SK287913B6 - Peptide derived from HIV-1 regulatory protein, antigens and use thereof, vaccine composition, method of detecting antibodies induced by HIV, immunoassay kit, antibody and plasmid DNA - Google Patents

Peptide derived from HIV-1 regulatory protein, antigens and use thereof, vaccine composition, method of detecting antibodies induced by HIV, immunoassay kit, antibody and plasmid DNA Download PDF

Info

Publication number
SK287913B6
SK287913B6 SK401-2003A SK4012003A SK287913B6 SK 287913 B6 SK287913 B6 SK 287913B6 SK 4012003 A SK4012003 A SK 4012003A SK 287913 B6 SK287913 B6 SK 287913B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
xaa
hiv
pro
seq
peptide
Prior art date
Application number
SK401-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK4012003A3 (en
Inventor
Birger Sorensen
Original Assignee
Bionor Immuno As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bionor Immuno As filed Critical Bionor Immuno As
Publication of SK4012003A3 publication Critical patent/SK4012003A3/sk
Publication of SK287913B6 publication Critical patent/SK287913B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/974—Aids related test
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses

Abstract

Described are modified peptides capable of inducing a HIV-1 specific immune response without antagonizing the cytotoxic T-cell activity in order to achieve an effective prophylactic and therapeutic vaccine against HIV. The peptides are based on conserved regions of HIV Tat and Rev, regulatory proteins and Nef, auxiliary proteins. Described are free- or carrier-bound antigens, which comprise at least one of the said peptides, vaccine compositions containing at least one of the antigens, immunoassay kits and a method of detecting antibodies induced by HIV or HIV specific peptides using such antigens.

