aktivitäten, die durch die Ligandenbindung vermittelt werden; dazu gehören z. B. die Modulation eines sekundären Botenstoffs, die Ca²&spplus;-Maskierung, die Phosphorylierung, Proteinassoziationen usw.
Der Ausdruck "Ligand" bezieht sich auf Moleküle, gewöhnlich Mitglieder der Familie der cytokinartigen Peptide, die über die an der Peptid-Ligand-Bindung beteiligten Segmente an den Rezeptor binden. Außerdem ist ein Ligand ein Molekül, das entweder als natürlicher Ligand dient, an den der Rezeptor oder ein Analogon davon bindet, oder ein Molekül, das ein funktionelles Analogon eines natürlichen Liganden ist. Das funktionelle Analogon kann ein Ligand mit strukturellen Modifikationen sein, oder es kann ein überhaupt nicht damit verwandtes Molekül sein, das eine Molekülform hat, die mit den richtigen Ligandbindungsdeterminanten wechselwirkt. Die Liganden können als Agonisten oder Antagonisten dienen, siehe z. B. Goodman et al. (Hrsg.), Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. Aufl.), 1990, Pergamon Press.
Besonders gut geeignete lösliche Fragmente der Rezeptor-Untereinheiten binden den IL-10-Liganden. Da der vollständige Rezeptor extrazelluläre Domänen zu enthalten scheint, an die der Ligand binden sollte, würde ein Protein, das die extrazellulären Segmente aminoproximal zu dem Transmembran-Helixsegment, das von Rest 217 bis 243 verläuft, umfaßt, eine solche Bindungsaktivität aufweisen. Fusionen der extrazellulären Domäne mit anderen Proteinen sowie kürzere Segmente können leicht auf Ligandenbindungsaktivität getestet werden. Fragmente, die aus der intrazellulären Domäne bestehen, können ebenfalls geeignet sein.
Die Human- und Maus-IL-10-Rezeptor-Untereinheiten weisen auf dem DNA- und dem Proteinsequenzniveau 70-75% Homologie auf. Auf der Basis von unterscheidbaren Strukturmotiven sind die IL-10-Rezeptor-Untereinheiten Mitglieder der als Klasse 2 bezeichneten Gruppe der Cytokin-Rezeptor-Überfamilie. Siehe z. B. Bazan, Immunology Today 11: 350 (1990); und Bazan, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 6934 (1990).
Zu den charakteristischen Motiven der Rezeptoren der Klasse 1 gehören eine aminoterminale Menge von vier konservierten Cystinen und einem Tryptophanrest sowie eine carboxyterminale (membranproximale) Ansammlung von beabstandeten aromatischen Resten. Die für die Rezeptoren der Klasse 2 charakteristischen Motive sind ein konserviertes Tryptophan und das zweite Cysteinpaar in der aminoterminalen Hälfte, ein WSxWS-Box-Analogon in der carboxyterminalen Hälfte und ein zweites konserviertes Cysteinpaar.
Die anderen Mitglieder der Klasse 2 sind die Rezeptoren für Interferon-α (IFN-α), Interferon-γ (IFN-γ), Gewebefaktor und für ein zweites lösliches virales IFN-Rezeptor-Homologes. Die hier beschriebenen IL-10-Rezeptor-Komponenten sind mit dem Interferon-γ-Rezeptor besonders nahe verwandt. Diese Ähnlichkeiten der Domänenstruktur lassen vermuten, daß die Mechanismen der Wirkung von IL-10 auf seinen Rezeptor ähnlich denen sein können, die an der Wechselwirkung von IFN-γ mit seinem Rezeptor beteiligt sind, obwohl es nicht Inhalt dieser Erfindung ist, zu entscheiden, ob dies wahr ist oder nicht. Siehe z. B. Levy et al., New Biologist 2: 923 (1990); Sen et al., J. Biol. Chem. 267: 5017 (1992); und Uze et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4774 (1992).
Zum Beispiel kann die antagonistische Wirkung von IL-10 auf die Makrophagenaktivierung durch IFN-γ direkt in die Signalkaskade der IFN-Antwort eingreifen. Dies kann durch die Wechselwirkung einer Komponente im IFN-Signalweg mit einer Komponente im IL-10-Weg bewirkt werden. Das Vorliegen gemeinsamer Komponenten in den beiden Wegen ist eine reale Möglichkeit, einschließlich einer direkten strukturellen Überlappung von einer oder mehreren Komponenten in aktiven Rezeptorkomplexen, z. B. gemeinsamen β-artigen Untereinheiten.
Alternativ dazu sagen die strukturellen Ähnlichkeiten der IFN- und der IL-10-Rezeptor-Komponenten voraus, daß Bereiche der Rezeptorstruktur, die bei einem Weg entscheidend und bei dem anderen konserviert sind, eine ähnliche Bedeutung haben werden. Diese Vorhersagbarkeit erstreckt sich sowohl auf die Formen der Moleküloberfläche des Liganden als auch auf intrazelluläre Merkmale, die wahrscheinlich mit nachgeschalteten Komponenten des Signalweges wechselwirken. Dies legt Verfahren zum Modulieren einer biologischen Wirkung von IL-10 nahe, die einen Schritt des Störens der Signalübertragung eines Interferonrezeptors umfassen, einschließlich z. B. Agonisten oder Antagonisten eines IFN oder homologen TL-10-Rezeptor-Varianten für IFN-Rezeptor-Mutamen. Man würde also erwarten, daß neutralisierende Antikörper gegen konservierte Bereiche ähnliche Wirkungen auf andere Rezeptoren in der Familie haben.
Diese Erfindung zieht die Verwendung der isolierten Nucleinsäuren, z. B. DNA, oder von Fragmenten, die die IL-10-Rezeptor- Untereinheiten codieren, in Betracht. Weiterhin umfaßt diese Erfindung die Verwendung von isolierter oder rekombinanter DNA oder von Fragmenten davon, die Proteine codieren, die homolog zu der jeweiligen Spezies-Variante des Rezeptors sind, oder die unter Verwendung von cDNA, die einen Rezeptor für IL-10 codiert, als Sonde isoliert wurde. Die isolierte DNA kann die jeweiligen regulatorischen Sequenzen in der 5'- und der 3'- Flanke aufweisen, z. B. Promotoren, Enhancer, Poly-A-Additionssignale und andere in der Technik bekannte. Solche Nucleinsäuren eignen sich im allgemeinen als Sonden, z. B. für Gene von mRNA, die IL-10-Rezeptoren oder Fragmente davon codiert.
Eine "isolierte" Nucleinsäure, wie sie hier definiert ist, ist eine Nucleinsäure, z. B. eine RNA, DNA oder ein gemischtes Polymer, die von anderen Komponenten, die eine native Sequenz natürlicherweise begleiten, z. B. Ribosomen, Polymerasen und flankierenden genomischen Sequenzen von der Ursprungsspezies, im wesentlichen getrennt ist. Der Ausdruck umfaßt eine Nucleinsäuresequenz, die aus ihrer natürlich vorkommenden Umgebung entfernt wurde, und umfaßt auch rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoga oder durch heterologe Systeme biologisch synthetisierte Analoga. Ein im wesentlichen reines Molekül umfaßt isolierte Formen des Moleküls.
Eine isolierte Nucleinsäure wird im allgemeinen eine homogene Zusammensetzung von Molekülen sein, wird jedoch in manchen Ausführungsformen auch eine Heterogenität in kleinerem Ausmaß enthalten. Diese Heterogenität findet man typischerweise an den Polymerenden oder an Teilen, die für eine gewünschte biologische Funktion oder Aktivität nicht entscheidend sind.
Eine "rekombinante" Nucleinsäure ist entweder durch ihr Herstellungsverfahren oder durch ihre Struktur definiert. Nimmt man Bezug auf ihr Herstellungsverfahren, z. B. als nach einem Verfahren hergestelltes Produkt, so besteht das Verfahren in der Verwendung von Nucleinsäure-Rekombinationstechniken, die z. B. einen menschlichen Eingriff in die Nucleotidsequenz beinhalten. Alternativ dazu kann es auch eine Nucleinsäure sein, die hergestellt wird, indem man eine Sequenz erzeugt, die die Fusion von zwei Fragmenten umfaßt, die natürlicherweise nicht direkt hintereinanderliegen, wobei jedoch Produkte der Natur, z. B. natürlich vorkommende Mutanten, ausgeschlossen sein sollen.
So sind zum Beispiel auch Produkte gemeint, die durch Transformieren von Zellen mit einem nicht natürlich vorkommenden Vektor hergestellt werden, wie etwa Nucleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, die unter Verwendung irgendeines Verfahres mit synthetischen Oligonucleotiden abgeleitet ist. Dies geschieht häufig, um ein Codon durch ein redundantes Codon zu ersetzen, das dieselbe oder eine konservative Aminosäure codiert, während typischerweise eine Sequenzerkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Alternativ dazu wird dies durchgeführt, um Nucleinsäuresegmente mit gewünschter Funktion miteinander zu verbinden und so eine einzige genetische Einheit zu schaffen, die eine gewünschte Kombination von Funktionen umfaßt, die man in den normalerweise verfügbaren natürlichen Formen nicht findet.
Ein Nucleinsäure-"Fragment" ist hier definiert als zusammenhängendes Segment von wenigstens etwa 17 Nucleotiden, im allgemeinen wenigstens 21 Nucleotiden, insbesondere wenigstens 25 Nucleotiden, normalerweise wenigstens 30 Nucleotiden, insbesondere wenigstens 35 Nucleotiden, häufig wenigstens 42 Nucleotiden, insbesondere wenigstens 49 Nucleotiden, typischerweise wenigstens 58 Nucleotiden, insbesondere wenigstens 75 Nucleotiden, gewöhnlich wenigstens 100 Nucleotiden, insbesondere wenigstens 200 Nucleotiden, vorzugsweise wenigstens 300 Nucleotiden, noch mehr bevorzugt wenigstens 500 Nucleotiden, und in besonders bevorzugten Ausführungsformen werden es wenigstens 800 oder mehr Nucleotide sein.
Eine DNA, die für eine IL-10-Rezeptor-Untereinheit oder ein Fragment davon codiert, kann verwendet werden, um Gene, mRNA- und cDNA-Spezies, die für verwandte oder homologe Rezeptoren codieren, sowie Nucleinsäuren, die für Spezies-Varianten dieser Rezeptorkomponenten codieren, zu identifizieren. Bevorzugte Sonden für diese Verwendung codieren Bereiche der Rezeptoren, die zwischen verschiedenen Spezies-Varianten konserviert sind. Konservierte Bereiche können durch Sequenzvergleiche identifiziert werden.
Diese Erfindung umfaßt weiterhin rekombinante DNA-Moleküle und Fragmente mit einer DNA-Sequenz, die mit denen der hier dargelegten isolierten DNAs identisch oder in hohem Maße homolog sind. Insbesondere werden die Sequenzen häufig operabel mit DNA-Segmenten verknüpft sein, die die Transkription, Translation und DNA-Replikation steuern. Genomische Sequenzen, die Introns enthalten, werden zusammen mit Methoden zu ihrer Isolierung ebenfalls verfügbar gemacht.
Homologe Nucleinsäuresequenzen weisen beim Vergleich eine erhebliche Ähnlichkeit auf. Die Standards für Homologie bei Nucleinsäuren sind Kriterien für Homologie, die entweder durch Sequenzvergleich in der Technik allgemein verwendet werden oder die auf Hybridisierungsbedingungen beruhen. Die Hybridisierungsbedingungen werden weiter unten in näheren Einzelheiten beschrieben, sind jedoch durch die Homologie mit anderen bekannten Rezeptoren für Cytokine, z. B. die oben beschriebenen Rezeptorkomponenten, weiter eingeschränkt. Homologiekriterien werden zusätzlich zu irgendwelchen angegebenen Parametern so eingeschränkt sein, daß die Homologie jede solche Ähnlichkeit zu diesen Rezeptoren, z. B. GM-CSF-, IL-3-, IL-4- und IL-5- Rezeptor-Komponenten, übersteigt.
Eine wesentliche Nucleinsäuresequenzhomologie bedeutet entweder, daß die Segmente oder ihre komplementären Stränge, wenn man sie mit geeigneten Nucleotidinsertionen oder -deletionen optimal aneinanderlegt, zu wenigstens 80%, gewöhnlich wenigstens etwa 85%, vorzugsweise wenigstens etwa 90%, noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 95 bis 98% oder mehr und in besonderen Ausführungsformen bis zu etwa 99% oder mehr der Nucleotide identisch sind.
Eine wesentliche Homologie liegt auch vor, wenn die Segmente unter selektiven (stringenten) Hybridisierungsbedingungen an einen Strang oder sein Komplement hybridisieren, wobei typischerweise eine hier definierte Sequenz verwendet wird.
Der oben beschriebene Homologievergleich kann über längere Strecken erfolgen, und wird in bestimmten Ausführungsformen über eine Strecke von wenigstens etwa 17 Nucleotiden, gewöhnlich wenigstens etwa 20 Nucleotiden, insbesondere wenigstens etwa 24 Nucleotiden, typischerweise wenigstens etwa 26 Nucleotiden, insbesondere wenigstens etwa 40 Nucleotiden, vorzugsweise wenigstens etwa 50 Nucleotiden und noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 75 bis 100 oder mehr Nucleotiden erfolgen.
Stringente Bedingungen in bezug auf die Homologie im Zusammenhang mit der Hybridisierung werden stringente kombinierte Bedingungen der Salzkonzentration, Temperatur, organischen Lösungsmittel und anderer Parameter sein, die bei Hybridisierungsreaktionen typischerweise kontrolliert werden. Stringente Temperaturbedingungen umfassen gewöhnlich Temperaturen von über etwa 30ºC, insbesondere über etwa 37ºC, typischerweise über etwa 45ºC, insbesondere über etwa 55ºC, vorzugsweise über etwa 65ºC und noch mehr bevorzugt über etwa 70ºC. Stringente Salzbedingungen sind gewöhnlich weniger als etwa 1000 mM, häufig weniger als etwa 700 mM, gewöhnlich weniger als etwa 500 mM, insbesondere weniger als etwa 400 mM, typischerweise weniger als etwa 300 mM, vorzugsweise weniger als etwa 200 mM und noch mehr bevorzugt weniger als etwa 150 mM. Die Kombination von Parametern ist jedoch viel wichtiger als der Wert irgendeines einzelnen Parameters [Wetmur et al., J. Mol. Biol. 31: 349 (1968)].
Nucleinsäuren, die wie hier beschrieben isoliert und charakterisiert wurden, können zur Herstellung von Varianten und Mutanten verwendet werden. Sie können auch verwendet werden, um Vektorkonstrukte geeignet zu machen, z. B. zur Herstellung von transgenen Zellen, einschließlich einer homologen Rekombination, z. B. von "k.o."-Tieren, und zur Gentherapie. Siehe z. B. Goodnow, "Transgenic Animals" in Roitt (Hrsg.), Encyclopedia of Immunology, 1992, Academic Press, San Diego, S. 1502-1504; Travis, Science 256: 1392 (1992); Kuhn et al., Science 254:
707 (1991); Capecchi, Science 244: 1288 (1989); Robertson (Hrsg.), Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A Practical Approach, 1987, IRL Press, Oxford; und Rosenberg, J. Clinical Oncology 10: 180 (1992).
Die isolierten Rezeptor-DNAs können durch Nucleotidsubstitutionen, -deletionen, -insertionen und -inversionen leicht modifiziert werden. Vorzugsweise wird dabei die IL-10-Bindungsfähigkeit in den Expressionsprodukten beibehalten. So erzeugte mutante Rezeptoren können leicht auf spezifische Bindung an IL-10, wie es hier offenbart ist, getestet werden. Diese modifizierten Sequenzen können unter Verwendung wohlbekannter Verfahren, wie ortsspezifischer Mutagenese, hergestellt werden. Modifizierte Sequenzen können z. B. auch unter Verwendung von modifizierten Primern, den hier beschriebenen Sequenzen und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante Proteine, z. B. heterologe Fusionsproteine, bereit, wobei Segmente aus den Rezeptor-Untereinheiten verwendet werden. Ein heterologes Fusionsprotein ist eine Verschmelzung von Proteinen oder Segmenten, die in der Natur normalerweise nicht in derselben Weise miteinander verschmolzen sind. Das Fusionsprodukt eines Immunglobulins mit einem Rezeptor-Polypeptid ist also ein zusammenhängendes Proteinmolekül mit in einer typischen Peptidverknüpfung miteinander verschmolzenen Sequenzen, das z. B. typischerweise als einzelnes Translationsprodukt hergestellt wird und Eigenschaften aufweist, die von jedem Quellenpeptid abgeleitet sind. Ein ähnliches Konzept gilt für heterologe Nucleinsäuresequenzen.
