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Die Erfindung betrifft NukleinsÅaure-Bindungs-Peptide und die Verwendung solcher Peptide in pharmazeutischen Präparaten.
Die Impfung ist eines der wirksamsten Konzepte der modernen Medizin. Bei einem typischen
Impfschema wird ein gesundes Individuum mit einem Pseudo-Angriff eines Pathogens unter Ver- wendung nicht-pathogener "Modelle" des Pathogens, z. B. inaktivierten Pathogenen, bestimmten
Fragmenten der Pathogene oder molekularer Mimikry der Pathogene konfrontiert. Solche Modelle des Pathogens können entweder vom natürlichen Pathogen (z. B. durch einen Inak- tivierungsprozess) stammen oder synthetisch hergestellt sein.
Eines der Hauptprobleme bei der Impfung ist es, die Strukturen, mit welchen die Impfung durchgeführt wird, dem Immunsystem des Individuum zu präsentieren und eine geeignete Im- munantwort hervorzurufen, so dass das Individuum gegen einen Angriff mit dem echten Pathogen immunologisch geschützt ist.
Es ist bekannt, dass die von Virusinfektionen hervorgerufene schützende Immunität oft eine
Th1-Polarisierung aufweist. Dagegen werden durch eine Impfung mit weniger immunogenen rekombinanten Untereinheits-Vakzinen oft-wenn überhaupt-Th2-"biased"immunantworten ge"primt". Daher müssen gemeinsam mit den Antigenen entsprechende Adjuvantien geliefert werden, um die Antwort zu verstärken und zu modulieren, damit eine Schutzwirkung erreicht wird
Die Wahl der Adjuvantien, die die Schutzwirkung eines Untereinheits-Vakzins in einem akzeptab- len Dosisbereich und ohne Nebenwirkungen verstärken kann, ist begrenzt.
Das Verständnis der
Strukturmerkmale viraler Antigene, die das "Primen" der Th1-lmmunantworten unterstützen, kann
Mechanismen verdeutlichen, die an der Regulierung der Polarisierung von T-Zellen-Antworten beteiligt sind und kann beim rationalen Entwerfen neuer, antiviraler Vakzine behilflich sein.
Derzeit sind Aliminiumsalze und MF59 die einzigen Vakzin-Adjuvantien, die für Verwendungen am Menschen zugelassen sind. Insbesondere angesichts der Entwicklung neuer Generationen von
Vakzinen (einschliesslich rekombinanter Untereinheits- und Mucosa-Vakzinen) wurde die Suche nach stärkeren Vakzin-Adjuvantien intensiviert, und derzeit werden ausgewählte neue Verbindun- gen im Hinblick auf ihre immunstimulierende Wirksamkeit evaluiert (zusammengefasst in 10).
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verbindungen vorzusehen, welche besonders in einem Impfkonzept geeignet sind, d. h. immunmodulierende Substanzen, die eine entsprechende schützende Immunisierung mit bestimmten Antigenen, insbesondere mit rekombinanten Antigenen, ermöglichen.
Diesen Zielsetzungen wird durch ein pharmazeutisches Präparat, umfassend - das Peptid TTTVVRRRDRG RSPRRRTPSP RRRRSQSPRR RRSQRESQC oder ein das
Peptid SPRRRRSQSPRRRRSQ oder das Peptid RRDRGRS aufweisendes Fragment da- von und - ein Antigen entsprochen.
Überraschenderweise zeigte es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass mit dem Präparat gemäss der vorliegenden Erfindung eine wirksame Immunantwort bei einem zu impfenden Individuum möglich ist. Insbesondere wenn eine solche Peptid- und/oder Peptid/AntigenZusammensetzung gemeinsam mit mindestens Spurenmengen von Nukleinsäuren angewendet werden, wird eine Th1-lmmunität leichter bewirkt.
Das Peptid gemäss der vorliegenden Erfindung basiert auf der C-terminalen (Arg-reichen Region des Hepatitis B-Virus-Kern-Antigens (Hbc).
Das p21- (21 kDa)-Kern (C)-Protein des Hepatitis B-Virus (HBV) fügt sich selbst zu 30 nm ikosaedrisch symmetrischen, immunogenen Teilchen zusammen, die als Hepatitis-Kern-Antigen (Hbc) bekannt sind. Bei Expression in Bakterien bildet Hbc starre Teilchen. Während der VirusReplikation enthalten die fest organisierten Kern-Teilchen prä-Genom-RNA, die an virale reverse Transkriptase gebunden ist. Die virale prä-Genom-RNA ist in den Kern-Partikeln vor Nukleasen geschützt (zusammengefasst in (2)). Kern-Partikel sind für kleine Moleküle, z. B. Nukleotide, durchlässig.
