ES2296793T3 - Peptidos de vih de regiones conservadas, tat, rev y wef y su aplicacion como por ejemplo componentes de vacuna. - Google Patents

Peptidos de vih de regiones conservadas, tat, rev y wef y su aplicacion como por ejemplo componentes de vacuna. Download PDF

Info

Publication number
ES2296793T3
ES2296793T3 ES01965768T ES01965768T ES2296793T3 ES 2296793 T3 ES2296793 T3 ES 2296793T3 ES 01965768 T ES01965768 T ES 01965768T ES 01965768 T ES01965768 T ES 01965768T ES 2296793 T3 ES2296793 T3 ES 2296793T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
xaa
peptide
ser
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01965768T
Other languages
English (en)
Inventor
Birger Sorensen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bionor Immuno AS
Original Assignee
Bionor Immuno AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bionor Immuno AS filed Critical Bionor Immuno AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2296793T3 publication Critical patent/ES2296793T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/974—Aids related test
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Péptido derivado de la proteína reguladora del VIH-1, en el que dicho péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos: en las que los aminoácidos de la cadena tienen los siguientes significados; Xaa en posición 1 del derivado peptídico es Met, Ser, Cys o ninguno, Xaa en posición 2 es Glu, Asp, Val, Ser o ninguno, Xaa en posición 3 es Trp, Tyr o Phe, Xaa en posición 4 es Val o Ile, Xaa en posición 5 es Ile, o Asn, Xaa en posición 6 es Pro, His o Ala, Xaa en posición 7 es Arg, Asn, Ser, Lys, Glu o Asp, Xaa en posición 12 es Leu, Ile o Nle, Xaa en posición 15 es Gly o Pro, Xaa en posición 16 es Ser, Asn o Ala, Xaa en posición 17 es Gln, Lys o Thr, Xaa en posición 18 es Pro o His, Xaa en posición 19 es Leu, Ile o Nle, Xaa en posición 20 es Thr, Ala o Ile, Xaa en posición 21 es Ala, Pro, Asp o Val, Xaa en posición 22 es Cys o Ser, Xaa en posición 23 es Thr, Asn o Ser, Xaa en posición 24 es Asn, Lys, Arg, Gln, Ala Pro o Thr, los extremos terminales de las secuencias pueden ser grupos amino o carboxilo libres, amidas, acilos, acetilos o sales de los mismos, dos o más residuos de los residuos de Cys pueden formar parte de un puente disulfuro intracatenario o intercatenario, un puente -S-(CH2)p-S- o un puente -(CH2)p en el que p = 1-8, interrumpidos opcionalmente por uno o más heteroátomos tales como O, N y S y/o las dichas secuencias peptídicas están inmovilizadas en un soporte sólido.

Description

Péptidos de VIH de regiones conservadas, Tat, Rev y Wef y su aplicación como por ejemplo componentes de vacuna.
La presente invención se refiere a péptidos novedosos basados en regiones conservadas de las proteínas reguladoras del VIH, a antígenos en forma unida a un soporte o libre que comprenden al menos uno de dichos péptidos, a composiciones de vacuna que contienen al menos uno de los antígenos, a kits de inmunoensayo y a un método de detección de anticuerpos, inducidos por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o péptidos específicos del VIH, usando tales antígenos.
Antecedentes
El virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-1), el agente causante del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) continúa presentando un desafío formidable para la salud en países en desarrollo. En el mundo occidental, las estrategias terapéuticas que seleccionan como diana la replicación y maduración del VIH-1 han tenido un impacto prominente sobre la evolución de la enfermedad. Sin embargo, el elevado coste del tratamiento actual, la elevada toxicidad de los fármacos y la ausencia de curación significan que el desarrollo de vacunas seguras y eficaces sigue siendo primordial para el control de la pandemia de SIDA.
VIH-1 es un retrovirus complejo que codifica seis genes reguladores y auxiliares no encontrados en los retrovirus sencillos, concretamente tat, rev, nef, vif, vpr y vpu (tabla 1). En células eucariotas, sólo se exportan al citoplasma ARNm completamente cortados y empalmados para su traducción. Los ARN no cortados ni empalmados o parcialmente cortados y empalmados se retienen y finalmente se degradan en el núcleo. De esta forma, las proteínas codificadas por los genes tat, rev y nef (designados Tat, Rev y Nef) derivados de especies de ARN cortados y empalmados de manera múltiple, se expresan en primer lugar y constituyen la expresión génica del VIH-1 temprana. Con el fin de expresar ARN cortado y empalmado de manera única y también transportar el genoma de ARN no cortado ni empalmado de longitud completa al citoplasma para su empaquetamiento, VIH-1 ha desarrollado medios para superar las restricciones en el transporte de ARN. Las proteínas reguladoras, Tat y Rev, son esenciales para la replicación del VIH-1 dado que las mutaciones en estas proteínas eliminan la producción del VIH-1 (Dayton A.I., et al. (1986) Cell, 44:941-947, y Fisher, A.G., et al. (1986) Nature, 320:367-371.).
Los genes auxiliares se derivan de exones colocados completamente en el sentido de 5' del gen de la envuelta del VIH-1, por ejemplo vif o exones en el sentido de 5' del mismo así como dentro de env pero en diferentes marcos de lectura, por ejemplo tat, rev. La eficacia del corte y empalme regula en parte los niveles de expresión génica de las diferentes proteínas auxiliares.
Tras la integración del ADN proviral del VIH-1, se sintetizan formas predominantemente truncadas de ARNm mediante la ARN polimerasa II celular que interacciona con sitios en la repetición terminal larga en 5' (LTR) del ADN proviral. tat es uno de los primeros genes que va a expresarse y porta una señal de localización nuclear. Es un potente activador de la transcripción que potencia la transcripción dirigida por LTR hasta en mil veces. La expresión continua de Tat garantiza un bucle de retroalimentación positivo para la expresión génica continuada de alto nivel. A diferencia de los activadores de la transcripción convencionales que interaccionan con las secuencias de ADN, Tat se une directamente a los extremos 5' de todos los ARN del VIH-1 en una estructura secundaria de tallo-bucle específica, TAR (elemento de respuesta de activación en trans). La estructura del bucle está altamente conservada y es esencial para la función de Tat. La estructura de la interacción Tat/TAR se ha analizado usando resonancia magnética nuclear (RMN) (Puglisi et al. (1992) Science, 257:76-80). Tat se une a TAR en asociación con la proteína celular, ciclina T, que a su vez se une a CDK9 que fosforila el dominio C-terminal de la ARN polimerasa II, promoviendo de ese modo el alargamiento de los transcritos de ARN. Estos cofactores celulares de Tat están presentes solamente en células activadas, su ausencia reprime la transcripción de ADN proviral dando como resultado una "cuasi latencia" en linfocitos T.
Tat se expresa a partir de dos exones, tanto la señal de localización nuclear como la región de unión a TAR se ubican en el primer exón. Tat se secreta a partir de células infectadas y puede ejercer efectos heterólogos en células vecinas. Estos incluyen activación celular (Hofman et al. (1993) Blood, 82:2774-2780.), inducción de la apoptosis celular (Macho et al. (1999) Oncogene, 18:7543-7551. 1999) funcionando como un factor de crecimiento secretable (Trinh, D.P. et. al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun., 256:299-306.) y modulando la síntesis de proteínas de la célula huésped a favor de la síntesis de proteínas viral (Xiao et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun., 244:384-389. 1998). Las estrategias terapéuticas que seleccionan como diana Tat tendrán por tanto un fuerte impacto sobre la infección por VIH-1.
