EA006210B1

EA006210B1 - Регуляторные и вспомогательные пептиды вич, антигены, вакцинные композиции, набор для иммуноанализа и способ обнаружения антител, индуцируемых вич

Info

Publication number: EA006210B1
Application number: EA200300335A
Authority: EA
Inventors: Биргер Сёренсен
Original assignee: Бионор Иммуно Ас
Priority date: 2000-09-04
Filing date: 2001-09-03
Publication date: 2005-10-27
Also published as: EP1322666B1; NO20004412L; JP2004508382A; EP1322666A2; AU2001286336B2; NO20004412D0; NZ524557A; EA200300335A1; HUP0303132A3; NO314587B1; CN101628933A; US7097971B2; DE60131432D1; CA2421199A1; WO2002020555A2; ZA200301742B; BR0114046A; US20050053616A1; AR033997A1; ATE378350T1

Abstract

Настоящее изобретение охватывает новые и модифицированные пептиды, способные индуцировать специфический иммунный ответ к ВИЧ-1, не антагонизируя активность цитотоксических Т-клеток, с целью получения эффективной профилактической и терапевтической вакцины против ВИЧ. В основе пептидов лежат консервативные участки регуляторных белков Tat и Rev и вспомогательных белков Nef вируса ВИЧ. Описаны антигены в свободной или связанной с носителем форме, включающие по меньшей мере один из пептидов, вакцинные композиции, содержащие по меньшей мере один из антигенов, наборы для иммуноанализа и способ обнаружения антител, индуцируемых ВИЧ или ВИЧ-специфичными пептидами, с помощью таких антигенов.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается новых пептидов на основе консервативных участков регуляторных и вспомогательных белков ВИЧ, антигенов в свободной или связанной с носителем форме, включающих по меньшей мере один из этих пептидов, вакцинных композиций, содержащих по меньшей мере один из этих антигенов, наборов для иммуноанализа и способа обнаружения антител, индуцируемых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или ВИЧ-специфичными пептидами, с помощью таких антигенов.

Уровень техники

Вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), являющийся возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), продолжает представлять трудноразрешимую проблему для здравоохранения в развивающихся странах. В Западном мире терапевтические подходы, нацеленные на процессы репликации и созревания ВИЧ, оказали большое влияние на развитие болезни. Однако высокая стоимость данного лечения, высокая токсичность лекарств и отсутствие излечения означают, что разработка безопасных и эффективных вакцин остается первостепенной задачей для контроля за пандемией СПИД.

ВИЧ-1 - это сложный ретровирус, кодирующий шесть регуляторных и вспомогательных генов, отсутствующих у простых ретровирусов, а именно !а!, геу, ие£, νίί, νρτ и ури (табл. 1). В клетках эукариотов только полностью сплайсированные мРНК экспортируются в цитоплазму для трансляции. Несплайсированные или частично сплайсированные РНК остаются и затем подвергаются деградации в ядре. Таким образом, кодируемые генами !а!, геу и ие£ белки (обозначаемые как Та!, Кеу и №£), образующиеся при множественном сплайсинге РНК, экспрессируются первыми и относятся к ранним генам при экспрессии ВИЧ-1. Для экспрессии однократно сплайсированных РНК, а также для транспортировки полного несплайсированного генома, состоящего из РНК, в цитоплазму для упаковки у ВИЧ-1 развились механизмы для преодоления ограничений на транспорт РНК. Регуляторные белки Та! и Кеу необходимы для репликации ВИЧ-1, так как мутации в этих белках устраняют образование ВИЧ-1 (ЛауЮп Α.Ι. е! а1. (1986) Се11, 44: 941-947, и Икйег Α.Ο. е! а1. (1986) Иа!иге, 320: 367-371).

Вспомогательные гены происходят из экзонов, находящихся всецело перед геном оболочки ВИЧ-1, к примеру, νί£, или экзонов, находящихся либо впереди от, либо внутри гена епу, но в других рамках считывания, например !а!, геу. Эффективность сплайсинга частично регулирует уровень экспрессии генов различных вспомогательных белков.