Das Hbc-Protein enthält zwei Domänen, die 149 AS N-terminale Domäne, die eine Dimerisierung und weitere Oligomerisierung in Capside fördert, und die C-terminale, Arginin (Arg)-reiche Region, die in der Nukleinsäure-Bindung impliziert ist. Die letzten 34 Reste der Arg-reichen Region haben eine Ähnlichkeit mit Protaminen und vermitteln eine Sequenz-unspezifische Bindung von Nukleinsäuren. NukleinsÅaure-Bindungsmotive können in der C-terminalen, Arg-reichen Region
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durch Hybridisierungsanalysen (3) identifiziert werden. Die in Hbc-Partikein gefundene Nukleinsäure ist eine RNA mit einer Länge von zwischen 100 und 3. 000 Nukleotiden (4).
Die Translations-Initiierung an verschiedenen AUG-Codons innerhalb der Kern-Gen-Region wird verwendet, um verschiedene Produkte im HBV-Genom zu exprimieren. Das Kern-AUG lenkt die Produktion des p21-Kern-Proteins (Hbc) (Fig. 1A). Das 5'-Prä-Kern-AUG lenkt die Produktion des 25 kDa-Prä-Kern-Proteins, das um 29 N-terminale AS länger ist als das 183 AS Kern-Protein (Fig. 1A). Eine 19 AS Signal-Sequenz führt das Prä-Kern-Protein zielgerichtet zur Sekretierung.
Ein Entfernen dieser Signaisequenz erzeugt das p22-Zwischenprodukt, welches durch Trunkieren der C-terminalen AS 150-183 im Lumen des endoplasmatischen Retikulums weiter verarbeitet wird. Dies erzeugt das sezernierte p17-Protein, das als e-Antigen (HBe) bekannt ist. Man weiss, dass eine Disulfidbrücke zwischen dem Cystein an Position 7 im Prä-Kern und dem Cystein an Position 61 im Kern-Antigen eine Partikelbildung durch HBe verhindert. Somit sind HBc und HBe strukturell verschieden, haben jedoch eine 149 AS-Sequenz gemeinsam. Kreuzreaktive AntikörperReaktionen gegen gemeinsame konformationelle und lineare Epitope von HBc und HBe wurden beschrieben. Ausserdem wurden HBe-spezifische Epitope, die keine Kreuzreaktion mit HBcPartikeln eingehen, identifiziert. Die Funktion von HBe in vivo ist unklar.
Sie spielt bei der HBVReplikation und-Zusammenfügung keine Rolle. Hohe HBe-Serumspiegel korrelieren mit hohen Virus-Replikationsraten, hohen Virämie-Werten und einer hohen Infektiosität. Es wurden T-Zellen- Epitope mit eingeschränkter H-2-Klasse 11 und -Klasse I identifiziert, die sowohl in HBc als HBe anwesend sind, bei Mäusen identifiziert. HBc ruft bei Mäusen Th1-lmmunantworten hervor, wogegen HBe bei Mäusen Th2-lmmunantworten hervorruft. Man weiss nicht, warum diese grossteils identischen Virus-Proteine, die dem Immunsystem entweder als sezerniertes 17 kDa-Protein oder als ein 30 nm-Protein-Partikel präsentiert werden, auffallend unterschiedliche Immunantworten hervorrufen.
Sequenzen in Bakterien- und Insekten-DNA sind starke Aktivatoren des angeborenen und spezifischen Immunsystems. Wenn synthetische Oligodesoxynukleotide (ODN) mit CpG-enthaltenden immunstimulierenden Sequenzen mit Protein-Antigenen gemischt werden, primen sie eine Th1- Immunität. Weiters stimulieren diese Formulierungen oft CTL-Antworten auf rekombinante Proteine. Der für die Adjuvans-Wirkung von ODN bei Mäusen erforderliche Dosisbereich beträgt 10-50 ug ODN pro Vakzin. Da rekombinante HBc-Partikel RNA an die C-terminale, Arg-reiche Domäne binden, wurde untersucht, ob eine mit HBc-Partikeln assoziierte RNA von kritischer Be-
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den sind, die Th1-"biased" Immunitt stimulieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen, mit weichem eine bestimmte Impfung durchgeführt werden soll, ein integraler Teil des Peptids gemäss der vorliegenden Erfindung. Ein solches kovalent gebundenes Peptid-Antigen (das auch chemisch oder biologisch modifiziert sein kann, z. B. durch Carbohydro-Strukturen oder eine andere chemische Derivatisierung) kann an jede Immunität in einem Individuum, das gegen dieses Antigen geimpft ist, sehr wirksam"primen".
Bevorzugterweise umfasst das Peptid oder Peptidfragment im Präparat gemäss der vorliegenden Erfindung eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RRRDRGR, GRRRRGR, RSPRRRTP, GRRRSR, RSPRRTP, GGGGRRRSR, RYSRSR, RRSRSR, RRRSHSK, KKEEKRR, RRRSRSGTR, RSRRRSK, RRRSRGR, RSRSRYR, RRRSRYR, RRRYRGR, RRRYRGR, KRNERSR, RRKQKGGE, RRRSRSN oder RERDRRER.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemässe pharmazeutische Präparat einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen aus einem Bakterien-, Viren- oder Protozoen-Pathogen stammt.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden T-Zellen-Epitope als Antigene verwendet.