Los ARNm pequeños cortados y empalmados de manera múltiple que codifican para Tat, Rev y Nef predominan durante la fase temprana tras la infección. Cuando se produce un nivel umbral de Rev, se acumulan ARN no cortados ni empalmados y cortados y empalmados de manera única en el citoplasma para su traducción, permitiendo que avance la infección productiva. Que no se genere este nivel umbral de Rev puede contribuir a la cuasi latencia del VIH. Rev sólo puede unirse a ARN que portan una estructura de ARN, RRE (elemento de respuesta a Rev) que está ubicada en la región codificante de env del genoma. Rev interacciona con el RRE como un multímero a través de una región básica rica en arginina presente en la mitad amino terminal de la proteína. Una consecuencia de esta interacción es el transporte de ARN cortados y empalmados parcialmente que proporcionarán productos génicos tales como Env, Vif, Vpu y Vpr así como ARN no cortados ni empalmados que servirán como nuevos genomas para su incorporación en partículas que están ensamblándose. El análisis estructural de la interacción Rev/RRR también se ha llevado a cabo usando RMN (Battiste et al. (1996) Science, 273:1547-1551. 1996). Rev porta una señal de exportación rica en leucina que le permite hacer de lanzadera entre el núcleo y el citoplasma para el transporte continuado de ARN recién sintetizados (Kalland et al. (1994). J. Virol., 68:1475-1485; Meyer & Malim, (1994) Genes Dev., 8:1538-1547). De esta forma, Rev garantiza que los genes estructurales se expresen tarde tras los genes reguladores. Las estrategias terapéuticas dirigidas frente a Rev interrumpirán el ciclo de vida viral de manera temprana en la infección.
Aunque se describió originalmente como un factor negativo, se ha mostrado más tarde que Nef tiene efectos positivos sobre la replicación del virus y se expresa en mayores cantidades que las de Tat y Rev, tanto de manera temprana como durante toda la infección. Nef está miristilado en el extremo N-terminal y está asociado con el lado interno de la membrana plasmática. Nef es parcialmente responsable de la regulación por disminución y de la degradación de CD4 superficial mediante endocitosis (Piguet et al. (1998) EMBO J., 17:2472-2481). La eliminación de CD4 de la superficie celular previene la superinfección con otras cepas del VIH-1, o la reinfección con virus recién liberado. Nef es también responsable de la regulación por disminución del MHC de clase 1 protegiendo de ese modo a las células infectadas de la destrucción mediante linfocitos T citotóxicos (Le Gall et al. (1997). Res. Virol., 148:43-47). Nef no es una proteína viral esencial dado que no se requiere para la infección in vitro de linfocitos de sangre periférica o líneas de células T. Sin embargo, los mutantes por deleción de Nef son menos patogénicos a lo largo de periodos de tiempo prolongados. Nef tiene también efectos complejos sobre las rutas de transducción de señales en la célula y contiene una región rica en prolina que puede interaccionar con el dominio SH3 de cinasas implicadas en la activación de células T, una característica necesaria para la replicación eficaz del VIH (Moarefi et al. (1997). Nature, 385:650-653). Los virus que contienen Nef pueden realizar más síntesis de ADN viral que los virus delecionados en el gen de Nef, lo que sugiere que Nef activa directa o indirectamente la transcriptasa inversa viral. El bajo nivel de Nef asociado con viriones puede ser responsable de este fenómeno. Se liberan también bajos niveles de Nef a partir de células infectadas, aunque no está claro el posible efecto sobre células vecinas. Dado que Nef se expresa de manera temprana en la infección y tiene efectos significativos sobre la expresión de CD4 y el MHC de clase I así como sobre la evolución de la enfermedad, representa una diana importante para futuras estrategias terapéuticas.
Tat y Nef se secretan y pueden captarse por macrófagos y expresarse en asociación con moléculas del MHC de clase II. Esto mejora su idoneidad como dianas para terapias basadas en péptidos que también se expresarían en el contexto del MHC de clase II.
Está claro que debe darse prioridad a seleccionar como diana productos génicos tempranos que son esenciales para la replicación del VIH-1, tales como Tat y Rev, además de Nef que también se expresa de manera temprana e influye sobre la evolución de la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Proteínas reguladoras y auxiliares del VIH-1
1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias del VIH que se producen de manera natural en candidatos de vacuna no pueden estimular una respuesta inmunitaria estable a largo plazo debido a la capacidad inherente de los VIH para esconderse cambiando el aspecto de los epítopos presentados al sistema inmunitario. Para superar esta presentación variable de los epítopos, determinadas sustituciones de aminoácidos y combinaciones de aminoácidos ayudarán al sistema inmunitario para presentar y reconocer estos antígenos de virus extraños de una manera fidedigna y por tanto en un mayor grado.
Basándose en los antecedentes anteriores, se decidió investigar la posibilidad de diseñar péptidos sintéticos novedosos que puedan imitar los epítopos de las proteínas reguladoras y auxiliares del VIH de tal forma que puedan exponerse tanto a la parte humoral como a la parte celular del sistema inmunitario, para satisfacer la necesidad de una vacuna profiláctica y/o terapéutica eficaz.
El trabajo inicial se basó en las secuencias de aminoácidos de Tat nativas publicadas por Korber B., et al., Human Retroviruses and AIDS 1997 Eds. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. El primer epítopo de Tat está ubicado entre el aminoácido 1 y el aminoácido 24 de la proteína Tat:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Epítopo de Tat 
\vskip1.000000\baselineskip
4
El código de una letra así como el de tres letras que definen los aminoácidos en las secuencias facilitadas a lo largo de toda esta memoria descriptiva están de acuerdo con las normas internacionales y se facilitan en libros de texto, por ejemplo Lehninger A.L., "Principies of Biochemistry", Worth Publishers Inc., Nueva York, 1982. Los aminoácidos facilitados a la derecha de la columna izquierda representan la variación natural de la secuencia. Los análisis dieron como resultado una secuencia que contenía este epítopo modificado:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\newpage
En el que Nl indica ácido 2-aminohexanoico (Norleucina, abreviado Nle y N1 en el código de tres letras y de una letra, respectivamente) y los residuos de cisteína están es un estado oxidado, es decir, están formando un puente disulfuro intracatenario. Dado que el residuo de cisteína en la parte C-terminal (en posición 22) del péptido es parte de un puente disulfuro intramolecular fuera de este epítopo seleccionado, se forma un puente disulfuro intrapeptídico similar colocando una cisteína en la parte N-terminal del epítopo seleccionado. Otra alternativa es formar un puente disulfuro intermolecular mediante dimerización de las secuencias:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
Una alternativa adicional es la dimerización con otro epítopo seleccionado de Tat. El segundo epítopo está ubicado entre el aminoácido 35 y el 57 en dirección C-terminal, separado del primer epítopo por 10 aminoácidos que contienen 5 residuos de Cys además del residuo de Cys en cada uno de los epítopos. El número relativamente alto de residuos de Cys ofrece una variedad de posibilidades de reticulación inter e intramolecular. Es probable que este dominio rico en Cys dominará la exposición inmunológica de esta proteína y por tanto provoque que los dos epítopos relevantes "se escondan". La selección y modificación de los dos epítopos adyacentes puede exponer una parte esencial de la proteína Tat de una forma más óptima.
Con el fin de reducir la probabilidad de desarrollar mutantes de escape, el número de epítopos se aumenta adicionalmente y se seleccionaron dos secuencias peptídicas adicionales. Estas secuencias están ubicadas en Rev (residuos 58-78) y Nef (residuos 65-85). Se han publicado las secuencias nativas en Human Retroviruses and AIDS 1999; A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Eds. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Epítopo de Tat
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Epítopo de Rev
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Epítopo de Nef
11
12
Se han sintetizado varios péptidos modificados con el fin de determinar la singularidad de las secuencias así como sus propiedades para la estimulación del sistema inmunitario en combinación con su especificidad y sensibilidad como antígenos del VIH-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de la invención
Los péptidos identificados se originan a partir de las cuatro áreas conservadas diferentes de las proteínas Tat, Rev y Nef del VIH-1 que se describieron anteriormente, que tienen las propiedades de mantener la singularidad (inmunogenicidad, sensibilidad y especificidad) de los epítopos del VIH-1. Además, los nuevos péptidos identificados no tienen efecto antagonístico de linfocitos T citotóxicos (CTL) reconocido y tendrán al menos un posible epítopo de CTL.
