DE60131432T2 - Hiv-peptide aus tat-, rev- und wef-konservierten regionen und deren anwendung z.b. als impfstoffkomponenten - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide basierend auf konservierten Regionen der regulatorischen HIV-Proteinen, Antigene in freier oder Träger-gebundenen Form, umfassend mindestens eines der genannten Peptide, Vaccinzusammensetzungen, enthaltend wenigstens eines der Antigene, Immunoassay-Kits und ein Verfahren zum Detektieren von Antikörpern, hervorgerufen durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) oder HIV-spezifische Peptide, unter Verwendung solcher Antigene.
• Hintergrund
• Das menschliche Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), der Erreger des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) stellt weiter eine enorme Herausforderung an die Gesundheit in Entwicklungsländern dar. In der westlichen Welt haben therapeutische Strategien, welche auf die HIV-1-Replikation und -Reifung zielen, einen herausragenden Einfluss auf den Krankheitsverlauf gehabt. Die hohen Kosten der gegenwärtigen Behandlung, die hohe Toxizität der Medikamente und das Fehlen einer Heilung bedeuten jedoch, dass die Entwicklung von sicheren und wirksamen Impfstoffen vorrangig für die Kontrolle von AIDS-Pandemien bleibt.
• HIV-1 ist ein komplexes Retrovirus, das für sechs regulatorische und Hilfsgene kodiert, welche in einfachen Retroviren nicht gefunden werden, nämlich tat, rev, nef, vif, vpr und vpu (Tabelle 1). In eukaryotischen Zellen werden nur vollständig gespleiste mRNA-Stücke zum Zytoplasma für die Translation exportiert. Nicht gespleiste oder teilweise gespleiste RNA-Stücke werden zurückgehalten und schließlich im Kern (Nukleus) abgebaut. Auf diesem Wege werden Proteine, die durch tat-, rev- und nef-Gene kodiert werden (als Tat, Rev und Nef bezeichnet), die sich aus vielfach gespleisten RNA-Spezies ableiten, zuerst exprimiert und bilden eine frühe HIV-1-Gen-Expression. Um einfach gespleiste RNA-Stücke zu exprimieren und weiterhin das ungespleiste RNA-Genom in voller Länge in das Zytoplasma zum Verpacken zu transportieren, hat HIV-1 ein Mittel entwickelt, um die Einschränkungen des RNA-Transportes zu überwinden. Die regulatorischen Proteine, Tat und Rev, sind für die HIV-1 Replikation essentiell, da Mutationen in diesen Proteinen die HIV-1 Produktion elimi nieren (Dayton A. I. et al. (1986) Cell, 44:941-947 und Fisher, A. G., et al. (1986) Nature, 320:367-371).
• Die Hilfsgene leiten sich von Exons ab, die vollständig stromaufwärts (upstream) auf dem HIV-1 Envelope-Gen positioniert sind, z. B. vif oder von Exons sowohl stromaufwärts als auch innerhalb env aber in unterschiedlichen Leserahmen, z. B. tat, rev. Die Effizienz des teilweise Spleisens reguliert die Niveaus der Genexpression der verschiedenen Hilfsproteine:
  Der Integrierung von HIV-1 proviraler DNA folgend, werden vorwiegend gekürzte Formen der mRNA durch die zelluläre RNA-Polymerase II synthetisiert, welche mit Stellen auf der 5' long terminal repeat (LTR) der proviralen DNA interagiert. Tat ist eines der ersten Gene, welches exprimiert wird, und trägt ein Kernlokalisierungssignal. Es ist ein potenter Transkriptionsaktivator, welcher die LTR-gerichtete Transkription bis um das 1000-fache erhöht. Eine kontinuierliche Expression von Tat sichert eine positive Rückkoppelungsschleife für einen kontinuierlich hohes Niveau der Genexpression. Im Gegensatz zu konventionellen Transkriptionsaktivatoren, welche mit DNA-Sequenzen interagieren, bindet Tat direkt an die 5'-Enden aller HIV-1 RNA-Stücke an einer spezifischen sekundären Haarnadelstruktur, TAR (transactivating response element). Die Struktur der Schlaufe ist hochkonserviert und essentiell für die Tat-Funktion. Die Struktur der Tat/TAR-Interaktion wurde unter Verwendung der Kernspinresonanz (NMR) analysiert (Puglisi et al. (1992) Science, 257:76-80). Tat bindet TAR in Verbindung mit dem zellulären Protein, Cyclin T, welches wiederum CDK9 bindet, das die C-terminale Domäne der RNA-Polymerase II phosphoryliert, wodurch die Verlängerung des RNA-Transkripts gefördert wird. Diese zellulären Tat-Cofaktoren sind nur in aktivierten Zellen vorhanden, ihre Abwesenheit unterdrückt die Transkription der proviralen DNA, welches in einen „quasi latenten Zustand" in T-Lymphozyten resultiert.
• Tat wird von zwei Exons exprimiert, wobei sowohl das Kernlokalisierungssignal und die TAR-Bindungsregion im ersten Exon lokalisiert sind. Tat wird aus infizierten Zellen sekretiert und kann heterologe Effekte auf benachbarte Zellen ausüben. Dies beinhaltet eine zelluläre Aktivierung (Hofmann et al. (1993) Blood, 82:2774-2780), Induzierung einer zellulären Apoptose (Macho et al. (1999) Oncogene, 18:7543-7551.1999), die Funktion als ein sekretierbarer Wachstumsfaktor (Trinh, D.P. et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun., 256:299-306) und Modulieren der Gastzellproteinsynthese zugunsten der viralen Proteinsynthese (Xiao et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun., 244:384-389.1998). Therapeutische Strategien, die Tat zum Ziel haben, werden daher einen starken Einfluss auf die HIV-1 Infektion haben.
• Die kleinen, mehrfach gespleisten mRNA-Stücke, die für Tat, Rev und Nef kodieren, herrschen während der frühen Phase nach der Infektion vor. Wenn ein Schwellenwert von Rev hergestellt ist, reichern sich nicht gespleiste und einfach gespleiste RNA-Stücke im Zytoplasma für die Translation an, welches der erfolgreichen Infektion erlaubt, voranzuschreiten. Ein Versagen in der Herstellung des Schwellenwerts von Rev kann zu einer Quasilatenz von HIV beitragen. Rev kann nur an RNA-Stücke binden, welche eine RNA-Struktur, RRE (Rev responsive element), tragen, welches in der env-Kodierungsregion des Genoms lokalisiert ist. Rev interagiert mit dem RRE als ein Multimer durch eine basische Arginin-reiche Region, die in der aminoendständigen Hälfte des Proteins vorhanden ist. Eine Konsequenz dieser Interaktion ist der Transport von teilweise gespleisten RNA-Stücken, welche Genprodukte wie Env, Vif, Vpu und Vpr zur Verfügung stellen werden, sowie von nicht-gespleisten RNA-Stücken, welche als neue Genome zur Einfügung in sich aufbauende Partikeln dienen werden. Eine Strukturanalyse der Rev/RRE Interaktion wurde ebenfalls unter Verwendung von NMR ausgeführt (Battiste et al. (1996) Science, 273:1547-1551.1996). Rev trägt ein Leucinreiches Exportsignal, welches erlaubt, dass es zwischen dem Kern und dem Zytoplasma für einen kontinuierlichen Transport der neu synthetisierten RNA-Stücke hin und her pendelt (Kailand et al. (1994), J. Virol., 68:1475-1485; Meyer & Malim, (1994) Genes Dev., 8:1538-1547). Auf diese Weise sichert Rev, dass die strukturellen Gene spät nach den regulatorischen Genen exprimiert werden. Therapeutische Strategien, die gegen Rev gerichtet sind, werden den viralen Lebenszyklus früh in der Infektion unterbrechen.
• Obwohl er ursprünglich als ein Negativfaktor beschrieben wurde, wurde später gezeigt, dass Nef positive Wirkung auf die Virusreplikation aufweist und in größerer Anzahl als Tat und Rev exprimiert wird, sowohl früh als auch während der Infektion. Nef ist am N-terminalen Ende myristyliert und mit der inneren Seite der Plasmamembran verbunden. Nef ist teilweise für die Runterregulierung und Abbau des Oberflächen-CD4 durch Endozytose verantwortlich (Piguet et al. (1998) EMBO J., 17:2472-2481). Das Entfernen von CD4 von der Zelloberfläche verhindert die Superinfektion mit anderen HIV-1 Stämmen oder die Reinfektion mit neu freigesetztem Virus. Nef ist auch für die Runterregulierung der MHC-Klasse I verantwortlich, wodurch infizierte Zellen vor der Zerstörung durch zytotoxische T-Lymphozyten geschützt werden (Le Gall et al. (1997), Res. Virol., 148:43-47). Nef ist kein essentielles virales Prote in, da es nicht für die in vitro Infektion von peripheren Blutlymphozyten oder T-Zelllinien benötigt wird. Nef-Deletionsmutanten sind jedoch über einen längeren Zeitraum weniger pathogen. Nef hat weiterhin komplexe Wirkungen auf die Signalübertragungswege in der Zelle und enthält eine Prolin-reiche Region, die mit der SH3-Domäne von Kineasen, die in der T-Zellaktivierung involviert sind, interagieren kann, ein Merkmal, welches für die effiziente HIV-Replikation wichtig ist (Moarefi et al. (1997), Nature, 385:650-653). Viren, die Nef enthalten, sind zu einer höheren viralen DNA-Synthese in der Lage als Viren, in welchen das Nef-Gen zerstört wurde, was darauf hinweist, dass Nef direkt oder indirekt die virale Reverstranskriptase aktiviert. Das niedrige Niveau von Nef verbunden mit Virionen kann für diese Phänomen verantwortlich sein. Niedrige Niveaus von Nef werden auch von infizierten Zellen freigesetzt, obwohl der mögliche Effekt auf benachbarte Zellen nicht klar ist. Da Nef am Anfang einer Infektion exprimiert wird und signifikante Wirkung auf die CD4- und MHC-Klasse I-Expression sowie auf das Fortschreiten der Krankheit hat, stellt es ein wichtiges Ziel für zukünftige therapeutische Strategien dar.
• Tat und Nef werden sekretiert und können durch Makrophagen aufgenommen werden und in Verbindung mit MHC-Klasse-II-Molekülen exprimiert werden. Dies verbessert ihre Eignung als Ziele für Peptid-basierende Therapien, welche ebenso im Kontext der MHC Klasse II exprimiert werden würden.
• Es ist offenkundig, dass dem Targeting von frühen Genprodukten, die für die HIV-1 Replikation essentiell sind, wie Tat und Rev, zusätzlich zu Nef, welches ebenso in einem frühen Anfangsstadium exprimiert wird und den Krankheitsverlauf beeinflusst, Priorität beigemessen werden sollte. Tabelle 1 HIV-1 regulatorische und Hilfsproteine