Alternativ kann auch eine Kombination von T-Zellen-Epitopen und B-Zellen-Epitopen bevorzugt sein.
Die bei den vorliegenden Zusammensetzungen zu verwendenden Antigene - entweder kovalent gebunden oder dem Peptid gemäss der vorliegenden Erfindung beigemischt - sind nicht von
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kritischer Bedeutung. Es können natürlich auch Mischungen aus verschiedenen Antigenen gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise werden Proteine oder Peptide, die von einem Vlrus- oder Bakterien-Pathogen oder von Pilzen oder Parasiten stammen, als solche
Antigene (einschliesslich derivatisierter Antigene oder glykosilierter Antigene oder lipidisierter Anti- gene oder Polysaccharide oder Lipide) verwendet. Andere bevorzugte Antigene sind Gazellen-
Vakzine, vollständige oder Teile von Organismen, wie Bakterien, Viren, Parasiten usw. Eine ande- re bevorzugte Quelle für Antigene sind Tumor-Antigene.
Bevorzugte Pathogene sind ausgewählt aus AIDS-Virus (HIV), Hepatitis A- und B-Virus, Hepatitis C-Virus (HCV), Rous-Sarkom-Virus (RSV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Influenza-Virus, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumonias, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumonias,
Bacillus anthracis, Vibrio cholera, Plasmodium sp. (PL falciparum, Pl. vivax, etc.), Aspergillus sp. oder Candida albicans. Die Antigene können auch Moleküle sein, welche von Krebszellen expri- miert werden (Tumor-Antigene). Der Derivatisierungsprozess kann die Reinigung eines spezifi- schen Proteins aus den Pathogen/Krebszellen, die Inaktivierung des Pathogens sowie die proteoly- tische oder chemische Derivatisierung oder Stabilisierung eines solchen Proteins inkludieren.
Auf dieselbe Weise können auch Tumor-Antigene (Krebs-Vakzine) oder Autoimmun-Antigene in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mit solchen Zusammensetzungen kann eine Tumor-Impfung oder eine Behandlung von Autoimmun-
Erkrankungen durchgeführt werden.
Im Fall von Peptid-Antigenen, ist die Verwendung von Peptid-Mimitopen/Agonisten/Superago- nisten/Antagonisten oder von Peptiden, die in bestimmten Positionen verändert sind, ohne die immunologischen Eigenschaften zu beeinflussen, oder von nicht-Peptid-
Mimitopen/Agonisten/Superagonisten/Antagonisten in der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen. Peptid-Antigene können auch Verlängerungen entweder am Carboxy- oder am AminoTerminus des Peptid-Antigens enthalten, was eine Wechselwirkung mit der (den) polykationischen Verbindung (en) oder der (den) immunstimulierenden Verbindung (en) erleichtert. Zur Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen können Peptid-Antagonisten angewandt werden.
Die Antigene können auch derivatisiert werden, so dass sie Moleküle beinhalten, die die Antigen-Präsentation und das gezielte Hinführen von Antigenen zu Antigen-präsentierenden Zellen verbessern.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung dient die pharmazeutische Zusammensetzung dazu, Proteinen oder Protein-Fragmenten und Peptiden, die bei Autoimmun-Erkrankungen eine Rolle spielen, eine Toleranz zu verleihen. Antigene, die bei diesen Ausführungsformen verwendet werden, dienen dazu, das Immunsystem tolerant zu machen oder die Immunantworten gegen Epitope, die an Autoimmunprozessen beteiligt sind, nach unten zu regulieren.
Das Primen der Th1-lmmunität wird insbesondere bewirkt, wenn mindestens Spurenmengen von Nukleinsäuren, insbesondere von Nukleinsäuren, von weichen man weiss, dass sie immunstimuiierende Fähigkeiten haben, in der vorliegenden Zusammensetzung vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst die vorliegende Zusammensetzung zwischen 1 ug-10 mg Nukleinsäuren, insbesondere 1 ng - 1 mg.
Die gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendenden immunogenen Nukleinsäuren können synthetischen, prokaryontischen und eukaryontischen Ursprungs sein. Im Falle eines eukaryontischen Ursprungs sollte die DNA von-bezogen auf den phylogenetischen Stammbaum - weniger entwickelten Spezies (z. B. Insekten, aber auch anderen) stammen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das immunogene Oligodesoxynukleotid (ODN) ein synthetisch herge- stelltes DNA-Molekül oder Mischungen solcher Moleküle.