Außerdem können neue Konstrukte durch Kombinieren ähnlicher funktioneller Domänen von anderen Proteinen hergestellt werden. Zum Beispiel können ligandbindende oder andere Segmente zwischen verschiedenen neuen Fusionspolypeptiden oder Fragmen ten "ausgetauscht" werden. Siehe z. B. Cunningham et al., Science 243: 1330 (1989); und O'Dowd et al., J. Biol. Chem. 263: 15985 (1988). Aus der funktionellen Verknüpfung von Ligandbindungsspezifitäten und intrazellulären Bereichen ergeben sich also neue chimärische Polypeptide mit neuen Kombinationen von Spezifitäten. Zum Beispiel können die ligandbindenden Domänen von anderen, verwandten Rezeptoren hinzugefügt oder anstelle von anderen bindenden Domänen dieser Rezeptoren verwendet werden. Das resultierende Protein wird häufig Hybrid- Funktionen und -Eigenschaften haben.
Mit dem von Beaucage et al., Tetra. Letts. 22: 1859 (1981), beschriebenen Phosphoramidit-Verfahren lassen sich geeignete synthetische DNA-Fragmente erzeugen. Häufig wird man ein doppelsträngiges Fragment erhalten, indem man entweder den komplementären Strang synthetisiert und den Strang unter geeigneten Bedingungen assoziieren läßt oder indem man den komplementären Strang unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz addiert.
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur Herstellung von Fusionsproteinen bereit. Verschiedene Rezeptorvarianten können etwas verschiedene Funktionen oder biologische Aktivitäten haben, auch wenn sie strukturell sehr ähnlich sind. Die Untersuchung von Strukturelementen, die die verschiedenen physiologischen Funktionen oder biologischen Aktivitäten bewirken, die die Rezeptoren liefern, ist unter Verwendung von Standardtechniken der modernen Molekularbiologie möglich, insbesondere beim Vergleichen von Varianten innerhalb der verwandten Familie der Cytokin-Rezeptoren. Siehe z. B. die Homologen-Scanning- Mutagenese-Technik, die in Cunningham et al., loc. cit., beschrieben ist, und die Ansätze, die in O'Dowd et al., loc. cit., und Lechleiter et al., EMBO J. 9: 4381 (1990), verwendet werden.
Ligandbindende Segmente können zwischen Rezeptoren ausgetauscht werden, um sowohl für die Ligandbindungsaffinität als auch für die Spezifität zu bestimmen, welche strukturellen Merkmale dafür wichtig sind. Die Segmente des Rezeptors, die für einen extrazellulären Liganden zugänglich sind, wären die primären Zielobjekte einer solchen Analyse. Man wird ein Feld verschiedener Rezeptorvarianten, z. B. alleler Varianten, verwenden, um auf Liganden zu durchmustern, die kombinierte Eigenschaften der Wechselwirkung mit diesen aufweisen. An intrazellulären Funktionen würden wahrscheinlich Segmente des Rezeptors beteiligt sein, die normalerweise für das Cytosol zugänglich sind. Unter bestimmten Umständen kann jedoch eine Rezeptorinternalisierung auftreten, und eine Wechselwirkung zwischen intrazellulären Komponenten und den designierten "extrazellulären" Segmenten kann erfolgen. Diese intrazellulären Funktionen beinhalten gewöhnlich die Signalübertragung von der Anbindung des Liganden. Die spezifischen Segmente der Wechselwirkung des Rezeptors mit anderen Proteinen können durch Mutagenese oder mit direkten biochemischen Mitteln, z. B. Vernetzungs- oder. Affinitätsverfahren, identifiziert werden. Eine Strukturanalyse durch kristallographische oder andere physikalische Verfahren wird ebenfalls anwendbar sein. Die Identifizierung der Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Rezeptorvarianten, die unterschiedliche Funktionen aufweisen, wird zu neuen diagnostischen und therapeutischen Mitteln oder Behandlungen führen.
Nucleinsäuren, die IL-10-Rezeptor-Untereinheiten oder Fragmente davon codieren, sind in den Klonen pMR29 und pSW8.1 erhältlich oder können durch chemische Synthese oder durch Durchmustern von cDNA oder genomischer Bibliotheken von Zellinien oder Gewebeproben erhalten werden.
Solche Nucleinsäuren können in einer Vielzahl von Wirtszellen für die Synthese der vollen Länge einer Rezeptor-Untereinheit oder von Fragmenten eines Rezeptors exprimiert werden, die wiederum zum Beispiel zur Erzeugung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, für Bindungsstudien, für den Aufbau und die Expression modifizierter Rezeptormoleküle und für Struktur/Funktion-Untersuchungen verwendet werden können. Jeder Rezeptor oder seine Fragmente können in Wirtszellen exprimiert werden, die mit geeigneten Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert werden. Diese Moleküle können im wesentlichen frei von anderen Protein- oder zellulären Kontaminanten sein als solchen, die von dem rekombinanten Wirt abgeleitet sind, und eignen sich daher besonders gut für pharmazeutische Zusammensetzungen, wenn man sie mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Verdünnungsmittel kombiniert. Der Rezeptor oder Teile davon können auch als Verschmelzungen mit anderen Proteinen exprimiert werden.
Expressionsvektoren sind typischerweise selbstreplizierende DNA- oder RNA-Konstrukte, die z. B. das gewünschte Rezeptorgen oder seine Fragmente enthalten, die gewöhnlich operabel mit geeigneten genetischen regulatorischen Elementen verknüpft sind, die in einer geeigneten Wirtszelle erkannt werden. Diese regulatorischen Elemente sind in der Lage, in einem geeigneten Wirt eine Expression zu bewirken. Der spezielle Typ der regulatorischen Elemente, der zum Bewirken der Expression notwendig ist, wird von der schließlich verwendeten Wirtszelle abhängen. Im allgemeinen können die genetischen regulatorischen Elemente ein prokaryontisches Promotorsystem oder ein eukaryontisches Promotor-Expressionskontrollsystem umfassen; dazu gehören typischerweise ein Transkriptionspromotor, ein wahlfreier Operator zur Steuerung des Einsetzens der Transkription, Transkriptions-Enhancer zur Erhöhung des Niveaus der mRNA-Expression, eine Sequenz, die eine geeignete Ribosomen- Bindungsstelle codiert, und Sequenzen, die die Transkription und Translation beenden. Expressionsvektoren enthalten gewöhnlich auch einen Replikationsstartpunkt, der es dem Vektor erlaubt, sich unabhängig von der Wirtszelle zu replizieren.
Die Vektoren dieser Erfindung enthalten DNA, die einen Rezeptor für ein IL-10-artiges Peptid codiert, oder ein Fragment davon, das ein biologisch aktives Rezeptor-Polypeptid codiert. Die DNA kann unter der Kontrolle eines viralen Promotors stehen und kann einen Selektionsmarker codieren. Diese Erfindung zieht weiterhin die Verwendung solcher Expressionsvektoren in Betracht, die in der Lage sind, eukaryontische cDNA, die für einen Rezeptor codiert, in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt zu exprimieren, wobei der Vektor mit dem Wirt verträglich ist und wobei die eukaryontische cDNA, die für den Rezeptor codiert, so in den Vektor insertiert ist, daß durch das Wachstum des Wirts, der den Vektor enthält, die in Frage stehende cDNA exprimiert wird. Gewöhnlich werden Expressionsvektoren für eine stabile Replikation in ihren Wirtszellen oder für eine Amplifikation entworfen, so daß die Gesamtzahl der Kopien des wünschenswerten Gens pro Zelle stark erhöht wird. Es ist nicht immer notwendig zu fordern, daß sich ein Expressionsvektor in einer Wirtszelle repliziert; z. B. ist es möglich, eine vorübergehende Expression des IL-10-Rezeptors oder seiner Fragmente in verschiedenen Wirten zu bewirken, wobei man Vektoren verwendet, die keinen Replikationsstartpunkt enthalten, der von der Wirtszelle erkannt wird. Es ist auch möglich, Vektoren zu verwenden, die eine Integration des IL-10-Rezeptors oder seiner Fragmente in die Wirts-DNA durch Rekombination bewirken.
Vektoren, wie der Ausdruck hier verwendet wird, umfassen Plasmide, Viren, Bakteriophagen, integrierbare DNA-Fragmente und andere Träger, die eine Integration von DNA-Fragmenten in das Genom des Wirtes ermöglichen. Expressionsvektoren sind spezialisierte Vektoren, die genetische regulatorische Elemente enthalten, welche eine Expression von operabel miteinander verknüpften Genen bewirken. Plasmide sind die am häufigsten verwendete Vektorform, doch sind auch andere Formen von Vektoren, die eine äquivalente Funktion erfüllen und die in der Technik bekannt sind oder sein werden, geeignet, um hier verwendet zu werden. Siehe z. B. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, und Ergänzungsbände, Elsevier, New York; und Rodriguez et al. (Hrsg.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston.
Transformierte Zellen sind Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, die mit unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken konstruierten Rezeptorvektoren transformiert oder transfiziert wurden. Transformierte Wirtszellen exprimieren gewöhnlich den Rezeptor oder seine Fragmente, aber für die Zwecke des Klonierens, Amplifizierens und Manipulierens seiner DNA brauchen sie den Rezeptor nicht zu exprimieren. Diese Erfindung zieht weiterhin das Kultivieren transformierter Zellen in einem Nährmedium in Betracht, so daß sich der Rezeptor oder die Fragmente, z. B. ein lösliches Protein, in der Kultur akkumulieren können. Die Rezeptorproteine können aus den Zellen oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
Für Zwecke dieser Erfindung werden DNA-Sequenzen operabel miteinander verknüpft, wenn sie funktionell aufeinander bezogen sind. Zum Beispiel wird DNA für eine Vorsequenz oder ein sekretorisches Leitpeptid operabel mit einem Polypeptid verknüpft, wenn sie als Präprotein exprimiert wird oder an der Zielsteuerung des Polypeptids zur Zellmembran oder an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist. Ein Promotor wird operabel mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription des Polypeptids steuert; eine Ribosom-Bindungsstelle wird operabel mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, daß sie eine Translation ermöglicht. Gewöhnlich bedeutet "operabel miteinander verknüpft" zusammenhängend und in demselben Leseraster, doch sind bestimmte genetische Elemente, wie Repressor-Gene, nicht zusammenhängend verknüpft und binden dennoch an Operatorsequenzen, die wiederum die Expression steuern.
Zu den geeigneten Wirtszellen gehören Prokaryonten, niedere Eukaryonten und höhere Eukaryonten. Zu den Prokaryonten gehören Gram-negative und Gram-positive Organismen, z. B. E. coli und B. subtilis. Zu den niederen Eukaryonten gehören Hefen, z. B. S. cerevisiae und Pichia, sowie Spezies der Gattung Dictyostellum. Zu den höheren Eukaryonten gehören bewährte Gewebekultur-Zellinien von Tierzellen, sowohl nicht von Säugern stammende, z. B. Insektenzellen und Vogelzellen, als auch von Säugern stammende, z. B. vom Menschen, von Primaten und Nagetieren.
Zu den Vektorsystemen für prokaryontische Wirte gehört eine Vielzahl von Vektoren für viele verschiedene Spezies. Wenn hier von E. coli und seinen Vektoren die Rede sein wird, so umfaßt diese Ausdrucksweise generisch auch äquivalente Vektoren, die in anderen Prokaryonten verwendet werden. Repräsentative Vektoren zum Amplifizieren von DNA sind pBR322 und viele seiner Derivate. Zu den Vektoren, die zum Exprimieren des Rezeptors oder seiner Fragmente verwendet werden können, gehören unter anderem solche Vektoren wie diejenigen, die den lac-Promotor (pUC-Reihe), den trp-Promotor (pBR322-trp), den Ipp-Promotor (pIN-Reihe), den λ-pP- oder den λ-pR-Promotor (pOTS) oder Hybridpromotoren, wie ptac (pDR540), enthalten. Siehe Brosius et al., "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters" in Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses (Hrsg. Rodriguez und Denhardt), 1988, Butterworth, Boston, Kapitel 10, S. 205-236.
Niedere Eukaryonten, z. B. Hefen und Dictyostellum, können mit Vektoren transformiert werden, die eine IL-10-Rezeptor-Sequenz enthalten. Für die Zwecke dieser Erfindung ist Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, der gebräuchlichste Wirt unter den niederen Eukaryonten. Sie wird so verwendet, daß sie generisch niedere Eukaryonten vertritt, obwohl auch mehrere andere Stämme und Spezies verfügbar sind. Hefevektoren bestehen typischerweise aus einem Replikationsstartpunkt (wenn sie nicht vom integrierenden Typ sind), einem Selektionsmarker- Gen, einem Promotor, DNA, die den Rezeptor oder seine Fragmente codiert, und Sequenzen für den Translationsabbruch, die Polyadenylierung und den Abbruch der Transkription. Zu den geeigneten Expressionsvektoren für Hefe gehören solche konstitutiven Promotoren wie die, die Gene für 3-Phosphoglycerat- Kinase und verschiedene andere glycolytische Enzyme enthalten, oder solche induzierbaren Promotoren wie der Alkohol- Dehydrogenase-2-Promotor oder Metallothionin-Promotor. Zu den geeigneten Vektoren gehören Derivate der folgenden Typen: selbstreplizierende mit niedriger Kopienzahl (wie die YRp- Reihe), selbstreplizierende mit hoher Kopienzahl (wie die YEp- Reihe), integrierende Typen (wie die YIp-Reihe) oder Minichromosomen (wie die YCp-Reihe).
In Gewebekultur gezüchtete Zellen höherer Eukaryonten sind häufig die bevorzugten Wirtszellen für die Expression des funktionell aktiven IL-10-Rezeptorproteins. Im Prinzip läßt sich jede höher-eukaryontische Gewebekultur-Zellinie verwenden, z. B. Insekten-Baculovirus-Expressionssysteme, ob sie nun aus einer Wirbellosen- oder Wirbeltier-Quelle stammen. Säugerzellen werden jedoch häufig bevorzugt. Die Transformation oder Transfektion und Vermehrung solcher Zellen ist zu einem Routineverfahren geworden. Beispiele für geeignete Zellinien sind HeLa-Zellen, CHO-Zellinien (CHO = Chinese hamster ovary), BRK- Zellinien (BRK = baby rat kidney), Insektenzellinien, Vogelzellinien und Affenzellinien (COS).
Expressionsvektoren für solche Zellinien umfassen gewöhnlich einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor, einen Translationsstartpunkt, RNA-Spleißstellen (wenn genomische DNA verwendet wird), eine Polyadenylierungsstelle und eine Transcriptionsabbruchstelle. Diese Vektoren enthalten gewöhnlich auch ein Selektionsmarker-Gen oder ein Amplifikationsgen. Geeignete Expressionsvektoren können Plasmide, Viren oder Retroviren sein, die Promotoren tragen, die z. B. von Quellen wie Adenovi rus, SV40, Parvoviren, Vaccinia-Virus oder Cytomegalovirus abgeleitet sind. Repräsentative Beispiele für geeignete Expressionsvektoren sind pCDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA); pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol. 5: 1136 (1985)], pMClneo- Poly-A [Thomas et al., Cell 51: 503 (1987)] und ein Baculovirus-Vektor, wie pAC 373 oder pAC 610 [O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 1992, Freeman & Co., New York].
Man wird häufig wünschen, ein Rezeptor-Polypeptid in einem System zu exprimieren, das ein spezielles oder definiertes Glycosylierungsmuster liefert. In diesem Fall wird das gewöhnliche Muster dasjenige sein, das natürlicherweise durch das Expressionssystem geliefert wird. Das Muster wird jedoch modifizierbar sein, indem man das Polypeptid, z. B. eine unglycosylierte Form, geeigneten Glycosylierungsproteinen aussetzt, die in das heterologe Expressionssystem eingeführt wurden. Zum Beispiel kann das Rezeptor-Gen zusammen mit einem oder mehreren Genen transformiert werden, die Säuger- oder andere glycosylierende Enzyme codieren. Bei Verwendung dieses Ansatzes werden bestimmte Säuger-Glycosylierungsmuster in prokaryontischen oder anderen Zellen erreichbar sein.