  Gen	Protein	Name	Expression	Lokalisierung	Funtionen
  Tat	Tat	Transaktivator der viralen Transkription	früh	Nukleus	Aktiviert virale Transkription. Wird aus infizierten Zellen sekretiert, wo es T-Zellen aktivieren kann, induziert Apoptose und fungiert als ein Wachstumsfaktor.
  Rev	Rev	nuklearer RNA Exportfaktor	früh	Nukleolus, Nukleoplasma, Zytoplasma	Reguliert das Spleissen/RNA-Transport zum Zytoplasma. Ein Shuttle-Protein.
  Nef	Nef	viele Effektorfunktionen	früh	Zytoplasma, Membranverbunden, Virionen	Triggert CD4 Endozytose, reguliert die MHC Klasse 1 Expression herunter. Bindet an Kinasen und kann die T-Zell-Signalleitung und Aktivierung beeinflussen.
  Vpu	Vpu	virales Protein u	spät	Zytoplasma, Membranverbunden	Triggert intrazellulären CD4 Abbau, reguliert die MHC Klasse 1 herunter, nichtspezifischer Promotor von retroviraler Partikelfreisetzung.
  Vif	Vif	viraler Infektionsfaktor	spät	Zytoplasma, Membranen Virionen	erhöht das Infektionspotential von viralen Partikeln in einer zellabhängigen Weise. Verbessert die Synthese der viralen DNA während der reversen Transkription.
  Vpr	Vpr	virales Protein r	spät	vorwiegend Nukleus Virionen	Trägt zum nuklearen Import von preintegrierten Komplexen bei. Hält Zellen in derG2/M Phase des Zellzyklus fest.

• Natürlich vorkommende HIV-Sequenzen in Impfstoffkandidaten sind nicht in der Lage, eine stabile Langzeitimmunantwort zu stimulieren aufgrund der inhärenten Fähigkeit von HIV sich zu verbergen, indem das Erscheinungsbild der Epitope, wie sie sich dem Immunsystem darstellen, geändert wird. Um diese variable Präsentation der Epitope zu überkommen, werden bestimmte Aminosäuresubstitutionen und Aminosäurekombinationen das Immunsystem unterstützen, um diese fremden Virusantigene in einer verlässlichen Weise zu präsentieren und zu erkennen, und dies so in einem größeren Ausmaß.
• Basierend auf dem obigen Hintergrund entschieden wir uns, die Möglichkeit der Konzeption von neuen synthetischen Peptide zu untersuchen, welche die Epitope von den regulatorischen und Hilfs-HIV-Proteinen in einer solchen Weise nachahmen können, dass sie sowohl dem humoralen als auch dem zellulären Teil des Immunsystems ausgesetzt werden können, um das Bedürfnis nach einem effektiven therapeutischen und/oder prophylaktischen Impfstoff zu erfüllen.
• Die anfängliche Arbeit basierte auf den nativen Tat-Aminosäure-Sequenzen, die von Korber B. et al., Human Retroviruses and AIDS 1997 Verleger Theoretical Biology and Biophysis Group, Los Alamos National Laborstory, Los Alamos, NM publiziert worden sind. Das erste Tat-Epitop ist zwischen Aminosäure 1 und Aminosäure 24 des Tat-Proteins lokalisiert: Tabelle 2 Tat-Epitop

  AS Nr.	Natürlich vorkommende Aminosäuren
  1	MS
  2	EDV
  3	SQPLVA
  4	VI
  5	DN
  6	PHA
  7	RNSKED
  8	LIQRVMT
  9	EDP
  10	PS
  11	W
  12	KNEHL
  13	HRQ
  14	P
  15	GP
  16	SNA
  17	QKT
  18	PH
  19	KTSARPEQ
  20	TAI
  21	APDV
  22	CS
  23	TNS
  24	NKRQAPT

• Der Ein-Buchstabe-Code sowie die Drei-Buchstaben-Codes definieren die Aminosäuren in den Sequenzen, wie sie dieser Beschreibung durchgehend gegeben sind, in Übereinstimmung mit den internationalen Standards und wie sie in Textbüchern, z. B. Lehninger A.L., „Principles of Biochemistry", Worth Publishers Inc., New York, 1982 verwendet werden. Die Aminosäuren, die rechts von der linken Spalte angegeben werden, stellen die natürliche Variation der Sequenz dar. Unsere Analysen resultierten in einer Sequenz, die dieses modifizierte Epitop enthalten:

  
• Worin NI eine 2-Aminohexansäure bedeutet (Norleucin, abgekürzt Nle und NI im Drei-Buchstaben- bzw. Ein-Buchstaben-Code) und die Cysteinreste im oxidierten Zustand vorliegen, d. h. eine Disulfidbrücke innerhalb der Kette bilden. Da der Cysteinrest am C-terminalen Teil (in Position 22) des Peptids Teil einer intramolekularen Disulfidbindung außerhalb des ausgewählten Epitops ist, wird eine ähnliche Disulfidbindung innerhalb des Peptids durch Einfügen eines Cysteins im N-terminalen Teil des ausgewählten Epitops gebildet. Eine weitere Alternative ist die Bildung einer intermolekularen Disulfidbindung durch Dimerisation der Sequenzen:

  
• Eine weitere Alternative ist die Dimerisation mit einem anderen Epitop ausgewählt aus Tat. Das zweite Epitop auf Tat ist zwischen Aminosäure 35 und 57 in C-terminaler Richtung lokalisiert, getrennt vom ersten Epitop durch 10 Aminosäuren enthaltend 5 Cys-Reste zusätzlich zu den Cys-Resten in jedem der Epitope. Die relativ hohe Anzahl an Cys-Resten bietet eine Vielzahl an inter- und intramolekularen Vernetzungsmöglichkeiten. Es ist wahrscheinlich, dass diese Cys-reiche Domäne die immunologische Exposition dieses Proteins dominiert und daher ein „Verstecken" der zwei relevanten Epitope verursacht. Auswahl und Modifizierung der zwei benachbarten Epitope kann einen wesentlichen Teil des Tat-Proteins auf bessere Art und Weise exponieren.
• Um die Wahrscheinlichkeit für die Entwicklung von Fluchtmutanten zu reduzieren, wird die Anzahl an Epitopen weiter erhöht und zwei zusätzliche Peptidsequenzen wurden ausgewählt. Diese Sequenzen sind auf Rev (Reste 58–78) und Nef (Reste 65–85) lokalisiert. Die nativen Sequenzen wurden in Human Retroviruses and AIDS 1999; A Compilation and Ana lysis of Nukleic Acid and Amino Sequences, Herausgeber Theoretical Biology and Bio physics Group, Los Alamos National Laborstory, Los Alamos, publiziert: Tabelle 3 Tat-Epitop

  AS Nr.	Natürlich vorkommende Aminosäuren
  35	QPILTYV
  36	VACL
  37	C
  38	F
  39	ILQMT
  40	TNKR
  41	KQ
  42	GA
  43	L
  44	GS
  45	I
  46	SFY
  47	YN
  48	G
  49	RKS
  50	K
  51	K
  52	R
  53	RKSG
  54	QRP
  55	R
  56	R
  57	RGS

  Tabelle 4 Rev-Epitop

  AS Nr.	Natürlich vorkommende Aminosäuren
  58	RWQ
  59	IVLF
  60	LIP
  61	GSNDCVTAR
  62	TADNS
  63	YCFRHSVL
  64	LV
  65	GH
  66	RG
  67	SPFL
  68	ATEQVPS
  69	EKQDN
  70	PSAN
  71	VNGP
  72	PQHSLRTDI
  73	LFV
  74	QLPHDE
  75	L
  76	P
  77	PLE
  78	LIVP

  und das Tabelle 5 Nef-Epitop

  AS Nr.	Natürlich vorkommende Aminosäuren
  65	EGDS
  66	NGDE
  67	EV
  68	AG
  69	LF
  70	P
  71	IV
  72	TRKAM
  73	P
  74	QH
  75	VLI
  76	P
  77	LVT
  78	R
  79	P
  80	MVI
  81	TD
  82	YFR
  83	KR
  84	AGSEQ
  85	ASV