Derivate oder Modifikationen von ODNs, wie mit Thiophosphat substituierte Analoga (Thiophosphat-Reste ersetzen das Phosphat), wie beispielsweise in den US-Patenten US 5 723 335 A und US 5 663 153 A beschrieben, und andere Derivate und Modifikationen, die vorzugsweise die immunstimulierende (n) Zusammensetzung (en) stabilisieren, jedoch nicht ihre immunologischen Eigenschaften verändern, sind ebenfalls inkludiert.
Ein bevorzugtes Sequenz-Motiv ist ein sechs-Basen-DNA-Motiv, welches ein (unmethyliertes) CpG-Dinukleotid enthält, das von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert ist (S'-Pur-Pur- C-G-Pyr-Pyr-3'). Die in den ODNs gemäss der vorliegenden Erfindung enthaltenen CpG-Motive sind in Mikroben-DNA üblicher als in der DNA höherer Vertebraten und zeigen Unterschiede im Methylierungsmuster. Bevorzugte palindromische oder nicht-paiindromische ODNs, die gemäss der
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sehen von der Stimulierung des Immunsystems, neutralisieren bestimmte ODNs einige Immun- antworten. Auch diese Sequenzen sind in der vorliegenden Erfindung inkludiert, beispielsweise für
Anwendungen zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen.
Die ODNs/DNAs können chemisch oder rekombinant erzeugt werden, oder sie können aus natürlichen Quellen stammen. Bevorzugte natürliche Quellen sind Insekten.
Alternativ können auch Nukleinsäuren mit Basen-Substitutionen (wie z. B. Desoxyinosin- enthaltende ODNs und/oder Desoxyuracil-enthaltende ODNs, beschrieben z. B. in der
WO 01/93905 A1) vorzugsweise als immunstimulierende Nukleinsäuren für die vorliegende Erfin- dung verwendet werden.
Natürlich können auch Mischungen aus verschiedenen immunogenen Nukleinsäuren gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das pharmazeutische Präparat gemäss der vorliegenden Erfindung kann weiters zusätzliche
Adjuvantien, insbesondere jene, die in (10), (11), (12), (13) beschrieben sind, und immunstimulie- rende Substanzen, insbesondere polykationische Verbindungen, umfassen.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Er- findung, insbesondere in Form eines Vakzins, weiters ein polykationisches Polymer, vorzugsweise ein polykationisches Peptid, insbesondere Polyarginin, Polylysin oder ein antimikrobielles Peptid.
Die gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendenden polykationische (n) Verbindung (en) kann (können) jede polykationische Verbindung sein, die die charakteristische Wirkung gemäss
WO 97/30721 A1 zeigt. Bevorzugte polykationische Verbindungen sind ausgewählt aus basischen
Polypeptiden, organischen Polykationen, basischen Polyaminosäuren oder Mischungen davon.
Diese Polyaminosäuren sollten eine Kettenlänge von mindestens 4 Aminosäure-Resten haben.
Insbesondere bevorzugt sind Substanzen, die Peptidbindungen, wie Polylysin, Polyarginin und
Polypeptide, die mehr als 20%, insbesondere mehr als 50%, basische Aminosäuren im Bereich von mehr als 8, insbesondere mehr als 20, Aminosäure-Resten oder Mischungen davon, enthalten.
Andere bevorzugte Polykationen und ihre pharmazeutischen Zusammensetzungen sind in WO 97/30721 A1 (z. B. Polyethylenimin) und WO 99/38528 A2 beschrieben. Vorzugsweise enthalten diese Polypeptide zwischen 20 und 500 Aminosäure-Reste, insbesondere zwischen 30 und 200 Reste.
Diese polykationischen Verbindungen können chemisch oder rekombinant hergestellt werden, oder sie können aus natürlichen Quellen stammen.
Kationische (Poly) peptide können auch polykationische antibakterielle mikrobielle Peptide sein.
Diese (Poly) peptide können prokaryontischen oder tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein, oder sie können chemisch oder rekombinant hergestellt werden. Die Peptide können auch zur Klasse der Defensine gehören. Sequenzen solcher Peptide kann man beispielsweise in der Antl- microbial Sequences Database unter der folgenden Internet-Adresse finden : http ://www. bbcm. univ. trieste. itl-tossi/paa1. html
Solche Wirts-Verteidigungs-Peptide oder Defensine sind auch eine bevorzugte Form des poly- kationischen Polymers gemäss der vorliegenden Erfindung.
Im Allgemeinen wird eine Verbindung, die als Endprodukt eine-vorzugsweise durch APCs (einschliesslich Dendritenzellen) vermittelte - Aktivierung (oder Niederregulierung) des adaptiven Immunsystems ermöglicht, als polykationsches Polymer verwendet.
Besonders bevorzugt für die Verwendung als polykationische Substanz bei der vorliegenden Erfindung sind von Cathelicidin stammende antimikrobielle Peptide oder Derivate davon (WO 02/13857 A2), insbesondere antimikrobielle Peptide, die aus Säuger-Cathelicidin, vorzugsweise von Mensch, Rind oder Maus, stammen, oder neuroaktive Verbindungen, wie (menschliches) Wachstumshormon (wie z. B. in WO 01/24822 A2 beschrieben).