Die Nucleinsäuren der Erfindung ergeben geeignete Quellenmaterialien, die hohe Konzentrationen an Rezeptorproteinen besitzen. Zellen, die diese Proteine exprimieren, können Quellen für die Proteinreinigung der natürlichen Rezeptorformen oder von Varianten davon sein. Außerdem können Reinigungssegmente mit geeigneten Teilen des Rezeptors verschmolzen werden, um die Isolierung und Herstellung zu unterstützen. Zum Beispiel kann die FLAG-Sequenz oder ein funktionelles Äquivalent davon über eine mit Protease entfernbare Sequenz mit dem Protein verschmolzen werden, so daß die FLAG-Sequenz durch ein Affinitätsreagens erkannt werden kann, und das gereinigte Protein kann einem Abbau durch Protease unterworfen werden, um die Verlängerung wieder zu entfernen.
Es gibt viele andere äquivalente Segmente, z. B. Polyhistidinsegmente, die eine Affinität zu Schwermetall-Säulenreagentien besitzen. Siehe z. B. Hochuli, Chemische Industrie 12: 69 (1989); Hochuli, "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Adsorbent" in Setlow (Hrsg.), Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87, 1990, Plenum Press, New York, und Crowe et al., QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System, 1992, QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.
Überdies können geeignete Wirtszellen verwendet werden, um die Rezeptorproteine in großen Mengen und unter physiologischen Bedingungen zu exprimieren, die eine wünschenswerte posttranslationale Verarbeitung, z. B. Glycosylierungsvarianten, ermöglichen.
Nachdem man Quellen der Expression mit hoher Konzentration erzeugt hat, werden Standard-Proteinreinigungstechniken angewendet, um die IL-10-Rezeptor-Komponenten bis fast zur Homogenität zu reinigen. Dazu gehören solche Verfahren wie die Ammoniumsulfat-Fällung, Säulenchromatographie, Elektrophorese, Zentrifugation, Kristallisation und andere. Siehe z. B. Ausubel et al., 1987 und periodische Ergänzungsbände, Current Protocols in Molecular Biology; Deutscher, "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology, Vol. 182, 1990, und andere Bände in dieser Reihe; sowie Verwendungshinweise des Herstellers auf Proteinreinigungsprodukten, z. B. von Pharmacia, Piscataway, NJ, oder Bio-Rad, Richmond, CA.
Diese Erfindung stellt auch Salze und markierte Derivate der. IL-10-Rezeptor-Untereinheiten bereit. Solche Derivate können eine kovalente oder aggregative Assoziation mit chemischen Struktureinheiten beinhalten. Diese Derivate fallen im allgemeinen in drei Klassen: (1) Salze, (2) kovalente Modifikationen der Seitenketten und der terminalen Reste und (3) Adsorptionskomplexe, zum Beispiel mit Zellmembranen. Solche kovalen ten oder aggregativen Derivate sind als Immunogene, als Reagentien in Immunoassays oder in Reinigungsverfahren, wie zur Affinitätsreinigung von IL-10 oder anderen bindenden Liganden, geeignet.
Zum Beispiel kann der IL-10-Rezeptor oder eine lösliche Form davon mit in der Technik wohlbekannten Verfahren durch kovalente Bindung an einen festen Träger, wie Bromcyan-aktivierte Sepharose, immobilisiert werden oder zur Verwendung in einem Assay oder bei der Reinigung von Anti-IL-10-Rezeptor-Antikörpern oder IL-10 mit oder ohne Glutaraldehyd-Vernetzung auf Polyolefin-Oberflächen adsorbiert werden. Der IL-10-Rezeptor kann auch zur Verwendung in diagnostischen Assays mit einer nachweisbaren Gruppe markiert, zum Beispiel mit dem Chloramin- T-Verfahren radioiodiert, kovalent an Seltenerdmetallchelate gebunden oder an eine andere fluoreszierende Struktureinheit konjugiert, werden.
Der solubilisierte IL-10-Rezeptor dieser Erfindung kann als Immunogen für die Herstellung von Antiseren oder Antikörpern, die spezifisch für den Rezeptor oder Fragmente davon sind, verwendet werden. Der gereinigte Rezeptor kann verwendet werden, um monoklonale Antikörper oder antigenbindende Fragmente zu durchmustern, die durch Immunisierung mit verschiedenen Formen von verunreinigten Präparaten hergestellt wurden, die den IL-10-Rezeptor enthielten.
Der Ausdruck "Antikörper" umfaßt auch antigenbindende Fragmente natürlicher Antikörper. Der gereinigte Rezeptor kann auch als Reagens verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die als Reaktion auf die Gegenwart erhöhter Mengen an IL-10- Rezeptor oder von Zellfragmenten, die den IL-10-Rezeptor enthalten, erzeugt werden. Zusätzlich können IL-10-Rezeptorfragmente auch als Immunogene dienen, um die Antikörper der vorliegenden Erfindung herzustellen, wie es im folgenden beschrieben wird. Zum Beispiel zieht diese Erfindung Antikör per in Betracht, die eine Bindungsaffinität für die hier definierten Aminosäuresequenzen oder Fragmente davon besitzen oder gegen diese erzeugt wurden.
Insbesondere zieht diese Erfindung Antikörper in Betracht, die eine Bindungsaffinität für spezielle Fragmente besitzen oder gegen diese erzeugt wurden, von denen vorhergesagt wird, daß sie außerhalb der Lipiddoppelschicht liegen. Diese Fragmente sollten bei einer Betrachtung der Sequenz des Human- oder des Maus-Rezeptors leicht zu Tage treten. Außerdem umfaßt diese Erfindung Fragmente des IL-10-Rezeptors, von denen vorhergesagt wird, daß sie auf der extrazellulären Seite der Membran liegen. Die Analyse der Proteinstruktur zur Identifikation der membranassoziierten Bereiche ist z. B. beschrieben in von Heijne, J. Mol. Biol. 225: 487 (1992), sowie Fasman et al., Trends in Biochemical Sciences 15: 89 (1990).
Antikörper können gegen die verschiedenen Spezies-Varianten der Rezeptor-Untereinheiten und Fragmente davon, sowohl in ihren natürlich vorkommenden Formen als auch in ihren rekombinanten Formen, erzeugt werden. Außerdem können Antikörper gegen IL-10-Rezeptoren entweder in ihrer aktiven Form oder in ihrer inaktiven Form erzeugt werden, wobei der Unterschied darin besteht, daß Antikörper gegen den aktiven Rezeptor mit höherer Wahrscheinlichkeit Epitope erkennen, die nur in dem aktiven Rezeptor vorhanden sind. Antiidiotypische Antikörper können ebenfalls nach Standardverfahren hergestellt werden.
Antikörper, einschließlich bindender Fragmente und Einkettenversionen, gegen vorbestimmte Fragmente des IL-10-Rezeptors können durch Immunisierung von Tieren mit Konjugaten der Fragmente mit immunogenen Proteinen erzeugt werden. Monoklonale Antikörper werden aus Zellen hergestellt, die den gewünschten Antikörper sezernieren. Diese Antikörper können auf die Bindung an normale oder defektbehaftete IL-10-Rezeptoren durchmustert oder auf agonistische oder antagonistische Wirkung auf den IL-10-Rezeptor durchmustert werden.
Diese monoklonalen Antikörper binden normalerweise mit einem Kd von wenigstens etwa 1 mM, insbesondere wenigstens 300 uM, im allgemeinen wenigstens 100 uM, insbesondere wenigstens 30 uH, normalerweise wenigstens 10 uM, insbesondere wenigstens 3 uH, häufig wenigstens 1 uM, insbesondere wenigstens 300 nM, typischerweise wenigstens 100 nM, insbesondere wenigstens 30 nM, gewöhnlich wenigstens 10 nM, insbesondere wenigstens 3 nM, vorzugsweise wenigstens 1 nM, noch mehr bevorzugt wenigstens 300 pM, und in besonders bevorzugten Ausführungsformen wenigstens 100 bis 10 pH oder besser.
Die Antikörper einschließlich der antigenbindenden Fragmente dieser Erfindung können einen erheblichen diagnostischen oder therapeutischen Wert haben. Sie können potente Antagonisten sein, die an den IL-10-Rezeptor binden und die Bindung von Liganden an den Rezeptor hemmen oder die Fähigkeit eines IL- 10-artigen Peptids zum Hervorrufen einer biologischen Reaktion hemmen. Sie können auch als nichtneutralisierende Antikörper geeignet sein und können an Toxine oder Radionuklide gekoppelt sein, so daß beim Binden des Antikörpers an den Rezeptor die Zelle selbst getötet wird. Weiterhin können diese Antikörper entweder direkt oder indirekt mit Hilfe eines Linkers mit Medikamenten oder anderen therapeutischen Mitteln konjugiert werden.
Die Antikörper dieser Erfindung können auch bei diagnostischen Anwendungen nützlich sein. Als Abfang- oder nichtneutralisierende Antikörper können sie an den IL-10-Rezeptor binden, ohne die Ligandbindung zu hemmen. Als neutralisierende Antikörper können sie für Assays mit kompetitiver Bindung geeignet sein. Sie können auch beim Nachweisen oder Quantifizieren von IL-10 oder von IL-10-Rezeptoren geeignet sein.
Rezeptorfragmente können mit anderen Materialien, insbesondere Polypeptiden, verbunden werden und bilden so verschmolzene oder kovalent verknüpfte Polypeptide, die als Immunogene zu verwenden sind. Der IL-10-Rezeptor und seine Fragmente können mit einer Vielzahl von Immunogenen, wie Schlitzschnecken-Hämocyanin, Rinderserumalbumin, Tetanus-Toxoid usw., verschmolzen oder kovalent verknüpft werden. Wegen Beschreibungen von Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antiseren, siehe Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner, Specificity of Serological Reactions, 1962, Dover Publications, New York; und Williams et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, 1967, Academic Press, New York.
In manchen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper von verschiedenen Säugerwirten herzustellen, wie Mäusen, Nagetieren, Rindern, Schafen, Ziegen, Eseln, Primaten, Menschen usw. Beschreibungen von Techniken, die zur Herstellung solcher monoklonaler Antikörper verwendet werden, sind z. B. zu finden in Stites et al. (Hrsg.), Basic and Clinical Immunology, 4. Aufl., Lange Medical Publications, Los Altos, CA; Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, CSH Press; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Aufl.), 1986, Academic Press, New York; und insbesondere in Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975).
Kurz gesagt, dieses Verfahren beinhaltet das Injizieren eines Immunogens in ein Tier. Dann wird das Tier getötet, und Zellen werden aus seiner Milz entnommen, die dann mit Myelomzellen fusioniert werden. Das Ergebnis ist eine Hybridzelle oder ein "Hybridom", das zur Reproduktion in vitro befähigt ist. Dann wird die Population der Hybridome durchmustert, um einzelne Klone zu isolieren, von denen jeder eine einzige Antikörperspezies gegen das Immunogen sezerniert. In dieser Weise sind die erhaltenen einzelnen Antikörperspezies die Produkte von unsterblich gemachten und klonierten einzelnen B-Zellen aus dem Immuntier, die als Reaktion auf eine spezifische Stelle erzeugt worden waren, die auf der immunogenen Substanz erkannt wurde.
Weitere geeignete Techniken beinhalten die in-vitro-Einwirkung der antigenen Polypeptide auf Lymphocyten oder alternativ dazu die Selektion von Lymphocyten aus Antikörperbibliotheken in Phagen- oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al., "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275 (1989); sowie Ward et al., Nature 341: 544 (1989).
Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne Modifikation verwendet werden; dies umfaßt auch chimärische oder humanisierte Antikörper. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper markiert, indem man entweder kovalent oder nichtkovalent eine Substanz hinzufügt, die für ein nachweisbares Signal sorgt. Eine Vielzahl von Markern und Konjugationstechniken ist bekannt; über sie wird sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur eingehend berichtet. Zu den geeigneten Markern gehören Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Struktureinheiten, chemilumineszierende Struktureinheiten, magnetische Teilchen und dergleichen. Zu den Patenten, die die Verwendung solcher Marker offenbaren, gehören die US-Patente Nr. 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 und 4,366,241. Auch rekombinante Immunglobuline können erzeugt werden, siehe Cabilly, US- Patent Nr. 4,816,567, und Moore et al., US-Patent Nr. 4,642,334.
Die Antikörper dieser Erfindung können für die Affinitätschromatographie beim Isolieren des Rezeptors verwendet werden. Säulen können hergestellt werden, in denen die Antikörper mit einem festen Träger, z. B. Teilchen, wie Agarose, Sephadex oder dergleichen, verknüpft sind, wobei man ein Zell-Lysat durch die Säule geben, die Säule waschen und anschließend steigende Konzentrationen eines milden Denaturierungsmittels aufbringen kann, wodurch das gereinigte Rezeptorprotein freigesetzt wird.
Die Antikörper können auch verwendet werden, um Expressionsbibliotheken auf besondere Expressionsprodukte hin zu durchmustern. Gewöhnlich werden die bei einem solchen Verfahren verwendeten Antikörper mit einer Struktureinheit markiert, was einen leichten Nachweis der Gegenwart von Antigen durch Bindung an den Antikörper erlaubt. Die antiidiotypischen Antikörper sind nützlich, um verschiedene immunologische Zustände nachzuweisen oder zu diagnostizieren, die mit der Expression der jeweiligen Rezeptoren zusammenhängen.
Lösliche Rezeptorfragmente können auch als Träger für IL-10 verwendet werden, z. B., um das Cytokin vor verschiedenen abbauenden oder anderen Wirkungen zu schützen. Der Komplex kann in bestimmten Situationen als Zusammensetzung mit langsamer Freisetzung nützlich sein, die eine langsame funktionelle Freisetzung des Cytokins oder Antagonisten erlaubt. Überdies werden lösliche Formen des Rezeptors, z. B. ein Fragment, das die cytokinbindenden Teile ohne membranassoziierte Segmente enthält, als Antagonisten von IL-10 nützliche diagnostische oder therapeutische Zusammensetzungen sein. Als diagnostisches Reagens kann ein solches Fragment als Ersatz für Antikörper gegen IL-10 verwendet werden, wird aber wahrscheinlich einem neutralisierenden Antikörper äquivalent sein.
Außerdem ist es wahrscheinlich, daß die hier beschriebene isolierte Komponente analog zu α-Untereinheiten anderer Cytokin-Rezeptoren ist. Dies läßt vermuten, daß es eine einzige β- Komponente für den IL-10-Rezeptor geben könnte, die in Verbindung mit diesen Komponenten die aus der Bindung von IL-10 resultierende Aktivität modulieren könnte. Dies ergibt ein bequemes Mittel zum Isolieren dieser mutmaßlichen β-Untereinheit. Siehe z. B. Hayashida et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 9655 (1990). Alternativ dazu können art- oder gewebe spezifische Hilfsmoleküle, z. B. Proteine, einen Kontext für die Modifikation der Eigenschaften oder Aktivitäten des Rezeptorproteins liefern.