Description

Tento vynález sa týka nových peptidov vychádzajúcich z konzervatívnych oblastí regulačných a pomocných peptidov HIV, antigénov voľných alebo viazaných na nosiči, ktoré obsahujú aspoň jeden z uvedených peptidov, vakcínových kompozícií obsahujúcich aspoň jeden z antigénov, súprav na imunologickú skúšku a spôsobu detekcie protilátok vyvolaných HIV alebo HlV-špecifickými peptidmi s použitím takýchto antigénov.
Doterajší stav techniky
Ľudský vírus imunitnej nedostatočnosti typu 1 (HIV-1), činiteľ spôsobujúci získaný syndróm imunitnej nedostatočnosti (AIDS), predstavuje stále významné ohrozenie zdravia v rozvojových krajinách. V krajinách Západu majú terapeutické stratégie, ktoré sú zacielené na replikáciu HIV ajeho dozrievanie, významný vplyv na progresiu ochorenia. Vysoké náklady na súčasnú liečbu, vysoká toxicita liekov a nedostatok liečiv však spôsobujú, že vývoj bezpečných a účinných vakcín je naďalej rozhodujúci pre udržanie pandémie AIDS pod kontrolou.
HIV-1 je zložitý retrovírus, ktorý kóduje šesť regulačných a pomocných génov, ktoré sa nenachádzajú v jednoduchých retrovírusoch, menovite tat, rev, nef, vifvpra vpu (tabuľka 1).
V eukaryotických bunkách sa len dokonale skombinované mRNA exportujú do cytoplazmy na transláciu. Neskombinované alebo čiastočne skombinované RNA sa v jadre zadržia a nakoniec sa rozkladajú. Týmto spôsobom prebieha najprv expresia proteínov kódovaných génmi tat, rev a nef (označovaných ako Tat, Rev a Nef) odvodených z viacnásobne skombinovaných druhov RNA a predstavujúcich počiatočnú expresiu génu HIV-1. Na expresiu jednoducho skombinovaných RNA a tiež na prenos genómu neskombinovanej RNA úplnej dĺžky do cytoplazmy na zbalenie si HIV-1 vyvinul prostriedky na prekonanie obmedzení v prenose RNA. Regulačné proteíny Tat a Rev sú kľúčové pri replikácii HIV, pretože mutácie v týchto proteínoch zabraňujú tvorbe HIV-1 (Dayton A. I. a kol. (1986) Celí, 44: 941 - 947 a Fisher A. G. a kol. (1986) Náture, 320: 367 až 371).
Pomocné gény sú odvodené z exónov umiestnených výlučne v protismere vývoja génu HIV-1, napríklad vif alebo exónov v protismere od alebo tiež vnútri env, ale v rozličných čítacích rámcoch, napr. tat, rev. Efektívnosť skombinovania sčasti reguluje úrovne génovej expresie rozličných pomocných proteínov.
Po integrácii HIV-1 provírusovej DNA sa syntetizujú prevažne skrátené formy mRNA bunkovou RNA polymerázou II, ktorá interaguje s polohami na 5' dlhom terminálnom opakovaní (LTR) provírusovej DNA. tat je jeden z prvých génov, ktorého expresia prebieha a ktorý nesie jadrový lokalizačný signál. Je to účinný aktivátor transkripcie, ktorý zvyšuje transkripciu riadenú LTR až tisíckrát. Nepretržitá expresia Tat zaisťuje kladnú spätnú väzbu pre vysokú úroveň expresie génu. Na rozdiel od bežných aktivátorov transkripcie, ktoré interagujú so sekvenciami DNA, sa Tat viaže priamo na 5' konce všetkých RNA HIV-1 pri zvláštnej sekundárnej štruktúre v tvare slučky TAR (prvku transaktivačnej reakcie). Štruktúra tejto slučky je vysoko konzervatívna a je nevyhnutná pre funkciu Tat. Štruktúra interakcie Tat/TAR sa analyzovala s použitím jadrovej magnetickej rezonancie (NMR) (Puglisi a kol. (1992) Science, 257: 76 - 80). Tat viaže TAR v spojení s bunkovým proteínom cyklínom T, ktorý zasa viaže CDK9, ktorý fosforyluje C-terminálnu doménu RNA polymerázy II, čím podporuje predlžovanie transkripcie RNA. Tieto bunkové kofaktory Tat sú prítomné iba v aktivovaných bunkách, ich neprítomnosť potláča transkripciu provírusovej DNA, čím dochádza ku „kvázilatencii“ v T lymfocytoch. Expresia Tat prebieha z dvoch exónov, pričom jadrový lokalizačný signál a väzbová oblasť TAR sú umiestnené v prvom exóne. Infikované bunky vylučujú Tat a tento môže pôsobiť heterológnymi účinkami na susedné bunky. K týmto účinkom patrí bunková aktivácia (Hofman a kol. (1993) Blood, 82: 2774 - 2780), vyvolanie bunkovej a- poptózy (Macho a kol. (1999) Oncogene, 18: 7543 - 7551), fungovanie ako vylúčiteľný rastový faktor (Trinh, D. P. a kol. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun., 256: 299 až 306) a modulovanie syntézy hostiteľského bunkového proteínu v prospech syntézy vírusového proteínu (Xiao a kol. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun., 244: 384 - 389). Terapeutické stratégie cielené na Tat budú preto mať značný vplyv na infekciu HIV-1.
V počiatočných štádiách po infikovaní majú prevahu malé viacnásobne skombinované mRNA kódujúce Tat, Rev a Nef. Keď sa dosiahne prahová hladina Rev, neskombinované a jednoducho skombinované RNA sa zhromažďujú v cytoplazme na transláciu, čo umožní pokračovanie rozširovania infekcie. Zlyhanie pri tvorení tejto prahovej hladiny Rev môže prispieť ku kvázilatencii HIV. Rev sa môže viazať len na tie RNA, ktoré obsahujú zvláštnu RNA štruktúru RRE (prvok reakcie na Rev), ktorá je umiestnená v env kódujúcej oblasti genómu. Rev interaguje s RRE ako multimér prostredníctvom zásaditej oblasti bohatej na arginin, ktorá je prítomná v amino terminálnej polovici proteínu. Dôsledkom tejto interakcie je prenos čiastočne skombinovaných RNA, ktoré poskytnú produkty génov, ako sú Env, Vif, Vpu a Vpr, ako aj neskombinovaných RNA, ktoré budú slúžiť ako nové genómy na začlenenie do vytvárajúcich sa častíc. Urobila sa tiež štruktúrna analý2 za interakcie Rev/RRE pomocou NMR (Battiste a kol. (1996) Science, 273: 1547 - 1551). Rev obsahuje bohatý exportný signál, čo mu umožňuje byť prenášačom pre nepretržitý transport práve syntetizovaných RNA medzi jadrom a cytoplazmou (Kalland a kol. (1994) J. Virol., 68: 1475 - 1485; Meyer & Málim, (1994) Genes Dev,, 8: 1538 - 1547). Týmto spôsobom Rev zabezpečuje, že expresia štruktúrnych génov prebieha neskôr, až po regulačných génoch. Terapeutické stratégie nasmerované proti Rev prerušia vo včasnom štádiu infekcie životný cyklus vírusu.
Aj keď bol pôvodne Nef opísaný ako negatívny faktor, neskôr sa ukázalo, že má pozitívne účinky na replikáciu vírusu a jeho expresia prebieha vo väčšom rozsahu ako Tat a Rev na začiatku aj v priebehu infekcie. Nef sa myristyluje na N konci a je spojený s vnútornou stranou plazmovej membrány. Nef je sčasti zodpovedný za reguláciu znižovaním a za rozklad povrchovej CD4 endocytózou (Piguet a kol. (1998) EMBO J., 17: 2472 - 2481). Odstránenie CD4 z povrchu bunky zabraňuje superinfekcii inými kmeňmi HIV-1 alebo opätovnej infekcii práve uvoľneným vírusom. Nef je tiež zodpovedný za reguláciu znižovaním MHC triedy I, čím ochraňuje infikované bunky pred deštrukciou cytotoxickými lymfocytmi T (Le Gali a kol. (1997) Res. Virol., 148: 43 - 47). Nef nie je kľúčovým proteínom vírusu, pretože nie je potrebný pre infekciu in vitro lymfocytov periférnej krvi alebo bunkových línii T. Delečné mutanty Nef sú však v dlhších časových obdobiach menej patogénne. Nef má tiež zložité vplyvy na prenosové cesty signálu v bunke a obsahuje oblasti bohaté na prolín, ktoré môžu interagovať s doménou SH3 kináz zúčastňujúcich sa na aktivácii buniek T, čo je vlastnosť potrebná na účinnú replikáciu HIV (Moarefi a kol. (1997) Náture, 385: 650 - 653). Vírusy obsahujúce Nef sú schopné syntetizovať viac vírusovej DNA než vírusy s vynechaným génom Nef, čo naznačuje, že Nef priamo alebo nepriamo aktivuje reverzné transkriptázy vírusu. Za tento jav môže byť zodpovedná nízka hladina Nef spojená s viriónmi. Nízke hladiny Nef sa uvoľňujú aj z infikovaných buniek, hoci potenciálny účinok susedných buniek je nejasný. Pretože expresia Nef prebieha na začiatku infekcie a má výrazné účinky na expresiu CD4 a MHC triedy I, ako aj na progresiu choroby, predstavuje Nef dôležitý cieľ pre budúce terapeutické stratégie.
Tat a Nef sa vylučujú a môžu byť prijímané makrofágmi a ich expresia môže prebiehať v spojení s molekulami MHC triedy II. To zvyšuje ich stabilitu ako cieľov na terapie na báze peptidov, ktorých expresia by tiež mohla prebiehať v súvislosti s MHC triedy II. Je jasné, že zameranie sa na počiatočné génové produkty, ktoré sú kľúčové pri replikách HIV-1, ako sú Tat a Rev, by malo dostať prednosť rovnako ako Nef, ktorého expresia prebieha tiež na začiatku a ovplyvňuje progresiu choroby.
Tabuľka 1 Regulačné a pomocné proteíny HIV-1
Gén Protein Názov Expresia Umiestnenie Funkcie
Tat Tat T ransaktivátor transkripcie vírusu Počiatočná Jadro Aktivuje transkripciu vírusu. Vylučovaný z infikovaných buniek, kde môže aktivovať T bunky, indukovať apoptózu a pôsobí ako rastový faktor
Rev Rev Exportný faktor jadrovej RNA Počiatočná Jadierko, nukleoplazma, cytoplazma Riadi spletanie/prenos RNA do cytoplazmy. Prenášači protein.
Nef Nef Rozličné efektorové fúnkcie Počiatočná Cytoplazma, virióny spojené s membránami Spúšťa endocytózu CD4. Reguluje znižovaním expresiu MHC triedy 1. Viaže sa na kinázy a môže ovplyvňovať signalizáciu a aktiváciu T buniek.
Vpu Vpu Vírusový protein u Neskoršia Cytoplazma, spojená s membránami Spúšťa vnútrobunkový rozklad CD4, reguluje znižovaním MHC triedy 1, nešpecifický urýchľovač uvoľňovania retrovírusových častíc.
Vif Vif Faktor infekčnosti vírusu Neskoršia Cytoplazma, membránové virióny Zvyšuje infekčnosť vírusových častíc bunkovo závislým spôsobom. Zlepšuje syntézu vírusovej DNA počas spätnej transkripcie.
Vpr Vpr Vírusový protein r Neskoršia Hlavne virióny jadra Prispieva k jadrovému importu predintegračného komplexu. Zastavuje bunky vo fáze G2/M bunkového cyklu.
Prirodzene sa vyskytujúce sekvencie HIV v kandidátoch na vakcínu nie sú schopné stimulovať stabilnú a dlhotrvajúcu imunitnú reakciu kvôli vnútornej schopnosti HIV ukryť sa pre imunitný systém zmenou vzhľadu prítomných epitopov. Na prekonanie tohto premenlivého vzhľadu epitopov budú niektoré substitúcie ami3 nokyselín a kombinácie aminokyselín podporovať imunitný systém v objavení a rozpoznávaní týchto antigénov cudzieho vírusu spoľahlivým spôsobom, a preto aj vo väčšej miere.
Na základe uvedených známych faktov sme sa rozhodli preskúmať možnosť vytvorenia nových syntetických peptidov, ktoré môžu napodobňovať epitopy z regulačných a pomocných proteínov HIV takým spôsobom, že môžu byť prístupné pre humorálnu, ako aj bunkovú časť imunitného systému, a spĺňali by požiadavky na účinnú terapeutickú a/alebo profylaktickú vakcínu.
Počiatočné práce vychádzali z prirodzených sekvencii aminokyselín Tat publikovaných Korberom a kol., Human Retrovíruses and AJDS (Ľudské retrovírusy a AIDS), 1997, Red. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. Prvý epitop Tat je umiestnený medzi aminokyselinou 1 a aminokyselinou 24 proteínu tat:
Tabuľka 2. Epitop Tat
Čís. AK Prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny
1 M S
2 E D V
3 S Q P L V A
4 V I
5 D N
6 P H A
7 R N S K E D
8 L I Q R V M T
9 E D P
10 P S
11 W
12 K N E H L
13 H R Q
14 P
15 G P
16 S N A
17 Q K T
18 P H
19 K T S A R P E
20 T A I
21 A P D V
22 C S
23 T N S
24 24 N K R Q A P
Jednopísmenové, rovnako ako trojpísmenové kódy definujúce aminokyseliny v sekvenciách uvedených v tejto špecifikácii sú v súlade s medzinárodnými normami a sú uvedené v učebniciach, napríklad Lehninger A. L., „Principles of Biochemistry“ (Základy biochémie), Worth Publishers Inc., New York, 1982. Aminokyseliny uvedené napravo od ľavého stĺpca predstavujú prirodzené varianty sekvencie. Naše analýzy viedli k sekvencii obsahujúcej tento modifikovaný epitop:
CSWVNPRLEPWLHPGSQPN1TACTN, v ktorom NI označuje kyselinu 2-aminohexánovú (norleucín, v skratke Nie v troj písmenovom resp. N1 v jednopísmenovom kóde) a cysteínové zvyšky sú v oxidovanom stave, t. j. vytvárajú vnútroreťazcovú disulfidickú väzbu. Pretože cysteínový zvyšok v C-koncovej časti (v polohe 22) peptidu je časťou intramolekulovej disulfidickej väzby mimo tohto zvoleného epitopu, podobná intrapeptidová disulfidická väzba sa vytvorí umiestnením cysteínu do N-koncovej časti zvoleného epitopu. Inou možnosťou je vytvorenie intermolekulovej disulfidickej väzby dimerizáciou sekvencii:
WVNPRLEPWLHPGSQPN1TACTN
I
WV NPRLEP WLHP G S QPN1 T AC TN.