• Verschiedene modifizierte Peptide wurden synthetisiert, um die Einzigartigkeit der Sequenzen sowie ihre Eigenschaften zur Stimulierung des Immunsystems in Kombination mit ihrer Spezifizität und Empfindlichkeit als HIV-1 Antigene zu bestimmen.
• Beschreibung der Erfindung
• Die identifizierten Peptide stammen von den vier unterschiedlich konservierten Bereichen der HIV-1 Tat-, Rev- und Nef-Proteinen ab, welche oben beschrieben werden, und welche die Eigenschaften der Beibehaltung der Einzigartigkeit (Immunogenität, Empfindlichkeit und Spezifizität) der HIV-1 Epitope aufweisen. Weiterhin besitzen die neu identifizierten Peptide keinen bekannten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) antagonistischen Effekt und sollen mindestens ein potentielles CTL Epitop haben.
• Die erfindungsgemäßen Peptide, welche die oben genannten Kriterien erfüllen, umfassen mindestens eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist unter folgender Gruppe von Aminosäuresequenzen:
  Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Leu Glu Pro Trp Xaa₁₂ His Pro Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ Xaa₂₄ (SEQ ID NO: 1)
  worin die Aminosäuren der Kette die folgenden Bedeutungen besitzen:
  Xaa in Position 1 des Peptidderivats steht für Met, Ser, Cys oder fehlt,
  Xaa in Position 2 des Peptidderivats steht für Glu, Asp, Val, Ser oder fehlt,
  Xaa in Position 3 des Peptidderivats steht für Ser, Gln, Pro, Leu, Val, Ala, Trp, Tyr oder Phe,
  Xaa in Position 4 des Peptidderivats steht für Val oder Ile,
  Xaa in Position 5 des Peptidderivats steht für Asp, Asn oder Ile,
  Xaa in Position 6 des Peptidderivats steht für Pro, His oder Ala,
  Xaa in Position 7 des Peptidderivats steht für Arg, Asn, Ser, Lys, Glu oder Asp,
  Xaa in Position 12 des Peptidderivats steht für Leu, Ile oder Nle,
  Xaa in Position 15 des Peptidderivats steht für Gly oder Pro,
  Xaa in Position 16 des Peptidderivats steht für Ser, Asn oder Ala,
  Xaa in Position 17 des Peptidderivats steht für Gln, Lys oder Thr,
  Xaa in Position 18 des Peptidderivats steht für Pro oder His,
  Xaa in Position 19 des Peptidderivats steht für Lys, Thr, Ser, Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, Ile oder Nle,
  Xaa in Position 20 des Peptidderivats steht für Thr, Ala oder Ile,
  Xaa in Position 21 des Peptidderivats steht für Ala, Pro, Asp oder Val,
  Xaa in Position 22 des Peptidderivats steht für Cys oder Ser,
  Xaa in Position 23 des Peptidderivats steht für Thr, Asn oder Ser,
  Xaa in Position 24 des Peptidderivats steht für Asn, Lys, Arg, Gln, Ala, Pro oder Thr,
  wobei die terminalen Enden der Sequenzen freie Carboxyl- oder Aminogruppen, Amide, Acyle, Acetyle oder Salze davon sein können,
  weiterhin zwei oder mehrere der Cys-Reste Teil einer innerkettigen oder interkettigen Disulfidbindung (d. h. einer Disulfidbindung innerhalb einer Kette oder zwischen Ketten), einer -S-(CH₂)_p-S- oder einer -(CH₂)_p-Brücke sein können,
  worin p = 1–8 und gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome, wie O, N und S unterbrochen ist und/oder wobei diese Peptidsequenzen auf einem festen Träger immobilisiert sind.
• Weitere identifizierte Peptide beinhalten
  Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Phe Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ -Z- Tyr Xaa_i Gly Xaa₁₅ Lys Lys Arg Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ (SEQ ID NO: 4)
  worin die Aminosäuren der Kette die folgenden Bedeutungen besitzen;
  Xaa in Position 1 des Peptidderivats steht für Pro, Ile, Leu, Thr, Tyr oder Val
  Xaa in Position 2 des Peptidderivats steht für Val, Ala, Cys, Leu
  Xaa in Position 3 des Peptidderivats steht für Cys, Ile, Leu, Val oder Nle
  Xaa in Position 5 des Peptidderivats steht für Ile, Leu, Gln, Met oder Thr
  Xaa in Position 6 des Peptidderivats steht für Thr, Asn, Lys oder Ara
  Xaa in Position 7 des Peptidderivats steht für Lys, Arg oder Gln
  Xaa in Position 8 des Peptidderivats steht für Gly oder Ala
  Xaa in Position 9 des Peptidderivats steht für Leu oder Ile
  Xaa in Position 10 des Peptidderivats steht für Gly, Ser oder Ala
  Xaa in Position 11 des Peptidderivats steht für Ile oder Gly
  Xaa in Position 12 des Peptidderivats steht für Ser, Phe oder Tyr
  Xaa_i eingefügt vor Position 14 des Peptidderivat steht für Leu, Ile, Nle
  Xaa in Position 15 des Peptidderivats steht für Arg, Lys, Ser oder Citrullin (Cit)
  Xaa in Position 19 des Peptidderivats steht für Arg, Lys, Ser, Gly oder Cit
  Xaa in Position 20 des Peptidderivats steht für Gln, Arg oder Pro
  Xaa in Position 21 des Peptidderivats steht für Ile oder Ieu
  Xaa in Position 22 des Peptidderivats steht für Gly, Leu, Ile, Cys oder fehlt
  Xaa in Position 23 des Peptidderivats steht für Gly oder fehlt
  worin die Sequenz von SEQ ID NO: 4 mindestens sechs nacheinander folgende Aminosäuren umfasst, -Z- ein optionaler Linker ist und die Bedeutung PEG, modifiziertes PEG und/oder [Gly]_n besitzt, worin n = 1, 2 oder 3,
  weiterhin können zwei oder mehr der Cys-Reste Teil einer Disulfidbindung innerhalb einer Kette oder zwischen Ketten sein, eine -S-(CH₂)_p-S- oder einer -(CH₂)_p-Brücke, worin p = 1–8, gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome, wie O, N oder S, unterbrochen,
  Xaa₁ Ile Leu Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Leu Gly Arg Xaa₁₀ Xaa₁₁-Z-Xaa₁₂ Leu Xaa_i Xaa_i Xaa₁₄ Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Leu Pro Pro Leu (SEQ ID NO: 7)
  worin Xaa in Position 1 des Peptidderivats steht für Phe, Tyr, Trp oder Arg
  Xaa in Position 4 des Peptidderivats steht für Gly, Ser, Asn, Asp, Cys, Val, Thr, Ala oder Arg
  Xaa in Position 5 des Peptidderivats steht für Thr, Ala, Asp, Asn oder Ser
  Xaa in Position 6 des Peptidderivats steht für Tyr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Val oder Leu
  Xaa in Position 10 des Peptidderivats steht für Ser, Pro, Phe, Leu oder Ile
  Xaa in Position 11 des Peptidderivats steht für Ala, Thr, Glu, Gln, Val, Pro oder Ser
  Xaa in Position 12 des Peptidderivats steht für Glu, Lys, Gln, Asp, Asn, Tyr, Trp oder Phe
  Xaa_i eingefügt nach Position 13 des Peptidderivats steht für Ser, Pro, Phe, Leu oder Ile
  Xaa_i eingefügt vor Position 14 des Peptidderivats steht für Ala, Thr, Glu, Gin, Val, Pro oder Ser
  Xaa in Position 14 des Peptidderivats steht für Glu, Lys, Gln, Asp oder Asn
  Xaa in Position 15 des Peptidderivats steht für Pro, Ser, Ala oder Asn
  Xaa in Position 16 des Peptidderivats steht für Val, Asn, Gly oder Pro
  Xaa in Position 17 des Peptidderivats steht für Pro, Gln, His, Ser, Leu, Arg, Thr, Asp oder Ile
  Xaa in Position 18 des Peptidderivats steht für Leu, Phe oder Val
  Xaa in Position 19 des Peptidderivats steht für Gln, Leu, Pro, His, Asp oder Glu
  worin die Sequenz von SEQ ID NO: 7 aus mindestens sechs nacheinander folgenden Aminosäuren besteht, der Linker -Z- optional ist und die Bedeutung PEG, modifiziertes PEG und/oder [Gly]_n besitzt, worin n = 1, 2 oder 3,
  Xaa₁ Leu Val Gly Xaa₅ Pro Xaa₇ Xaa₈ Pro Xaa₁₀ Xaa₁₁ Pro-Z-[Arg]_m Xaa_i Xaa₁₃ Xaa₁₄ Pro Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ (SEQ ID NO: 10)