Sowohl die natürlich vorkommende als auch die rekombinante Form der IL-10-Rezeptor-Untereinheiten dieser Erfindung sind für Kits und Assayverfahren geeignet, die in der Lage sind, Verbindungen auf eine bindende Wirkung an die Rezeptoren zu durchmustern. In den letzten Jahren wurden mehrere Verfahren zur Automatisierung von Assays entwickelt, so daß man Zehntausende von Verbindungen pro Jahr durchmustern kann. Siehe z. B. Fodor et al., Science 251: 767 (1991); dort sind Verfahren zum Testen der Bindungsaffinität durch eine Vielzahl definierter Polymere, die auf einem festen Substrat synthetisiert wurden, beschrieben. Phagen- oder andere Bibliotheken verschiedener statistischer Polypeptidsequenzen wären ebenfalls nützlich. Die Entwicklung geeigneter Assays kann durch die Verfügbarkeit großer Mengen an gereinigtem, löslichem Rezeptor, wie er durch diese Erfindung bereitgestellt wird, stark erleichtert werden.
Zum Beispiel können normalerweise Antagonisten gefunden werden, sobald der Rezeptor erst einmal charakterisiert wurde. Das Testen potentieller Rezeptor-Antagonisten ist nun durch die Entwicklung von hochautomatisierten Assayverfahren unter Verwendung eines gereinigten Rezeptors möglich geworden. Insbesondere werden durch die Verwendung von Durchmusterungstechniken, die durch die hier bereitgestellten Reagentien verfügbar gemacht werden, neue Agonisten und Antagonisten entdeckt werden.
Diese Erfindung eignet sich insbesondere zum Durchmustern von Verbindungen durch Verwendung der rekombinanten Rezeptoren in einer von verschiedenen Medikamentendurchmusterungstechniken. Zu den Vorteilen der Verwendung eines rekombinanten Rezeptors bei der Durchmusterung nach rezeptorreaktiven Medikamenten gehören: (a) eine verbesserte erneuerbare Quelle für den Rezep tor aus einer speziellen Quelle; (b) eine potentiell größere Anzahl von Rezeptoren pro Zelle, was in Assays ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis ergibt; und (c) eine Spezifität für Spezies-Varianten (was theoretisch eine größere biologische und Krankheits-Spezifität ergibt).
Ein Verfahren der Medikamentendurchmusterung verwendet eukaryontische oder prokaryontische Wirtszellen, die mit rekombinanten DNA-Molekülen, die den Rezeptor exprimieren, stabil transformiert sind. Es können Zellen isoliert werden, die einen Rezeptor in Isolation von allen anderen exprimieren. Solche Zellen können entweder in lebensfähiger oder fixierter Form für Standard-Rezeptor/Ligand-Bindungsassays verwendet werden. Siehe Parce et al., Science 246: 243 (1989); und Owicki et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 4007 (1990).
Kompetitive Assays sind besonders nützlich, wobei die Zellen (eine Quelle für IL-10-Rezeptor) mit einem markierten Liganden mit einer bekannten Bindungsaffinität zum Rezeptor, wie ¹²&sup5;I- IL-10, und einer Testverbindung, deren Bindungsaffinität zum IL-10-Rezeptor gemessen wird, in Kontakt gebracht und inkubiert werden. Der gebundene Ligand und der freie Ligand werden dann getrennt, um den Grad der Ligandenbindung zu bewerten. Die Menge der gebundenen Testverbindung ist umgekehrt proportional zur gemessenen Menge des gebundenen markierten Liganden. Eine von zahlreichen Techniken kann verwendet werden, um zur Bewertung des Grades der Ligandbindung den gebundenen vom freien Liganden zu trennen. Dieser Trennungsschritt könnte typischerweise ein Verfahren wie die Adhäsion an Filtern mit anschließendem Waschen, Adhäsion an Kunststoff mit anschließendem Waschen oder Zentrifugation der Zellmembranen beinhalten.
Lebensfähige Zellen können auch verwendet werden, um auf die Wirkungen von Medikamenten auf IL-10-Rezeptor-vermittelte Funktionen zu durchmustern, z. B. Konzentrationen an sekundärem Botenstoff, d. h. Ca²&spplus;, Zellproliferation, Änderungen des Inositolphosphat-Pools, Ausmaß der Phosphorylierung, Konzentrationen von Stickstoffoxid und andere. Bei einigen Nachweisverfahren kann auf einen Trennschritt verzichtet werden, z. B. bei einem proximitätsempfindlichen Nachweissystem. Calciumempfindliche Farbstoffe werden nützlich sein, um mit einem Fluorimeter oder einem Fluoreszenz-Zellsortier-Gerät Ca²&spplus;-Konzentrationen zu messen. Siehe Lowenstein et al., Cell 70: 705 (1992).
Ein anderes Verfahren verwendet Membranen von transformierten eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen als Quelle für den IL-10-Rezeptor. Diese Zellen werden mit DNA-Vektoren, die die Expression des IL-10-Rezeptors steuern, stabil transformiert. Im wesentlichen würde man die Membranen aus den Zellen präparieren und in einem geeigneten Rezeptor/Ligand- Bindungsassay verwenden, z. B. dem oben beschriebenen kompetitiven Assay.
Noch ein anderer Ansatz besteht darin, solubilisierte ungereinigte oder solubilisierte gereinigte Rezeptoren von transformierten eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen zu verwenden. Dies ermöglicht ein "molekulares" Bindungsassay mit den Vorteilen einer erhöhten Spezifität, der Automatisierbarkeit und eines hohen Medikamententestdurchsatzes.
Eine weitere Technik zum Durchmustern von Medikamenten beinhaltet einen Ansatz, der eine Durchmusterung mit hohem Durchsatz nach Verbindungen mit einer geeigneten Bindungsaffinität zum IL-10-Rezeptor liefert, und ist im einzelnen in Geysen, Europäische Patentanmedlung 84/03564, beschrieben. Zuerst wird eine große Zahl verschiedener Testverbindungen in Form von kleinen Peptiden auf einem festen Substrat, z. B. Kunststoffstiften oder einer anderen geeigneten Oberfläche, synthetisiert. Dann werden alle Stifte mit solubilisiertem ungereinigtem oder solubilisiertem gereinigtem IL-10-Rezeptor umge setzt und gewaschen. Der nächste Schritt beinhaltet den Nachweis von gebundenem IL-10-Rezeptor.
Ein rationales Medikamenten-Design kann auch auf strukturellen Untersuchungen der Molekülformen des Rezeptors und anderer Effektoren oder Liganden beruhen. Effektoren können andere Proteine sein, die als Reaktion auf die Bindung eines Liganden andere Funktionen vermitteln, oder andere Proteine, die normalerweise mit dem Rezeptor wechselwirken. Ein Mittel zur Bestimmung der Stellen, die mit speziellen anderen Proteinen wechselwirken, ist eine physikalische Strukturbestimmung, z. B. Röntgenkristallographie oder NMR-Techniken (2- oder 3-dimensional). Diese liefern Hinweise darauf, welche Aminosäurereste die Bereiche des molekularen Kontakts bilden.
Gereinigter Rezeptor kann zur Verwendung bei den oben genannten Medikamentendurchmusterungstechniken direkt auf Platten aufgetragen werden. Jedoch können auch nichtneutralisierende Antikörper gegen diese Rezeptoren als Abfang-Antikörper verwendet werden, um den jeweiligen Rezeptor auf der festen Phase zu immobilisieren.
Das Blockieren physiologischer Reaktionen auf IL-10-artige Peptide kann aus der Hemmung der Bindung des Liganden an den Rezeptor resultieren, wahrscheinlich durch kompetitive Hemmung. Daher werden bei in-vitro-Assays der vorliegenden Erfindung häufig isolierte Membranen von Zellen, die einen rekombinanten Rezeptor exprimieren, lösliche Fragmente, die die ligandbindenden Segmente dieser Rezeptoren umfassen, oder Fragmente, die an Festphasensubstrate gebunden sind, verwendet. Diese Assays ermöglichen auch die diagnostische Bestimmung der Wirkungen entweder von Mutationen und Modifikationen des bindenden Segments oder von Mutationen und Modifikationen des Liganden, z. B. Ligandanaloga.
Diese Erfindung zieht auch die Verwendung von kompetitiven Medikamentendurchmusterungsassays in Betracht, wobei z. B. neutralisierende Antikörper gegen den Rezeptor oder gegen Rezeptorfragmente mit einer Testverbindung um die Bindung an den Rezeptor konkurrieren. In dieser Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart eines Polypeptids nachzuweisen, das mit dem Rezeptor eine oder mehrere Bindungsstellen gemeinsam hat und das ebenfalls verwendet werden kann, um Bindungsstellen an dem Rezeptor zu besetzen, die ansonsten durch IL-10 besetzt werden könnten.
Zusätzlich können neutralisierende Antikörper gegen den Rezeptor sowie lösliche Fragmente des Rezeptors, die die Ligandbindungsstelle enthalten, verwendet werden, um die Funktion des IL-10-Rezeptors z. B. bei Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen oder verwandten Zelltypen zu hemmen.
Diese Erfindung zieht auch die Verwendung des IL-10-Rezeptors, von Fragmenten davon, Peptiden und ihren Verschmelzungsprodukten in einer Vielzahl von diagnostischen Kits und Verfahren zum Nachweis der Gegenwart des IL-10-Rezeptors in Betracht. Typischerweise wird der Kit eine Kammer aufweisen, die entweder ein definiertes Rezeptorpeptid oder Gensegment oder ein Reagens, das das eine oder das andere erkennt, enthält.
Ein Kit zur Bestimmung der Bindungsaffinität einer Testverbindung zum IL-10-Rezeptor würde typischerweise eine Testverbindung, eine markierte Verbindung, zum Beispiel einen Liganden oder Antikörper mit einer bekannten Bindungsaffinität zum IL- 10-Rezeptor, eine Quelle für IL-10-Rezeptor (natürlich vorkommend oder rekombinant) sowie ein Mittel zur Abtrennung der gebundenen von der freien markierten Verbindung, wie eine feste Phase zum Immobilisieren des IL-10-Rezeptors, umfassen. Sobald die Verbindungen durchmustert wurden, können diejenigen mit einer geeigneten Bindungsaffinität zum IL-10-Rezeptor in geeigneten biologischen Assays, wie sie in der Technik wohlbe kannt sind, bewertet werden, um zu bestimmen, ob sie als Agonisten oder Antagonisten wirken. Die Verfügbarkeit rekombinanter Rezeptor-Polypeptide ergibt auch wohldefinierte Standards zum Eichen solcher Assays.
Ein bevorzugter Kit zur Bestimmung der Konzentration zum Beispiel von IL-10-Rezeptor in einer Probe würde typischerweise eine markierte Verbindung, zum Beispiel einen Liganden oder Antikörper mit einer bekannten Bindungsaffinität zum Rezeptor, eine Quelle für IL-10-Rezeptor (natürlich vorkommend oder rekombinant) sowie ein Mittel zur Abtrennung der gebundenen von der freien markierten Verbindung, zum Beispiel eine feste Phase zum Immobilisieren des IL-10-Rezeptors, umfassen. Normalerweise werden auch Kammern, die Reagentien enthalten, sowie Anweisungen bereitgestellt.
Antikörper einschließlich antigenbindender Fragmente, die spezifisch für den Rezeptor oder die Rezeptorfragmente sind, sind nützlich für diagnostische Anwendungen, um die Gegenwart erhöhter Mengen des Rezeptors und/oder seiner Fragmente nachzuweisen. Bei solchen diagnostischen Assays können Lysate, lebende Zellen, fixierte Zellen, Immunofluoreszenz, Zellkulturen und Körperflüssigkeiten eingesetzt werden, und sie können weiterhin den Nachweis von mit dem IL-10-Rezeptor verwandten Antigenen in Serum oder dergleichen beinhalten. Diagnostische Assays können homogen (ohne Trennungsschritt zwischen freiem Reagens und Rezeptor-Ligand-Komplex) oder heterogen (mit einem Trennschritt) sein. Es gibt verschiedene kommerzielle Assays, wie Radioimmunoassay (RIA), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), Enzym-Immunoassay (EIA), EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique), substratmarkiertes Fluoreszenz-Immunoassay (SLFIA) und dergleichen. Zum Beispiel können unmarkierte Antikörper eingesetzt werden, indem man einen zweiten Antikörper verwendet, der markiert ist und der den Antikörper gegen den IL-10-Rezeptor oder gegen ein bestimmtes Fragment davon erkennt. Diese Assays wurden ebenfalls ausführlich in der Literatur diskutiert. Siehe z. B. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, CSH.
Antiidiotypische Antikörper können eine ähnliche Verwendung haben, um die Gegenwart von Antikörpern gegen einen Rezeptor zu diagnostizieren, da diese für verschiedene anormale Zustände diagnostisch sein können. Zum Beispiel kann eine Überproduktion oder unangebrachte Produktion von IL-10-Rezeptor zu verschiedenen immunologischen Reaktionen führen, die diagnostisch für eine anormale Rezeptorexpression sein können, insbesondere bei proliferativen Zellbedingungen, wie Krebs.
Häufig werden die Reagentien für diagnostische Assays in Kits geliefert, um die Empfindlichkeit des Assays zu optimieren. Für die vorliegende Erfindung werden je nach der Natur des Assays, der Vorschrift und dem Marker entweder markierter oder unmarkierter Antikörper oder markierter Rezeptor bereitgestellt. Dies geschieht gewöhnlich in Verbindung mit anderen Additiven, wie Puffern, Stabilisatoren, Materialien, die für die Signalerzeugung notwendig sind, wie Substrate für Enzyme, und dergleichen. Vorzugsweise enthält der Kit auch Anweisungen zur richtigen Verwendung und zur Entsorgung des Inhalts nach der Verwendung. Typischerweise weist der Kit Kammern für jedes nützliche Reagens auf. Wünschenswerterweise werden die Reagentien als trockenes lyophilisiertes Pulver bereitgestellt, wobei die Reagentien in einem wäßrigen Medium mit geeigneten Konzentrationen zur Durchführung des Assays rekonstituiert werden können.
Jeder der Bestandteile der Medikamenten-Durchmusterungs- und der diagnostischen Assays kann ohne Modifikation verwendet werden oder kann in vielfältiger Weise modifiziert werden. Zum Beispiel können sie markiert werden, wie es oben beschrieben ist.
Es gibt außerdem zahlreiche Verfahren zur Trennung des gebundenen vom freien Liganden oder alternativ dazu der gebundenen von der freien Testverbindung. Der Rezeptor kann auf verschiedenen Matrizen immobilisiert werden, wobei man anschließend wäscht. Zu den geeigneten Matrizen gehören Kunststoffe, wie eine ELISA-Platte, Filter und Kügelchen. Zu den Verfahren zum Immobilisieren des Rezeptors an einer Matrix gehören unter anderem die direkte Haftung am Kunststoff, die Verwendung eines Abfang-Antikörpers, die chemische Kopplung und das Biotin-Avidin-System. Der letzte Schritt bei diesem Ansatz beinhaltet die Fällung des Rezeptor/Ligand-Komplexes durch eines von mehreren Verfahren einschließlich solcher, bei denen z. B. ein organisches Lösungsmittel, wie Polyethylenglycol, oder ein Salz, wie Ammoniumsulfat, verwendet wird. Zu den weiteren geeigneten Trennungstechniken gehören unter anderem das von Rattle et al. [Clin. Chem. 30: 1457 (1984)] beschriebene Fluorescein-Antikörper-magnetisierbare-Teilchen-Verfahren sowie die im US-Patent Nr. 4,659,678 beschriebene Doppelantikörper-magnetische-Teilchen-Trennung.
Ein weiterer diagnostischer Aspekt dieser Erfindung beinhaltet die Verwendung von Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen, die von der Sequenz eines Rezeptors für IL-10 genommen sind. Diese Sequenzen können als Sonden zum Nachweis anormaler Mengen des Rezeptors in definierten Zellen von Patienten verwendet werden, von denen man annimmt, daß sie z. B. unter einer Autoimmunkrankheit, einer Unfähigkeit zur angemessenen Reaktion auf Infektionen oder Entzündung oder einer proliferativen Zellbedingung, wie Krebs, leiden. Die Herstellung sowohl von RNA- als auch von DNA-Nucleotidsequenzen, die Markierung der Sequenzen und die bevorzugte Größe der Sequenzen wurden in der Literatur ausführlich beschrieben und diskutiert.