Los péptidos, según la invención, que han cumplido los criterios anteriores, comprenden al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos;
\vskip1.000000\baselineskip
100 
\vskip1.000000\baselineskip
en las que los aminoácidos de la cadena podrían tener los siguientes significados;
Xaa en posición 1 del derivado peptídico es Met, Ser, Cys o ninguno,
Xaa en posición 2 es Glu, Asp, Val, Ser o ninguno,
Xaa en posición 3 es Ser, Gln, Pro, Leu, Val, Ala, Trp, Tyr o Phe,
Xaa en posición 4 es Val o Ile,
Xaa en posición 5 es Asp, Asn o Ile,
Xaa en posición 6 es Pro, His o Ala,
Xaa en posición 7 es Arg, Asn, Ser, Lys, Glu o Asp,
Xaa en posición 12 es Leu, Ile o Nle,
Xaa en posición 15 es Gly o Pro,
Xaa en posición 16 es Ser, Asn o Ala,
Xaa en posición 17 es Gln, Lys o Thr,
Xaa en posición 18 es Pro o His,
Xaa en posición 19 es Lys, Thr, Ser, Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, Ile o Nle,
Xaa en posición 20 es Thr, Ala o Ile,
Xaa en posición 21 es Ala, Pro, Asp o Val,
Xaa en posición 22 es Cys o Ser,
Xaa en posición 23 es Thr, Asri o Ser,
Xaa en posición 24 es Asn, Lys, Arg, Gln, Ala Pro o Thr
los extremos terminales de las secuencias pueden ser grupos amino o carboxilo libres, amidas, acilos, acetilos o sales de los mismos, además dos o más de los residuos de Cys pueden formar parte de un puente disulfuro intracatenario o intercatenario, un puente -S-(CH_{2})_{p}-S- o un puente -(CH_{2})_{p} en el que p = 1-8, interrumpidos opcionalmente por uno o más heteroátomos tales como O, N y S y/o las dichas secuencias peptídicas están inmovilizadas en un soporte sólido.
Otros péptidos identificados incluyen
101
en los que los aminoácidos de la cadena tienen el siguiente significado;
Xaa en posición 1 es Pro, Ile, Leu, Thr, Tyr o Val,
Xaa en posición 2 es Val, Ala Cys, Leu,
Xaa en posición 3 es Cys, Ile, Leu, Val o N1e,
Xaa en posición 5 es Ile, Leu, Gln, Met o Thr,
Xaa en posición 6 es Thr, Asn, Lys o Ara,
Xaa en posición 7 es Lys, Arg o Gln,
Xaa en posición 8 es Gly o Ala,
Xaa en posición 9 es Leu o Ile,
Xaa en posición 10 es Gly, Ser o Ala,
Xaa en posición 11 es lie o Gly,
Xaa en posición 12 es Ser, Phe o Tyr,
Xaa_{i} insertado antes de la posición 14 es Leu, Ile, Nle,
Xaa en posición 15 es Arg, Lys, Ser o citrulina (Cit),
Xaa en posición 19 es Arg, Lys, Ser, Gly o Cit,
Xaa en posición 20 es Gln, Arg o Pro,
Xaa en posición 21 es Ile o leu,
Xaa en posición 22 es Gly, Leu, Ile, Cys o ninguno,
Xaa en posición 23 es Gly o ninguno,
en los que la secuencia de SEQ ID NO: 4 comprende al menos seis aminoácidos consecutivos, -Z- es un ligador opcional y tiene el significado PEG, PEG modificado y/o [Gly]_{n} en el que n = 1, 2 ó 3,
además, dos o más de los residuos de Cys pueden formar parte de un puente disulfuro intracatenario o intercatenario, un puente -S-(CH_{2})_{p}-S o un puente -(CH_{2})_{p} en el que p = 1-8, interrumpidos opcionalmente por uno o más heteroátomos tales como O, N o S,
102
en la que
Xaa en posición 1 es Phe, Tyr, Trp o Arg,
Xaa en posición 4 es Gly, Ser, Asn, Asp, Cys, Val, Thr, Ala, o Arg,
Xaa en posición 5 es Thr, Ala, Asp, Asn o Ser,
Xaa en posición 6 es Tyr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Val o Leu,
Xaa en posición 10 es Ser, Pro, Phe, Leu o Ile,
Xaa en posición 11 es Ala, Thr, Glu, Gln, Val Pro o Ser,
Xaa en posición 12 es Glu, Lys, Gln, Asp, Asn, Tyr, Trp o Phe,
Xaa_{i} insertado tras la posición 13 es Ser, Pro, Phe, Leu o Ile,
Xaa_{i} insertado antes de la posición 14 es Ala, Thr, Glu, Gin, Val, Pro, o Ser,
Xaa en posición 14 es Glu, Lys, Gln, Asp o Asn,
Xaa en posición 15 es Pro, Ser, Ala o Asn,
Xaa en posición 16 es Val, Asn, Gly o Pro,
Xaa en posición 17 es Pro, Gln, His, Ser, Leu, Arg, Thr, Asp o lie,
Xaa en posición 18 es Leu Phe o Val,
Xaa en posición 19 es Gln, Leu, Pro, His, Asp o Glu,
en la que la secuencia de SEQ ID NO: 7 consiste en al menos seis aminoácidos consecutivos, el ligador -Z- es opcional y tiene el significado de PEG, PEG modificado y/o [Gly]_{n} en el que n = 1, 2 ó 3,
103
en la que
Xaa en posición 1 es Lys o Arg,
Xaa en posición 5 es Phe o Leu,
Xaa en posición 7 es Ile o Val,
Xaa en posición 8 es Thr, Arg, Lys, Ala o Met,
Xaa en posición 10 es Gln o His,
Xaa en posición 11 es Val, Leu o Ile,
Xaa_{i} insertado antes de la posición 13 es Leu,
Xaa en posición 13 es Leu, Val o Thr,
Xaa en posición 14 es Arg o citrulina (Cit),
Xaa en posición 16 es Met, Val, Ile o Nle, Leu,
Xaa en posición 17 es Thr o Asp,
Xaa en posición 18 es Tyr, Phe o Arg,
Xaa en posición 19 es Lys o Arg,
Xaa en posición 20 es Ala, Gly, Ser, Glu o Gin,
Xaa en posición 21 es Ala, Ser o Val,
en la que la secuencia de SEQ ID NO: 10 consiste en al menos seis aminoácidos consecutivos, el ligador -Z- es opcional y tiene el significado de PEG, PEG modificado y/o [Gly]_{n} en el que n = 1, 2 ó 3, e independientemente de n, m en [Arg]_{m} es = 0, 1, 2 ó 3,
los extremos terminales de las secuencias pueden ser grupos amino o carboxilo libres, amidas, acilos, acetilos o sales de los mismos, y/o las dichas secuencias peptídicas están inmovilizadas en un soporte sólido.
Las nuevas secuencias peptídicas tienen el potencial para servir como un buen antígeno en el que el antígeno comprende al menos un péptido de SEQ ID NO: 1. La antigenicidad puede adaptarse a través del ajuste de la razón o concentración de diferentes péptidos o el tamaño de los péptidos mediante por ejemplo dimerización o polimerización y/o inmovilización en una fase sólida. El antígeno comprende una o más secuencias polipeptídicas, según la invención, que podrían estar o bien unidas mediante un puente, por ejemplo un puente disulfuro entre los residuos de Cys de las cadenas o puentes tipo alquileno C_{1}-C_{8} interrumpidos posiblemente mediante uno o más heteroátomos como O, S o N o preferiblemente no están unidas. Las cadenas pueden estar inmovilizadas en una fase sólida en formas monoméricas, diméricas u oligoméricas. Pueden añadirse aminoácidos adicionales a los extremos con el fin de lograr un "brazo" para facilitar la inmovilización.
PEG es polietilenglicol (HO(CH_{2}CH_{2}O)_{a}H y puede ser parte del ligador Z, opcionalmente el PEG está modificado mediante un ácido dicarboxílico (HO(CH_{2}CH_{Z}O)_{a}CO(CH_{2})_{b}COOH) o un grupo carboxílico terminal (HO(CH_{2}CH_{2}
O)_{a-1}CH_{2}COOH) en los que a = 1-10 y b = 2-6, antes de la unión.