После интеграции провирусной ДНК ВИЧ-1 синтезируются преимущественно укороченные формы мРНК клеточной РНК-полимеразой II, которая взаимодействует с сайтами на длинном 5'-концевом повторе (ЬТК) провирусной ДНК. Одним из первых экспрессируется ген !а!, который несет сигнал ядерной локализации. Он является сильным активатором транскрипции, усиливающим ЬТК-направляемую транскрипцию почти в 1000 раз. Непрерывная экспрессия Та! обеспечивает положительную обратную связь для продолжения генной экспрессии на высоком уровне. В отличие от обычных активаторов транскрипции, взаимодействующих с последовательностями ДНК, Та! непосредственно связывается с 5'концами всех РНК ВИЧ-1 на специфической вторичной структуре типа петли - ТАК (элемент трансактивации реакции). Структура петли сильно консервативна и необходима для функционирования Та!. Структура взаимодействия Та!/ТАК была проанализирована с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (Ριΐβΐίκί е! а1. (1992) Заепсе. 257: 76-80). Та! связывается с ТАК вместе с клеточным белком, циклином Т, который, в свою очередь, связывает СЭК9, фосфорилирующий С-концевой домен РНКполимеразы II, что стимулирует удлинение РНК-транскриптов. Эти клеточные кофакторы Та! имеются только в активированных клетках, а их отсутствие подавляет транскрипцию провирусной ДНК, приводя к квазилатентности в Т-лимфоцитах. Та! экспрессируется из двух экзонов, причем сигнал ядерной локализации и участок связывания ТАК находятся в первом экзоне. Та! секретируется из инфицированных клеток и может оказывать гетерологические эффекты на соседние клетки. Они включают клеточную активацию (НоГтап е! а1. (1993) Βίοοά, 82: 2774-2780), индукцию клеточного апоптоза (Масйо е! а1. (1999) Опсодепе, 18: 7543-7551, 1999), функционирование в качестве секретируемых факторов роста (Тгшй Ό.Ρ. е! а1. (1999) Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип., 256: 299-306) и модуляцию синтеза белка в клетках хозяина в пользу синтеза вирусных белков (Х1ао е! а1. (1998) Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип., 244: 384-389, 1998). Таким образом, направленные на Та! терапевтические подходы будут иметь сильное влияние на инфекцию ВИЧ-1.

Небольшие многократно сплайсированные мРНК, кодирующие Та!, Кеу и №£, преобладают во время ранней фазы после инфекции. После того как вырабатывается пороговый уровень Кеу, несплайсированные и однократно сплайсированные РНК накапливаются в цитоплазме для трансляции, давая начало продуктивной инфекции. Неспособность выработки порогового уровня Кеу может вносить вклад в квазилатентное состояние ВИЧ. Кеу может связываться только с РНК, несущими особую структуру ККЕ (реагирующий на Кеу элемент), которая находится в кодирующей епу области генома. Кеу взаимодействует с ККЕ в виде мультимера через богатый аргинином основный участок, находящийся в аминоконцевой половине белка. В результате этого взаимодействия происходит транспортировка частично сплайсированных РНК, что дает такие генные продукты, как Епу, УК, Ури и Ург, а также несплайсированных РНК, которые будут вводиться в качестве новых геномов при сборке частиц. Структурный анализ взаи

- 1 006210 модействия Кез/ККЕ также проводился методом ЯМР (Ва!!1к!е е! а1. (1996) 8с1спсс. 273: 1547-1551, 1996). Кеу несет богатый лейцином сигнал экспорта, позволяющий ему мигрировать между ядром и цитоплазмой для непрерывной транспортировки новосинтезированных РНК (Ка11апб е! а1. (1994). 1. Упо1., 68: 1475-1485; Меуег & МаНт, (1994) Сепек Эеу.. 8: 1538-1547). Именно таким образом Кеу обеспечивает то, что структурные гены экспрессируются после регуляторных генов. Терапевтические подходы, направленные против Кеу, приведут к прерыванию жизненного цикла вируса на ранней стадии инфекции.