Normalerweise sollte eine Oligonucleotidsonde wenigstens etwa 14 Nucleotide, gewöhnlich wenigstens etwa 18 Nucleotide, aufweisen, und die Größe der Polynucleotidsonden kann bis zu mehreren Kilobasen betragen. Verschiedene Marker können eingesetzt werden, am häufigsten Radionuklide, insbesondere ³²P. Jedoch können auch andere Techniken eingesetzt werden, wie die Verwendung von photoreaktiven oder biotinmodifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Stelle für die Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer Vielzahl von Markern, wie Radionukliden, Fluoreszenzmarkern, Enzymen oder dergleichen, markiert sein können.
Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezielle Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexen, RNA-Duplexen, DNA-RNA-Hybrid-Duplexen oder DNA-Protein-Komplexen. Die Antikörper können wiederum markiert sein, und der Assay kann durchgeführt werden, wobei der Duplex an eine Oberfläche gebunden wird, so daß bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart eines an den Duplex gebundenen Antikörpers nachgewiesen werden kann. Die Verwendung von Sonden für die neue Antisense-RNA kann bei jeder herkömmlichen Technik erfolgen, wie Nucleinsäure-Hybridisierung, plus- und minus-Screening, rekombinatorische Sondierung, hybridfreigesetzte Translation (HRT) und hybridarretierte Translation (HART). Dazu gehören auch Amplifikationstechniken, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Diagnostische Kits, die auch auf die Gegenwart anderer Marker testen oder deren Konzentration bestimmen, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Die Diagnose oder Prognose kann von der Kombination mehrerer Indikationen abhängen, die als Marker verwendet werden. Daher können Kits auf Kombinationen von Markern testen. Siehe z. B. Viallet et al., Progress in Growth Factor Res. 1: 89 (1989).
Diese Erfindung stellt Mittel mit erheblichem therapeutischem Wert bereit. Der IL-10-Rezeptor (natürlich vorkommend oder rekombinant), Fragmente davon und Antikörper dagegen sollten zusammen mit Verbindungen, deren Bindungsaffinität zum IL-10- Rezeptor bekannt ist, für die Behandlung verschiedener Zustände geeignet sein, z. B. Autoimmunkrankheiten, septische und toxische Schockzustände und infektiöse Zustände. Siehe z. B. Hsu et al., Int'l Immunol. 4: 563 (1992); de Waal Malefyt et al., J. Expt'l Med. 174: 1209 (1991); Fiorentino et al., J. Immunol. 147: 3815 (1991); und Ishida et al., J. Expt'l Med. 175: 1213 (1992). Außerdem sollte diese Erfindung einen therapeutischen Wert bei jeder Krankheit oder jedem Zustand haben, die bzw. der mit einer anormalen Expression oder anormalen Auslösung der Rezeptoren für IL-10 verbunden sind. Zum Beispiel spielt der IL-10-Rezeptor wahrscheinlich eine Rolle bei vielen grundlegenden regulatorischen Vorgängen der Immunfunktion. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wird man Agonisten und Antagonisten des Cytokins entwickeln. Siehe auch z. B. Harada et al., J. Biol. Chem. 267: 22752 (1992); dort werden Rezeptorsegmente identifiziert, die sich für eine Antagonisierung der Rezeptorfunktion eignen.
Rekombinanter IL-10-Rezeptor einschließlich löslicher Fragmente davon oder IL-10-Rezeptor-Antikörper können gereinigt und dann an einen Patienten verabreicht werden. Diese Reagentien können für die therapeutische Verwendung z. B. in herkömmlichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln zusammen mit physiologisch unschädlichen Stabilisatoren und Arzneimittelhilfsstoffen mit zusätzlichen Wirkstoffen kombiniert werden. Diese Kombinationen können sterilfiltriert und in Darreichungsformen überführt werden, etwa durch Lyophilisierung in Dosierungsgläschen oder Aufbewahrung in stabilisierten wäßrigen Präparaten. Diese Erfindung zieht auch die Verwendung von Antikörpern oder bindenden Fragmenten davon, die z. B. löslich sind und nicht komplementbindend sind, in Betracht.
Eine Medikamentendurchmusterung unter Verwendung des IL-10- Rezeptors oder von Fragmenten davon kann durchgeführt werden, um Verbindungen mit Bindungsaffinität zum IL-10-Rezeptor zu identifizieren. Dann können anschließende biologische Assays verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine intrinsische stimulierende Wirkung hat und daher insofern ein Blocker oder Antagonist ist, als sie die Wirkung von IL-10 blockiert. Genauso kann eine Verbindung mit einer intrinsischen stimulierenden Wirkung den Rezeptor aktivieren und ist daher insofern ein Agonist, als sie die Wirkung von IL-10 stimuliert. Diese Erfindung zieht weiterhin die therapeutische Verwendung von Antikörpern gegen den IL-10-Rezeptor als Antagonisten in Betracht.
Die für eine effektive Therapie notwendigen Mengen an Reagentien hängen von vielen verschiedenen Faktoren ab einschließlich den Mitteln der Verabreichung, dem Zielort, dem physiologischen Zustand des Patienten und den anderen verabreichten Medikamenten. Die Behandlungsdosen sollten also titriert werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Typischerweise können die in vitro verwendeten Dosen nützliche Anhaltspunkte für die Mengen sein, die für die in-situ-Verabreichung dieser Reagentien geeignet sind. Die Ermittlung der für die Behandlung bestimmter Störungen wirksamen Dosen durch Tierversuche ergibt weitere aussagekräftige Hinweise auf die Dosierung beim Menschen. Verschiedene Überlegungen sind z. B. beschrieben in Gilman et al. (Hrsg.), Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. Aufl., 1990, Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Aufl., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Penn.
Verfahren zur Verabreichung werden dort und im folgenden diskutiert, z. B. für orale, intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung, transdermale Diffusion und andere. Zu den pharmazeutisch annehmbaren Trägern gehören Wasser, Kochsalzlösung, Puffer und andere Verbindungen, die z. B. im Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey, beschrieben sind. Wegen der hohen Affinität der Bindung zwischen IL-10 und seinen Rezeptoren würde man erwarten, daß am Anfang niedrige Dosen dieser Reagentien wirksam sind. Man würde also normalerweise erwarten, daß die Dosisbereiche Konzentrationen von weniger als 1 mM, typischerweise weniger als etwa 10 uM, gewöhnlich weniger als etwa 100 nM, vorzugsweise weniger als etwa 10 pM und am meisten bevorzugt weniger als etwa 100 fM entsprechen, mit einem geeigneten Träger. Für die kontinuierliche Verabreichung werden häufig Zubereitungen für langsame Freisetzung oder Vorrichtungen für langsame Freisetzung verwendet. Die intrazellulären Segmente der Rezeptoren, sowohl des IL-10-Rezeptors als auch verwandter Rezeptoren, werden zusätzliche Verwendungen finden, wie es unten im Einzelnen beschrieben ist.
Der IL-10-Rezeptor, Fragmente davon und Antikörper gegen den Rezeptor oder seine Fragmente, Antagonisten und Agonisten können dem zu behandelnden Wirt direkt verabreicht werden, oder je nach der Größe der Verbindungen kann es auch wünschenswert sein, sie vor der Verabreichung mit Trägerproteinen, wie Ovalbumin oder Serumalbumin, zu konjugieren. Therapeutische Zubereitungen können in jeder herkömmlichen Darreichungsform verabreicht werden. Der Wirkstoff kann zwar auch allein verabreicht werden, wird jedoch vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung angeboten.
Solche Zusammensetzungen umfassen wenigstens einen Wirkstoff, wie er oben definiert ist, zusammen mit einem oder mehreren annehmbaren Trägern für diesen. Jeder Träger muß in dem Sinne sowohl pharmazeutisch als auch physiologisch annehmbar sein, daß er mit den anderen Bestandteilen verträglich ist und dem Patienten nicht schadet. Zu den Zubereitungen gehören solche, die für orale, rektale, nasale oder parenterale (einschließlich subcutane, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) Verabreichung geeignet sind.
Die Zubereitungen können zweckmäßigerweise in Form von Dosiseinheiten angeboten werden und können nach einem der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Siehe z. B. Avis et al. (Hrsg.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, 1993, Dekker, New York; Lieberman et al. (Hrsg.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, 1990, Dekker, New York; und Lieberman et al. (Hrsg.), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, 1990, Dekker, New York. Die therapeutischen Verfahren dieser Erfindung können mit anderen chemotherapeutischen oder chemopräventiven Mitteln kombiniert bzw. zusammen mit diesen verwendet werden.
Die Materialien dieser Erfindung können auch durch Standard- Gentherapietechniken abgegeben werden; dazu gehören z. B. die direkte Injektion von DNA in Gewebe, die Verwendung von rekombinanten viralen Vektoren und die Implantierung von transfizierten Zellen. Siehe z. B. Rosenberg, J. Clin. Oncol. 10: 180- 199 (1992).
Es ist sehr wahrscheinlich, daß es noch andere Untereinheiten des IL-10-Rezeptors gibt. IL-10 zeigt in verschiedenen biologischen Assays verschiedene spezifische Aktivitäten (Einheiten pro mg Protein). Zum Beispiel ist die spezifische Aktivität von IL-10 in Cytokin-Synthese-Inhibitionsfaktor-Assays, bei denen IL-10 auf Makrophagen wirkt, höher als die, die man bei der Costimulation der Maus-Thymocyten- oder Maus-Mastzellen- Proliferation beobachtet.
Die hier bereitgestellten Human- und Maus-IL-10-Rezeptoren binden IL-10, obwohl die Fähigkeit jeder Komponente allein, vIL-10 zu binden, noch nicht gezeigt wurde. Das effektive Kd des rekombinanten IL-10-Rezeptors (100-400 pM) ist beträchtlich höher als das EC&sub5;&sub0; von IL-10 an Makrophagen und Monocyten (5-20 pM). Analog zu verwandten Cytokin-Rezeptoren der Klasse 2, z. B. IFN-α, IFN-β oder IFN-γ, deren Strukturmotive ähnlich sind, könnte für die Signalübertragung aufgrund der IL-10- Bindung ein Hilfsmolekül erforderlich sein.
Verschiedene Ansätze können verwendet werden, um nach solchen Hilfskomponenten zu durchmustern. Diese Ansätze umfassen sowohl physikalische Affinitätsverfahren als auch Durchmusterung auf Aktivität. Ähnliche Affinitätsverfahren, wie sie hier mit Human-IL-10 verwendet wurden, können auch mit vIL-10 verwendet werden. Da vIL-10 biologisch aktiv ist, aber nicht gezeigt wurde, daß es an die Untereinheiten bindet, könnte es eine modifizierte Form des Rezeptors geben. Ein FLAG-vIL-10- Verschmelzungskonstrukt sollte für die selektive Reinigung von Zellen, die eine solche Rezeptorform enthalten, geeignet sein.
Ein Ansatz besteht darin, Bibliotheken zu transfizieren, die aus geeigneten Zellen hergestellt sind, z. B. Zellen, die auf vIL-10 zu reagieren vermögen, um transfizierte Zellen auszumustern, die ansonsten nicht auf vIL-10 reagieren oder die nicht an vIL-10 (oder das FLAG-vIL-10-Verschmelzungsprodukt) binden. Eine solche Bibliothek aus transfizierten Zellen könnte unter Verwendung eines FLAG-vIL-10-Markers mit einer Konzentration, die zu gering ist, um effektiv an die Rezeptor-Untereinheiten dieser Erfindung zu binden, durchmustert werden. Siehe z. B. Kitamura et al., Cell 66: 1165 (1991).
Alternativ dazu kann ein FLAG-vIL-10-Verschmelzungskonstrukt auch zum Auswaschen oder zur FACS-Trennung verwendet werden, wie es z. B. unten beschrieben ist. Diese Techniken können mit der Cotransfektion mit der bereits isolierten IL-10-Komponente kombiniert werden, um z. B. Hilfskomponenten zu isolieren, die die Bindungseigenschaften modifizieren. Komponenten, die bei der Assoziation die Ligandenbindungsaffinität erhöhen, sind besonders wünschenswert. In dieser Weise isolierte cDNA-Klone werden z. B. durch Sequenzieren charakterisiert und strukturell mit anderen Untereinheiten oder Hilfsproteinen verglichen, die in anderen Rezeptoren identifiziert wurden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung kann anhand der folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert werden. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Prozentsätze, die unten für Feststoffe in festen Gemischen, Flüssigkeiten in Flüssigkeiten und Feststoffe in Flüssigkeiten angegeben sind, auf der Basis w/w, v/v bzw. w/v angegeben.
Die folgenden Beispiele zeigen, daß iodiertes Human-IL-10 (hIL-10) mit hoher spezifischer Aktivität in einer spezifischen und sättigungsfähigen Weise an IL-10-Rezeptoren in mehreren Maus- und Human-Zellinien binden kann. MC/9- Proliferationsassays zeigten, daß dieses markierte Protein mehr als 50% der biologischen Aktivität beibehält. Eine Klassierung des gereinigten, iodierten Proteins anhand des Molekulargewichts wies darauf hin, daß das Protein vorwiegend als Dimer vorliegt und in dieser Form in der Lage ist, spezifisch an seinen Rezeptor zu binden. Ein 37-kDa-Dimer von Human-IL-10 kann bei der Untersuchung durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese [SDS-PAGE: Laemmli, Nature 227: 680 (1970)] unter reduzierenden Bedingungen durch Detergentien in eine monomere 18-kDa-Spezies dissoziiert werden. Dies steht mit der Annahme im Einklang, daß die 37-kDa-Spezies ein nicht kovalent verknüpftes Dimer des Cytokins darstellt. Überdies läßt dies vermuten, daß aktives hIL-10 ein nicht kovalent verknüpftes Dimer ist.
Eine Durchmusterung auf spezifische Bindung mit mehreren, von Maus und Mensch abgeleiteten Zellinien weist darauf hin, daß die Maus-Mastzellinie MC/9 und die Human-B-Lymphom-Linie JY die höchste Zahl an zugänglichen, d. h. unbesetzten, Rezeptoren pro Zelle aufweisen. Die Human-B-Zellinien Ramos und BH5 sowie die Erythroleukämie-Linie TF-1 binden auf einem reduzierten Niveau im Vergleich zu MC/9 und JY, gefolgt von Human-T-Zell- und Makrophagen-Linien. Diese Zellinien wurden auf der Grund lage der beschriebenen Beobachtungen ausgewählt, daß Mastzellen, Makrophagen/Monocyten, 8-Zellen und T-Zellen auf IL-10 ansprechen. Die TF-1-Zellinie, die ursprünglich von einem erythroleukämischen Patienten abgeleitet war, ist für ein langfristiges Wachstum von IL-3, Erythropoietin oder GM-CSF abhängig. Die Zellinie spricht in Proliferationsassays auch auf IL-4, IL-5 und IL-6 an. Trotz des Ansprechverhaltens der TF-1-Zellinie auf eine Vielzahl von Cytokinen konnten keine proliferativen Wirkungen auf TF-1-Zellen als Reaktion auf hIL- 10 entweder allein oder in Kombination mit anderen Cytokinen nachgewiesen werden.
Durch Scatchard-Analyse erhaltene Kd-Werte weisen darauf hin, daß hIL-10 sowohl an Maus- als auch an Human-Zellen mit relativ hoher Affinität an seinen Rezeptor bindet und daß es zwischen 100 und 300 unbesetzte Rezeptoren pro Zelle gibt. Kompetitive Bindungsassays mit Human- und Maus-IL-10 an der Maus-Mastzellinie MC/9 und der Human-Zellinie JY zeigten, daß der Maus-Ligand zwar in der Lage ist, mit iodiertem hIL-10 um die Bindung an die Maus-Zellinie zu konkurrieren, jedoch nicht bei der Human-Zellinie. Eine Erklärung dafür ist, daß hIL-10 unter den eingesetzten Bindungsbedingungen sowohl den Maus- als auch den Human-Rezeptor erkennen und daran binden kann, während das Maus-IL-10 nur den Maus-Rezeptor erkennen kann. Diese Idee der Artspezifität des Maus-Liganden bei der Erkennung der Binsungsstelle wird durch das Fehlen jeder nennenswerten biologischen Kreuzreaktivität von Maus-IL-10 auf Human- Zellen gestützt.