  worin Xaa in Position 1 des Peptidderivats steht für Lys oder Arg
  Xaa in Position 5 des Peptidderivats steht für Phe oder Leu
  Xaa in Position 7 des Peptidderivats steht für Ile oder Val
  Xaa in Position 8 des Peptidderivats steht für Thr, Arg, Lys, Ala oder Met
  Xaa in Position 10 des Peptidderivats steht für Gln oder His
  Xaa in Position 11 des Peptidderivats steht für Val, Leu oder Ile
  Xaa_i eingefügt vor Position 13 des Peptidderivats steht für Leu, Val oder Thr
  Xaa in Position 13 des Peptidderivats steht für Leu
  Xaa in Position 14 des Peptidderivats steht für Arg oder Citrullin (Cit)
  Xaa in Position 16 des Peptidderivats steht für Met, Val, Ile oder Nle, Leu
  Xaa in Position 17 des Peptidderivats steht für Thr oder Asp
  Xaa in Position 18 des Peptidderivats steht für Tyr, Phe oder Arg
  Xaa in Position 19 des Peptidderivats steht für Lys oder Arg
  Xaa in Position 20 des Peptidderivats steht für Ala, Gly, Ser, Glu oder Gin
  Xaa in Position 21 des Peptidderivats steht für Ala, Ser oder Val
  worin die Sequenz von SEQ ID NO: 10 aus mindestens sechs nacheinander folgenden Aminosäuren besteht, -Z- ein optionaler Linker ist und die Bedeutung PEG, modifiziertes PEG und/oder [Gly]_n hat,
  worin n = 1, 2 oder 3 und unabhängig von n, m in [Arg]_m = 0, 1, 2 oder 3 ist,
  die terminalen Enden der Sequenzen können freie Carboxyl- oder Aminogruppen sein, Amide, Acyle, Acetyle oder Salze davon und/oder die Peptidsequenzen sind auf einem festen Träger immobilisiert.
• Die neuen Peptidsequenzen haben das Potential, als ein gutes Antigen zu dienen, worin das Antigen mindestens ein Peptid von SEQ ID NO: 1 umfasst. Die Antigenizität kann durch Einstellen des Verhältnisses oder der Konzentration der unterschiedlichen Peptide oder Größe der Peptide angepasst werden, beispielsweise durch Dimerisation oder Polymerisation und/oder Immobilisation auf einer festen Phase. Die Antigene umfassen eine oder mehrere Polypeptidsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung, welche entweder mit einer Brücke, beispielsweise eine Disulfidbrücke zwischen den Cys-Resten der Kette oder Brücken wie C₁-C₈-Alkylen, optional unterbrochen durch ein oder mehrere Heteroatome, wie O, S oder N, verknüpft sind oder bevorzugt sind sie nicht verknüpft. Die Ketten können auf eine feste Phase immobilisiert werden in monomerer, dimerer oder oligomerer Form. Weitere Aminosäuren können an die Enden zugefügt werden, um einen „Arm" zu erhalten, um die Immobilisierung zu erleichtern.
• PEG ist ein Polyethylenglycol (HO(CH₂CH₂O)_aH und kann Teil des Linkers Z sein, optional ist PEG mit einer Dicarboxylsäure (HO(CH₂CH₂O)_aCO(CH₂)_bCOOH) oder einer terminalen Carboxylgruppe (HO(CH₂CH₂O)_a-1CH₂COOH) modifiziert, worin a = 0,1–10 und b = 2–6, früher zum Verknüpfen.
• Der Linker -Z- kann entweder aus PEG, modifiziertem PEG oder einer Kombination daraus und/oder einem oder mehreren Gly-Resten bestehen. Alternativ kann der Linker Z- aus einer Gly-Brücke [Gly]_n bestehen, worin n = 1, 2 oder 3.
• Alle Aminosäuren in den Peptiden der Erfindung können sowohl in der D- als auch in der L-Form vorliegen, obgleich die natürlich vorkommende L-Form bevorzugt ist.
• Die C- und N-terminalen Enden der Peptidsequenzen konnten aus natürlichen Sequenzen durch Modifizierung der terminalen NH₂-Gruppe und/oder COOH-Gruppe abgeleitet werden, sie können beispielsweise acyliert, acetyliert, amidiert oder modifiziert sein, um eine Bindungsstelle für einen Träger oder ein anderes Molekül bereitzustellen.
• Die erfindungsgemäßen Peptide bestehen aus 6 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt zwischen 10 und 30 Aminosäuren. Sie decken alle natürlichen Variationen der Aminosäuren in den identifizierten Positionen ab.
• Das erfindungsgemäße Polypeptid-Antigen ist entweder in einer freien oder in einer trägergebundenen Form. Der Träger oder die feste Phase, an welches das Peptid optional ge bunden ist, kann ausgewählt werden aus einer großen Vielzahl von bekannten Trägern. Er sollte im Hinblick auf die beabsichtigte Verwendung des immobilisierten Polypeptids als ein diagnostisches Antigen oder als eine immunisierende Komponente in einem Impfstoff ausgewählt werden.
• Beispiele von Trägern, die beispielsweise für diagnostische Zwecke verwendet werden können, sind magnetische Kugeln (beads) oder ein Latex von Copolymeren wie Styrol-Divinylbenzol, hydroxyliertes Styrol-Divinylbenzol, Polystyrol, carboxylierte Polystyrole, Kugeln aus Ruß, nicht-aktiviertes oder Polystyrol- oder Polyvinyl-aktiviertes Glas, Epoxy-aktiviertes poröses magnetisches Glas, Gelatine oder Polysaccharidpartikel oder weitere Proteinpartikel, rote Blutzellen, mono- oder polyklonale Antikörper oder Fab-Fragmente solcher Antikörper.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Antigene Teil eines Impfstoffes bilden, möglicherweise mit Trägern, Adjuvantien kombiniert, oder mit weiteren immunostabilisierenden Elementen, wie das Kanarienpockenvirus, das env-Gen tragend, kombiniert werden. Beispiele von Trägern und/oder Adjuvantien für Impfzwecke sind weitere Proteine, wie menschliches oder Rinderserum-Albumin und Keyhole Limpet Haemocyanin und Fettsäuren. Immunstimulierende Materialien können in drei Gruppen aufgeteilt werden; Adjuvantien, Träger für Antigene und Vehikel. Beispiele der Adjuvantien beinhalten Aluminiumhydroxid, Aluminiumsalze, Saponin, Muramyl-di- und -tri-Peptide, Monophosphoryl-Lipid A, Palminsäure, B. Pertussis und verschiedene Cytokine beinhaltend das Th1 Cytokin IL-12 und IL-1. Eine Anzahl von Proteintoxinen kann verwendet werden, um Passenger-Proteine über zelluläre Membranen in das Cytosol zu transportieren, welche in der Entwicklung von CTL-Impfstoffen nützlich sind. Träger beinhalten Bakterien-Toxoide, wie inaktivierte Tetanus- und Cholera-Toxine, genetisch entgiftete bakterielle Toxine, wie hitzelabile Enterotoxine aus E.coli, Fettsäuren, lebende Vektoren, wie Poliochimären und Hybridproteine, welche partikuläre Teilchen bilden, wie beispielsweise Hefe-Retrotransposon-Hybrid TY-Partikel und HbcAg-Partikel. Vehikel, welche häufig vorkommende Komponenten in modernen Impfstoffen sind, bestehen aus Mineralölemulsionen, komplettem und inkomplettem Freund'schem Adjuvans, Pflanzenölemulsionen, nichtionischen Block-Copolymer-Tensiden, Squalenne oder Squalanen, Lipopeptiden, Liposomen und biologisch abbaubaren Mikrosphären. Zwei neue Adjuvantien, welche ein großes Potential für die Entwicklung von neuen Impfstoffen besitzen, beinhalten eine Öl-in-Wasser- Mikroemulsion (MF59) und polymere Mikropartikel. Jede Substanz, die die Immunogenizität der Antigene erhöhen kann, kann verwendet werden und einige weitere Alternativen von Trägern oder Adjuvantien sind in der US- oder europäischen Pharmakopeia gegeben.
• Eine geeignete Formulierung des Antigens zur Immunstimulierung kann auch Interferone, wie INF-Y, antivirale Chemokine oder hämatopoetische Wachstumsfaktoren, wie Granulozyten-/Makrophagen-Wachstumsfaktor enthalten.