El ligador -Z- puede consistir o bien en PEG, PEG modificado o bien en una combinación de los mismos y/o uno o más residuos de Gly combinados. Alternativamente, el ligador Z puede consistir en un puente de Gly [Gly]_{n} en el que n = 1, 2 ó 3.
Todos los aminoácidos en los péptidos de la invención puede estar tanto en forma D como L, aunque se prefiere la forma L que se produce de manera natural.
Los extremos C y N-terminales de las secuencias peptídicas pueden desviarse de las secuencias naturales mediante modificación del grupo NH_{2} terminal y/o el grupo COOH, por ejemplo pueden estar acilados, acetilados, amidados o modificados para proporcionar un sitio de unión para un soporte u otra molécula.
Los péptidos según la invención consisten en de 6 a 50 aminoácidos, preferiblemente entre 10 y 30 aminoácidos. Cubren toda la variación natural de los aminoácidos en las posiciones identificadas.
El antígeno polipeptídico según la invención está o bien en forma libre o bien unido a un soporte. El soporte o fase sólida a la que está unido opcionalmente el péptido puede seleccionarse de una amplia variedad de soportes conocidos. Debe seleccionarse con respecto al uso previsto del polipéptido inmovilizado como un antígeno de diagnóstico o como un componente de inmunización en una vacuna.
Ejemplos de soportes que pueden usarse por ejemplo para fines de diagnóstico son perlas magnéticas o látex de copolímeros tales como estireno-divinilbenceno, estireno hidroxilado-divinilbenceno, poliestireno, poliestireno carboxilado, perlas de negro de carbón, vidrio activado con poli(cloruro de vinilo) o poliestireno o no activado, vidrio magnético poroso activado con resina epoxídica, partículas de polisacárido o gelatina u otras partículas proteicas, glóbulos rojos, anticuerpos mono o policlonales o fragmentos fab de tales anticuerpos.
Según una realización adicional de la presente invención, los antígenos pueden formar parte de una vacuna combinados posiblemente con soportes, adyuvantes o combinados con otros elementos inmunoestimulantes tales como virus de la viruela del canario que porta el gen env. Ejemplos de soportes y/o adyuvantes para fines de vacuna son otras proteínas tales como albúmina sérica humana o bovina y hemocianina de lapa californiana y ácidos grasos. Los materiales inmunoestimulantes pueden dividirse en tres grupos: adyuvantes, soportes para antígenos y vehículos. Ejemplos de adyuvantes incluyen hidróxido de aluminio, sales de aluminio, saponina, di y tripéptidos de muramilo, monofosforil lípido A, ácido palmítico, B. pertussis y diversas citocinas incluyendo la citocina Thl IL-12 e IL-1. Pueden usarse varias toxinas proteicas para transportar proteínas pasajeras a través de las membranas celulares en el citosol, que son útiles para desarrollar vacunas de CTL. Los soportes incluyen toxoides bacterianos tales como toxinas del tétano y del cólera inactivadas, toxinas bacterianas genéticamente destoxificadas tales como la enterotoxina termolábil de E. coli, ácidos grasos, vectores vivos tales como quimeras de la polio y proteínas híbridas que forman materiales particulados, por ejemplo partículas de TY híbridas de retrotransposón de levaduras y partículas de HBcAg. Vehículos que son componentes que se producen frecuentemente en vacunas modernas consisten en emulsión de aceite mineral, adyuvante completo e incompleto de Freund, emulsiones de aceite vegetal, tensioactivos no iónicos de copolímero de bloque, escualeno o escualano, lipopéptidos, liposomas y microesferas biodegradables. Dos adyuvantes novedosos que presentan un potencial significativo para el desarrollo de nuevas vacunas incluyen una microemulsión de aceite en agua (MF59) y micropartículas poliméricas. Puede usarse cualquier sustancia que pueda potenciar la inmunogenicidad del
antígeno y se facilitan varias otras alternativas de soportes o adyuvantes en la farmacopea europea o estadounidense.
Una formulación adecuada del antígeno para usos inmunoestimulantes también puede comprender interferones tales como INF-y, quimiocinas antivirales o factores de crecimiento hematopoyéticos tales como el factor de crecimiento de granulocitos y macrófagos.
Otro enfoque con el fin de potenciar la estimulación y absorción por ejemplo en el intestino es administrar los péptidos de la invención con péptidos pequeños tales como di, tri o tetrapéptidos. Estos péptidos pueden administrarse además de, o en combinación con, los péptidos de la invención. Preferiblemente, los péptidos se administran junto con el tripéptido YGG, que consiste en aminoácidos en formas D o L, preferiblemente en forma D.
Enfoques recientes a la administración no parenteral de vacunas, por ejemplo a través de la mucosa, incluyen tecnología de fusión génica para crear derivados no tóxicos de adyuvantes de la mucosa, antígenos inactivados genéticamente con una deleción en un gen esencial, coexpresión de un antígeno y una citocina específica que es importante en la modulación y control de una respuesta inmunitaria de la mucosa y propio material genético que permitirá captar ADN o ARN y su expresión endógena en las células huésped.
Un enfoque para desarrollar respuestas duraderas en las que se requiere inmunidad mediada por células, es vacunar con ADN de plásmido que codifica para uno o más antígeno(s) específico(s).
Con el fin de proteger frente a la infección por VIH, las vacunas deben inducir tanto respuestas inmunitarias sistémicas como de la mucosa y pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por vía parenteral o no parenteral, tal como por vía subcutánea, por vía intracutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía oral, por vía mucosa o por vía intranasal, por ejemplo.
En una realización preferida de la vacuna según la presente invención, comprende antígenos que contienen péptidos seleccionados de al menos un péptido de SEQ ID NO: 1, se prefiere más que los diferentes péptidos se produzcan en cantidades iguales.
En una realización preferida adicional, la composición de vacuna contiene el antígeno.
Las secuencias pueden activar el sistema inmunitario celular, y contribuyen con epítopos de CTL. Los cambios de aminoácidos implementados dentro del marco de los epítopos de CTL se diseñan para lograr una unión potenciada. Se han realizado otros cambios de aminoácidos con el fin de facilitar la síntesis del péptido y/o aumentar la solubilidad del péptido.
Un método para detectar anticuerpos, inducidos por VIH-1 o péptidos o proteínas específicas del VIH-1, en una muestra de líquido corporal usando los presentes antígenos, es una realización adicional de la invención. También puede desarrollarse un kit de inmunoensayo diseñado para esta detección y anticuerpos que pueden reaccionar selectivamente con dichos antígenos.
Descripción de la preparación de los péptidos
Los péptidos de la invención pueden producirse mediante cualquier método conocido de producción de una secuencia de aminoácidos lineal, tal como técnicas de ADN recombinante. Se introduce una secuencia de ácido nucleico que codifica para uno o más péptidos de la invención o un multímero de dichos péptidos en un vector de expresión. Vectores de expresión adecuados son por ejemplo plásmidos, cósmidos, virus y YAC (cromosoma artificial de levaduras) que comprenden regiones de control necesarias para la replicación y expresión. Puede estimularse el vector de expresión para su expresión en una célula huésped. Células huésped adecuadas son por ejemplo bacterias, células de levaduras y células de mamífero. Tales técnicas se conocen bien en la técnica y se describen por ejemplo por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989. Otras técnicas bien conocidas son la degradación o síntesis mediante acoplamiento de un residuo de aminoácidos al siguiente en fase líquida o preferiblemente sobre una fase sólida (resina), por ejemplo mediante la denominada síntesis de Merrifield. Véanse por ejemplo Barany y Merrifield en Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2, E. Gross and Meinhofer, Ed. (Acad. Press, N.Y., 1980), Kneib-Coronier y Mullen Int. J. Peptide Protein Res., 30, págs. 705-739 (1987) y Fields y Noble Int. J. Peptide Protein Res., 35, págs. 161-219 (1990).