Beispiel 1: Allgemeine Verfahren

Zellinien und Gewebekultur

MC/9-Zellen (ATCC-Nr. CRL1649) wurden routinemäßig in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Kälberfetusserum (FBS), das 3-5% Mitogen-stimuliertes, Milz-kondi tioniertes Medium, 100 E/ml mIL-4, 10 E/ml Penicillin/Streptomycin, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1 · MEM essentielle und nichtessentielle Aminosäuren, 1 · MEM Vitamine, 50 uM β-Mercaptoethanol, 6 mg/l Folsäure, 116 mg/l L- Arginin und 36 mg/l L-Asparagin enthielt, gezüchtet. TF-1- Zellen [Kitamura et al., J. Cell. Physiol. 140: 323 (1989)] wurden in RPMI1640 mit 10% FBS und 1 ug/l Maus-GM-CSF gezüchtet. JY-Zellen (zur Verfügung gestellt von J. de Vries, DNAX, Palo Alto, CA) wurden in DMEM mit 10% FBS, 6 mM Glutamin sowie Antibiotika gezüchtet. Andere Zellinien [Ramos (ATCC-Nr. cRL1596), WEHI 265.1 (TIB204), U937 (cRL1593), HL-60 (CCL290), JD (CRL8163), Jijoye (CCL87), THP-1 (TIB202), B-JAB (zur Verfügung gestellt von J. Banchereau, Schering-Plough Frankreich) und BH-5 (zur Verfügung gestellt von W. Tadmori, Schering-Plough Research Institute, SPRI)] wurden in RPMI mit 10% FBS, 6 mM Glutamin sowie Antibiotika gezüchtet. Außerdem wurden die Kulturmedien für BH-5- und THP-1-Zellen mit 50 uM β-Mercaptoethanol ergänzt. Alle Gewebekulturreagentien wurden von GIBCO (Gaithersburg, MD) erhalten.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)

FACS wurde unter Verwendung von Standard-Verfahren mit einem Becton-Dickinson FACStar PLUS durchgeführt. Siehe z. B. Shapiro, Practical Flow Cytometry (2. Aufl.), 1988, Alan Liss, New York.

Cytokine und Antikörper

Rekombinantes, von CHO abgeleitetes Human-IL-10 und -IL-5 sowie von E. coli abgeleitetes Human-GM-CSF, IFN-γ und Maus-IL- 10 wurden vom Schering-Plough Research Institute (SPRI), New Jersey, zur Verfügung gestellt. Die mit einem MC/9- Proliferationsassay (siehe unten) gemessene spezifische biologische Aktivität dieser Präparate betrug 2,3 · 10&sup7; E/mg für hIL-10 und 1,6 · 10&sup7; E/mg für mIL-10. Rekombinantes hIL-6 wurde von Genzyme (Cambridge, MA) bezogen. Monoklonale Antikörper gegen IL-10 und IL-5 wurden von J. Abrams [DNAX, Palo Alto, CA; siehe Abrams et al., Immunol. Rev. 127: 5 (1992)] zur Verfügung gestellt, könnten jedoch auch nach Standard- Verfahren hergestellt werden.

Iodierung von Human-IL-10

Gereinigtes hIL-10-Protein wurde unter Verwendung des Radioiodierungs-Reagens Enzymobead (Bio-Rad, Richmond, CA), bei dem es sich um ein immobilisiertes Präparat von Lactoperoxidase und Glucose-Oxidase handelt, gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Das gereinigte Protein wurde durch eine PD- 10-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) gegeben, um freien Marker zu entfernen. Weitere Proben wurden ebenfalls unter Verwendung des Lactoperoxidase-Verfahrens iodiert (NEN Research Products, Boston, MA). Die erhaltene spezifische Radioaktivität lag im Bereich von 100-180 uCi pro ug hIL-10. Dann wurde das iodierte Material durch eine 120-ml- Sephadex-G-75-Säule (Pharmacia LKB) gegeben, wobei Fraktionen von 1,1 ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgefangen wurden. Eine TCA-Fällung wurde durchgeführt, indem man Aliquote der Fraktionen 1 Stunde lang bei 4ºC in 10%iger Trichloressigsäure inkubierte. Dann wurden die nach der Zentrifugation gebildeten Sedimente in einem Clinigamma-Zähler (Pharmacia LKB) gezählt.

MC/9-Proliferationsassay

Die biologische Aktivität von hIL-10 wurde unter Verwendung eines colorimetrischen MTT-Farbstoff-Reduktionsassay bestimmt. Siehe z. B. Tada et al., J. Immun. Meth. 93 : 157 (1986), und Mosmann, J. Immun. Meth. 65: 55 (1983). Kurz gesagt, 5 · 10³ MC/9-Zellen pro Napfin 100 ul Medium, das 100 E mIL-4 pro ml enthielt, in einer 96-Napf-Mikrotiterplatte wurden 48 Stunden lang mit verschiedenen Mengen Human-IL-10 behandelt. Der hIL- 10-Standard wurde mit maximal 200 Einheiten/100 ul verwendet und in einer Verdünnungsreihe jeweils zweifach verdünnt. Dazu wurden 25 ul MTT von 5 mg/ml gegeben, und es wurde 3 bis 5 Stunden lang inkubiert. Dann wurden die Zellen in 10% SDS mit 10 mM HCl Detergenslysiert, und die Platten wurden hinsichtlich der Extinktion bei 570 nm abgelesen.

Bindungsassays und Scatchard-Analyse

Ungefähr 5 · 10&sup6; Zellen jeder getesteten Zellinie wurden durch 10 min Zentrifugation mit 200 · g sedimentiert, in PBS gewaschen und in 200 ul Bindungspuffer (PBS, 10% Kälberfetusserum, 0,1% NaN&sub3;) resuspendiert, der 100-500 pM iodiertes hIL-10 enthielt. Nach zwei Stunden Inkubation bei 4ºC in einem Rotationsmischer wurden die Zellen 10 Minuten mit 200 · g zentrifugiert, in 100 ul Bindungspuffer ohne markiertes hIL-10 resuspendiert, in länglichen Mikrozentrifugenröhrchen über 200 ul eines 1 : 1-Gemischs von Dibutyl- und Dioctylphthalat-Öl geschichtet, 5 Minuten bei 4ºC mit 400 · g zentrifugiert und in flüssigem Stickstoff schnellgefroren. Dann wurden die Zellsedimente zurechtgeschnitten und in einem Clinigamma-1272- Zähler (Pharmacia LKB) gezählt. Die nichtspezifische Bindung wurde bestimmt, indem man die Bindung in Gegenwart eines 500- bis 1000fachen molaren Überschusses von unmarkiertem hIL-10 durchführte.
Für Sättigungsbindungsexperimente wurden Verdünnungsreihen mit jeweils zweifacher Verdünnung einer ungefähr 600 pM Lösung von iodiertem hIL-10 verwendet, wobei eine parallele Reihe durchgeführt wurde, um die nichtspezifische Bindung zu bestimmen. Eine Scatchard-Analyse wurde mit den erhaltenen Datenpunkten durchgeführt, wobei man das EBDA-Programm (Elsevier-Biosoft, Cambridge, UK) verwendete. Die Antikörper-Hemmung wurde unter den obigen Bindungsbedingungen durchgeführt, aber unter Zugabe eines 100fachen molaren Überschusses von jedem der monoklonalen Antikörper. Die Cytokin-Spezifität wurde unter ähnlichen Bedingungen bestimmt, aber unter. Zugabe eines 500fachen molaren Überschusses der angegebenen Cytokine.

Chemische Vernetzung

Etwa 2 · 10&sup8; Zellen wurden 4 Stunden bei 4ºC in 2 ml Bindungsmedium inkubiert, das aus PBS, 0,1% NaN&sub3;, 10% Rinderserumalbumin und 200 pM ¹²&sup5;I-hIL-10 mit oder ohne 200 nM unmarkiertes hIL-10 bestand. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann in 1 ml PBS resuspendiert. Zu der Zellsuspension wurden 10 ul einer 15 M Stammlösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC; Pierce Chemical Co.) gegeben, und die Zellen wurden unter ständigem Schaukeln 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Reaktion wurde abgebrochen, indem man die Zellen zweimal mit kaltem PBS wusch und dann 150 mM Glycin, pH 7,2, gepuffert mit Tris-HCl, hinzufügte. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und durch Hinzufügen von 1 ml Lysepuffer, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 140 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mg/ml Leupepton (Sigma), 2 mM Prefabloc SC (Boehringer Mannheim), 2 mM Iodacetamid (Sigma), 2 mM o-Phenanthrolin (Sigma) und 1% Triton X-100 (Sigma) lysiert. Die Lysate wurden 20 Minuten bei 4ºC mit 10000 · g zentrifugiert.
Die Überstände wurden abgeerntet und über Nacht bei 4ºC mit polyklonalem Kaninchen-Anti-hIL-10-Antiserum inkubiert, das nach Standardverfahren hergestellt und auf Protein-G-Harz (Pierce Chemical Co.) vorsorbiert worden war. Jede Probe enthielt 20 ul des Harzes. Nach der Inkubation wurde das Harz dreimal mit PBS gewaschen und in 20 ul SDS-PAGE-Puffer ohne Reduktionsmittel resuspendiert. Dann wurden 20 ul jeder Probe einer SDS-PAGE in einem Gel mit einem Gradienten von 4-15% (Daiichi Chemical Co., Tokyo) unter nichtreduzierenden Bedingungen unterzogen. Eine Gruppe von vorgefärbten Molekulargewichtsmarkern (Life Technologies, Inc.) wurde parallel laufen gelassen, um die Größe der vernetzten Komplexe zu bestimmen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und bei -80ºC 48 Stunden lang autoradiographisch auf einen Kodak-XAR-Film mit zwei Verstärkerfolien kopiert.