Ďalšou možnosťou je dimerizácia s iným vybraným epitopom z Tat. Druhý epitop na Tat je umiestnený medzi aminokyselinami 35 a 57 v smere C-konca aje oddelený od prvého epitopu 10 aminokyselinami obsahujúcimi ďalších 5 Cys zvyškov, okrem Cys zvyškov v každom z epitopov. Pomerne veľký počet Cys zvyškov ponúka veľa možností medzimolekulových a vnútromolekulových prepojení. Je pravdepodobné, že táto doména bohatá na Cys bude dominovať v imunologickej expozícii tohto proteínu a tým zabezpečí „ukrytie dvoch relevantných epitopov. Výber a modifikácia týchto dvoch susedných epitopov môže sprístupniť kľúčovú časť proteínu Tat optimálnejším spôsobom.
Aby sa obmedzila pravdepodobnosť vývoja únikových mutantov, počet epitopov sa ďalej zvýšil a vybrali sa dve ďalšie sekvencie peptidov. Tieto sekvencie sú umiestnené na Rev (zvyšky 58 - 78) a Nef (zvyšky 65 až 85). Prirodzené sekvencie sa publikovali v knihe Human Retroviruses and AIDS 1999; A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences (Ľudské retrovírusy a AIDS, 1999; Prehľad a analýzy sekvencií nukleových kyselín a aminokyselín). Red. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos Laboratory, Los Alamos:
Tabuľka 3. Epitop Tat
Cis. AK Prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny
35 Q P I L T Y V
36 v A C L
37 c
38 F
39 I L Q M T
40 T N K R
41 K Q
42 G A
43 L
44 G S
45 I
46 S F Y
47 Y N
48 G
49 R K s
50 K
51 K
52 R
53 R K s G
54 Q R P
55 R
56 R
57 R G s
Tabuľka 4. Epitop Rev
Čís. AK Prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny
58 R W Q
59 89 I v L F
60 L I P
61 G S N D C V T
62 T A D N S
63 Y C F R H S V
64 L V
65 G H
66 R G
67 S P F L
68 A T E Q V P s
69 E K Q D N
70 P S A N
71 V N G P
72 P Q H S L R T
73 L F V
74 Q L P H D E
75 L
76 P
77 P L E
78 L I V P
A
L
D a
Tabuľka 5. Epitop Nef sa vyskytujúce aminokyseliny
Cis. AK Prirodzene
65 E G D S
66 N G D E
67 E V
68 A G
69 L F
70 P
71 I V
72 T R K A M
73 P
74 0 H
75 V L I
76 P
77 L V T
78 R
79 P
80 M V I
81 T D
82 Y F R
83 K R
84 A G S E Q
85 A S v
Niekoľko modifikovaných peptidov sa syntetizovalo na to, aby sa stanovila jedinečnosť sekvencií, ako aj ich vlastností stimulácie imunitného systému v kombinácii s ich špecificitou a citlivosťou ako antigénov HIV-1.
Podstata vynálezu
Peptidy podľa tohto vynálezu pochádzajú zo štyroch rozličných konzervatívnych oblastí proteínov Tat, Rev a Nef HIV-1, ktoré sú opísané skôr a ktoré majú vlastnosti uchovávajúce jedinečnosť (imunogenicitu, citlivosť a špecificitu) epitopov HIV-1. Nové peptidy podľa tohto vynálezu ďalej nemajú pozorovateľný cytotoxický antagonistický účinok na T lymfocyty (CTL) a musia mať aspoň jeden potenciálny CTL epitop.
Peptidy podľa tohto vynálezu, ktoré spĺňali nasledujúce kritériá, sú vybraté z nasledujúcich skupín:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa^ Xaa7 Leu Glu Pro Trp Xaa12 His Pro Xaa]5 Xaai6 Xaa,7 Xaai8 Xaaig Xaa20 Xaa2| Xaa22 Xaa23 Xaa24 (SEQ ID NO: 1), kde aminokyseliny reťazca môžu mať nasledujúci význam;
Xaa v polohe 1 derivátu peptidu je Met, Ser, Cys alebo nič,
Xaa v polohe 2 je Glu, Asp, Val, Ser alebo nič,
Xaa v polohe 3 je Ser, Gin, Pro, Leu, Val, Ala, Trp, Tyr alebo Phe,
Xaa v polohe 4 je Val alebo íle,
Xaa v polohe 5 je Asp, Asn alebo íle,
Xaa v polohe 6 je Pro, His alebo Ala,
Xaa v polohe 7 je Arg, Asn, Ser, Lys, Glu alebo Asp,
Xaa v polohe 12 je Leu, íle alebo Nie,
Xaa v polohe 15 je Gly alebo Pro,
Xaa v polohe 16 je Ser, Asn alebo Ala,
Xaa v polohe 17 je Gin, Lys alebo Thr,
Xaa v polohe 18 je Pro alebo His,
Xaa v polohe 19 je Lys, Thr, Ser, Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, íle alebo Nie,
Xaa v polohe 20 je Thr, Ala alebo íle,
Xaa v polohe 21 je Ala, Pro, Asp alebo Val,
Xaa v polohe 22 je Cys alebo Ser,
Xaa v polohe 23 je Thr, Asn alebo Ser,
Xaa v polohe 24 je Asn, Lys, Arg, Gin, Ala, Pro alebo Thr, terminálnymi ukončeniami sekvencií môžu byť voľné karboxylové skupiny alebo aminoskupiny, amidy, acyly, acetyly alebo ich soli, okrem toho dva alebo viac Cys zvyškov môžu vytvárať časť vnútroreťazcovej alebo medzireťazcovej disulfidickej väzby, mostík -S-(CH2)P-S- alebo -(CH2)P-, kde p = 1 - 8, prípadne s vloženým jedným alebo viacerými heteroatómami, ako je O, N alebo S, a/alebo sú uvedené sekvencie peptidov imobilizované na pevnom nosiči.
Ďalšie peptidy zahŕňajú:
Xaai Xaa2 Xaa3 Phe Xaa5 Xaa^, Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa,0 Xaa n Xaa,2 -Z- Tyr Xaa; Gly Xaa,5 Lys Lys Arg Xaal9
Xaa20 Xaa2| Xaa22 Xaa23 (SEQ ID NO: 4), kde aminokyseliny reťazca majú nasledujúci význam;
Xaa v polohe 1 je Pro, íle, Leu, Thr, Tyr alebo Val,
Xaa v polohe 2 je Val, Ala, Cys, Leu,
Xaa v polohe 3 je Cys, íle, Leu, Val alebo Nie,
Xaa v polohe 5 je íle, Leu, Gin, Met alebo Thr,
Xaa v polohe 6 je Thr, Asn, Lys alebo Arg,
Xaa v polohe 7 je Lys, Arg alebo Gin,
Xaa v polohe 8 je Gly alebo Ala,
Xaa v polohe 9 je Leu alebo íle,
Xaa v polohe 10 je Gly, Ser alebo Ala,
Xaa v polohe 11 je íle alebo Gly,
Xaa v polohe 12 je Ser, Phe alebo Tyr,
Xaa, vložená pred polohou 14 je Leu, íle, Nie,
Xaa v polohe 15 je Arg, Lys, Ser alebo citrulín (Cit),
Xaa v polohe 19 je Arg, Lys, Ser, Gly alebo Cit,
Xaa v polohe 20 je Gin, Arg alebo Pro,
Xaa v polohe 21 je íle alebo Leu,
Xaa v polohe 22 je Gly, Leu, íle, Cys alebo nič,
Xaa v polohe 23 je Gly alebo nič, kde sekvencia SEQ ID NO: 4 obsahuje aspoň šesť po sebe idúcich aminokyselín, -Z- je možný spoj a predstavuje PEG, modifikovaný PEG a/alebo [Gly]n, v ktorom n = 1,2 alebo 3, okrem toho dva alebo viac Cys zvyškov môže vytvárať časť vnútroreťazcovej alebo medzireťazcovej disulfidickej väzby, mostík -S-(CH2)P-S- alebo -(CH2)P-, kde p = 1 - 8, prípadne s vloženým jedným alebo viacerými heteroatómami, ako je O, N alebo S,
Xaa, íle Leu Xaa4 Xaa5 Xaa^ Leu Gly Arg Xaa|0 Xaa,, -Z- Xaai2 Leu Xaaj Xaa, Xaal4 Xaa,5 Xaa,6 Xaai7 Xaa,8 Xaa,9 Leu Pro Pro Leu (SEQ ID NO: 7), kde Xaa v polohe 1 je Phe, Tyr, Trp alebo Arg,
Xaa v polohe 4 je Gly, Ser, Asn, Asp, Cys, Val, Thr, Ala alebo Arg,
Xaa v polohe 5 je Thr, Ala, Asp, Asn alebo Ser,
Xaa v polohe 6 je Tyr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Val alebo Leu,
Xaa v polohe 10 je Ser, Pro, Phe, Leu alebo íle,
Xaa v polohe 11 je Ala, Thr, Glu, Gin, Val, Pro alebo Ser,
Xaa v polohe 12 je Glu, Lys, Gin, Asp, Asn, Tyr, Trp alebo Phe,
Xaaj vložená za polohou 13 je Ser, Pro, Phe, Leu alebo Íle,
Xaaj vložená pred polohou 14 je Ala, Thr, Glu, Gin, Val, Pro alebo Ser,
Xaa v polohe 14 je Glu, Lys, Gin, Asp alebo Asn,
Xaa v polohe 15 je Pro, Ser, Ala alebo Asn,
Xaa v polohe 16 je Val, Asn, Gly alebo Pro,
Xaa v polohe 17 je Pro, Gin, His, Ser, Leu, Arg, Thr, Asp alebo íle,
Xaa v polohe 18 je Leu, Phe alebo Val,
Xaa v polohe 19 je Gin, Leu, Pro, His, Asp alebo Glu, kde sekvencia SEQ ID NO: 7 obsahuje aspoň šesť po sebe idúcich aminokyselín, spojka -Z-je dobrovoľná a predstavuje PEG, modifikovaný PEG a/alebo [Gly]n, v ktorom n = 1,2 alebo 3,
Xaai Leu Val Gly Xaa5 Pro Xaa7 Xaa8 Pro Xaaio Xaau Pro -Z- [Arg]ra Xaaj Xaa,3 Xaa,4 Pro Xaa,6 Xaa,7 Xaa,8 Xaa,9 Xaa20 Xaa21 (SEQ ID NO: 10), kde Xaa v polohe 1 je Lys alebo Arg,
Xaa v polohe 5 je Phe alebo Leu,
Xaa v polohe 7 je íle alebo Val,
Xaa v polohe 8 je Thr, Arg, Lys, Ala alebo Met,
Xaa v polohe 10 je Gin alebo His,
Xaa v polohe 11 je Val, Leu alebo íle,
Xaa, vložená pred polohou 13 je Leu,
Xaa v polohe 13 je Leu, Val alebo Thr,
Xaa v polohe 14 je Arg alebo citrulín (Cit),
Xaa v polohe 16 je Met, Val, íle alebo Nie, Leu,
Xaa v polohe 17 je Thr alebo Asp,
Xaa v polohe 18 je Tyr, Phe alebo Arg,
Xaa v polohe 19 je Lys alebo Arg,
Xaa v polohe 20 je Ala, Gly, Ser, Glu alebo Gin,
Xaa v polohe 21 je Ala, Ser alebo Val, kde sekvencia SEQ ID NO: 10 obsahuje aspoň šesť po sebe idúcich aminokyselín, spojka -Z-je dobrovoľná a predstavuje PEG, modifikovaný PEG a/alebo [Gly]„, v ktorom n = 1,2 alebo 3 a nezávisle od n je m v [Arg]m rovnajúce sa 0, 1,2 alebo 3, terminálnymi koncami sekvencii môžu byť voľné karboxylové skupiny alebo amino skupiny, amidy, acyly, acetyly alebo ich soli, a/alebo sú uvedené sekvencie peptidov imobilizované na tuhom nosiči.
Nové sekvencie peptidov majú schopnosť slúžiť ako dobrý antigén, v ktorom antigén obsahuje aspoň jeden peptid vybratý zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Antigenicita sa môže upravovať zmenou pomeru koncentrácií rozličných peptidov alebo veľkosti peptidov napríklad dimerizáciou alebo polymerizáciou a/alebo imobilizáciou na tuhej fáze. Antigén obsahuje dve alebo viac sekvencii polypeptidov podľa tohto vynálezu, ktoré by mohli byť buď spojené mostíkom, napríklad disulfidickým mostíkom medzi Cys zvyškami reťazcov, alebo mostíkmi, ako je CrC8 alkylén, prípadne s vloženým jedným alebo viacerými heteroatómami, ako sú O, S alebo N, alebo sú výhodne nespojené. Reťazce môžu byť imobilizované na tuhej fáze v monomémej, dimérnej alebo oligomémej forme. Ku koncom sa môžu pridať ďalšie aminokyseliny, aby vzniklo «rameno» na uľahčenie imobilizácie.
PEG je polyetylénglykol (HO(CH2CH2O)a H) a môže byť časťou spojky - Z-, prípadne je PEG modifikovaný dikarboxylovou skupinou (HO(CH2CH2O)a CO(CH2)b COOH) alebo koncovou karboxylovou skupinou (HO(CH2CH2O)a i CH2COOH), kde pred spojením a = 1 - 10 a b = 2 - 6.
Spojka -Z- môže byť tvorená buď PEG, modifikovaným PEG alebo ich kombináciou a/alebo kombináciou jedného alebo viacerých Gly zvyškov. Spojka -Z- môže byť tiež tvorená Gly-mostíkom [Gly]n, v ktorom n= 1,2 alebo 3.
Všetky aminokyseliny v peptidoch podľa tohto vynálezu môžu byť v D-forme alebo v L-forme, hoci prirodzene sa vyskytujúca L-forma je výhodnejšia.
C- a N-terminálne ukončenia sekvencii peptidov sa môžu odlišovať od prírodných sekvencii modifikáciou terminálnych NH2 skupín a/alebo COOH skupín, môžu byť napríklad acylované, acetylované, amidované alebo modifikované tak, že poskytujú miesto naviazania na nosič alebo inú molekulu.
Peptidy podľa tohto vynálezu pozostávajú zo 6 až 50 aminokyselín, výhodne z 10 až 30 aminokyselín. Tieto predstavujú celú prírodnú paletu aminokyselín v identifikovaných polohách.
Polypeptidový antigén podľa tohto vynálezu je buď voľný alebo vo forme viazanej na nosiči. Nosič alebo tuhá fáza, na ktorú je peptid prípadne naviazaný, sa môže vybrať zo širokej palety známych nosičov. Mal by byť vybratý s ohľadom na zamýšľané použitie imobilizovaného polypeptidu ako diagnostického antigénu alebo ako imunizačnej zložky vo vakcíne.
Príkladmi nosičov, ktoré sa môžu použiť napríklad na diagnostické účely, sú magnetické guľôčky alebo živica z kopolymérov, ako je styrén-divinylbenzén, hydroxylovaný styrén-divinylbenzén, polystyrén, karboxylovaný polystyrén, guľôčky z uhlíkovej černe, neaktivované alebo polystyrénom alebo polyvinylchloridom aktivované sklo, epoxidom aktivované porózne magnetické sklo, želatínové alebo polysacharidové častice alebo iné proteínové častice, červené krvinky, monoklonálne a polyklonálne protilátky alebo fab fragmenty týchto protilátok.
Podľa ďalšieho praktického uskutočnenia tohto vynálezu môžu byť antigény súčasťou vakcíny s možnosťou kombinácie s nosičmi, adjuvantmi alebo s inými imunostimulačnými prvkami, ako je vírus kiahní obsahujúci env gén. Príkladmi nosičov a/alebo adjuvantov na účely vakcíny sú iné proteíny, ako je ľudský alebo hovädzí sérový albumín, limpetový hemocyanin a mastné kyseliny. Imunostimulačné materiály sa dajú rozdeliť do troch skupín: adjuvanty, nosiče na antigény a vehikulá. Príkladmi adjuvantov sú hydroxid hlinitý, hlinité soli, saponín, muramyl di- a tripeptidy, monofosforyllipid A, kyselina palmitová, B. pertussis a rozličné cytokíny zahŕňajúce Thl cytokín IL-12 a IL-1. Rad proteínových toxínov, ktoré sú užitočné pri vývoji CTL vakcín, sa môže použiť na dopravu prenášačových proteínov cez bunkové membrány do cytosolu. K nosičom patria bakteriálne toxoidy, ako je inaktivovaný toxín tetanu a cholery, geneticky detoxifikované bakteriálne toxíny, ako je teplotné labilný enterotoxín z E. coli, mastné kyseliny, živé vektory, ako je polio chimeras, a hybridné proteíny, ktoré tvoria častice, napríklad častice kvasinkového retrotranspozónového hybridu TY a častice HBcAg. Vehikulá, ktoré sú často sa vyskytujúcimi zložkami v moderných vakcínach, obsahujú emulzie minerálnych olejov, Freundov úplný a neúplný adjuvant, emulzie rastlinných olejov, povrchovo aktívne látky na báze neiónových blokových kopolymérov, skvalén alebo skvalán, lipopeptidy, lipozómy a biologicky odbúrateľné mikroguľôčky. Dvoma novými adjuvantmi, ktoré sú významné pri vývoji nových vakcín, sú mikroemulzia olej vo vode (MF59) a polyméme mikročastice. Môže sa použiť akákoľvek látka, ktorá môže zvýšiť imunogenicitu antigénu, a niektoré ďalšie alternatívy nosičov alebo adjuvantov sú uvedené v americkom alebo v európskom liekopise.