Polykationische Verbindungen, die aus natürlichen Quellen stammen inludieren HIV-REV oder HIV-TAT (abgeleitete kationische Peptide, Antennapedia-Peptide, Chitosan oder andere Derivate von Chitin) oder andere Peptide, die von diesen Peptiden oder Proteinen durch biochemische oder rekombinante Produktion herrühren. Andere bevorzugte polykationische Verbindungen sind Cathelin oder verwandte oder abgeleitete Substanzen von Cathelin, insbesondere Maus-, Rinder- oder
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insbesondere Human-Catheline und/oder Catheiicidine. Verwandte oder abgeleitete CathelinSubstanzen enthalten die ganze oder Teile der Cathelin-Sequenz mit mindestens 15-20 Aminosäure-Resten.
Zu den Derivatisierungen können die Substitution oder Modifikation der natürlichen Aminosäuren durch Aminosäuren, die nicht zu den 20 Standard-Aminosäuren gehören, inkludieren. Ausserdem können weitere kationische Reste in solche Cathelin-Moleküle eingeführt werden. Diese Cathelin-Moleküle sind vorzugsweise mit der AntigenNakzin-Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung zu kombinieren. Diese Cathelin-Moleküle erwiesen sich jedoch überraschenderweise auch als ein Adjuvans für ein Antigen ohne den Zusatz weiterer Adjuvantien wirksam. Es ist daher möglich, solche Cathelin-Moleküle als wirksame Adjuvantiens in VakzinFormulierungen mit oder ohne weitere immunaktivierende Substanzen zu verwenden.
Eine andere bevorzugte gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendende polykationische Substanz ist ein synthetisches Peptid, das mindestens 2 KLK- Motive, getrennt durch einen Linker von 3 bis 7 hydrophoben Aminosäuren (WO 02/32451 A1) enthält.
Vorzugsweise kann das pharmazeutische Präparat gemäss der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung bestimmter herkömmlicher Vakzine durch Modifizieren dieser Vakzine mit den Ingredienzien gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise umfasst die vorliegende Zusammensetzung weiters ein Protein oder ein Peptid-Fragment, das als Adjuvans wirkt, z. B. Tetanus-Toxoid, Diphterie-Toxoid, Choleratoxin, Hitzeschock-Proteine oder funktionell aktive Fragmente davon.
Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Präparats gemäss der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Herstellung einer Vakzin-Zusammensetzung.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Zeichnungsfiguren näher veranschaulicht, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.
Fig. 1 : (A) HBV-Kern-Antigene. Eine übliche 149 AS-Seguenz, die am HBcAg und am mutierten HBcAg-149 vorhanden ist, enthielt alle bekannten B- und T-Zellen-Epitope. Nur das HBcAg baute Bakterien-DNA ein, die an die C-terminale Arg-reiche Domäne gebunden war. Die gebunde-
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Mäusen pro Gruppe 4-8 Wochen nach der Immunisierung erhalten und auf Kern-spezifische IgG-, IgG1- oder IgG2b-Serum-Antikörper In ELlSA analysiert. Die gezeigten ELISA-Daten wurden mit dem HBcAg-149-Detektions-Antigen erhalten. Die korrespondierenden IgG1/1gG2b-Antikörper- Verhältnisse wurden bestimmt.
Die Milz wurde aus immunisierten Mäusen 1-8 Wochen nach der Impfung entfernt, in vitro mit inaktivierten, HBcAg-exprimierenden Transfektanten spezifisch stimuliert und in einem kurzfristigen Cr-Freisetzungstest gegen mit HBcAg-transferierte RBL5/C-Zellen und Kontroll-RBL5 getestet. Gezeigt sind die mittleren spezifischen Lyse-Werte (von Triplikaten) bei einem EfT-Verhältnis von 20.
Fig. 2 : Immunogenität von HBV-Oberflächen-Antigen. C57BL/6-Mäuse wurden entweder mit
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die für die gemeinsame Abgabe mit Nukleotiden ausgewählt wurden, sind gezeigt. (B) ODN, das mit von HBcAg stammendem C-2-Peptid verstärkt war, rief Immunantworten hervor. B6-Mäuse wurden i. m. immunisiert : mit 5 ug HBsAg (a), mit HBsAg, gemischt entweder mit 30-100 ug C-2Peptid (b), oder mit 3 bis 30 ug ODN 1826 (c, e), oder mit 30 ug ODN 1982 (g), oder mit 3 oder 30 ug ODN, das an 30-100 ug C-2-Peptid gebunden war (d, f, h). Als Kontrolle wurden Mäuse mit BHsAg (linker Muskel) und mit 30 ug ODN 1826, das an 100 ug C-2-Peptid gebunden war (in den rechten Muskel) immunisiert (i).