COS-7-Transfektionen

5 ug Plasmid-DNA wurden in einer Elektroporationsküvette (Bio- Rad, Richmond, CA) mit 5 · 10&sup6; COS-7-Zellen in 250 ul DMEM mit 10% FBS und Antibiotika gemischt. Die Zellen wurden mit einem Bio-Rad Gene Pulser mit Hilfe von 0,20 kV elektroporiert, wobei die Kapazität auf 960 uF und der Widerstand auf 200 Ohm eingestellt waren. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen in 10-cm-Schalen mit 10 ml vollständigem Medium übertragen und anhaften gelassen.
Nach einer über Nacht erfolgten Inkubation bei 37ºC wurde das Medium durch dasselbe Medium, aber ohne Serum, ersetzt. Zwei Tage später wurden die Zellen von den Platten abgelöst, indem man in PBS mit 4 mM EDTA und 0,03% NaN&sub3; inkubierte, abgeerntet und für Bindungsassays verwendet. Ungefähr 1 · 10&sub6; Zellen wurden für jede Bindungsbestimmung verwendet.

Beispiel 2: Herstellung von Human- und Maus-IL-10-Fusionsproteinen mit FLAG-Sequenzen

Nucleinsäure-Konstrukte, die Fusionsproteine codieren, wurden unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie hergestellt. Die FLAG-Sequenz wird von kommerziell erhältlichen Antikörpern (IBI-Kodak, Rochester, NY) erkannt und stört die in biologischen Assays auf IL-10-Aktivität gemessene Assoziation des IL-10-Fusionsproteins mit dem Bindungsprotein nicht wesentlich.

Beispiel 3: Herstellung von cDNA-Bibliotheken

cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung von Standardtechniken aus Zellinien aufgebaut, die gegenüber IL-10 empfindlich sind. Siehe SuperScript Plasmid System for cDNA Systems and Plasmid Cloning, Life Technologies, BRL, Gaithersburg, MD. Die BJAB-B-Human-Zellinie wurde verwendet, ebenso wie die Maus- MC/9-Mastzell- und die J774-Makrophagen-Zellinie.

Beispiel 4: Anreicherung von transformierten Zellen, die erhöhte Mengen von IL-10-Bindungsprotein exprimieren

Mit den cDNA-Bibliotheken transfizierte Zellen wurden einer FACS-Sortierung unter Verwendung von biotinylierten fluoreszenten FLAG-Antikörpern als Marker unterzogen. Nach dem Einwirkenlassen der Antikörper auf die transformierten Zellen wurde Phycoerythrin-Streptavidin (PE-Streptavidin) hinzugefügt. Dann wurden die markierten Zellen durch FACS analysiert, um die 3-5% der Zellen zu gewinnen, die die größte Menge der IL-10-Bindung exprimierten. Ausgewählte Zellen wurden verwendet, um cDNA-Bibliotheken herzustellen, und die Zellen wurden drei Anreicherungscyclen unterzogen. Dabei wurde gefunden, daß IL-10 mit der FLAG-IL-10-Bindung konkurrieren kann.
Zellen mit exprimiertem IL-10-Bindungsprotein wurden durch Affinitätsreinigung, d. h. Auswaschen auf Platten, die mit Anti-FLAG-Antikörpern beschichtet waren, ausgewählt. Auf diese Weise identifizierte Zellen wurden mehreren Cyclen des Auswaschverfahrens unterzogen, und ihre exogenen Vektoreinschübe wurden isoliert und charakterisiert.

Beispiel 5: Charakterisierung von Nucleinsäure, die das IL-10- Bindungsprotein codiert

Die isolierten Einschübe sowohl aus der Human- als auch der Maus-cDNA-Quelle wurden durch Sequenzieren nach Standardverfahren weiter charakterisiert.
Die meisten Zellen hatten nach der Selektion eine höhere Fluoreszenzintensität, und das Bindungssignal wurde durch Konkurrenz mit einem 50fachen Überschuß an IL-10 stark reduziert.

Beispiel 6: Biologische Aktivität von Lactoperoxidase-markiertem Human-IL-10

Gereinigtes, von CHO abgeleitetes hIL-10 wurde unter Verwendung des Lactoperoxidase-Verfahrens auf eine hohe spezifische Aktivität (100 bis 200 uCl pro ug Protein) iodiert. Anfängliche Versuche, von CHO abgeleitetes hIL-10 mit dem IODO-GEN- Reagens (Pierce, Rockford, IL) zu markieren, führten dazu, daß bei der Rezeptorcharakterisierung ein Protein mit unzureichender spezifischer Aktivität verwendet wurde. Das Lactoperoxidase-Verfahren ergab iodiertes hTL-10 mit einer spezifischen Aktivität, die ungefähr fünfmal höher war als die mit IODO-GEN erhaltene.
Um zu bestimmen, ob das mit hoher spezifischer Aktivität markierte hIL-10 biologisch aktiv war, wurden Proben nach dem Verfahren von Thomson-Snipes et al., J. Exp. Med. 173: 507 (1991), auf ihre Fähigkeit untersucht, eine MC/9-Zellproliferation zu induzieren. Unter Verwendung von Konzentrationen von jeweils 50 ng/ml wurden für die geschätzten Aktivitäten des markierten und des unmarkierten IL-10 Werte von 7,48 · 10² bzw. 1,16 · 10³ Einheiten/ml gefunden. Das markierte TL-10 behielt also 64% der biologischen Aktivität bei. Assays mit anderen Proben von iodiertem hIL-10 wiesen routinemäßig mehr als 50% Retention der biologischen Aktivität auf.

Beispiel 7: Dimerer Charakter der aktiven Form von radioaktiv markiertem hIL-10

Das markierte Proteingemisch wurde beim Durchlaufenlassen durch eine Sephadex-G-75-Gelfiltrationssäule in drei unterschiedliche Spezies aufgetrennt. Diese Fraktionierung erwies sich als notwendig zum Reduzieren der Hintergrundbindung an Zielzellen. Die größte Spezies war eine hochmolekulare Form, die mit dem ausgeschlossenen Volumen eluiert. Die kleinste Spezies eluierte zwischen dem Standard mit dem niedrigsten Molekulargewicht (13,7 kDa) und dem Farbstoff-Marker Bromphenolblau.
Eine Klassierung mit Molekulargewichtsstandards zeigte, daß die zweite Spezies ungefähr 37 kDa aufwies, was mit dem vorhergesagten Molekulargewicht für ein hIL-10-Dimer im Einklang stand. SDS-PAGE der drei Spezies zeigte, daß die hochmolekulare Form als Aggregat zwischen 43 kDa und 200 kDa durchlief. Die zweite Spezies wanderte unter diesen Bedingungen mit ungefähr 18 kDa, während die dritte Spezies überhaupt nicht beobachtet wurde. Die mit der größten und der zweiten Spezies assoziierte Radioaktivität ließ sich mit TCA ausfällen, während dies für die mit der kleinen Spezies assoziierte Radioaktivität nicht gilt.

Beispiel 8: Bindung von radioiodiertem Human-IL-10 an zelluläre Rezeptoren

Auf der Grundlage der Beobachtung, daß das radioiodierte hIL- 10 biologisch aktiv war, wurden fraktionierte Proben auf ihre Fähigkeit getestet, spezifisch an in Frage kommende Zellinien zu binden. MC/9-Zellen reagieren auf hIL-10 durch Proliferation; daher wurden sie zuerst verwendet, um die Bindungsspezifität von hIL-10 zu bestimmen. Als die drei von der G-75-Säule fraktionierten Spezies auf Bindung an MC/9-Zellen getestet wurden, war die 37-kDa-Spezies in der Lage, in einem hohen Ausmaß zu binden, die anderen beiden jedoch nicht; überdies konnte ein 500facher molarer Überschuß des unmarkierten IL-10- Proteins mehr als 90% der Bindung des markierten IL-10 blockieren.
Um die Spezifität der Bindung von hIL-10 an seinen Rezeptor zu ermitteln, wurden andere Cytokine sowie monoklonale Antikörper gegen hIL-10 auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von iodiertem hIL-10 an seinen Zelloberflächenrezeptor zu hemmen. Es wurde gefunden, daß überschüssiges hIL-10 in der Lage war, mit markiertem hIL-10 um die Bindung an TF-1-Zellen zu konkurrieren. Dagegen waren hIL-5, hIL-4, IFN-γ, GM-CSF und hIL-6 beim Konkurrieren ineffektiv.
Um weiter zu demonstrieren, daß die Bindung von hIL-10 an TF-1-Zellen spezifisch ist, wurden monoklonale Antikörper gegen hIL-10 und hIL-5 auf ihre Fähigkeit untersucht, die Bindung von iodiertem hIL-10 an seinen Rezeptor zu blockieren. Neutralisierende monoklonale Antikörper, die gegen hIL-10 erzeugt wurden, hemmten die Bindung von markiertem hIL-10 an TF-1-Zellen, aber ein monoklonaler Anti-Human-IL-5-Antikörper hemmte sie nicht.
Bindungsassays mit mehreren verschiedenen Zellinien wiesen darauf hin, daß hIL-10 in der Lage ist, in variierendem Ausmaß an die meisten dieser Linien zu binden. Der höchste Grad der Bindung wurde bei der Maus-Mastzellinie MC/9 und der Human-B- Lymphom-Linie JY gefunden. TF-1 (eine Human-Erythroleukämie- Linie) sowie Ramos und BH5 (Human-B-Lymphom-Linien) zeigten ein reduziertes Niveau der Bindung im Vergleich zu JY und MC/9. Human-IL-10 band an die anderen untersuchten Zellinien mit relativ niedrigem Niveau. Ein Bindungsassay mit WEHI 265.1, einer Maus-Monocyten-Zellinie, zeigte ebenfalls ein relativ niedriges Bindungsniveau.

Beispiel 9: Affinität der Bindung von Human-IL-10 an zelluläre Rezeptoren

Um die Bindungsaffinität zu bestimmen und die Zahl der Bindungsstellen/Rezeptoren pro Zelle abzuschätzen, wurden typische Sättigungsbindungskurven mit JY- und MC/9-Zellen aufgenommen. Die maximale Bindung erfolgte bei beiden Zellinien bei ungefähr 300 bis 400 pM markiertem hIL-10. Scatchard-Analysen der repräsentativen Bindungsdaten ergaben lineare Graphen mit Steigungen, die ein Kd von ungefähr 150 pM für die JY-Zellinie und 49 pM für die MC/9-Linie ergaben. Die erhaltenen Bmax- Werte, die die maximale Konzentration des an Zellen gebundenen Liganden darstellen, betrugen für MC/9-Zellen bzw. JY-Zellen 4,0 pM bzw. 7,5 pM. Unter der Annahme, daß ein hIL-10-Dimer- Ligandmolekül genau einen Rezeptor bindet, wurde abgeschätzt, daß bei MC/9 ungefähr 100 unbesetzte Rezeptoren pro Zelle und bei JY 180 unbesetzte Rezeptoren pro Zelle vorlagen. Aus mehreren unabhängigen Experimenten wurde die Human-IL-10- Bindungsaffinität zu JY- und MC/9-Zellen zu ungefähr 50 bis 1T0 pM bestimmt, mit 100 bis 300 unbesetzten Rezeptoren pro Zelle.

Beispiel 10: Artspezifität der Rezeptorbindung von Human- und Maus-IL-10

Um die Artspezifität der Rezeptorbindung zu untersuchen, wurde die Fähigkeit von Maus- und Human-IL-10 untersucht, mit markiertem Human-IL-10 um die Bindung an Maus- und Human- Zellinien zu konkurrieren. Da die durch biologischen MC/9- Assay bestimmte spezifische biologische Aktivität des von E. coli abgeleiteten Maus-IL-10 60-70% von der des Human-IL-10 beträgt, wurden die Konzentrationen von Human- und Maus-IL-10 bei den Konkurrenzexperimenten entsprechend angepaßt. Sowohl Maus- als auch Human-IL-10 waren in der Lage, die Bindung von markiertem hIL-10 an die Maus-MC/9-Linie zu blockieren. Dagegen war Human-IL-10, aber nicht Maus-IL-10, in der Lage, erfolgreich mit der Bindung von markiertem hIL-10 an die Human-B-Lymphom-Linie JY zu konkurrieren.

Beispiel 11: Multiple Komplexe, die nach der chemischen Vernetzung von Human-IL-10 mit zellulären Rezeptoren entstehen

Um die Größe von hIL-10-Rezeptorbindungskomplexen abzuschätzen, wurde 125I-hIL-10 an JY und MC/9-Zellen (ATCC CRL1649) gebunden, und die Zellen wurden wie oben beschrieben mit EDC behandelt. Da die Zahl der hIL-10-Rezeptoren in beiden Zellinien niedrig war, wurden die Zellysate nach Vernetzung mit polyklonalem Anti-hIL-10-Antiserum einer Immunfällung unterzogen, um die Bindungskomplexe anzureichern.
Nach einer SDS-PAGE und einer wie oben beschrieben durchgeführten Autoradiographie wurde gefunden, daß sowohl die JY- als auch die MC/9-Zellen hIL-10-spezifische Bindungskomplexe ergaben. Eine vorherrschende Form von Bindungskomplex mit einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 97 kDa wurde von beiden Zellinien erzeugt. Die JY-Zellen, aber nicht die MC/9- Zellen, ergaben zwei zusätzliche Banden mit geschätzten Molekulargewichten von etwa 190 und 210 kDa.
Einige schwächere Banden, die zwischen dem 68- und dem 43-kDa- Marker wanderten, waren ebenfalls zu sehen. Dabei kann es sich um Abbauprodukte der größeren Komplexe gehandelt haben. Vernetztes ¹²&sup5;I-hIL-10 erschien als Bande, die zwischen dem 43- und dem 29-kDa-Marker wanderte. Die Bildung aller vernetzten Komplexe wurde in Gegenwart eines 1000fachen molaren Überschusses von unmarkiertem hIL-10 vollständig gehemmt.

Beispiel 12: Spezifität der Bindung an Human-IL-10

COS7-Zellen wurden mit dem Human- oder Maus-cDNA-Klon transfiziert, man ließ sie 72 Stunden lang den Vektor exprimieren und testete sie dann auf Bindung an radioiodiertes Human-IL-10. Im Unterschied zu dem Vektor allein war die klonierte RezeptorcDNA in der Lage, COS-Zellen eine spezifische Bindungsfähigkeit für Human-IL-10 zu verleihen. Sowohl der Human- als auch der Maus-Klon waren in der Lage, Human-IL-10 zu binden.

Beispiel 13: Herstellung von löslichen und Fusionsderivaten der Human-IL-10-Rezeptor-Untereinheit

Im folgenden Beispiel werden die SEQ ID NOs offenbart, die die verschiedenen für PCR verwendeten Oligonucleotid-Primer definieren. Die Nucleotidsequenzen dieser Primer können somit gefunden werden, indem man auf das Sequenzlisting zurückgreift.
Das Fusionsderivat, das unten zum Erläutern dieser Erfindung verwendet wird, ist ein Protein, das die extrazelluläre Domäne des Human-IL-10-Rezeptors, die intrazelluläre Domäne von Human-IL-10 sowie die Transmembrandomäne entweder von Human- IL-10 oder von Human-IL-4 enthält. Solche Konstrukte sind z. B. zur Aufklärung des Mechanismus der Signalübertragung durch die relevanten Cytokine nützlich.
Um das Klonieren eines rekombinanten Plasmids in E. coli und die Expression mit hoher Ausbeute in transfizierten COS-Zellen zu erleichtern, wurde zuerst ein Derivat des pSV. Sport-Vektors (Life Technologies, Gaithersburg, MD) hergestellt. Dies erfolgte durch Ersetzen eines (am Ende aufgefüllten) PstI-ClaI- Fragments, das den ori von SV40 und den frühen Promotor von pSV. Sport enthielt, durch ein (am Ende aufgefülltes) PstI- HindIII-Fragment, das den SRα-Promotor und das SV40-t-Antigen- Intron aus dem Plasmid pDSRG (ATCC 68233) enthielt. Das resultierende Plasmid wurde als pSR. Sport bezeichnet.