Vhodný prípravok obsahujúci antigén na imunostimulačné použitie môže tiež obsahovať interferóny, ako je INF-γ, antivírusové chemokíny alebo hematopoetické rastové faktory, ako je rastový faktor granulocytovmakrofágov.
Iným priblížením, ktorého cieľom je zvýšiť stimuláciu a absorpciu, napríklad v črevách, je podanie peptidov podľa tohto vynálezu s malými peptidmi, ako sú di-, tri- alebo tetrapeptidy. Tieto peptidy sa môžu podávať navyše alebo v kombinácii s peptidmi podľa tohto vynálezu. Výhodne sa tieto peptidy podávajú spolu s tripeptidom YGG, ktorý pozostáva z aminokyselín v D-forme alebo v L-forme, výhodne v D-forme.
Nedávne prístupy k neparenterálnemu podávaniu vakcíny, napríklad cez sliznicu, zahŕňajú: technológiu génovej fúzie na vytvorenie netoxických derivátov sliznicových adjuvantov, geneticky inaktivované antigény s deléciou v esenciálnom géne, koexpresiu antigénu a špecifického cytokínu, ktorý je dôležitý pri modulácii a riadení sliznicovej imunitnej reakcie, a samotný genetický materiál, ktorý by umožnil prijatie DNA alebo RNA a jeho endogénnu expresiu v hostiteľských bunkách.
Jedným prístupom k vývoju trvanlivých reakcií, keď sa vyžaduje bunkami sprostredkovaná imunita, je vakcinácia s plazmidom DNA kódujúcim jeden alebo viac špecifických antigénov.
Na ochranu proti infekcii HIV musia vakcíny vykazovať sliznicovú aj systémovú imunitnú reakciu a mali by sa podávať akýmkoľvek konvenčným spôsobom, napríklad parenterálne alebo neparenterálne, ako je napríklad subkutánne, intrakutánne, intravenózne, intramuskuláme, perorálne, mukoticky alebo intranazálne.
Vo výhodnom praktickom uskutočnení vakcína podľa tohto vynálezu obsahuje antigény obsahujúce peptidy vybraté z aspoň jedného peptidu SEQ ID NO: 1, výhodnejšie sa peptidy vyskytujú v rovnakých množstvách.
V ďalšom praktickom uskutočnení vakcína obsahuje antigény:
F VIHRLEP WLHPGSQHN1 T ASTN - NH2 (SEQ TD NO: 14).
Tieto sekvencie môžu aktivovať bunkový imunitný systém a spolupracuje s CTL-epitopmi. Zmeny v aminokyselinách zabudované v rámci CTL-epitopov sú navrhnuté tak, aby sa dosiahlo zlepšenie viazania. Vykonali sa aj ďalšie zmeny v aminokyselinách, aby sa uľahčila syntéza peptidu a/alebo sa zvýšila rozpustnosť peptidu.
Ďalším praktickým uskutočnením vynálezu je spôsob detekcie protilátok vyvolaných HIV-1 alebo HIV-1-špecifickými peptidmi alebo proteínmi vo vzorke telovej tekutiny pomocou uvedených antigénov. Tento vynález zahŕňa aj súpravu na imunologickú skúšku na uvedenú detekciu a protilátky schopné selektívne reagovať s uvedenými antigénmi.
Opis prípravy peptidov
Peptidy podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť akoukoľvek známou metódou prípravy lineárnej sekvencie aminokyselín, ako sú rekombinantné DNA techniky. Sekvencia nukleových kyselín, ktorá kóduje jeden alebo viac peptidov podľa tohto vynálezu alebo multimér uvedených peptidov sa zavedie do expresného vektora. Vhodnými expresnými vektormi sú napríklad plazmidy, kozmidy, vírusy a YAC (kvasinkové umelé chromozómy), ktoré obsahujú potrebné kontrolné oblasti na replikáciu a expresiu. Expresný vektor môže byť stimulovaný na expresiu v hostiteľskej bunke. Vhodnými hostiteľskými bunkami sú napríklad baktérie, bunky kvasiniek a bunky cicavcov. Takéto techniky sú dobre známe odborníkom v problematike a sú opísané napríklad Sambrookom a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulárne klonovanie: Laboratórna príručka), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989. Inými dobre známymi technikami sú degradácia alebo syntéza pripojením aminokyselinového zvyšku k ďalšiemu zvyšku v kvapalnej fáze alebo výhodne na tuhej fáze (živica), napríklad takzvanou Merrifieldovou syntézou. Pozri napríklad Barany a Merrifield v knihe Peptides, Analysis, Synthesis, Biology (Peptidy, analýza, syntéza, biológia), zv. 2, red. E. Gross a Meinhofer (Acad. Press, N. Y., 1980), Kneib-Coronier a Mullen, Int. J. Peptid Res., 30, s. 705 - 739 (1987) a Fields a Noble, Int. J. Peptid Proteín Res. 35, s. 161 - 214 (1990).
V prípade, že sa požaduje lineárny alebo cyklický peptid, na sekvencii aminokyselín sa vykoná krok chemickej oxidácie, aby sa pri syntetizovaní vhodných sekvencii lineárnych aminokyselín cyklizovali alebo spojili dva cysteínové zvyšky v rámci jednej alebo medzi dvoma sekvenciami peptidov, pozri Akaji a kol., Tetrahedron Letter, 33, 8, s. 1073 - 1076, 1992.
Všeobecný opis syntézy
Všetky deriváty peptidov pripravené v príkladoch uvedených neskôr sa syntetizovali na syntezátore peptidov Miliigen 9050 s použitím štandardného programu. Použitá živica bola Tenta Gel P RAM s teoretickým plnením 0,20 meq/g (RAPP POLYMERE GmBH, Tiibingen). Konečný produkt syntézy sa vysušil cez noc vo vákuu. Peptid sa potom oddelil od živice pôsobením 90 % kyseliny trifluóroctovej v prítomnosti etánditiolu (5 %) a vody (5 %) ako lapačov nečistôt (1,5 hodiny pri teplote miestnosti). Potom sa živica odfiltrovala a premyla na filtri ďalšou dávkou kyseliny trifluóroctovej (100 %) (2 x 20 ml). Spojené filtráty sa odparili vo vákuu (vodný kúpeľ pri teplote miestnosti) a zvyšok sa zmiešal s etyléterom (200 ml) a vyzrážaný produkt sa odfiltroval. Tuhá látka sa ihneď rozpustila na filtri v ľadovej kyseline octovej (100 ml), pridala sa k 1,5 1 20 % kyseliny octovej v metanole a na zmes sa pôsobilo 0,1 M roztokom jódu v metanole, až sústava získala svetlohnedú farbu. Potom sa pridal iónomenič Dowex 1 x 8 vo forme acetátu (15 g) (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) a zmes sa prefiltrovala. Filtrát sa odparil a zvyšok sa lyofilizoval z kyseliny octovej. Produkt sa potom prečistil kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci s Kromasilom® 100 - 5 C8 (EKA Nobel, Súrte, Švédsko) vo vhodnom systéme obsahujúcom acetonitril v 0,1 % vodnom roztoku kyseliny trifluóroctovej. Vzorky odobraté zo stĺpca sa analyzovali analytickou vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) (Beckman System Gold, USA) na stĺpci Kromasilu® 100 - 5 C8 (EKA Nobel, Súrte, Švédsko). Frakcie obsahujúce čistú látku sa spojili, rozpúšťadlo sa odparilo a produkt sa lyofilizoval z kyseliny octovej. Na výslednom produkte sa urobila záverečná analýza HPLC a štruktúra peptidu sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Všetky aminokyseliny použité v syntéze boli L-aminokyseliny a ich funkčná α-aminoskupina bola chránená fluórenylmetoxykarbonylovou skupinou. Bočné reťazce boli chránené nasledujúcim spôsobom:
Cys (Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Thr(tBu).
Skratky v zátvorkách znamenajú:
Trt = trifenylmetyl, t-Bu = Zerc-butyl,
OtBu = Zerc-butylester.
Deriváty aminokyselín dodala firma Bachem AG, Švajčiarsko.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava C S W VNP RLEP WN1 HP G S QHN1 T AC TN - NH2 (SEQ ID NO: 2). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Pepid sa potom cyklizoval oxidáciou pomocú I2. Peptid sa rozpustil v kyseline octovej/metanole (1 : 4) a pridalo sa 0,1 M I2 v metanole. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 97 % (menej ako 1 % jednotlivej nečistoty)
Mólová hmotnosť (voľná báza): 2746,2
Príklad 2
Príprava FVIPRLEPWN1HPGSQPN1TACTN -NH2 (SEQ ID NO: 3). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 97 % (menej ako 1 % jednotlivej nečistoty)
Mólová hmotnosť (voľná báza): 2538,0
Príklad 3
Príprava Y L L F L T K G L G I S G G G Y N1 G Cit K K R Cit Q I L G - NH2 (SEQ ID NO: 5). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Príklad 4
Príprava YLNIFLTRGLGISGGGYNIGCitKKRCitQICG - NH2 (SEQ ID NO: 6). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 97 % (menej ako 1 % jednotlivej nečistoty)
Mólová hmotnosť (voľná báza): 3097,7
Príklad 5
Príprava RILSTYLGRISGGGWLSAEPVPLQLPPL- NH2 (SEQ ID NO: 8). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 97 % (menej ako 1 % jednotlivej nečistoty) Mólová hmotnosť (voľná báza): 2990,6
Príklad 6
Príprava RILSTYLGRISGGGYLSAEPVPLQLPPL - NH2 (SEQ ID NO: 9). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Príklad 7
Príprava KLVGFPVKPQVPGGGRLLCitPNITYKAA - NH2 (SEQ ID NO: 11). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Príklad 8
Príprava RLVGFP VKPQ VPGGGRLLRPLT YK A A-NH2 (SEQ ID NO: 12). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 97 % (menej ako 1 % jednotlivej nečistoty)
Mólová hmotnosť (voľná báza): 2790,4
Molekulový vzorec: C130H217O39N29
Príklad 9
Dimerizácia pomocou disulfidického mostíka.
Sekvencie peptidov z príkladu 2 sa spojili oxidačným krokom za vzniku dipeptidu, v ktorom cysteínové zvyšky tvoria disulfidický mostík. Mostík sa vytvoril jedným z dvoch spôsobov:
A) Oxidácia pomocou I2. Peptidy (rovnaké množstvá, ak sú rôzne) sa rozpustia v kyseline octovej/metanole (1 : 4) a pridá sa 0,1 M I2 v metanole za vzniku zmesi homodiméru, alebo
B) Oxidácia pomocou [Cys(Spy)22]-SEQ ID NO: 3. 2,3 mM peptidu SEQ ID NO: 3 rozpusteného v 2 M AcOH (aq) a 2-propanolu (1 : 1) sa nechajú reagovať s 2,2-ditiodipyridínom (3 ekv.), pričom sa získa [Cys(Spy)22]-SEQ ID NO: 3. [Cys(Spy)22]-SEQ ID NO: 3 sa rozpustí v 10 mM NH4Oac (aq pH = 6,5) a metanole (5 : 2), pričom sa získa dimér SEQ ID NO: 13.
Čistota výsledného diméru sa určuje analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdzuje analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Príklad 10
Príprava F VIHRLEP WLHPG SQHN1 T ASTN-NH2 (SEQ ID NO: 14). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 98 % (menej ako 1 % jednotlivej nečistoty)
Mólová hmotnosť (voľná báza): 2540,2
Príklad 11
Príprava RL VGFP VKP Q VPGLLRP LT YK A A - NH2 (SEQ ID NO: 15). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 99 % (menej ako 1 % jednotlivej nečistoty)
Mólová hmotnosť (voľná báza): 2520,3
Príklad 12 - Referenčný príklad
Príprava prirodzenej sekvencie tatl; MESVDPRLEPWKHPGSQPKTACTN - NH2 (SEQ ID NO: 16). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 97 % (menej ako 1 % jednotlivej nečistoty)
Mólová hmotnosť (voľná báza): 2708,1
Príklad 13 - Referenčný príklad
Príprava prirodzenej sekvencie tat2; Q V CF IT KG L GI S Y GRKKRRQ RRR - NH2 (SEQ ID NO: 17). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 94 %
Mólová hmotnosť (voľná báza): 2806,4
Príklad 14 - Referenčný príklad
Príprava prirodzenej sekvencie Nef; EEVGFPVRPQVPLRPMTYKAA - NH2 (SEQ ID NO: 18). Peptid sa syntetizoval vo forme amidu zo zodpovedajúcich východiskových materiálov podľa všeobecného opisu syntézy. Čistota sa stanovila analýzou HPLC a štruktúra sa potvrdila analýzou aminokyselín a hmotnostnou spektrometriou (LDI-MS).
Čistota (HPLC): viac než 95 %
Mólová hmotnosť (voľná báza): 2384,8
Príklad 15
Pripraví sa vakcína obsahujúca peptidy SEQ ID NO: 3 a 12. Lyofilizované peptidy sa rozpustia v sterilnej vode na výslednú koncentráciu 4 mg/ml. Pripraví sa tiež preparát faktoru stimulujúceho granúl ocytovomakrofágové kolónie (GM-CSF) podľa návodu na použitie výrobcu s výslednou koncentráciou 0,3 mg/ml. Tieto dva roztoky sa podávajú intrakutánne. Typická injekčná dávka je 100 μΐ.
Príklad 16
Pripraví sa vakcína obsahujúca peptidy SEQ ID NOS: 14 a 15. Lyofdizované peptidy sa rozpustia v sterilnej vode na výslednú koncentráciu 4 mg/ml. Pripraví sa tiež preparát faktoru stimulujúceho granulocytovomakrofágové kolónie (GM-CSF) podľa návodu na použitie výrobcu s výslednou koncentráciou 0,3 mg/ml. Tieto dva roztoky sa podávajú intrakutánne. Typická injekčná dávka je 100 μΐ.