HBsAg-spezifische Serum-lgG-, IgG1- und IgG2b-Antikörper und CTL wurden 2-8 Wochen nach der Immunisierung bestimmt. Gezeigt sind die Sequenzen des immunstimulierenden (ISS+) 1826-ODN und des nicht-stimulierenden (NSS) Kontroll-ODN 1982.
Fig. 4 : A) Arg-reiche Peptide verstärkten die Th1-stimulierende Kraft niedriger Dosen von ODN.
(A) BALB/c-Mäuse wurden i. m. immunisiert : mit 5 ug HBe (a), mit HBe, gemischt entweder mit
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c. immunisiert :rum-lgG-, IgG1-, IgG2a- und IgG2b-Antikörper wurden 6-12 Wochen nach der Immunisierung bestimmt.
Versuchsprotokoll
Mäuse. BALLB/cJ (H-2d) und C57BL/6 (B6) (H-2b) -Mause wurden gezüchtet und unter patho- genfreien Standard-Bedingungen in der Tierkolonie der Universität von Ulm (Ulm, Deutschland) gehalten.
Antiken-Präparate. Rekombinante HBcAg-Partikel wurden in E. coli (NF-1) unter Verwendung des Plasmids pLEH2 erzeugt. Dieses Konstrukt exprimiert HBcAg unter der Kontrolle des Bakteri- ophagen lambda pL- Promotors. Die HBcAg-149-Partikel wurden in E. coli (GI-698) unter Verwendung des Plasmids pPLC/c1-149 erzeugt. Die Expression und Reinigung des Bakterien-HBcAg wurde beschrieben2. Die an die Proteine gebundenen Nukleinsäuren wurden auf Agarose-Gel-
Elektrophorese, gefolgt von Ethidiumbromid-Färbung anatysiert. HBsAg wurde im Wirt Hansenu- la polymorpha, Stamm RB10, erzeugt. Die HBsAg-Partikel wurden von rohen Hefe-Extrakten durch Adsorption an Silikagel, Säulenchromatographie und Ultrazentrifugation gereinigt. Bakterien-HBe wurde von American Research Products (Kat. Nr. 12-3068 ; Belmont ; USA) erhalten. OVA wurde von Sigma (Kat.
Nr. A-7641 ; Deisenhofen, BRD) erhalten.
Immunisierung der Mäuse. Die Mäuse wurden intramuskulär (in beide Tibialis anteriorMuskel) oder subkutan (in die Schwanzwurzel) mit den angegebenen Dosen der rekombinanten
Proteine immunisiert. Die Antigene wurden miteinander, mit dem synthetischen immunstimulierenden (ISS) ODN 1826 TCCATGACGTTCCTGACGTT, dem nicht-stimulierenden (NSS) ODN 1982 TCCAGGACTTCTCTCAGGTT (MWG Biotech AG, Ebersberg, BRD), oder mit den synthetischen, von HBcAg/adw stammenden Peptiden RRRDRGRS (HBcAgiso. ) oder SPRRRRSQSPRRRRSQ (HBcAgl64-179) (Jerini Bio Tools, Berlin, BRD) wie beschrieben gemischt.
Bestimmung der Immunantworten. Serumproben wurden von einzelnen Mäusen durch Blutabnahmen aus dem Schwanz erhalten. Antigen-spezifische IgG-, IgG1-, IgG2b- und IgG2a-Serum- Antikörper wurden durch Endpunkt-Verdünnungs-ELISA-Test unter Verwendung der relevanten Detektions-Antigene, wie beschrieben9, bestimmt. Th1-"biased" IgG2b-Antikörper in C57BU6- Mäusen und igG2a-Antikörper in BALB/c-Mäusen wurden bestimmt. Antigen-spezifische CTL wurden mittels 1Cr-Freisetzungs-Tests gegen Antigen-exprimierende und nicht-transferierte Ziel- Zellen, wie beschrieben4, nachgewiesen.
Ergebnisse und Diskussion
Das HBcAg-System hat den Vorteil, dass der Adjuvans-Effekt der Arg-reichen Motive direkt unter Verwendung von gentechnisch erzeugten Varianten des Antigens, die diese Domäne nicht enthalten, getestet werden kann. Die HBcAg- und HBcAg-149-Partikel haben die N-terminale 149Reste-Sequenz gemeinsam, sie unterscheiden sich jedoch in der C-terminalen NukleinsäureBindungs-Domäne (Fig. 1A). Bei Herstellung in Bakterien enthält HBcAg, jedoch nicht HBcAg-149, 5-20 ng RNA pro ug Protein (Fig. 1A). Eine einzige Injektion von HBcAg (in PBS ohne Adjuvans) in Mäuse rief hohe Titer von HBcAg-spezifischen Serum-IgG2b-Antikörpem hervor; das IgG1/lgG2b-Verhèlltnis dieser Antikörper-Reaktion war < 0, 3 (Fig. 1B, Gruppe a).