En el caso en que se desee un péptido cíclico o unido, se somete la secuencia de aminoácidos a una etapa de oxidación química con el fin de ciclar o unir los dos residuos de cisteína dentro de una o entre dos secuencias peptídicas, cuando se sintetizan las secuencias de aminoácidos lineales apropiadas, véase Akaji et al., Tetrahedron Letter, 33, 8, págs. 1073-1076, 1992.
Descripción general de la síntesis
Todos los derivados peptídicos preparados en los ejemplos facilitados a continuación se sintetizaron en un sintetizador peptídico Milligen 9050 usando un programa convencional. La resina usada fue Tenta Gel P RAM con una carga teórica de 0,20 meq/g (RAPP POLYMERE GmbH, Tübingen). Se secó el producto final de la síntesis a vacío durante la noche. Entonces se escindió el péptido de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético al 90% en presencia de etanoditiol (5%) y agua (5%) como eliminadores (1,5 horas a TA). Entonces se filtró la resina y se lavó sobre el filtro con ácido trifluoroacético adicional (100%) (2 x 20 ml). Se evaporaron los filtrados combinados a vacío (baño de agua a TA) y se trituró el residuo con etil éter (200 ml) y se eliminó el producto precipitado por filtración. Se disolvió inmediatamente el sólido sobre el filtro con ácido acético glacial (100 m1) y se añadió a 1,5 1 de ácido acético al 20% en metanol y se trató con una disolución 0,1 M de yodo en metanol hasta que quedó un color marrón claro. Entonces se añadió intercambiador iónico Dowex 1 x 8 en forma de acetato (15 g) (Bio-Rad, Richmond, CA) y se filtró la mezcla. Se evaporó el filtrado y se liofilizó el residuo en ácido acético. Entonces se purificó el producto mediante cromatografía de líquidos en fase inversa en una columna cargada con Kromasil® 100 - 5 C8 (EKA Nobel, Surte, Suecia) en un sistema adecuado que contenía acetonitrilo en una disolución acuosa de ácido trifluoroacético al 0,1%. Se analizaron las muestras recogidas de la columna mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) analítica (Beckman System Gold, EE.UU.) equipada con una columna Kromasil® 100 - 5 C8 (EKA Nobel, Surte, Suecia). Se combinaron las fracciones que contenían la sustancia pura, se evaporó el disolvente y se liofilizó el producto en ácido acético. Se realizó el análisis de HPLC final en el producto final, y se confirmó la estructura del péptido mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Todos los aminoácidos usados durante la síntesis fueron L-aminoácidos y estaban protegidos con un grupo fluorofenilmetoxicarbonilo en la función \alpha-amino. Las cadenas laterales se protegieron tal como sigue:
Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Thr(tBu).
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas dentro de los paréntesis son:
Trt = trifenilmetilo
t-Bu = terc-butilo
OtBu = éster terc-butílico
Los derivados de aminoácidos los suministró Bachem AG, Suiza.
Ejemplo 1
Preparación de C S W V N P R L E P W Nl H P G S Q H Nl T A C T N -NH_{2} (SEQ ID NO: 2). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Entonces se cicló el péptido mediante oxidación con I_{2}. Se disolvió el péptido en ácido acético/metanol (1:4) y se añadió I_{2} 0,1 M en metanol. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 97% (impureza única inferior al 1%).
Peso molecular (base libre): 2746,2.
Ejemplo 2
Preparación de F V I P R L E P W N1 H P G S Q P Nl T A C T N -NH_{2} (SEQ ID NO: 3). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 97% (impureza única inferior al 1%)
Peso molecular (base libre): 2538,0
Ejemplo 3
Preparación de Y L L F L T K G L G I S G G G Y Nl G Cit K K R Cit Q I L G -NH_{2} (SEQ ID NO: 5). Se sintetiza el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determina la pureza mediante análisis de HPLC y se confirma la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Ejemplo 4
Preparación de Y L Nl F L T R G L G I S G G G Y Nl G Cit K K R Cit Q I C G-NH_{2} (SEQ ID NO: 6). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 97% (impureza única inferior al 1%)
Peso molecular (base libre): 3097,7
Ejemplo 5
Preparación de RILSTYLGRISGGGWLSAEPVPLQLPPL-NH_{2} (SEQ ID NO: 8). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 97% (impureza única inferior al 1%)
Peso molecular (base libre): 2990,6
Ejemplo 6
Preparación de R I L S T Y L G R I S G G G Y L S A E P V P L Q L P P L -NH_{2} (SEQ ID NO: 9). Se sintetiza el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determina la pureza mediante análisis de HPLC y se confirma la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-MS).
Ejemplo 7
Preparación de K L V G F P V K P Q V P G G G R L L Cit P Nl T Y K A A -NH_{2} (SEQ ID NO: 11). Se sintetiza el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determina la pureza mediante análisis de HPLC y se confirma la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Ejemplo 8
Preparación de R L V G F P V K P Q V P G G G R L L R P L T Y K A A-NH_{2} (SEQ ID NO: 12). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 97% (impureza única inferior al 1%)
Peso molecular (base libre): 2790,4
Fórmula molecular: C_{130}H_{217}O_{39}N_{29}
Ejemplo 9 Dimerización mediante puentes disulfuro
Se unen las secuencias peptídicas del ejemplo 2 mediante una etapa de oxidación para formar un dipéptido en el que los residuos de cisteína forman un puente disulfuro. El puente se forma de cualquiera de las formas;
A) Oxidación con I_{2}. Se disuelven los péptidos (cantidades iguales si son diferentes) en ácido acético/metanol (1:4) y se añade I_{2} 0,1 M en metanol produciendo una mezcla del homodímero,
O
B) Oxidación mediante [Cys(Spy)^{22}]-SEQ ID NO: 3. 2,3 mM del péptido de la SEQ ID NO: 3 disueltos en AcOH 2 M (ac.) y 2-propanol (1:1) se tratan con 2,2-ditiodipiridina (3 equivalentes) para proporcionar [Cys(Spy)^{22}]-SEQ ID NO: 3. Se disuelve [Cys(Spy)^{22}]-SEQ ID NO: 3 en NH_{4}Oac 10 mM (ac., pH = 6,5) y metanol (5:2) para proporcionar el dímero de SEQ ID NO: 13.
Se determina la pureza del dímero resultante mediante análisis de HPLC y se confirma la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Ejemplo 10
Preparación de F V I H R L E P W L H P G S Q H N I T A S T N -NH_{2} (SEQ ID NO: 14). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 98% (impureza única inferior al 1%)
Peso molecular (base libre): 2540,2
Ejemplo 11
Preparación de R L V G F P V K P Q V P G L L R P L T Y K A A-NH_{2} (SEQ ID NO: 15). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 99% (impureza única inferior al 1%)
Peso molecular (base libre): 2520,3
Ejemplo 12 - Ejemplo de referencia
Preparación de una secuencia de tat1 nativa; MESVDPRLEPWKHPGSQPKTAC T N -NH_{2} (SEQ ID NO: 16). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 97% (impureza única inferior al 1%)
Peso molecular (base libre): 2708,1
Ejemplo 13 - Ejemplo de referencia
Preparación de una secuencia de tat-2 nativa; QVCFITKGLGISYGRKKRRQRRR -NH_{2} (SEQ ID NO: 17). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 94%
Peso molecular (base libre): 2806,4
Ejemplo 14 - Ejemplo de referencia
Preparación de secuencia de Nef nativa; E E V G F P V R P Q V P L R P M T Y K A A -NH_{2} (SEQ ID NO: 18). Se sintetizó el péptido en forma de amida, a partir de los materiales de partida correspondientes según la descripción general de la síntesis. Se determinó la pureza mediante análisis de HPLC y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas (LDI-EM).