Príklad 17
Roztok alebo suspenzia antigénu sa zmieša s rovnakými množstvami Freundovho adjuvantu od Behringa, úplného alebo neúplného, a potom sa jemne emulguje natiahnutím do injekčnej striekačky a ráznym vytlačením z nej, alebo homogenizátorom. Emulzia by mala ostať stabilná aspoň 30 minút. Emulzie antigén-adjuvant je najlepšie podávať injekčné subkutánne ako depot.
Príklad 18
Imunologická skúška na detekciu protilátok vyvolaných HIV-1
Činidlá s magnetickými časticami sa pripravia podľa protokolu odporúčaného výrobcom. Dynal AS je výrobcom Dynabeads, ktoré sa použili. Magnetické častice pokryté ligandom sa nazývajú činidlo 1. Peptid podľa tohto vynálezu je kovalentne naviazaný na predaktivovaný povrch magnetických častíc. Je tiež možné absorbovať peptid íýzikálne na povrchu magnetických častíc. Koncentrácia častíc v činidle 1 je v rozsahu od 1 mg/ml do 1 5 mg/ml. Veľkosť častíc sa mení v rozsahu 0,2 pm až 15 pm. Koncentrácia peptidov je v rozsahu od 0,01 mg/mg častíc do 1 mg/mg častíc.
Antihumánnou Ig alkalickou fosfatázou (AP) konjugované protilátkové činidlo sa pripraví podľa odporúčaného protokolu Dáko AS. Tento protokol je štandardným postupom v tomto odbore. Toto činidlo sa nazýva činidlo 2.
Roztok substrátu fenolftaleínmonofosfátu sa pripraví podľa odporúčaného protokolu Fluka AG. Tento protokol je štandardným postupom v tomto odbore. Roztok substrátu sa nazýva činidlo 3.
Použitý premývací a inkubačný tlmivý roztok je štandardný tlmivý roztok 0,05 M tris-zásady s nasledujúcimi prídavnými zlúčeninami: Tween 20 (0,01 % až 0,1 %), glycerol (0,1 % až 10 %) a chlorid sodný (0,2 % až 0,1 %).
Postup skúšky zahŕňa inkubačný krok, v ktorom sa v každej jamke zmieša 1 kvapka činidla 1 s 2 kvapkami premývacieho tlmivého roztoku. Po zmiešaní sa pridá 30 μΐ vzorky a roztok sa inkubuje 5 minút. Magnetické častice sa môžu magnetom zachytiť a kvapalina sa môže odstrániť, po čom sa magnet oddiali. Potom sa jamky vypláchnu dvakrát 4 kvapkami premývacieho roztoku, po čom nasleduje inkubácia činidlom 2. Pridá sa 1 kvapka činidla 2 s 2 kvapkami premývacieho tlmivého roztoku a roztok sa inkubuje 5 minút. Magnetické častice sa môžu magnetom zachytiť a kvapalina sa môže odstrániť, po čom sa magnet oddiali. Potom sa premývací krok opakuje a nasleduje inkubácia s činidlom 3. Do každej jamky sa pridajú 2 kvapky činidla 3 a roztok sa inkubuje 3 minúty. Výsledky sa môžu odčítať oproti bielemu pozadiu. Pozitívne výsledky sú čer12 vene (3+ = sýto červené), kým negatívne výsledky sú jasne svetložlté/svetlohnedé roztoky, aké sa získajú pri negatívnej kontrole.
Príklad 19
Terapeutická a profylaktická vakcína
Aspoň jeden z peptidov podľa tohto vynálezu vybratý zo skupiny sekvencií SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 alebo SEQ ID NO: 10 môže tvoriť antigény a predstavovať aktívnu zložku profylaktickej alebo terapeutickej vakcíny určenej na to, aby poskytovala ochranu proti vírusu ľudskej imunitnej nedostatočnosti typu 1 (HIV-1). Vakcína môže obsahovať zlúčeniny, ktoré majú priaznivé účinky pri ochrane alebo stimulácii imunitného systému hostiteľa (človeka alebo iného živočícha-stavovca), napríklad interleukíny, interferóny, rastové faktory granulocytov-makrofágov, hematopoetické rastové faktory a podobne. Vakcíny ďalej výhodne obsahujú adjuvant alebo vehikulum, výhodnejšie je adjuvantom alebo vehikulom monofosforyllipid A (MPL®), prípadne s alumom, Freundov adjuvant (úplný alebo neúplný) alebo hydroxid hlinitý. Optimálne množstvo adjuvantu/vehikula bude závisieť od vybratého typu (typov).
Peptidy podľa tohto vynálezu by sa mohli modifikovať C-koncovou adíciou jednoduchej mastnej kyseliny, ako je jednoduchý palmitoylový reťazec, za vzniku lipopeptidovej vakcíny. Lipopeptidy sa môžu ďalej zaviesť do lipozómových membrán metódou cyklov zmrazenia a roztopenia, čím sa získajú lipozómy, ktoré majú na svojom povrchu peptidové ligandy.
Preparát peptidu alebo vakcíny sa pred uskladnením môže lyofilizovať. Lyofilizované peptidy sa môžu rozpustiť v sterilnej vode na konečnú koncentráciu 0,1 - 100 mg/ml. Vakcína sa môže skladovať výhodne pri nízkej teplote, v ampulách obsahujúcich jednu alebo viac jednotkových dávok použiteľných bez úpravy. Typická jednotková dávka peptidu podľa tohto vynálezu je v rozmedzí koncentrácií: 0,05 pg - 1 mg na kg telesnej hmotnosti, výhodne 0,15 pg 0,15 mg na kg telesnej hmotnosti. Osoby s praxou v problematike ocenia, že vhodná dávka bude závisieť od telesnej hmotnosti pacienta, od typu ochorenia závažnosti stavu, spôsobu podávania a niektorých ďalších faktorv. Keď sa používa vakcína ako terapeutická, môže sa podať až dvanásťkrát, injekčné. Za tým môžu nasledovať aj ďalšie dávky injekcií a v niektorých prípadoch sa môže pokračovať počas celého života pacientov. Pri príprave injekčného roztoku sa peptidy rozpustia v sterilnej vode na výslednú koncentráciu 1 mg/ml peptidu. Typický objem injekcie je 100 pl až 200 pl (2 x 100 pl). Peptid sa výhodne podáva spolu s vhodným adjuvantom a/alebo s rastovým faktorom granulocytov makrofágov, napríklad s prípravkom Leucomax® «Shering Plough» pripraveným v koncentračnom rozsahu od 0,1 mg/ml do 1 mg/ml alebo podľa návodov na použitie od ich výrobcov. Obzvlášť výhodnou je kombinovaná terapia, kde sa tieto peptidy podávajú spolu s peptidmi, ktoré sú opísané v publikovanej medzinárodnej prihláške patentu č. PCT/NO00/00075 a/alebo v spoločne prejednávanej prihláške nórskeho patentu č. 20004413. Tieto peptidy sa môžu podávať súčasne alebo po sebe. Vhodným spôsobom podania môže byť intrakutánne, subkutánne, intravenózne, perorálne, intramuskuláme, intranazálne, mukozálne alebo inou vhodnou cestou. Na udržanie ochranného účinku sa môže vyžadovať opakované podávanie. Pre odborníkov v problematike bude zrejmé, že vakcínové kompozície podľa tohto vynálezu sú prospešné nielen v prevencii infekcie, ale aj pri liečbe infekcie.
Žiadne toxické účinky peptidov podľa tohto vynálezu sa nepozorovali, keď sa podali injekčné myšiam v dávke 100 pg na kg telesnej hmotnosti.
Uvedené príklady sú mienené len ako ilustrácia vynálezu. Musí to byť chápané tak, že osoba s praxou v problematike môže modifikovať tu opísané peptidy, antigény a vakcíny tak, že sa neodchýlia od zmyslu a z rámca tohto vynálezu, ako je uvedené v nárokoch.
ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:
(i) PRIHLASOVATEĽ:
(A) MENO: Bionor Immuno AS (B) ULICA: Stramdalsjordet 4, P, O. Box 1893 Gulset (C) MESTO: 3703 Skien (E) ŠTÁT: Nórsko (F) POŠTOVÝ KÓD (ZIP): N-3705 (G) TELEFÓN: +47 35 50 57 50 (H) TELEFAX: +47 35 50 57 01 (i) PÔVODCA:
(A) MENO : Birger Sorensen (B) ULICA : Meierlia 3 (C) MESTO : 3727 Skien (D) ŠTÁT: Nórsko (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Regulačné a pomocné peptidy HIV, antigény, vakcínové kompozície, súprava na imunologickú skúšku a spôsob detekcie protilátok vyvolaných HIV.
(iii) POČET SEKVENCII: 18 (iv) POČÍTAČOVÁ ČÍTACIA FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM Kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: Windows 2000 (D) SOFTWARE: Word 7.0 (v) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:
ČÍSLO PRIHLÁŠKY:
(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 - 24 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie (v) (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 1 je Met, Ser, Cys alebo nič ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 2 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = ” Xaa v polohe 2 je Glu, Asp, Val, Ser alebo nič ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 3 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 3 je Ser, Gin, Pro, Leu, Val, Ala, Trp, Tyr alebo Phe ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 4 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 4 je Val alebo íle ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 5 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 5 je Asp, Asn alebo íle ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 6 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 6 je Pro, His alebo Ala ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 7 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 7 je Arg, Asn, Ser, Lys, Glu alebo Asp ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 12 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 12 je Leu, íle alebo Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 15 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 15 je Gly alebo Pro ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 16 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 16 je Ser, Asn alebo Ala ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 17 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 17 je Gin, Lys alebo Thr ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 18 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 18 je Pro alebo His ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 19 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 19 je Lys, Thr, Ser, Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, íle alebo Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 20 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 20 je Thr, Ala, alebo íle ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 21 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 21 je Ala, Pro, Asp alebo Val ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 22 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 22 je Cys alebo Ser ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 23 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 23 je Thr, Asn alebo Ser ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 24 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 24 je Asn, Lys, Arg, Gin, Ala, Pro alebo
Thr ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Cys v polohe 1 môže tvoriť časť disulfidického mostíka ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 22 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Cys v polohe 22 môže tvoriť časť disulfidického mostíka (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa,, Xaa7 Leu Glu Pro Trp Xaa]2 His Pro Xaai5 Xaa,6 Xaai7 15 10 15
Xaaig Xaa μ; Xaa2o Xaa2i Xaa22 Xaa23 Xaa24 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid HY(iii) POTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 1...22 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Cys v polohe 1 a 22 môže tvoriť časť vnútroreťazcového disulfidického mostíka (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 2:
Cys Ser Trp Val Asn Pro Arg Leu Glu Pro Trp Nie His Pro Gly Ser Gin His Nie Thr 15 10 15 20
Ala Cys Thr Asn (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3:
Phe Val íle Pro Arg Leu Glu Pro Trp Nie His Pro Gly Ser Gin Pro Nie Thr Ala Cys 15 10 15 20