Хотя исходно ИеГ был описан как отрицательный фактор, позже было показано, что он оказывает положительное влияние на вирусную репликацию и экспрессируется в больших количествах, чем Та! и Кеу, как на ранней стадии, так и позже в процессе инфекции. ИеГ подвергается миристилированию на Ν’конце и связывается с внутренней стороной плазматической мембраны. ИеГ частично принимает участие в подавлении поверхностного СЭ4 и в его деградации путем эндоцитоза (Р1дие! е! а1. (1998) ЕМВО 1., 17: 2472-2481). Удаление СЭ4 из поверхности клетки препятствует суперинфицированию другими штаммами ВИЧ-1 или повторному инфицированию выделяющимся вирусом. ИеГ также подавляет МНС-Ι, тем самым защищая инфицированные клетки от разрушения цитотоксическими Т-лимфоцитами (Ье Са11 е! а1. (1997). Кек. УпоЬ, 148: 43-47). ИеГ не является обязательным вирусным белком, так как он не требуется для инфекции лимфоцитов периферической крови или Т-клеточных линий ΐη νίΐτο. Мутанты с делецией ИеГ, однако, менее патогенны за длительные периоды времени. ИеГ также оказывает комплексное влияние на пути передачи сигналов в клетке и содержит богатый пролином участок, который может взаимодействовать с доменом 8Н3 киназ, участвующих в активации Т-клеток, что необходимо для эффективной репликации ВИЧ (Моагей е! а1. (1997) Иа!иге, 385: 650-653). Содержащие ИеГ вирусы способны синтезировать большее количество вирусной ДНК по сравнению с вирусами с делецией гена ИеГ, что означает прямое или непрямое участие ИеГ в активации обратной транскриптазы вируса. Низкое содержание ИеГ, связанного с вирионами, может объяснить такой феномен. Из инфицированных клеток также выделяется небольшое количество ИеГ, хотя его действие на соседние клетки неясно. Поскольку ИеГ экспрессируется на ранней стадии инфекции и оказывает значительное влияние на экспрессию СЭ4 и МНС-Ι, а также на течение болезни, он является важной мишенью для будущих терапевтических подходов.

Та! и ИеГ секретируются и могут захватываться макрофагами и экспрессироваться вместе с молекулами МНС-ΙΙ. Это улучшает их пригодность в качестве мишеней для подходов, основанных на пептидах, которые также могут экспрессироваться вместе с молекулами МНС-ΙΙ. Ясно, что следует отдать приоритет подходам, направленным на продукты ранних генов, необходимых для репликации ВИЧ-1, таких как Та! и Кезз наряду с ИеГ, который также экспрессируется на ранней стадии и влияет на течение болезни.

Таблица 1

Регуляторные и вспомогательные белки ВИЧ-1

Ген	Белок	Название	Экспрессия	Локализация	Функции
!а!	Та!	Трансактиватор вирусной транскрипции	Ранняя	Ядро	Активирует вирусную транскрипцию; секретируется из инфицированных клеток, при этом он может активировать Т-клетки, индуцировать апоптоз и функционировать в качестве фактора роста
гез	Кез	Ядерный фактор экспорта РНК	Ранняя	Ядрышко, нуклеоплазма, цитоплазма	Регулирует сплайсинг/транспорт РНК в цитоплазму; челночный белок
пеГ	ИеГ	Большое число эффекторных функций	Ранняя	Цитоплазма, связан с мембраной; вирионы	Запускает эндоцитоз СЭ4; подавляет экспрессию МНС-Ι; связывается с киназами и может влиять на сигнальную систему Т-клеток и их активацию
зри	Ури	Вирусный белок и	Поздняя	Цитоплазма, связан с мембраной	Запускает внутриклеточную деградацию СЭ4, подавляет МНС-Ι, неспецифически стимулирует выделение ретровирусных частиц
νΐί	У1Г	Фактор инфекционности вируса	Поздняя	Цитоплазма, мембраны; вирионы	Усиливает инфекционность вирусных частиц зависимым от клетки образом; усиливает синтез вирусной ДНК во время обратной транскрипции
νρτ	Ург	Вирусный белок г	Поздняя	Главным образом, ядро; вирионы	Способствует импорту в ядро преинтеграционного комплекса; останавливает клетки на фазе С2/М клеточного цикла

Природные последовательности ВИЧ в вакцинах-кандидатах неспособны стимулировать стабильный долговременный иммунный ответ вследствие присущей вирусу ВИЧ способности к маскировке пу

- 2 006210 тем изменения эпитопов, презентируемых иммунной системе. Для преодоления такой вариабельной презентации эпитопов определенные замены и комбинации аминокислот должны оказать содействие иммунной системе в презентации и распознавании этих чужеродных вирусных антигенов надежным образом и, следовательно, в большей степени.

Основываясь на этих предпосылках, мы решили исследовать возможность разработки новых синтетических пептидов, способных имитировать эпитопы регуляторных и вспомогательных белков ВИЧ таким образом, чтобы они стали доступными как для гуморальной, так и для клеточной ветвей иммунной системы, и удовлетворить потребность в эффективной терапевтической и/или профилактической вакцине.

Первоначальная работа основывалась на аминокислотных последовательностях нативных Та!, опубликованных КогЬег В. е! а1. ш Нитап Ве!гоу1ги§е8 апб ΑΙΌ8 1997 Еб§. ТЪеоге!1са1 Вю1оду апб В1орйу81С8 Огоир, Ьоз Л1атоз Ха11опа1 ЬаЬога!огу, Ьоз А1ато8, ΝΜ. Первый эпитоп Та! находится между аминокислотами 1 и 24 белка !а!.