Rekonstruktion der intrazellulären Domäne (IC) des Human-IL-4- Rezeptors

Aus verfahrenstechnischen Gründen wurde das IC von hIL-4 in zwei einzelne Teile geteilt, die unter Bildung des IC miteinander kombiniert wurden. Durch PCR wurde ein BamHI-PstI-Fragment synthetisiert, wobei Primer, die als C3632CC (SEQ ID NO: 5) und C3633CC (SEQ ID NO: 6) bezeichnet wurden, sowie das Plasmid pMEIBS-hIL-4R (ATCC 68263) als Matrize verwendet wurden. Dadurch wurde eine ursprüngliche Sau3A-Stelle durch eine stille Mutation in eine BamHI-Stelle umgewandelt, um das Klonieren zu erleichtern. Dieses Fragment wurde durch BamHI und PstI gespalten, in pUC19 (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) einkloniert und durch DNA-Sequenzierung überprüft.
Dann wurde das Plasmid pME18S-hIL-4R mit PstI behandelt, wobei ein 900-bp-PstI-PstI-Fragment freigesetzt wurde, das an der PstI-Stelle des Plasmids pUC19 eingesetzt wurde, das wie oben beschrieben modifiziert worden war. Das resultierende Konstrukt, das das vollständige Human-IL-4-IC enthielt, wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft. Das hIL-4-IC wurde somit als BamHI------PstI------PstI-Einschub in pUC19 rekonstruiert.

Rekonstruktion der extrazellulären Domäne (EC) des Human-IL- 10-Rezeptors

Die Konstruktion des EC wurde ebenfalls durch Ligasierung von zwei Restriktionsfragmenten erreicht. Eine KpnI-Stelle wurde durch eine stille Mutation an der Base 346 (der dritten Base des Codons für Glycin 95) der hIL-10-Rezeptor-Untereinheit (SEQ ID NO: 1) erzeugt, um das Klonieren zu erleichtern. Die Fragmente des 5'- und des 3'-Endes wurden einzeln durch PCR synthetisiert und als EcoRI/SalI--KpnI-Fragment bzw. KpnI- BstEII-Stop/EcoRI/BamHI-Fragment in pUC19 einkloniert. DNA des Klons SW8.1 (ATCC 69146) wurde als Matrize für die Synthese beider Fragmente verwendet. Zur Herstellung des 5'-Fragments wurden als C3628CC (SEQ ID NO: 7)- und C3629CC (SEQ ID NO: 8) bezeichnete Primer verwendet, während zur Herstellung des 3'- Fragments als C3630CC (SEQ ID NO: 9) und C3631CC (SEQ ID NO: 10) bezeichnete Primer verwendet wurden.
Eine BstETT-Stelle wurde durch eine stille Mutation der Base 757 (SEQ ID NO: 1) erzeugt. Am Ende des EC wurde ein Stop- Codon für die Konstruktion eines löslichen hIL-10-Rezeptors hinzugefügt, der wie unten beschrieben als EcoRI-EcoRI-Fragment kloniert werden sollte.
Das EcoRI/SalI--KpnI- und das KpnI--BstEII-Stop/EcoRI/BamHI- Fragment wurden durch DNA-Sequenzierung überprüft, und danach wurde das KpnI--BstEII-Stop/EcoRI/BamHI-Fragment mit dem anderen ligasiert, so daß das EC von hIL-10R entstand, ein EcoRI/SanI--KpnI--BstEII-Stop/EcoRI/BamHI-Fragment.

Rekonstruktion der Transmembrandomäne (TM)

DNA, die das hIL-4R-TM codierte, wurde durch PCR als EcoRI/BstEII-BamHI-Fragment synthetisiert, wobei Plasmid pME18S-hIL- 4R (ATCC 68263: hinterlegt am 20. März 1990) als Matrize sowie als C3634CC (SEQ ID NO: 11) und C3635CC (SEQ ID NO: 12) bezeichnete Primer verwendet wurden. Stille Mutationen wurden eingeführt, um die Restriktionsstellen zu erzeugen, und das Konstrukt wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft, nachdem das TM in pUC19 einkloniert worden war.

Zusammenbau der chimärischen Rezeptor-DNA in voller Länge

Das hIL-4R-IC wurde als BamHI-HindIII-Fragment aus dem oben beschriebenen Vektor herausgeschnitten und in den pUC19-Vektor eingesetzt, der bereits das hIL-10R-EC enthielt. Dann wurde ein synthetisches TM von hIL-4R als BstEII-BamHI-Fragment in den pUC19-Vektor eingesetzt, so daß ein Plasmid entstand, das die chimärische Rezeptor-DNA in voller Länge enthielt. Diese DNA wurde dann aus dem Plasmid herausgeschnitten, als SaII- ---HindIII-Fragment in den Expressionsvektor pSR. Sport einkloniert und exprimiert, um den chimärischen Rezeptor zu erzeugen.

Löslicher Human-IL-10-Rezeptor

Das oben beschriebene EcoRT/SalI--KpnI--BstEII-Stop/EcoRI/BamHI-Fragment wurde als EcoRI------EcoRI-Fragment aus dem Vektor herausgeschnitten und für die direkte Transfektion in pDSRG einkloniert oder als EcoRI- (am Ende aufgefüllt) und SalI-Fragment herausgeschnitten und für die Cotransfektion mit pDSRG in SalI/SnaßI-gespaltenes pSR. Sport einkloniert.

Reinigung und Charakterisierung des löslichen Human-IL-10- Rezeptors

Eine Human-IL-10-Affinitätssäule wurde konstruiert, indem man nach Standardverfahren hergestelltes hIL-10 (siehe US-Patent Nr. 5,231,012 an Mosmann et al.) mit durch N-Hydroxysuccinimidester aktivierten Agarosegel-Kügelchen vernetzte. Konditioniertes Medium aus transfizierten Zellen, die den löslichen Rezeptor erzeugen, wurde auf die Säule aufgetragen, und die Säule wurde mit PBS gewaschen, das 0,5 M NaCl und 0,1% Octylglucosid enthielt. Dann wurde die Säule mit 2 M MgCl&sub2; (pH 7,5) beladen, so daß gebundener löslicher hIL-10-Rezeptor freigesetzt wurde, und das eluierte Produkt wurde durch SDS-PAGE mit Silber-Anfärbung analysiert.
Eine Gruppe von drei Banden, zwei größere und eine kleinere, mit effektiven Molekulargewichten von etwa 43 kDa wurde beobachtet. Eine Western-Blot-Analyse mit einem durch Standardverfahren hergestellten Antiserum eines polyklonalen Anti- Rezeptor-Peptids (das die Reste 147-168 von SEQ ID NO: 1 umfaßte) zeigte drei Banden, die den durch Silber-Anfärbung nachgewiesenen Banden entsprachen, was darauf hinwies, daß alle mit hIL-10R im Zusammenhang standen. Eine Kontrolle unter Verwendung eines Serums vor der Immunisierung ergab kein nachweisbares Signal.
Da die für das hIL-10-Rezeptorprotein vorhergesagte Aminosäuresequenz mehrere potentielle N-Glycosylierungsstellen enthält, hätte die beobachtete Komplexität des gereinigten Rezeptorproteins auf eine variable Glycosylierung zurückzuführen sein können. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde das eluierte Produkt zuerst in PBS dialysiert und dann mit Endoglycanase F (N-Glycanase) behandelt und zusammen mit dem unbehandelten Produkt durch Elektrophorese und Western-Blotting analysiert.
In der mit Glycanase behandelten Probe wanderten die drei Banden bei etwa 43 kDa als einzige Bande mit einem effektiven Molekulargewicht von etwa 25 kDa zusammen, was der vorhergesagten Größe des unglycosylierten rekombinanten löslichen hIL- 10-Rezeptors entsprach. Außerdem zeigte eine aminoterminale Sequenzierung des Elutionsprodukts von der Affinitätssäule, daß die ersten fünfzehn Aminosäurereste den Resten 22-36 (SEQ ID NO: 2) entsprachen, die aus der Nucleotidsequenz der hIL- 10-Rezeptor-DNA vorhergesagt wurden. Es scheint daher, daß das Polypeptidgerüst des gereinigten löslichen Rezeptors hinsichtlich der Molekülgröße homogen war.

Sequenzlisting

(1) Allgemeine Angaben:

(i) Anmelder:
(A) Name: Schering Corporation
(B) Straße: One Giralda Farms
(C) Stadt: Madison
(D) Staat: New Jersey
(E) Land: USA
(F) Postcode (ZIP): 07940-1000
(G) Telefon: 201-822-7375
(H) Telefax: 201-822-7039
(I) Telex: 219165
(ii) Titel der Erfindung: Säuger-Rezeptoren für Interleukin-10 (IL-10)
(iii) Zahl der Sequenzen; 12
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Art des Datenträgers: Diskette
(B) Computer: Apple Macintosh
(C) Betriebssystem: Macintosh 6.0.8
(D) Software: Microsoft Word 5.1a
(v) Angaben zur jetzigen Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Anmeldedatum:
(vi) Angaben zu früherer Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer: US 08/110,683
(B) Anmeldedatum: 23. Aug. 1993
(vi) Angaben zu früherer Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer: US 08/011,066
(B) Anmeldedatum: 29. Jan. 1993
(vi) Angaben zu früherer Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer: US 07/989,792
(B) Anmeldedatum: 10. Dez. 1992

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 1:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 3632 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: cDNA (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 2:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 578 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 3:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 3520 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: cDNA (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 4:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 575 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 4:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 5:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 42 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 5:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 6:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 37 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 6:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 7:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 49 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 7:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 8:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 46 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 8:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 9:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 43 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 9:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 10:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 65 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 10:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 11:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 47 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 11:

(2) Angaben zu SEQ ID NO: 12:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 44 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 12:

Claims

1. Isoliertes Säuger-Rezeptorprotein oder Fragment davon, das spezifisch IL-10 bindet und eine Sequenzhomologie von 50-100% mit einem Human-Polypeptid, das durch SEQ ID NO: 2 definiert ist, oder einem Maus-Polypeptid, das durch SEQ ID NO: 4 definiert ist, aufweist.

2. Isoliertes Säuger-Rezeptorprotein oder Fragment gemäß Anspruch 1, bei dem es sich um ein Human-IL-10-Rezeptorprotein oder -Fragment handelt.

3. Isoliertes Säuger-Rezeptorprotein oder Fragment gemäß Anspruch 1, bei dem es sich um ein Maus-IL-10-Rezeptorprotein oder -Fragment handelt.

4. Isoliertes Human-Rezeptorprotein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 2 definiert ist.

5. Isoliertes Maus-Rezeptorprotein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 4 definiert ist.

6. Isoliertes Säuger-Rezeptorprotein oder Fragment gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, bei dem es sich um eine lösliche Form eines Human-IL-10-Rezeptorproteins handelt.

7. Chimärisches Rezeptorprotein, das eine extrazelluläre Domäne eines Human-IL-10-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 2, wobei die extrazelluläre Domäne spezifisch IL-10 bindet, und eine intrazelluläre Domäne eines Human-IL-4- Rezeptorproteins umfaßt.

8. Isolierte oder rekombinante Nucleinsäure, die ein Säuger- IL-10-Rezeptorprotein oder Fragment davon codiert, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert ist.

9. Isolierte oder rekombinante Nucleinsäure gemäß Anspruch 8, die unter stringenten Bedingungen an ein Plasmid hybridisiert, das bei der American Type Culture Collection unter der Zugriffsnummer ATCC 69146 oder 69147 hinterlegt ist.

10. Isolierte oder rekombinante Nucleinsäure gemäß Anspruch 8, die ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 definiert ist;

(b) einer Nucleinsäure, die mit hoher Stringenz an eine Nucleinsäure gemäß Teil (a) zu hybridisieren vermag; oder

(c) einer Nucleinsäure, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ein funktionelles Äquivalent der Nucleinsäure von Teil (a) oder (b) ist.

11. Isolierte oder rekombinante Nucleinsäure gemäß Anspruch 8, die wenigstens 35 Nucleotide aufweist und die eine Sequenz umfaßt, die eine Homologie von wenigstens 80% zu einer Sequenz aus dem codierenden Teil von SEQ ID NO: 1 oder 3 aufweist.

12. Isolierte oder rekombinante Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, die eine lösliche Form eines Human- IL-10-Rezeptorproteins codiert.

13. Isolierte oder rekombinante Nucleinsäure gemäß Anspruch 12, die ein Protein, das aus den Aminosäureresten 1-216 von SEQ ID NO: 2 besteht, oder ein Protein, das eine Sequenzhomologie von 50-100% dazu aufweist und spezifisch IL-10 bindet, codiert.

14. Isolierte oder rekombinante Nucleinsäure gemäß Anspruch 13, die ein Protein codiert, das die extrazellulären Segmente aminoproximal zu dem Transmembranhelixsegment, das sich von Rest 217 bis Rest 243 von SEQ ID NO: 2 erstreckt, umfaßt.

15. Isolierte oder rekombinante Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 8 bis 14, die ein heterologes Fusionsprotein codiert.

16. Fragment, das aus einem zusammenhängenden Segment von wenigstens 17 Nucleotiden einer isolierten oder rekombinanten Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 8 bis 15 besteht.

17. Rekombinanter Vektor, der eine Nucleinsäure oder ein Fragment gemäß einem der Ansprüche 8 bis 16 umfaßt.

18. Wirtszelle, die einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 17 umfaßt.

19. Verfahren zur Herstellung eines Säuger-IL-10-Rezeptorproteins oder Fragments davon, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 18 unter Bedingungen, bei denen die Nucleinsäure exprimiert wird.

20. Antikörper oder bindendes Fragment davon gegen ein Rezeptorprotein oder Fragment davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines, das nach dem Verfahren von Anspruch 19 herstellbar ist.

21. Antikörper oder bindendes Fragment gemäß Anspruch 20, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper oder ein bindendes Fragment davon handelt.

22. Verwendung eines Antikörpers oder bindenden Fragments gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21 zur affinitätschromatographischen Isolierung eines Säuger-IL-10-Rezeptorproteins.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Antagonisieren der biologischen Wirkung von IL-10, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine lösliche Form eines Human-IL- 10-Rezeptors oder einen Antikörper oder ein bindendes Fragment gemäß einem der Ansprüche 6, 20 oder 21 umfaßt.

24. Kit, der einen Behälter umfaßt, der eine Nucleinsäure, ein Rezeptorprotein oder ein Fragment davon, einen Antikörper oder ein bindendes Fragment gemäß einem der Ansprüche 7, 20 oder 21 umfaßt.