Thr Asn (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 - 27 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 1 je Pro, íle, Leu, Thr, Tyr alebo Val ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 2 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 2 je Val, Ala Cys, Leu, ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 3 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 3 je Cys, íle, Leu, Val alebo Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 5 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 5 je íle, Leu, Gin, Met alebo Thr ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 6 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 6 je Thr, Asn, Lys alebo Arg ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 7 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 7 je Lys, Arg alebo Gin ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 8 je Gly alebo Ala ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 9 je Leu alebo íle ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 10 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 10 je Gly, Ser alebo Ala ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 11 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 11 je íle alebo Gly ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 12 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 12 je Ser, Phe alebo Tyr ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: Xaaj vložený pred polohou 14 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaaj vložený pred polohou 14 je Leu, íle, Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 15 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 15 je Arg, Lys, Ser alebo Citrulín ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 19 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 19 je Arg, Lys, Ser, Gly alebo Citrulín ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 20 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 20 je Gin, Arg alebo Pro ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 21 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = ” Xaa v polohe 21 je íle alebo Leu ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 22 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 22 je Gly, Leu, íle, Cys alebo nič ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 23 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 23 je Gly alebo nič ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 12..13 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = '' prípadne vložený spoj -Zix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 2, 3 a 22 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Cys v polohách 2, 3 a 22 môže tvoriť časť disulfidického mostíka (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4:
Xaa, Xaa2 Xaa3 Phe Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa,0 Xaan Xaai2 -Z- Tyr Xaa( Gly 15 10 15
Xaa,5 Lys Lys ArgXaai9Xaa20 Xaa2[ Xaa22Xaa23 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 27 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 12..13 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = vložený Gly-mostík 3 zvyškov (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 5:
Tyr Leu Leu Phe Leu Thr Lys Gly Leu Gly íle Ser Gly Gly Gly Tyr Nie Gly Cit Lys Lys 15 10 15 20
Arg Cit Gin íle Leu Gly 25 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 28 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 12..13 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = vložený Gly-mostík 3 zvyškov ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 27 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Cys v polohe 27 môže tvoriť časť disulfidického mostíka (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6:
Tyr Leu Nie Phe Leu Thr Arg Gly Leu Gly íle Ser Gly Gly Gly Tyr Nie Gly Cit Lys Lys 1 5 10 15 20
Arg Cit Gin íle Cys Gly 25 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 25 - 28 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 1 je Phe, Tyr, Trp alebo Arg ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 4 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 4 je Gly, Ser, Asn, Asp, Cys, Val, Thr, Ala, alebo Arg ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 5 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 5 je Thr, Ala, Asp, Asn alebo Ser ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 6 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 6 je Tyr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Val alebo Leu ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 10 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 10 je Ser, Pro, Phe, Leu alebo íle ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 11 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 11 je Ala, Thr, Glu, Gin, Val, Pro alebo Ser ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 12 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 12 je Glu, Lys, Gin, Asp, Asn, Tyr, Trp alebo Phe ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: Xaa, vložený za polohou 13 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa, vložený za polohou 13 je Ser, Pro, Phe, Leu alebo íle ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: Xaa; vložený pred polohou 14 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa, vložený pred polohou 14 je Ala, Thr, Glu, Gin, Val, Pro, alebo Ser ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 14 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 14 je Glu, Lys, Gin, Asp alebo Asn ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 15 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 15 je Pro, Ser, Ala alebo Asn ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 16 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 16 je Val, Asn, Gly alebo Pro ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 17 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 17 je Pro, Gin, His, Ser, Leu, Arg, Thr, Asp alebo íle ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 18 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 18 je Leu Phe alebo Val ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 19 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 19 je Gin, Leu, Pro, His, Asp alebo Glu ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 11..12 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = pripadne vložený spoj -Zix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) cUMIESTNENIE: 4 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Cys v polohe 4 a 6 môže tvoriť časť disulfidického mostíka (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7:
Xaa, íle Leu Xaa4 Xaa$ Xaa6Leu Gly Arg Xaaio Xaan -Z- Xaa12 Leu13 Xaa, Xaa, Xaai4 1 5 10 15
Xaa,5 Xaai6 Xaai7 Xaa18 Xaa19 Leu Pro Pro Leu 20 25 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 28 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 11..12 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = vložený [Gly]n mostík, kde n = 3 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8:
Arg íle Leu Ser Thr Tyr Leu Gly Arg íle Ser Gly Gly Gly Trp Leu Ser Ala Glu Pro Val 15 10 15 20
Pro Leu Gin Leu Pro Pro Leu 25
INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 28 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 11..12 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = vložený [Gly],, mostík, kde n = 3 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 9:
Arg íle Leu Ser Thr Tyr Leu Gly Arg íle Ser Gly Gly Gly Tyr Leu Ser Ala Glu Pro Val 15 10 15 20
Pro Leu Gin Leu Pro Pro Leu 25 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 - 29 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 1 je Lys alebo Arg ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 5 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 5 je Phe alebo Leu ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 7 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 7 je íle alebo Val ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 8 je Thr, Arg, Lys, Ala alebo Met ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 10 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 10 je Gin alebo His ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 11 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 11 je Val, Leu alebo íle ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: Xaaj vložený pred polohou 13 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Leu je vložený pred polohou 13 ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 13 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 13 je Leu, Val alebo Thr ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 14 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 14 je Arg alebo Cit ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 16 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 16 je Met, Val, íle, Leu alebo Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 17 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 17 je Thr alebo Asp ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 18 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 18 je Tyr, Phe alebo Arg ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 19 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 19 je Lys alebo Arg ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 20 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 20 je Ala, Gly, Ser, Glu aleho Gin ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 21 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Xaa v polohe 21 je Ala, Ser alebo Val ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 12...(LeUi Xaa13) (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = prípadne spoj -Z- a/alebo [Arg]m mostík je vložený medzi Xaa]2 a (Leu( Xaa,3), kde m je 0,1, 2 alebo 3.
(xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:
Xaai Leu Val Gly Xaa5 Pro Xaa7Xaa8 Pro Xaa,0 Xaait Pro -Z- [Arg]m LeUj Xaa,3 1 5 10
Xaa,4 Pro Xaa,b Xaaj7 Xaä|8Xaai9 Xaa2oXaa2i 15 20
INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 26 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: 12...(LeUiXaa,3....) (C) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = spoj -Z-je [Gly],, kde n je 3 a [Arg]ra kde m je 1.
(xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11:
Lys Leu Val Gly Phe Pro Val Lys Pro Gin Val Pro Gly Gly Gly Arg Leu Leu Cit Pro Nie
10 15 20
Thr Tyr Lys Ala Ala 25 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 26 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (E) UMIESTNENIE: 12...(LeUiXaal3) (F) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = spoj -Z-je [Gly]„ kde nje 3 a [Arg]m kde m je 1.
(xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12:
Arg Leu Val Gly Phe Pro Val Lys Pro Gin Val Pro Gly Gly Gly Arg Leu Leu Arg Pro Leu
10 15 20
Thr Tyr Lys Ala Ala 25 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 44 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: dvojitý (D) TOPOLOGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: dimérický peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie ix) ZNAKY:
(A) MENO/KĽÚČ: Modifikované miesto (B) UMIESTNENIE: disulfidická väzba medzi polohou 20 v SEQ ID NO: 3 a polohou 20 v SEQ ID
NO: 3 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: dvojitý (D) TOPOLOGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 14:
Phe Val íle His Arg Leu Glu Pro Trp Leu His Pro Gly Ser Gin His Nie Thr Ala Ser Thr Asn
5 10 15 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 23 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: dvojitý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15:
Arg Leu Val Gly Phe Pro Val Lys Pro Gin Val Pro Gly Leu Leu Arg Pro Leu Thr Tyr Lys Ala
5 10 15 20
Ala (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: dvojitý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie, tatl prirodzená sekvencia (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 16:
Met Glu Ser Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gin Pro Lys Thr Ala Cys 15 10 15 20
Thr Asn (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 23 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: dvojitý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie, tat2 prirodzená sekvencia (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17:
Gin Val Cys Phe íle Thr Lys Gly Leu Gly íle Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10 15 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 18:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZEC: dvojitý (D) TOPOLÓGIA: obidvoje (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: Nie, prirodzená Nef sekvencia (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18:
Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gin Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Ala 1 5 10 21