Таблица 2 Эпитоп Та!

№ Ам. к-та

Природные аминокислоты

М 8

2	Е	ϋ	V
3	8	Ω	Р	Е	V	А
4	V	I
5	ϋ	N
6	Р	Н	А
7	к	N	8	К	Е	ϋ
8		I	Ω	К	V	М	т
9	Е	ϋ	Р
10	Р	8
11	λΥ
12	К	N	Е	Н
13	Н	К	Ω
14	Р
15	С	Р
16	8	N	А
17	Ω	К	Т
18	Р	н
19	к	Т	8	А	К	Р	Е
20	Т	А	I
21	А	Р	ϋ	V
22	С	8
23	Т	N	8
24	N	К	К		А	Р	т

Однобуквенные и трехбуквенные обозначения аминокислот в последовательностях, приведенных в настоящем описании, соответствуют международным стандартам, изложенным в учебниках, например Ьейптдег Λ.Ι,., Рппс1р1е8 о£ В1ос11ет181гу, \Тог111 РиЬйзЪегз 1пс., Νο\ν Уогк, 1982. Аминокислоты, приведенные справа от левой колонки, представляют естественные варианты последовательности. Наш анализ привел к последовательности, содержащей следующий модифицированный эпитоп:

ΟδλννΝΡΚΕΕΡλνΕΗΡΟδρΡΝίΤΑϋΤΝ где N1 означает 2-аминогексановую кислоту (норлейцин, сокращенно Ме и N1 в трехбуквенном и однобуквенном коде соответственно), а цистеиновый остаток находится в окисленной форме, то есть образует дисульфидный мостик. Поскольку остаток цистеина в С-концевой части (в положении 22) пептида входит в состав внутримолекулярной дисульфидной связи за пределами данного эпитопа, то подобная внутрипептидная дисульфидная связь образуется введением цистеина в Ν-концевую часть данного эпитопа.

- 3 006210

Альтернативный подход заключается в образовании межмолекулярной дисульфидной связи путем димеризации последовательностей \УУМРК.ЬЕР\¥ЬНРО8РРК1ТАСТК

I

ΧννΝΡΚΕΕΡΧνΕΗΡσδρΡΝΙΤΑΟΤΝ

Другой альтернативный способ состоит в димеризации с другим эпитопом, выбранным из Та!. Второй эпитоп Та! находится между аминокислотами 35 и 57 в направлении к С-концу и отделен от первого эпитопа 10 аминокислотами, содержащими 5 остатков Суз в дополнение к остатку Суз в каждом из эпитопов. Относительно высокое число остатков Суз позволяет осуществить целый ряд внутри- и межмолекулярных перекрестных сшивок. Вероятно, такой богатый цистеином домен будет доминировать при иммунологической презентации данного белка и вследствие этого будет маскировать два существенных эпитопа. Отбор и модификация двух соседних эпитопов могут способствовать презентации существенной части белка Та! более оптимальным образом.

Для того чтобы уменьшить вероятность появления мутантов, избегающих узнавания, число эпитопов еще больше увеличили и выбрали две дополнительные пептидные последовательности. Эти последовательности локализуются в Кеу (остатки 58-85) и Νβί (остатки 65-85). Нативные последовательности были опубликованы в Нитап Ке!гоу1шзез апс.1 ΑΙΏ8 1999: А СотрПаИоп апс.1 Апа1уз1з о£ Хискас Аси! апс.1 Атто Ас1б 8ециепсез. ЕСз. Тйеоге!1са1 Вю1оду ап! ВюрЬузюз Сгоир, Еоз А1атоз Ж!юпа1 ЕаЬога!огу, Еоз А1атоз, ΝΜ.

Таблица 3

Эпитоп Та!

№	Ам. к-та	Природные аминокислоты
35	Ω	Р	I	ь т	Υ	V
36	V	А	с	к
37	С
38	г
39	I	И	Ω	м т
40	т	N	к	к
41	к	Ω
42	σ	А
43	ь
44	о	8
45	I
46	8	Г	Υ
47	Υ	N
48	σ
49	к	К	8
50	к
51	к
52	к
53	к	К	8	с
54	Ω	к	Р
55	к
56	к
57	к	о	8