• Eine weiterer Ansatz, um die Stimulation und Absorption beispielsweise im Darm zu erhöhen, ist das Verabreichen von den erfindungsgemäßen Peptiden mit kleinen Peptiden, wie Di-, Tri- oder Tetra-Peptiden. Diese Peptide können zusätzlich zu oder in Kombination mit den erfindungsgemäßen Peptiden verabreicht werden. Bevorzugt werden Peptide zusammen mit dem Tri-Peptid YGG, bestehend aus Aminosäuren in der D- oder L-Form, bevorzugt in der D-Form, verabreicht.
• Neue Ansätze für eine nicht-parenterale Verabreichung von Impfstoffen, beispielsweise über die Schleimhaut, beinhalten: Genfusionstechnologie, um nicht-toxische Derivate von mukosalen Adjuvantien zu schaffen, genetisch inaktivierte Antigene mit einer Löschung in einem essentiellen Gen, Coexpression eines Antigens und eines spezifischen Cytokins, welches in der Modulation und Kontrolle einer mukosalen Immunantwort wichtig ist, und genetisches Material selbst, welches DNA- oder RNA-Aufnahme und seine endogene Expression in den Gastzellen erlauben würde.
• Ein Ansatz zur Entwicklung dauerhafter Antworten, wo eine zellvermittelte Immunität erforderlich ist, ist mit Plasmid-DNA zu impfen, welche für ein oder mehrere spezifische Antigen(e) kodiert.
• Um gegen HIV-Infektion zu schützen, sollten Impfstoffe sowohl mukosale als auch systemische Immunantworten hervorrufen und könnten mittels jeder möglichen herkömmlichen Route verabreicht werden, parenteral oder nicht-parenteral, wie subkutan, intrakutan, intravenös, intramuskulär, peroral, mukosal oder intranasal beispielsweise.
• In einer bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffes gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst er Antigene, die Peptide ausgewählt aus mindestens einem Peptid aus SEQ ID NO: 1 enthalten, bevorzugter erscheinen die unterschiedlichen Peptide in gleichen Mengen.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Vaccinzusammensetzung das Antigen;
  Die Sequenzen können das zelluläre Immunsystem aktivieren und tragen mit CTL-Epitopen bei. Die Aminosäureänderungen, die innerhalb des Leserahmens der CTL-Epitope implementiert sind, sind konzipiert, um eine erhöhte Bindung zu erreichen. Weitere Aminosäurenänderungen sind durchgeführt worden, um die Synthese der Peptide zu erleichtern und/oder die Löslichkeit der Peptide zu erhöhen.
• Ein Verfahren zum Detektieren der Antikörper, hervorgerufen durch HIV-1 oder HIV-1-spezifische Peptide oder Proteine, in einer Probe von Körperflüssigkeiten unter Verwendung der vorliegenden Antigene ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung. Weiterhin können ein Immunoassay-Kit, der für die Detektion konzipiert worden ist, und Antikörper, die in der Lage sind, selektiv mit diesen Antigenen zu reagieren, entwickelt werden.
• Beschreibung der Herstellung der Peptide
• Die erfindungsgemäßen Peptide können durch jedes bekanntes Verfahren zum Herstellen einer linearen Aminosequenz hergestellt werden, wie beispielsweise rekombinanter DNA-Techniken. Eine Nukleinsäuresequenz, die ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide kodiert oder ein Multimer dieser Peptide wird in einen Expressionsvektor eingeführt. Geeignete Expressionsvektoren sind beispielsweise Plasmide, Cosmide, Viren und YAC (yeast artifical chromosome), welche nötige Kontrollregionen für die Replikation und Expression umfassen. Der Expressionsvektor kann in einer Gastzelle zur Expression stimuliert werden. Geeignete Gastzellen sind beispielsweise Bakterien, Hefezellen und Säugerzellen. Solche Techniken sind im Stand der Technik gut bekannt, und beispielsweise von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, 1989 beschrieben. Weitere gut bekannte Techniken sind Abbau oder Synthese durch Verknüpfen eines Aminosäurerestes an den nächsten Rest in einer flüssigen Phase oder bevorzugt auf einer festen Phase (Harz), beispielsweise durch die sogenannte Merrifield-Synthese. Siehe beispielsweise Barany and Merrifield in the Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Band 2, E. Gross and Meinhofer, Verleger (Acad. Press, N.Y., 1980), Kneib-Coronier and Mullen Int. J. Peptide Protein Res., 30, Seiten 705-739 (1987) und Fields and Noble Int. J. Peptide Protein Res., 35, Seiten 161-214 (1990).
• Falls ein verknüpftes oder zyklisches Peptid gewünscht wird, wird die Aminosäuresequenz einem chemischen Oxidationsschritt unterworfen, um die zwei Cystein-Reste innerhalb einer oder zwischen zwei Peptidsequenzen zu zyklisieren oder zu verknüpfen, wenn die geeigneten linearen Aminosäuresequenzen synthetisiert sind, siehe Akaji et al., Tetrahedron Letter, 33, 8, Seiten 1073-1076, 1992.
• Allgemeine Beschreibung der Synthese
• Alle in den unten gegebenen Beispiele hergestellten Peptide wurden auf einem Milligen 9050 Peptid-Synthesizer unter Verwendung eines Standard-Programms synthetisiert. Das verwendete Harz war Tenta Gel P RAM mit einer theoretischen Beladung von 0,20 meq/g (RAPP POLYMERE GmbH, Tübingen). Das Endprodukt der Synthese wurde in vacuo über Nacht getrocknet. Das Peptid wurde anschließend vom Harz durch Behandlung mit 90%-iger Trifluoressigsäure in der Gegenwart von Ethandithiol (5%) und Wasser (5%) als Fänger (1,5 Stunden bei RT) abgespalten. Anschließend wurde das Harz filtriert und auf dem Filter mit zusätzlicher Trifluoressigsäure (100%) (2 × 20 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden in vacuo verdampft (Wasserbad bei Raumtemperatur) und der Rückstand wurde mit Ethylether (200 ml) trituriert und das ausgefällt Produkt abfiltriert. Der Feststoff wurde sofort auf einem Filter mit Eisessig (100 ml) aufgelöst und zu 1,5 l einer 20%-igen Essigsäure in Methanol zugefügt und mit 0,1 M Jodlösung in Methanol behandelt, bis eine leichte braune Farbe zurückblieb. Dann wurde Dowex 1 × 8 Ionenaustauscher in Acetatform (15g) (Bio-Rad, Richmond, CA) zugefügt und die Mischung filtriert. Das Filtrat wurde verdampft und der Rückstand aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Produkt wurde anschließend durch Reversed-Phase-Flüssigchromatographie auf einer Säule, die mit Kromasil^® 100-5 C8 (EKA Nobel, Surte, Schweden) gefüllt war, in einem geeigneten System enthaltend Acetonitril in 0,1%-iger Trifluoressigsäure-Wasserlösung aufgereinigt. Die Proben von der Säule wurden gesammelt und durch analytische Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) (Beckman System Gold, USA) ausgestattet mit einer Kromasil^® 100-5 C8 Säule (EKA Nobel, Surte, Schweden) analysiert. Fraktionen enthaltend die reine Substanz wurden gepoolt, das Lösungsmittel wurde verdampft und das Produkt aus Essigsäure gefriergetrocknet. Die letzte HPLC-Analyse wurde am Endprodukt durchgeführt und die Struktur des Peptids wurde durch Aminosäurenanalyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
• Alle Aminosäuren, die während der Synthese verwendet wurden, waren L-Aminosäuren und sie wurden mit einer Fluorenylmethoxycarbonylgruppe an der α-Aminofunktion geschützt. Die Seitenketten wurden wie folgt geschützt:
  Cys (Trt), Gln (Trt), Glu (OtBu), Thr (tBu).
• Die Abkürzung innerhalb der Klammern sind:

Trt

= Triphenylmethyl

t-Bu

= tert.Butyl

OtBu

= tert.Butylester

• Die Aminosäurederivate wurden von Bachem AG, Schweiz zur Verfügung gestellt.
• Beispiel 1
• Herstellung von CSWVNPRLEPWNIHPGSQHNITACTN-NH₂ (SEQ ID NO: 2). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Das Peptid wurde anschließend durch Oxidation mit I₂ zyklisiert. Das Peptid wurde in Essigsäure/Methanol (1:4) aufgelöst und 0,1 M I₂ in Methanol wurde zugefügt. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 97% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 2746,2
• Beispiel 2
• Herstellung von FVIPRLEPWNIHPGSQPNITACTN-NH₂ (SEQ ID NO: 3). Das Peptid wurde in Amidform synthetisiert, aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 97% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 2538,0
• Beispiel 3
• Herstellung von YLLFLTKGLGISGGGYNIGCitKKRCitQICN-NH₂ (SEQ ID NO: 5). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
• Beispiel 4
• Herstellung von YLNIFLTRGLGISGGGYNIGCitQICG-NH₂ (SEQ ID NO: 6). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 97% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 3097,7
• Beispiel 5
• Herstellung von RILSTYLGRISGGGWLSAEPVPLQLPPL-NH₂ (SEQ ID NO: 8). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 97% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 2990,6
• Beispiel 6
• Herstellung von RILSTYLGRISGGGYLSAEPVPLQLPPL-NH₂ (SEQ ID NO: 9). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
• Beispiel 7
• Herstellung von KLVGFPVKPQVPGGGRLLCitPNITYKAA-NH₂ (SEQ ID NO: 11). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
• Beispiel 8
• Herstellung von RLVGFPVKPQVPGGGRLLRPITYKAA-NH₂ (SEQ ID NO: 12). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 97% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 2790,4
  Molekularformel: C₁₃₀H₂₁₇O₃₉N₂₉
• Beispiel 9
• Dimerisierung über Disulfidbrücke
• Die Peptidsequenzen aus Beispiel 2 werden durch einen Oxidationsschritt verknüpft, um ein Dipeptid zu bilden, worin die Cystein-Reste eine Disulfidbrücke bilden. Die Brücke wird auf zweierlei Wegen gebildet;
• A) Oxidation mit I₂. Die Peptide (gleiche Mengen, falls unterschiedlich) werden in Essigsäure/Methanol (1:4) gelöst und 0,1 M I₂ in Methanol wird zugefügt, um eine Mischung des Homodimer zu ergeben, oder
• B) Oxidation mittels [Cys(Spy)²²]-SEQ ID NO: 3. 2,3 mM des Peptides von SEQ ID NO: 3 gelöst in 2 M AcOH (aq) und 2-Propanol (1:1) wird mit 2,2-Dithiodipyridin (3 Äquiv.) behandelt, um [Cys(Spy)²²]-SEQ ID NO: 3 zu erhalten. [Cys(Spy)²²]-SEQ ID NO: 3 wird in 10 mM NH₄Oac (aq pH = 6,5) und Methanol (5:2) gelöst, um das Dimer von SEQ ID NO: 13 zu erhalten.
• Die Reinheit des Dimers wird durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wird durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
• Beispiel 10
• Herstellung von FVIHRLEPWLHPGSQHNITASTN-NH₂ (SEQ ID NO: 14).Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 97% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 2540,2
• Beispiel 11
• Herstellung von RLVGFPVKPQVPGLLRPLTYKAA-NH₂ (SEQ ID NO: 15). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 97% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 2520,3
• Beispiel 12 – Referenzbeispiel
• Herstellung einer nativen tat1 Sequenz; MESVDPRLEPWKHPGSQPKTACTN-NH₂ (SEQ ID NO: 16). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 97% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 2708,1
• Beispiel 13 – Referenzbeispiel
• Herstellung einer nativen tat2 Sequenz; QVCFITKGLGISYGRKKRRQRRR-NH₂ (SEQ ID NO: 17). Das Peptid wurde in Amidform aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese synthetisiert. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 94% (einzelne Unreinheiten weniger als 1%)
  Molekulargewicht (freie Base): 2806,4
• Beispiel 14 – Referenzbeispiel
• Herstellung einer nativen Nef Sequenz; EEVGFPVRPqQVPLRPMTYKAA-NH₂ (SEQ ID NO: 18). Das Peptid wurde in Amidform synthetisiert, aus den korrespondierenden Ausgangsmaterialien gemäß der allgemeinen Beschreibung der Synthese. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestimmt und die Struktur wurde durch Aminosäuren-Analyse und Massenspektrometrie (LDI-MS) bestätigt.
  Reinheit (HPLC): größer als 95%
  Molekulargewicht (freie Base): 2384,8
• Beispiel 15
• Ein Impfstoff umfassend die Peptide von SEQ ID NO: 3 und 12 wird hergestellt. Die gefriergetrockneten Peptide werden in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 4 mg/ml gelöst. Ein Ansatz eines Granulozyt-/Makrophagen-Kolonnie stimulierenden Faktors (GM-CSF) wird ebenso hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Verwendung, auf eine Endkonzentration von 0,3 mg/ml. Die beiden Lösungen werden intrakutan verabreicht. Eine typische Injektionsdosis beträgt 100 μl.
• Beispiel 16
• Ein Impfstoff umfassend die Peptide von SEQ ID NO: 14 und 15 wird hergestellt. Die gefriergetrockneten Peptide werden in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 4 mg/ml gelöst. Ein Ansatz eines Granulozyt-/Makrophagen-Kolonnie stimulierenden Faktors (GM-CSF) wird ebenso hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Verwendung, auf eine Endkonzentration von 0,3 mg/ml. Die beiden Lösungen werden intrakutan verabreicht. Eine typische Injektionsdosis beträgt 100 μl.
• Beispiel 17
• Eine antigene Lösung oder Suspension wird mit gleichen Teilen von Freund'schem Adjuvans von Behring, komplett oder inkomplett, gemischt und anschließend fein emulgiert durch Aufziehen und heftigem Herauspressen einer Injektionsspritze oder mit einem Homogenisator. Die Emulsion sollte für mindestens 30 Minuten stabil bleiben. Die Antigen-Adjuvans-Emulsion wird am besten subkutan als ein Depot injiziert.
• Beispiel 18
• Immunoassay zur Detektion von Antikörpern hervorgerufen durch HIV-1.
• Die magnetischen Partikelreagenzien sollten gemäß dem von den Herstellern empfohlenen Protokoll hergestellt werden. Dynal AS ist der Hersteller der Dynabeads, welche verwendet werden. Die mit Ligand bedeckten magnetischen Partikel werden Reagenz 1 genannt. Ein erfindungsgemäßes Peptid wird kovalent an die voraktivierte Oberfläche der magnetischen Partikel verknüpft. Es ist auch möglich, das Peptid physikalisch auf die Oberfläche der magnetischen Partikel zu absorbieren. Die Konzentration der Partikel in Reagenz 1 ist innerhalb des Bereiches von 1 mg/ml bis 15 mg/ml. Die Partikelgröße variiert zwischen 0,2 μm bis 15 μm. Die Konzentration der Peptide ist innerhalb des Bereichs von 0,01 mg/mg Partikel bis 1 mg/mg Partikel.
• Das antihumane Ig Alkalinphosphatase (AP) konjugierte Antikörperreagenz wird gemäß dem empfohlenen Protokoll von Dako AS hergestellt. Dieses Protokoll ist ein Standardverfahren auf diesem Gebiet. Das Reagenz wird Reagenz 2 genannt.
• Die Substratlösung Phenolphthalein-Monophosphat wird gemäß dem empfohlenen Protokoll der Fluka AG hergestellt. Dieses Protokoll ist ein Standardverfahren auf diesem Gebiet. Die Substratlösung wir Reagenz 3 genannt.
• Der Wasch- und Inkubationspuffer, welcher verwendet wird, ist der Standard 0,05 M tris-basierende Puffer mit den folgenden zusätzlichen Verbindungen; Tween 20 (0,01% bis 0,1%), Glycerol (0,1% bis 10%) und Natriumchlorid (0,2% bis 0,1%).
• Das Assayverfahren umfasst einen Inkubationsschritt, worin 1 Tropfen von Reagenz 1 mit 2 Tropfen des Waschpuffers in jedem Well gemischt wird. Nach dem Mischen werden 30 μl der Probe zugefügt und die Lösung wird für 5 Minuten inkubiert. Die magnetischen Partikel können durch einen Magneten eingefangen werden und die Flüssigkeit entfernt werden, bevor der Magnet abgetrennt wird. Anschließend werden die Wells zweimal mit 4 Tropfen einer Waschlösung gewaschen, vor der Inkubation mit Reagenz 2. 1 Tropfen des Reagenz 2 wird mit 2 Tropfen des Waschpuffers zugefügt und die Lösung wird für 5 Minuten inkubiert. Die magnetischen Partikel können durch einen Magneten eingefangen werden und die Flüssigkeit entfernt werden, bevor der Magnet entfernt wird. Anschließend wird der Waschschritt wiederholt, bevor die Inkubation mit Reagenz 3 erfolgt. 2 Tropfen von Reagenz 3 werden in die Wells zugefügt und die Lösung wird für 3 Minuten inkubiert. Die Ergebnisse können gegen einen weißen Hintergrund gelesen werden. Positive Ergebnisse sind Rot (3+ = starkes Rot) während negative Ergebnisse klare, leicht gelb-braune Lösungen sind, wie sie in der Negativkontrolle erhalten werden.
• Der Immunoassay-Kit kann in der Detektion von Antikörpern verwendet werden, die entweder durch HIV-Viren oder durch HIV-spezifische Peptide oder Proteine, wie beispielsweise Peptide der vorliegenden Erfindung, induziert werden.
• Beispiel 19
• Therapeutische oder prophylaktische Impfstoffe
• Mindestens eines der erfindungsgemäßen Polypeptide, ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 10 kann Antigene bilden und konstituiert das aktive Prinzip eines prophylaktischen oder therapeutischen Impfstoffes, von welchem erwartet wird, dass er einen Schutz gegen den menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) bereitstellt. Der Impfstoff kann Verbindungen beinhalten, welche positive Wirkung im Schutz oder der Stimulierung des Gastimmunsystems (Mensch oder Wirbeltier) haben, beispielsweise Interleukine, Interferone, Granulozyten/Makrophagen Wachstumsfaktor, hämatopoetische Wachstumsfaktoren oder ähnliches. Bevorzugt enthält die Vaccinusammensetzung weiter ein Adjuvans oder Vehikel, bevorzugter ist das Adjuvans oder Vehikel Monophosphoryl Lipid A (MPL^®) möglicherweise mit Aluminium, Freund'schem Adjuvans (komplett oder inkomplett) oder Aluminiumhydroxid. Die optimale Menge des Hilfsmittel/Vehikels wird von dem (den) gewählten Typ(en) abhängen.
• Die erfindungsgemäßen Peptide können modifiziert werden durch Zugabe einer einzelnen Fettsäure, wie einer einzelnen Palmitinkette am C-terminalen Ende, um einen Lipopeptid-Impfstoff zu bilden. Weitere Lipopeptide können in die Liposomenmembran durch die Gefrier-Taumethode eingeführt werden, resultierend in Liposomen enthaltend die Peptidliganden auf ihrer Oberfläche.
• Die Peptid- oder Impfstoffformulierung kann vor der Lagerung gefriergetrocknet werden. Die gefriergetrockneten Peptide können in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,1–100 mg/ml gelöst werden. Der Impfstoff kann bevorzugt bei niedrigen Temperaturen gelagert werden, in Ampullen enthaltend eine oder mehrere Dosierungseinheiten, verabreichungsfertig. Eine typische Dosierungseinheit der erfindungsgemäßen Peptide ist innerhalb des Konzentrationsbereichs: 0,05 μg–1 mg pro kg Körpergewicht, bevorzugt innerhalb 0,15 μg–0,15 mg pro kg Körpergewicht. Der Fachmann wird erkennen, dass eine geeignete Dosis vom Körpergewicht des Patienten abhängt, der Art der Krankheit, der schwere des Zustands, der Verabreichungsroute und weiteren anderen Faktoren. Wenn als ein therapeutischer Impfstoff verwendet, kann der Impfstoff bis zu 12 Mal durch Injektion verabreicht werden. Weitere Boosters können folgen und können in einigen Fällen während des ganzen Patientenlebens stattfinden. In der Herstellung einer Injektionslösung werden die Peptide in sterilem Wasser bis zu einer finalen Konzentration von 1 mg/ml pro Peptid gelöst. Typischerweise ist ein Injektionsvolumen 100 μl bis 200 μl (2 × 100 μl). Das Peptid wird bevorzugt zusammen mit einem geeigneten Hilfsmittel und/oder einer Granulozyten/Makrophagen Wachstumsfaktor, wie beispielsweise Leucomax^® „Shering Plough" verabreicht, innerhalb einem Konzentrationsbereich von 0,1 mg/ml bis 1 mg/ml oder gemäß den Verwendungsempfehlungen des Herstellers. Besonders bevorzugt ist eine Kombinationstherapie, worin die vorliegenden Peptide zusammen mit den Peptiden verabreicht werden, die in der veröffentlichten internationalen Patentanmeldung PCT/NO00/00075 und/oder der anhängigen norwegischen Patentanmeldung Nr. 2000 4413 beschrieben sind. Diese Peptide können simultan oder nacheinander verabreicht werden. Eine geeignete Verabreichung kann intrakutan, subkutan, intravenös, peroral, intramuskulär, intranasal, mukosal oder jede weitere geeignete Route sein. Boosterverabreichungen können erforderlich sein, um den Schutz zu erhalten. Für den Fachmann ist es verständlich, dass die Vaccinzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur in der Verhinderung einer Infektion, sondern auch in der Behandlung einer Infektion nützlich sind.
• Keine toxischen Wirkungen der erfindungsgemäßen Peptide wurden beobachtet, wenn sie in Mäusen mit einer Dosierung von 100 μg pro kg Körpergewicht injiziert wurden.
• Die obigen Beispiele sind nur zur Illustrierung der Erfindung beabsichtigt. Es sollte verstanden werden, dass der Fachmann die Peptide, Antigene und Impfstoffe, die hier beschrieben sind, modifizieren kann ohne vom Konzept und Schutzumfang der Erfindung, wie in den Ansprüchen beschrieben, abzuweichen. Sequenzliste