CD4+ T-Zellen, die durch Impfung mit HBcAg"geprimt"waren, setzten nach Restimulation mit Antigen4 grosse Mengen an IFN#, jedoch geringen Mengen an IL4 frei. In Mäusen, die mit HBcAg-149 immunisiert waren, wurden niedrigere Titer von HBcAg-spezifischen Serum-lgG-Antikörpern induziert, die vorwiegend zur IgG1-Unterklasse gehörten () gG1/) gG2b-Verhä) tnis > 20) (Fig. 1B, Gruppe b). Es konnte kein Hervorrufen von HBcAg-spezifischen CTL-Reaktionen durch Injektion von exogenem HBcAg3 festgestellt werden, nicht einmal bei Anwesenheit von immunstimulierendem ODN5 (Fig. 1B).
Natives, jedoch nicht mutiertes HBcAg ruft Th1-Reaktionen hervor (Fig. 1B), und diese intrinsische Th1-fördernde Adjuvans-Aktivität hängt vom Vorhandensein der Arg-reichen Domäne ab. Somit kann diese Adjuvans-Aktivität die Immunogenität nicht-verwandter Antigene, mit weichen HBcAg gemeinsam geliefert wird, verstärken und/oder modulieren.
HBcAg, das mit HBsAg oder OVA gemischt ist, "primt" spezifische Th1-lmmunität und CTL-Reaktionen gegen beide Antigene auf wirksame Weise
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Spezifische IgG1-Serum-Antikörper-Reaktionen wurden wirksam bei Mäusen"geprimt", wet- chen HBsAg ohne Adjuvantien injiziert wurde (Fig. 1C, Gruppe a).
Ein neuer endolysosomaler Prozessierungsweg für exogenes HBsAg wurde beschrieben, welcher L"-und Kb-bindende Peptide für immunogene Präsentations-CD8+ erzeugt. CTL-Reaktionen auf HBsAg werden durch Impfung von BALB/c (H-2d), jedoch nicht von B6- (H-2b) -Mäusen mit HBsAg ohne Adjuvantien"geprimt" Das Primen spezifischer CTL-Reaktionen durch HBsAg erfordert eine CD4+-T-Zellen-Hilfe und eine IL 12-Reaktivität. Mischen von HBsAg mit CpG-enthaltendem ODN (Flg.
2, Gruppe b) vor der Injektion verschob die Th2-"bias" der hervorgerufenen Immunantwort zur Th1 hin und erleichterte die Induktion von CTL-Reaktionen auf HBsAg bei B6-Mäusen6'9. Die Immunisierung von B6Mausen mit HBsAg ist daher ein geeignetes System, um Adjuvantien auf Th1- und CTL-fördernde Aktivität zu testen.
Es wurde dann getestet, ob die intrinsische, Th1-fördernde Aktivität von HBcAg das Primen der Th1-Reaktionen auf gemeinsam gelieferte HBsAg-Partikel erleichtert, indem diese vor der Injektion in B6-Mäuse entweder mit HBcAg (enthaltend bakterielle RNA) (Fig. 2, Gruppe d) oder mit mutiertem HBcAg-149 (Fig. 2, Gruppe c) gemischt wurden. Die gemeinsame Abgabe mit HBcAg, jedoch nicht mit HBcAg-149, erhöhte die HBsAg-spezifischen IgG2b-Serum-Antikörper-Titer ganz wesentlich (IgG1/IgG2b-Verhältnis < 1) (Fig. 2, Gruppen c, d). Ausserdem erleichterte ein gemeinsam abgegebenes HBcAg die Erzeugung von HBsAg-spezifischem CTL in B6-Mäusen (Fig. 2, Gruppen c, d).
Die intrinsische Adjuvans-Aktivität von HBcAg kann somit die Immunantwort eines nicht verwandten Antigens, mit welchem es gemeinsam abgegeben wird, verstärken und modulieren Die intrinsische Th1-fördernde Adjuvans-Aktivität von HBcAg wurde isoliert und als'natürliches' Adjuvans bei Impf-Ansätzen verwendet.
Arg-reiche Peptide, die mit immunstimulierendem ODN beladen sind, sind starke Adjuvantien bei gemeinsamer Abgabe mit Antigenen
Zwei Arg-reiche Peptid-Motive, die am C-Terminus von HBcAg vorhanden sind, wurden synthetisiert (Fig. 3A) : das Peptid C-1 (HBcAg1so-157 : RRRDRGRS) und das Peptid C-2 (HBci-ive SPRRRRSQSPRRRRSQ).
Die Th1-Adjuvantizität von ODN wurde verglichen, wenn sie entweder in freier Form mit HBsAg agegeben oder als Peptid/ODN-Komplexe mit HBsAg abgegeben wurden (Fig. 3B) Eine einzige Injektion von HBsAg, gemischt mit > 100 ug/Maus C-2-Peptid verstärkte die HBsAg-spezifische IgG1-Antikörper-Reaktion leicht, veränderte jedoch nicht ihr IgG1/1gG2b-
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entwickelten sie eine Dosis-abhängige Th1-lmmunität (Fig. 3B, Gruppen c, e).