Pureza (HPLC): superior al 95%
Peso molecular (base libre): 2384,8
Ejemplo 15
Se prepara una vacuna que comprende los péptidos de las SEQ ID NO: 3 y 12. Se disuelven los péptidos liofilizados en agua estéril a una concentración final de 4 mg/ml. Se prepara también una preparación de factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), según las directrices de los fabricantes para su uso, hasta una concentración final de 0,3 mg/ml. Se administran las dos disoluciones por vía intracutánea. Una dosis de inyección típica es de 100 \mul.
Ejemplo 16
Se prepara una vacuna que comprende los péptidos de las SEQ ID NO: 14 y 15. Se disuelven los péptidos liofilizados en agua estéril a una concentración final de 4 mg/ml. Se prepara también una preparación de factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), según las directrices de los fabricantes para su uso, hasta una concentración final de 0,3 mg/ml. Se administran las dos disoluciones por vía intracutánea. Una dosis de inyección típica es de 100 \mu1.
Ejemplo 17
Se mezcla una disolución o suspensión de antígeno con partes iguales de adyuvante de Freund de Behring, completo o incompleto, y entonces se emulsiona finamente absorbiéndolo en, y extrayéndolo vigorosamente mediante presión de, una jeringa de inyección, o con un homogenizador. La emulsión debe permanecer estable durante al menos 30 minutos. Las emulsiones de antígeno-adyuvante se inyectan mejor por vía subcutánea como un depósito.
Ejemplo 18 Inmunoensayo para la detección de anticuerpos inducidos por VIH-1
Los reactivos de partícula magnética deben prepararse según el protocolo recomendado por los fabricantes. Dynal AS es el fabricante de Dynabeads, que se emplean. Las partículas magnéticas recubiertas con ligando se denominan reactivo 1. Se acopla covalentemente un péptido según la invención a la superficie preactivada de las partículas magnéticas. También es posible absorber físicamente el péptido a la superficie de las partículas magnéticas. La concentración de partículas en el reactivo 1 está dentro del intervalo de desde 1 mg/ml hasta 15 mg/ml. El tamaño de partícula varía entre 0,2 \mum y 15 \mum. La concentración de péptidos está dentro del intervalo de desde 0,01 mg/ml de partículas hasta 1 mg/mg de partículas.
Se prepara el reactivo de anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) anti-Ig humana según el protocolo recomendado de Dako AS. Este protocolo es un procedimiento convencional en este campo. Este reactivo se denomina reactivo 2.
La disolución de sustrato fenolftaleína-monofosfato debe prepararse según el protocolo recomendado de Fluka AG. Este protocolo es un procedimiento convencional en este campo. La disolución de sustrato se denomina reactivo 3.
El tampón de lavado e incubación que se usa es tampón tris-base 0,05 M convencional con los siguientes compuestos adicionales; Tween 20 (del 0,01% al 0,1%), glicerol (del 0,1% al 10%) y cloruro de sodio (del 0,2% al 0,1%).
El procedimiento de ensayo comprende una etapa de incubación en la que se mezcla una gota de reactivo 1 con 2 gotas de tampón de lavado en cada pocillo. Tras mezclar, se añaden 30 \mul de muestra y se incuba la disolución durante 5 minutos. Las partículas magnéticas pueden atraparse mediante un imán y eliminarse el líquido, antes de que se separe el imán. Entonces se lavan los pocillos dos veces en 4 gotas de disolución de lavado, antes de la incubación con el reactivo 2. Se añade 1 gota de reactivo 2 con dos gotas de tampón de lavado y se incuba la disolución durante 5 minutos. Las partículas magnéticas pueden atraparse mediante un imán y eliminarse el líquido, antes de que se separe el imán. Entonces se repite la etapa de lavado antes de la incubación con reactivo 3. Se añaden 2 gotas de reactivo 3 a cada pocillo y se incuba la disolución durante 3 minutos. Los resultados pueden leerse contra un fondo blanco. Los resultados positivos son rojos (3+ = rojo fuerte) mientras que los resultados negativos son claramente disoluciones amarillas/marrones claras tal como se obtienen en el control negativo.
El kit de inmunoensayo podría usarse en la detección de anticuerpos, inducidos o bien por virus del VIH o péptidos o proteínas específicas del VIH, por ejemplo los péptidos de la presente invención.
Ejemplo 19 Vacuna terapéutica o profiláctica
Al menos uno de los polipéptidos de la invención, seleccionado del grupo de secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10 puede formar antígenos y constituir el principio activo de una vacuna profiláctica o terapéutica destinada a proporcionar protección frente al virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). La vacuna puede incluir compuestos que tienen efectos beneficiosos en la protección o estimulación del sistema inmunitario del huésped (ser humano o animal vertebrado), por ejemplo interleucinas, interferones, factores de crecimiento de granulocitos y macrófagos, factores de crecimiento hematopoyéticos o similares. Preferiblemente, la composición de vacuna contiene además un adyuvante o vehículo, más preferiblemente el adyuvante o vehículo es monofosforil lípido A (MPL®) posiblemente con alumbre, adyuvante de Freund (completo o incompleto) o hidróxido de aluminio. La cantidad óptima de adyuvante/vehículo dependerá del/de los tipo(s) que se elija(n).
Los péptidos de la invención pueden modificarse mediante la adición C-terminal de un único ácido graso tal como una única cadena de palmitoílo para formar una vacuna de lipopéptido. Además, los lipopéptidos pueden introducirse en membranas de liposoma mediante el método de congelación-descongelación dando como resultado liposomas que portan los ligandos peptídicos sobre su superficie.
El péptido o formulación de vacuna puede liofilizarse antes de su almacenamiento. Los péptidos liofilizados pueden disolverse en agua estéril hasta una concentración final de 0,1-100 mg/ml. La vacuna puede almacenarse preferiblemente a baja temperatura, en ampollas que contienen una o más unidades de dosificación, listas para su uso. Una unidad de dosificación típica del péptido según la invención está dentro del intervalo de concentración: 0,05 \mug-1 mg por kg de peso corporal, preferiblemente dentro de 0,15 \mug-0,15 mg por kg de peso corporal. Los expertos en la técnica apreciarán que una dosis adecuada dependerá del peso corporal del paciente, el tipo de enfermedad, la gravedad del estado, la vía de administración y varios otros factores. Cuando se usa como una vacuna terapéutica, la vacuna puede administrarse hasta 12 veces, mediante inyecciones. Pueden seguir refuerzos adicionales y en algunos casos pueden tener lugar a lo largo de toda la vida de los pacientes. En la preparación de una disolución de inyección, los péptidos se disuelven en agua estéril a una concentración final de 1 mg/ml por péptido. Normalmente, un volumen de inyección es de 100 \mul a 200 \mul (2 x 100 \mul). Preferiblemente, el péptido se administra conjuntamente con un adyuvante adecuado y/o un factor de crecimiento de granulocitos y macrófagos, por ejemplo Leucomax® "Shering Plough" preparado dentro de un intervalo de concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 1 mg/ml, o según las recomendaciones de los fabricantes para su uso. Se prefiere particularmente una terapia de combinación en la que se administran los presentes péptidos junto con los péptidos descritos en la solicitud de patente internacional publicada número PCT/NO00/00075 y/o la solicitud de patente noruega en tramitación junto con la presente número 2000 4413. Estos péptidos pueden administrarse simultánea o secuencialmente. La administración adecuada puede ser intracutánea, subcutánea, intravenosa, oral, intramuscular, intranasal, por la mucosa o cualquier otra vía adecuada. Pueden requerirse administraciones de refuerzo con el fin de mantener la protección. Para los expertos en la técnica, se entenderá que las composiciones de vacuna según la invención son útiles no sólo en la prevención de la infección, si no también en el tratamiento de la infección.
No se observan efectos tóxicos de los péptidos según la invención cuando se inyectan en ratones en una dosificación de 100 \mug por kg de peso corporal.