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

Claims (15)

1. Peptid, abgeleitet vom HIV-1-regulatorischen Protein, wobei das Peptid wenigstens eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist unter folgender Gruppe von Aminosäuresequenzen: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Leu Glu Pro Trp Xaa₁₂ His Pro Xaa₁₅ Xaa₁₈ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ Xaa₂₄ (SEQ ID NO: 1) worin die Aminosäuren der Kette die folgenden Bedeutungen besitzen: Xaa in Position 1 des Peptidderivats steht für Met, Ser, Cys oder fehlt, Xaa in Position 2 des Peptidderivats steht für Glu, Asp, Val, Ser oder fehlt, Xaa in Position 3 des Peptidderivats steht für Trp, Tyr oder Phe, Xaa in Position 4 des Peptidderivats steht für Val oder Ile, Xaa in Position 5 des Peptidderivats steht für Ile oder Asn, Xaa in Position 6 des Peptidderivats steht für Pro, His oder Ala, Xaa in Position 7 des Peptidderivats steht für Arg, Asn, Ser, Lys, Glu oder Asp, Xaa in Position 12 des Peptidderivats steht für Leu, Ile oder Nle, Xaa in Position 15 des Peptidderivats steht für Gly oder Pro, Xaa in Position 16 des Peptidderivats steht für Ser, Asn oder Ala, Xaa in Position 17 des Peptidderivats steht für Gln, Lys oder Thr, Xaa in Position 18 des Peptidderivats steht für Pro oder His, Xaa in Position 19 des Peptidderivats steht für Leu, Ile oder Nle, Xaa in Position 20 des Peptidderivats steht für Thr, Ala oder Ile, Xaa in Position 21 des Peptidderivats steht für Ala, Pro, Asp oder Val, Xaa in Position 22 des Peptidderivats steht für Cys oder Set, Xaa in Position 23 des Peptidderivats steht für Thr, Asn oder Ser, Xaa in Position 24 des Peptidderivats steht für Asn, Lys, Arg, Gln, Ala, Pro oder Thr, wobei die terminalen Enden der Sequenzen freie Carboxyl- oder Aminogruppen, Amide, Acyle, Acetyle oder Salze davon sind, wobei zwei oder mehrere der Cys-Reste Teil einer innerkettigen oder interkettigen Disulfidbindung, einer -S-(CH₂)_p-S- oder einer -(CH₂)_p-Brücke sein können, worin p = 1–8 ist und gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome, wie O, N und S unterbrochen ist und/oder wobei diese Peptidsequenzen auf einem festen Träger immobilisiert sind.
2. Peptid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 ausgewählt ist unter SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 14.
3. Antigen, umfassend wenigstens ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2.
4. Vaccinzusammensetzung, umfassend ein Antigen nach Anspruch 3 mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel und gegebenenfalls einem Adjuvans, Träger und/oder Vehikel und gegebenenfalls zusätzlich mit einer oder mehreren immunstimulatorischen Verbindungen.
5. Vaccinzusammensetzung nach Anspruch 4, worin die Vaccinzusammensetzung wenigstens ein Peptid gemäß SEQ ID NO: 1 umfaßt.
6. Vaccinzusammensetzung nach Anspruch 5, umfassend das Peptid gemäß SEQ ID NO: 14.
7. Vaccinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin die Peptide in einer sterilen Wasserlösung gelöst sind und die optional vorhandene immunstimulatorische Verbindung ein Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor ist.
8. Vaccinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, worin die Zusammensetzung ein Adjuvans umfasst, ausgewählt unter Monophosphoryllipid A (MPL^®), komplettem oder inkomplettem Freund'schem Adjuvans oder Aluminiumhydroxid.
9. Vaccinzusammensetzung, worin ein Antigen nach Anspruch 3 als Lipopeptid und/oder als eine Liposomenformulierung formuliert ist.
10. Verfahren zur Detektion von Antikörpern, welche durch ein HIV oder HIV-spezifische Peptide oder Proteine induziert werden, in einer Probe einer Körperflüssigkeit, worin diese Probe einem Immunoassay unterzogen wird, worin das Antigen (die Antigene) ausgewählt ist (sind) unter den Peptiden nach Anspruch 1 und 2.
11. Immunoassay-Kit zur Detektion von Antikörpern, induziert durch HIV oder HIV-spezifische Peptide oder Proteine, in einer Körperflüssigkeitsprobe, worin das diagnostische Antigen ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2 ist.
12. Antikörper, der mit dem Antigen nach Anspruch 3 selektiv reagiert.
13. Plasmid-DNA, welche für ein oder mehrere Antigene nach Anspruch 3 kodiert.
14. Antigen nach Anspruch 3 zur Verwendung zum Schutz vor HIV Typ I-Infektionen.
15. Verwendung des Antigens nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz vor HIV Typ I-Infektionen.