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Peptid odvodený od regulačného proteínu H1V-1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa aspoň jednu sekvenciu aminokyselín vybratú z nasledujúcich skupín sekvencii aminokyselín:
    Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa^ Xaa7 Leu Glu Pro Trp Xaa12 His Pro Xaa,5 Xaaj6 Xaai7 Xaa,g Xaaig Xaa2o Xaa21 Xaa22 Xaa22 Xaa24 (SEQ ID NO: 1), kde aminokyseliny reťazca majú nasledujúci význam;
    Xaa v polohe 1 derivátu peptidu je Met, Ser, Cys alebo nič,
    Xaa v polohe 2 je Glu, Asp, Val, Ser alebo nič,
    Xaa v polohe 3 je Trp, Tyr alebo Phe,
    Xaa v polohe 4 je Val alebo íle,
    Xaa v polohe 5 je íle,
    Xaa v polohe 6 je Pro, His alebo Ala,
    Xaa v polohe 7 je Arg, Asn, Ser, Lys, Glu alebo Asp,
    Xaa v polohe 12 je Leu, íle alebo Nie,
    Xaa v polohe 15 je Gly alebo Pro,
    Xaa v polohe 16 je Ser, Asn alebo Ala,
    Xaa v polohe 17 je Gin, Lys alebo Thr,
    Xaa v polohe 18 je Pro alebo His,
    Xaa v polohe 19 je Leu, íle alebo Nie,
    Xaa v polohe 20 je Thr, Ala alebo íle,
    Xaa v polohe 21 je Ala, Pro, Asp alebo Val,
    Xaa v polohe 22 je Cys alebo Ser,
    Xaa v polohe 23 je Thr, Asn alebo Ser,
    Xaa v polohe 24 je Asn, Lys, Arg, Gin, Ala, Pro alebo Thr, terminálnymi ukončeniami sekvencií môžu byť voľné karboxylové skupiny alebo aminoskupiny, amidy, acyly, acetyly alebo ich soli, dva alebo viac Cys zvyškov môže tvoriť časť vnútroreťazcovej alebo medzireťazcovej disulfidickej väzby, mostík -S-(CH2)P-S- alebo -(CH2)P-, v ktorom p = 1 až 8, prípadne s vloženým jedným alebo viacerými heteroatómami, ako je O, N alebo S, a/alebo sú uvedené sekvencie peptidov imobilizované na tuhom nosiči.
  2. 2. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sekvencia aminokyselín SEQ ID NO: 1 je vybratá zo skupín SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 14.
  3. 3. Antigén, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa aspoň jeden peptid podľa nároku 1 až 2.
  4. 4. Vakcínová kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa antigén podľa nároku 3 s farmaceutický prijateľným riedidlom a prípadne s adjuvantom, nosičom a/alebo vehikulom a prípadne s prídavnou imunostimulačnou látkou (látkami).
  5. 5. Vakcínová kompozícia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa aspoň jeden peptid z SEQ ID NO: L
  6. 6. Vakcínová kompozícia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa peptid SEQ ID NO: 14.
  7. 7. Vakcínová kompozícia podľa nárokov 4až 6, vyznačujúca sa tým, že peptidy sú rozpustené v sterilnej vode a prípadná imunostimulačná zlúčenina je rastový faktor granulocytovej makrofágovej kolónie.
  8. 8. Vakcínová kompozícia podľa nárokov 4 až 7, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa adjuvant vybratý zo skupiny monofosforyllipid A, Freundov úplný alebo neúplný adjuvant alebo hydroxid hlinitý.
  9. 9. Vakcínová kompozícia, vyznačujúca sa tým, že antigén podľa nároku 3 je vo forme lipopeptidového a/alebo lipozómového prípravku.
  10. 10. Spôsob detekcie protilátok vyvolaných HIV alebo HlV-špecifíckými peptidmi alebo proteínmi vo vzorke telesnej tekutiny, vyznačujúci sa tým, že sa na uvedenej vzorke vykoná imunologická skúška, v ktorej je(sú) antigén(y) vybratý(é) z peptidov podľa nárokov 1 a 2.
  11. 11. Súprava na imunologickú skúšku na detekciu protilátok vyvolaných HIV alebo HlV-špecifickými peptidmi alebo proteínmi vo vzorke telesnej tekutiny, vyznačujúca sa tým, že diagnostickým antigénomje peptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 alebo 2.
  12. 12. Protilátka vyznačujúca sa tým, že je schopná selektívne reagovať s antigénom podľa nároku 3.
  13. 13. Plazmidová DNA, vyznačujúca sa tým, že kóduje jeden alebo viac antigénov podľa nároku 3.
  14. 14. Antigén podľa nároku 3 na použitie na ochranu proti infekcii HIV typu 1.
  15. 15. Použitie antigénov podľa nároku 3 na prípravu liečiva na ochranu proti infekcii HIV typu 1.
SK401-2003A 2000-09-04 2001-09-03 Peptide derived from HIV-1 regulatory protein, antigens and use thereof, vaccine composition, method of detecting antibodies induced by HIV, immunoassay kit, antibody and plasmid DNA SK287913B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20004412A NO314587B1 (no) 2000-09-04 2000-09-04 HIV regulatoriske- og hjelpepeptider, antigener, vaksinepreparater, immunoassay testsett og en metode for påvisning av antistoffer fremkaltav HIV
PCT/NO2001/000363 WO2002020555A2 (en) 2000-09-04 2001-09-03 Hiv peptides from tat, rev and wef conserved regions and their application as e.g.vaccine components