Los ejemplos anteriores sólo pretenden ilustrar la invención. Debe entenderse que un experto en la técnica puede modificar los péptidos, antígenos y vacunas descritos en el presente documento sin desviarse del concepto y alcance de esta invención tal como se expone en las reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Bionor Immuno AS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Strømdalsjordet 4, P.O. Box 1893 Gulset
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: 3703 Skien
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Noruega
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): N-3705
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: +47 35 50 57 50
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: + 47 35 50 57 01
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
INVENTOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Birger Sørensen
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Meierlia 3
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: 3727 Skien
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: Noruega
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos reguladores y auxiliares del VIH, antígenos, composiciones de vacuna, inmunoensayo y método de detección de anticuerpos inducidos por el VIH.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: Windows 2000
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: Word 7.0
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.800000\baselineskip
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22-24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 1 es Met, Ser, Cys o ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 2 es Glu, Asp, Val, Ser o ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 3 es Ser, Gln, Pro, Leu, Val, Ala, Trp, Tyr o {}\hskip4,62cm Phe
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 4 es Val o Ile
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 5 es Asp, Asn o Ile
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 6 es Pro, His o Ala
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 7 es Arg, Asn, Ser, Lys, Glu o Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 12 es Leu, Ile o N1e
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 15 es Gly o Pro
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 16 es Ser, Asn o Ala
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 17 es Gln, Lys o Thr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 18 es Pro o His
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 19 es Lys, Thr, Ser, Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, {}\hskip4,62cm Ile o Nle
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 20 es Thr, Ala, o Ile
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 21 es Ala, Pro, Asp o Val
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 22 es Cys o Ser
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 23 es Thr, Asn o Ser
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 24 es Asn, Lys, Arg, Gln, Ala, Pro o Thr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cys en posición 1 puede formar parte de un puente disulfuro
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cys en posición 22 puede formar parte de un puente disulfuro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1...22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cys en posición 1 y 22 puede formar parte de un puente disul- {}\hskip4,62cm furo intracatenario
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24-27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 1 es Pro, Ile, Leu, Thr, Tyr o Val
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 2 es Val, Ala Cys, Leu,
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 3 es Cys, Ile, Leu, Val o Nle
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 5 es Ile, Leu, Gln, Met o Thr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= 'Xaa en posición 6 es Thr, Asn, Lys o Arg
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 7 es Lys, Arg o Gln
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 8 es Gly o Ala
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 9 es Leu o Ile
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 10 es Gly, Ser o Ala
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 11 es Ile o Gly
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 12 es Ser, Phe o Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: Xaa_{i} insertado antes de la posición 14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa_{i} insertado antes de la posición 14 es Leu, Ile, Nle
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 15 es Arg, Lys, Ser o citrulina
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 19 es Arg, Lys, Ser, Gly o citrulina
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 20 es Gln, Arg o Pro
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 21 es Ile o leu
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 22 es Gly, Leu, Ile, Cys o ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 23 es Gly o ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 12..13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``ligador Z opcionalmente insertado
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 2, 3 y 22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cys en las posiciones 2, 3 y 22 pueden formar parte de un {}\hskip4,62cm puente disulfuro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 12..13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``puente de Gly insertado de 3 residuos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 12..13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``puente de Gly insertado de 3 residuos
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 27
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cys en posición 27 puede formar parte de un puente disulfuro.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25-28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 1 es Phe, Tyr, Trp o Arg
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 4 es Gly, Ser, Asn, Asp, Cys, Val, Thr, Ala, o {}\hskip4,62cm Arg
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 5 es Thr, Ala, Asp, Asn o Ser
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 6 es Tyr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Val o Leu
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 10 es Ser, Pro, Phe, Leu o lie
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 11 es Ala, Thr, Glu, Gin, Val, Pro o Ser
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 12 es Glu, Lys, Gin, Asp, Asn, Tyr, Trp o Phe
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: Xaa_{i} insertado antes de la posición 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa_{i} insertado antes de la posición 13 es Ser, Pro, Phe, Leu o {}\hskip4,62cm Ile
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: Xaa_{i} insertado antes de la posición 14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa_{i} insertado antes de la posición 14 es Ala, Thr, Glu, Gln, {}\hskip4,62cm Val, Pro, o Ser
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 14 es Glu, Lys, Gin, Asp o Asn
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 15 es Pro, Ser, Ala o Asn
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 16 es Val, Asn, Gly o Pro
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 17 es Pro, Gln, His, Ser, Leu, Arg, Thr, Asp o {}\hskip4,62cm Ile
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 18 es Leu, Phe o Val
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 19 es Gin, Leu, Pro, His, Asp o Glu
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 11..12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``ligador Z opcionalmente insertado
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cys en posición 4 y 6 puede formar parte de un puente disul- {}\hskip4,62cm furo
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 11..12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``puente de [Gly]_{n} insertado, en el que n = 3
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 11..12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``puente de [Gly]_{n} insertado, en el que n = 3
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22-29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 1 es Lys o Arg
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 5 es Phe o Leu
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 7 es Ile o Val
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 8 es Thr, Arg, Lys, Ala o Met
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 10 es Gln o His
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 11 es Val, Leu o Ile
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: Xaa_{i} insertado antes de la posición 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Leu se inserta antes de la posición 13
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 13 es Leu, Val o Thr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 14 es Arg o Cit
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 16 es Met, Val, Ile, Leu o Nle
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 17 es Thr o Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 18 es Tyr, Phe o Arg
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 19 es Lys o Arg
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 20 es Ala, Gly, Ser, Glu o Gln
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Xaa en posición 21 es Ala, Ser o Val
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1 2... (Leu_{i}Xaa_{13})
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``se inserta opcionalmente un ligador Z y/o un puente de [Arg]_{m} {}\hskip4,62cm entre Xaa_{12} y (Leu_{i}Xaa_{13}), en el que m es 0, 1, 2 ó 3.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
UBICACIÓN: 12...(Leu_{i}Xaa_{13}....)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``el ligador Z es [Gly]_{n} en el que n es 3 y un [Arg]_{m}, en el que m {}\hskip4,62cm es 1.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
UBICACIÓN: 12... (Leu_{i}Xaa_{13})
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= el ligador Z es [Gly]_{n} en el que n es 3 y un [Arg]_{m} en el que m {}\hskip4,62cm es 1.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido dimérico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: puente disulfuro entre la posición 20 en SEQ ID NO: 3 y la posición 20 en SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No, secuencia nativa de tat1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No, secuencia nativa de tat2
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No, secuencia nativa de Nef
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
29

Claims (15)

1. Péptido derivado de la proteína reguladora del VIH-1, en el que dicho péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos:
104
en las que los aminoácidos de la cadena tienen los siguientes significados;
Xaa en posición 1 del derivado peptídico es Met, Ser, Cys o ninguno,
Xaa en posición 2 es Glu, Asp, Val, Ser o ninguno,
Xaa en posición 3 es Trp, Tyr o Phe,
Xaa en posición 4 es Val o Ile,
Xaa en posición 5 es Ile, o Asn,
Xaa en posición 6 es Pro, His o Ala,
Xaa en posición 7 es Arg, Asn, Ser, Lys, Glu o Asp,
Xaa en posición 12 es Leu, Ile o Nle,
Xaa en posición 15 es Gly o Pro,
Xaa en posición 16 es Ser, Asn o Ala,
Xaa en posición 17 es Gln, Lys o Thr,
Xaa en posición 18 es Pro o His,
Xaa en posición 19 es Leu, Ile o Nle,
Xaa en posición 20 es Thr, Ala o Ile,
Xaa en posición 21 es Ala, Pro, Asp o Val,
Xaa en posición 22 es Cys o Ser,
Xaa en posición 23 es Thr, Asn o Ser,
Xaa en posición 24 es Asn, Lys, Arg, Gln, Ala Pro o Thr,
los extremos terminales de las secuencias pueden ser grupos amino o carboxilo libres, amidas, acilos, acetilos o sales de los mismos, dos o más residuos de los residuos de Cys pueden formar parte de un puente disulfuro intracatenario o intercatenario, un puente -S-(CH_{2})_{p}-S- o un puente -(CH_{2})_{p} en el que p = 1-8, interrumpidos opcionalmente por uno o más heteroátomos tales como O, N y S y/o las dichas secuencias peptídicas están inmovilizadas en un soporte sólido.
2. Péptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se selecciona de los grupos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 14.
3. Antígeno que comprende al menos un péptido según la reivindicación 1 ó 2.
4. Composición de vacuna que comprende un antígeno según la reivindicación 3 con un diluyente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante, soporte y/o vehículo y opcionalmente compuesto(s) inmunoestimulante(s) adicional(es).
5. Composición de vacuna según la reivindicación 4, en la que dicha composición de vacuna comprende al menos un péptido de SEQ ID NO: 1.
6. Composición de vacuna según la reivindicación 5, que comprende el péptido de SEQ ID NO: 14.
7. Composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que los péptidos están disueltos en una disolución de agua estéril y el compuesto inmunoestimulante opcional es un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos.
8. Composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que la composición comprende un adyuvante seleccionado del grupo del monofosforil lípido A (MPL®), adyuvante completo o incompleto de Freund o hidróxido de aluminio.
9. Composición de vacuna, en la que se formula un antígeno según la reivindicación 3 como una formulación de lipopéptido y/o liposoma.
10. Método de detección de anticuerpos, inducidos por un VIH o péptidos o proteínas específicas del VIH, en una muestra de líquido corporal, en el que dicha muestra se somete a un inmunoensayo, en el que el/los antígeno(s) se selecciona(n) de los péptidos según las reivindicaciones 1 y 2.
11. Kit de inmunoensayo para la detección de anticuerpos, inducidos por un VIH o péptidos o proteínas específicas del VIH, en una muestra de líquido corporal, en el que el antígeno de diagnóstico es un péptido según la reivindicación 1 ó 2.
12. Anticuerpo que puede reaccionar selectivamente con el antígeno según la reivindicación 3.
13. ADN de plásmido que codifica para uno o más antígenos según la reivindicación 3.
14. Antígeno según la reivindicación 3, para su uso en la protección frente a la infección por VIH tipo I.
15. Uso de los antígenos según la reivindicación 4, para la fabricación de un medicamento para la protección frente a la infección por VIH tipo I.
ES01965768T 2000-09-04 2001-09-03 Peptidos de vih de regiones conservadas, tat, rev y wef y su aplicacion como por ejemplo componentes de vacuna. Expired - Lifetime ES2296793T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20004412A NO314587B1 (no) 2000-09-04 2000-09-04 HIV regulatoriske- og hjelpepeptider, antigener, vaksinepreparater, immunoassay testsett og en metode for påvisning av antistoffer fremkaltav HIV
NO20004412 2000-09-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2296793T3 true ES2296793T3 (es) 2008-05-01

Family

ID=19911532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01965768T Expired - Lifetime ES2296793T3 (es) 2000-09-04 2001-09-03 Peptidos de vih de regiones conservadas, tat, rev y wef y su aplicacion como por ejemplo componentes de vacuna.

Country Status (18)

Country Link
US (1) US7097971B2 (es)
EP (1) EP1322666B1 (es)
JP (1) JP2004508382A (es)
CN (2) CN101628933A (es)
AR (1) AR033997A1 (es)
AT (1) ATE378350T1 (es)
AU (2) AU2001286336B2 (es)
BR (1) BR0114046A (es)
CA (1) CA2421199A1 (es)
DE (1) DE60131432T2 (es)
EA (1) EA006210B1 (es)
ES (1) ES2296793T3 (es)
HU (1) HUP0303132A3 (es)
NO (1) NO314587B1 (es)
NZ (2) NZ535908A (es)
SK (1) SK287913B6 (es)
WO (1) WO2002020555A2 (es)
ZA (1) ZA200301742B (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA02007478A (es) 2000-02-04 2004-08-23 Univ Duke Vacuna contra el virus de inmunodeficiencia humana.
WO2007104932A2 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Peptcell Limited Peptides of regulatory or accessory proteins of hiv, compositions and the utilization thereof
JP4931483B2 (ja) * 2006-06-14 2012-05-16 ルネサスエレクトロニクス株式会社 半導体不良解析装置、不良解析方法、及び不良解析プログラム
WO2011119920A2 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CN102210874A (zh) * 2011-05-17 2011-10-12 浙江大学 一种hiv重组亚型dna疫苗的制备方法
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
MX2014014683A (es) * 2012-06-06 2015-02-24 Bionor Immuno As Peptidos derivados de proteinas virales para usarse como inmunogenos y reactivos de dosificacion.
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
CA2894166A1 (en) * 2012-12-06 2014-06-12 Pin Pharma, Inc. Treatment of inflammation, autoimmune, and neurodegenerative disorders with immunosuppressive tat derivative polypeptides
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
US9931394B2 (en) 2015-03-23 2018-04-03 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5219990A (en) * 1991-01-28 1993-06-15 Biogen, Inc. Papillomavirus e2 trans-activation repressors
WO1994015634A1 (en) * 1992-12-30 1994-07-21 Matthias Rath Tat and rev oligopeptides in hiv treatment
EP0814834B2 (fr) * 1995-03-08 2009-03-18 Neovacs Immunogenes denues de toxicite derivant d'une proteine de regulation retrovirale, anticorps diriges contre ces immunogenes, procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant
US5891994A (en) * 1997-07-11 1999-04-06 Thymon L.L.C. Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1
IT1297090B1 (it) * 1997-12-01 1999-08-03 Barbara Ensoli Tat di hiv-1 o suoi derivati, da soli od in combinazione, a scopo vaccinale, profilattico e terapeutico, contro l'aids i tumori e le
FR2773156B1 (fr) * 1997-12-26 2000-03-31 Biovacs Inc Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida
NO311807B1 (no) 1999-03-04 2002-01-28 Bionor Immuno As HIV-peptider, antigener, vaksinepreparater, immunoassay- testsett og en metode for påvisning av antistoffer fremkalt av HIV
WO2000078969A1 (en) * 1999-06-21 2000-12-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv tat peptides and multiple peptide conjugate system
SE0001351L (sv) * 2000-04-12 2001-03-26 Kjell Sjoegren Smådjurstoalett

Also Published As

Publication number Publication date
NZ535908A (en) 2006-03-31
HUP0303132A3 (en) 2012-09-28
EA006210B1 (ru) 2005-10-27
ZA200301742B (en) 2004-06-21
SK4012003A3 (en) 2003-09-11
EP1322666B1 (en) 2007-11-14
US20050053616A1 (en) 2005-03-10
CN1458936A (zh) 2003-11-26
DE60131432T2 (de) 2008-09-18
ATE378350T1 (de) 2007-11-15
CA2421199A1 (en) 2002-03-14
WO2002020555A2 (en) 2002-03-14
HUP0303132A2 (hu) 2005-03-29
NO20004412D0 (no) 2000-09-04
WO2002020555A3 (en) 2002-06-06
EA200300335A1 (ru) 2003-08-28
CN101628933A (zh) 2010-01-20
US7097971B2 (en) 2006-08-29
BR0114046A (pt) 2003-07-22
AU2001286336B2 (en) 2007-03-15
NZ524557A (en) 2005-04-29
NO314587B1 (no) 2003-04-14
DE60131432D1 (de) 2007-12-27
NO20004412L (no) 2002-03-05
EP1322666A2 (en) 2003-07-02
SK287913B6 (sk) 2012-03-02
AR033997A1 (es) 2004-01-21
AU8633601A (en) 2002-03-22
JP2004508382A (ja) 2004-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2312465T3 (es) Peptidos de vih de regiones conservadas en gag p17 y sus aplicaciones, tales como vacunas.
JP5814331B2 (ja) Ｈｉｖペプチド、抗原、ワクチン組成物、免疫学的検定キット及びｈｉｖによって誘発された抗体を検出する方法
ES2296793T3 (es) Peptidos de vih de regiones conservadas, tat, rev y wef y su aplicacion como por ejemplo componentes de vacuna.
AU2001282706A1 (en) HIV peptides from conserved in gag p17 and 924 and their application in E.G. vaccines
AU2001286336A1 (en) HIV peptides from Tat, Rev and Wef conserved and their application as E.G. vaccine components