Am meisten fiel auf, dass B6-Mäuse, die mit HBsAg, gemischt mit C-2-Peptid-gebundenem ODN 1826, immunisiert wurden, 10-20fach höhere Serum-anti-HBSAg-Antikörper-Titer entwickelten, sie zeigten eine deutliche Verschiebung ihrer spezifischen Antikörper-Reaktion hin zu einem Vorherrschen der IgG2b-Antikörper, und sie entwickelten leicht detektierbare HBsAg-spezifische CTL-Reaktionen (Fig. 3B, Gruppen d, f). Verstärkte Th1-lmmunantworten wurden ebenfalls beobachtet, wenn Hepatitis B-Prä-Kern-Antigen (HBe)1 oder OVA als Test-Antigene verwendet wurden, die gemeinsam mit niedrigen Dosen von ODN 1826, das auf Arg-reiche Peptide geladen war, abgegeben wurden (Fig. 4A, B). Bei Mäusen, die mit HBe oder OVA (ohne Adjuvantien) immunisiert worden waren, wurde eine Th2-lmmunität induziert (Fig. 4, Gruppen a, e).
Wenn die Antigene mit suboptimalen Dosen von freiem ODN 1826 (5 ug/Maus) oder mit ODN 1826, das auf C-2-Peptid geladen war, gemischt wurden, verschoben sich die induzierten Serum-Antikörper-Reaktionen zu Th1 hin (Fig. 4). In den Antigen-ODN/Peptid-Gruppen (Fig. 4, Gruppen d, h) wurden jedoch 10-15fach verstärkte Immunantworten beobachtet. Die Adjuvans-Wirkung des C-2-Peptid/ODN erforderte die gemeinsame Abgabe von Komplexen, die vor der Injektion mit dem Antigen vorgebildet worden waren. Es wurde keine Adjuvans-Wirkung nachgewiesen, wenn HBsAg In das rechte Bein und C- 2-Pep-tid/ODN 1826 in das linke Bein injiziert wurde (Fig. 3B, Gruppe i). ODN, das an Arg-reiche Peptide gebunden ist, amplifiziert somit die Adjuvans-Wirkung freier ODNs ganz auffallend.
Sehr ähnliche Wirkungen wurden beobachtet, wenn ODN mit kationischen Liposomen abgegeben wurden. Folglich können Arg-reiche Peptide nicht nur die Adjuvans-Stärke kleiner ODN verstärken (Fig. 3,4), sondern auch die grosser Plasmid-DNA oder des RNA-Analogons, Po) y-)/C.
Kationische Peptide, die an Antigene gekoppelt sind, oder die für das Antigen intrinsisch sind, erleichtern deren Eindringen in Antigen-prasentierende Zellen. Die Aufnahme des tat-Proteins von
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HIV-1 durch Zellen erfordert dessen hoch basische Aminosäure-Sequenz RKKRRQRRR, die ähnlich ist den bei dieser Untersuchung verwendeten Sequenzen RRRDRGRS (C-1) oder SPRRRRSQSPRRRRSQ (C-2) von HBV, und den Polyarginin-Homopolymeren, die auch wirksam in Zellen eindringen. Eine verbesserte Antigen-Aufnahme alleine erklärt ihre Adjuvans-Aktivität nicht, weil diese von immunstimulierenden Nukleinsäuren, die an diese Peptide gebunden sind, abhängt.
Die Bindung von Nukleinsäuren an kationische Peptide kann diese vor einem Abbau durch Nukleasen während der extrazellulären Phase schützen, ihre Aufnahme durch die Zellen erleichtern, und ihre Abgabe an ein endolysosomales Kompartiment lenken. Es wurde gezeigt, dass das Auslösen der Adjuvans-Wirkung auf ein ODN von unspezifische Endocytose, endosomaler Reifung und Stress-Kinase-Aktivität abhängt. Somit kann der Schutz vor einem Abbau und die gezielte Abgabe einer kritischen Menge an ODN an Vesikel, in welchen sie aktivierende Rezeptoren"triggern"können, für die Steigerung der Stärke der ODN-Adjuvans-Wirkung durch kationsche Peptide von kritischer Bedeutung sein.
Literaturstellen
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9. Schirmbeck et al., Int. Immunol. 11,1093-1102 (1999).
PATENTANSPRÜCHE :
1. Pharmazeutisches Präparat, umfassend - das Peptid TTTWRRRDRG RSPRRRTPSP RRRRSQSPRR RRSQRESQC oder ein das
Peptid SPRRRRSQSPRRRRSQ oder das Peptid RRDRGRS aufweisendes Fragment da- von und - ein Antigen.