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK4012003A3 SK4012003A3 (en) 2003-09-11
SK287913B6 true SK287913B6 (sk) 2012-03-02

Family

ID=19911532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK401-2003A SK287913B6 (sk) 2000-09-04 2001-09-03 Peptide derived from HIV-1 regulatory protein, antigens and use thereof, vaccine composition, method of detecting antibodies induced by HIV, immunoassay kit, antibody and plasmid DNA

Country Status (18)

Country Link
US (1) US7097971B2 (sk)
EP (1) EP1322666B1 (sk)
JP (1) JP2004508382A (sk)
CN (2) CN101628933A (sk)
AR (1) AR033997A1 (sk)
AT (1) ATE378350T1 (sk)
AU (2) AU8633601A (sk)
BR (1) BR0114046A (sk)
CA (1) CA2421199A1 (sk)
DE (1) DE60131432T2 (sk)
EA (1) EA006210B1 (sk)
ES (1) ES2296793T3 (sk)
HU (1) HUP0303132A3 (sk)
NO (1) NO314587B1 (sk)
NZ (2) NZ535908A (sk)
SK (1) SK287913B6 (sk)
WO (1) WO2002020555A2 (sk)
ZA (1) ZA200301742B (sk)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6982086B2 (en) 2000-02-04 2006-01-03 Duke University Human immunodeficiency virus immunogenic composition
CA2645342A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Peptcell Limited Peptides of regulatory or accessory proteins of hiv, compositions and the utilization thereof
JP4931483B2 (ja) * 2006-06-14 2012-05-16 ルネサスエレクトロニクス株式会社 半導体不良解析装置、不良解析方法、及び不良解析プログラム
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CN102210874A (zh) * 2011-05-17 2011-10-12 浙江大学 一种hiv重组亚型dna疫苗的制备方法
PL2691530T3 (pl) 2011-06-10 2019-02-28 Oregon Health & Science University Glikoproteiny i rekombinowane wektory CMV
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
MX2014014683A (es) * 2012-06-06 2015-02-24 Bionor Immuno As Peptidos derivados de proteinas virales para usarse como inmunogenos y reactivos de dosificacion.
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
DK2928910T3 (da) * 2012-12-06 2019-10-07 Pin Pharma Inc Behandling af inflammation, autoimmune og neurodegenerative sygdomme med immunosuppressive tat-derivat polypeptider
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5219990A (en) * 1991-01-28 1993-06-15 Biogen, Inc. Papillomavirus e2 trans-activation repressors
WO1994015634A1 (en) * 1992-12-30 1994-07-21 Matthias Rath Tat and rev oligopeptides in hiv treatment
WO1996027389A1 (fr) * 1995-03-08 1996-09-12 Neovacs Immunogenes denues de toxicite derivant d'une proteine de regulation retrovirale, anticorps, procede de preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant
US5891994A (en) * 1997-07-11 1999-04-06 Thymon L.L.C. Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1
IT1297090B1 (it) 1997-12-01 1999-08-03 Barbara Ensoli Tat di hiv-1 o suoi derivati, da soli od in combinazione, a scopo vaccinale, profilattico e terapeutico, contro l'aids i tumori e le
FR2773156B1 (fr) 1997-12-26 2000-03-31 Biovacs Inc Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida
NO311807B1 (no) 1999-03-04 2002-01-28 Bionor Immuno As HIV-peptider, antigener, vaksinepreparater, immunoassay- testsett og en metode for påvisning av antistoffer fremkalt av HIV
WO2000078969A1 (en) 1999-06-21 2000-12-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv tat peptides and multiple peptide conjugate system
SE0001351L (sv) * 2000-04-12 2001-03-26 Kjell Sjoegren Smådjurstoalett

Also Published As

Publication number Publication date
EP1322666B1 (en) 2007-11-14
NO20004412L (no) 2002-03-05
JP2004508382A (ja) 2004-03-18
EP1322666A2 (en) 2003-07-02
AU2001286336B2 (en) 2007-03-15
NO20004412D0 (no) 2000-09-04
NZ524557A (en) 2005-04-29
EA200300335A1 (ru) 2003-08-28
HUP0303132A3 (en) 2012-09-28
NO314587B1 (no) 2003-04-14
CN101628933A (zh) 2010-01-20
US7097971B2 (en) 2006-08-29
DE60131432D1 (de) 2007-12-27
CA2421199A1 (en) 2002-03-14
WO2002020555A2 (en) 2002-03-14
ZA200301742B (en) 2004-06-21
BR0114046A (pt) 2003-07-22
US20050053616A1 (en) 2005-03-10
AR033997A1 (es) 2004-01-21
ATE378350T1 (de) 2007-11-15
NZ535908A (en) 2006-03-31
EA006210B1 (ru) 2005-10-27
AU8633601A (en) 2002-03-22
ES2296793T3 (es) 2008-05-01
DE60131432T2 (de) 2008-09-18
WO2002020555A3 (en) 2002-06-06
HUP0303132A2 (hu) 2005-03-29
CN1458936A (zh) 2003-11-26
SK4012003A3 (en) 2003-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5814331B2 (ja) Ｈｉｖペプチド、抗原、ワクチン組成物、免疫学的検定キット及びｈｉｖによって誘発された抗体を検出する方法
US7612168B2 (en) Modified HIV peptides, antigens, compositions, immunoassay kit and a method of detecting antibodies induced by HIV
AU2001282706A1 (en) HIV peptides from conserved in gag p17 and 924 and their application in E.G. vaccines
SK287913B6 (sk) Peptide derived from HIV-1 regulatory protein, antigens and use thereof, vaccine composition, method of detecting antibodies induced by HIV, immunoassay kit, antibody and plasmid DNA
AU2001286336A1 (en) HIV peptides from Tat, Rev and Wef conserved and their application as E.G. vaccine components
AU2004200155C1 (en) HIV peptides, antigens, vaccine compositions, immunoassay kit and a method of detecting antibodies induced by HIV

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20120120