- 4 006210 №

Ам. к-та

К

I

Ь

О т

Υ ь σ к

А

Е

Р

V

Р ь

Ω ь

Р

Р ь

Эпитоп Кеу

Природные аминокислоты

V/О

V ЬР

IР

Nϋ

А ϋN

С РК

V н

о

Таблица 4

А К

Ь

Р	Р	ь
т	Е	Ω
к	Ω	ϋ
8	А	N
N	О	Р
Ω	Н	8
Р	V
ь	Р	Н

Ь Е

I V Р

Таблица 5

Эпитоп №£ № Ам. к-та

Природные аминокислоты

65Е

66N

67Е

68А

69Ь

70Р

71I

72Т

73Р

74(}

75V

76Р

77Ь

78К

79Р

80М

81Т

82Υ

83К

84А

85А σ σ ν о Р

V I ϋ

Р К

К

О 8

V

- 5 006210

Было синтезировано несколько модифицированных пептидов для того, чтобы определить уникальность последовательностей, их способность стимулировать иммунную систему, а также их специфичность и чувствительность в качестве антигенов ВИЧ-1.

Раскрытие изобретения

Пептиды по изобретению происходят из четырех различных консервативных участков белков ВИЧ-1 Та!, Вес и ΝοΓ. описанных выше, которые обладают свойством сохранения уникальности (иммуногенности, чувствительности и специфичности) эпитопов ВИЧ-1. Кроме того, новые пептиды по изобретению не обладают заметным антагонистическим эффектом по отношению к цитотоксическим Т-лимфоцитам (СТЬ) и должны иметь по меньшей мере один потенциальный эпитоп СТЬ.

Пептиды по настоящему изобретению, удовлетворяющие указанным выше критериям, выбирают из следующих групп:

Хаа₁ Хаа₂ Хаа₃ Хаа₄ Хаа₅ Хаа₆ Хаа₇ Ьеи С1и Рго Тгр Хаа₁₂ Н1к Рго Хаа₁₅ Хаа₁₆ Хаа₁₇ Хаа₁₈ Хаа₁₉ Хаа₂₀Хаа₂₁ Хаа₂₂ Хаа₂₃ Хаа₂₄ (δΕΟ ΙΌ Νο. 1), где аминокислоты цепи могут иметь следующие значения:

Хаа в положении 1 модифицированного пептида - Ме!, 8ет, Сук или отсутствует,

Хаа в положении 2 - С1и, Акр, Уа1, 8ет или отсутствует,

Хаа в положении 3 - 8ет, С1п, Рго, Ьеи, Уа1, А1а, Тгр, Туг или Рйе,

Хаа в положении 4 - Уа1 или 11е,

Хаа в положении 5- Акр, Акп или 11е,

Хаа в положении 6 - Рго, Н1к или А1а,

Хаа в положении 7 - Агд, Акп, 8ет, Бук, С1и или Акр,

Хаа в положении 12 - Ьеи, 11е или Ме,

Хаа в положении 15- С1у или Рго,

Хаа в положении 16 - 8ет, Акп или А1а,

Хаа в положении 17 - С1п, Бук или Тйт,

Хаа в положении 18- Рго или Н1к,

Хаа в положении 19 - Бук, Тйт, 8ет, А1а, Агд, Рго, С1и, Беи, 11е или Ме,

Хаа в положении 20 - ТПг, А1а или 11е,

Хаа в положении 21 - А1а, Рго, Акр или Уа1,

Хаа в положении 22 - Сук или 8ет,

Хаа в положении 23 - ТПг, Акп или 8ет,

Хаа в положении 24 - Акп, Бук, Агд, С1п, А1а, Рго или Тйт, причем пептид содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из последовательности 8ΕΟ ΙΌ №. 1, кроме того, два или более остатков Сук могут образовывать внутрицепочечную или межцепочечную дисульфидную связь либо мостик -8-(СН₂)_р-8- или -(СН₂)_р-, где р=1-8, необязательно с одним или более гетероатомами типа О, N или δ между ними;

Хаа1 Хаа₂ Хаа₃ Рйе Хаа₅ Хаа₆ Хаа₇ Хаа₈ Хаа₉ Хаа_!0 Хаац Хаа_!2 -Ζ- Туг Хаа₁ С1у Хаа_!5 Бук Бук Агд Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа2з (8Е^ Ю Nο. 4), где аминокислоты цепи имеют следующие значения:

Хаа в положении 1 - Рго, 11е, Беи, Тйт, Туг или Уа1,

Хаа в положении 2 - Уа1, А1а, Сук, Беи,

Хаа в положении 3 - Сук, 11е, Беи, Уа1 или Ме,

Хаа в положении 5 - 11е, Беи, С1п, Ме! или Тйт,

Хаа в положении 6 - ТПг, Акп, Бук или Агд,

Хаа в положении 7 - Бук, Агд или С1п,

Хаа в положении 8 - С1у или А1а,

Хаа в положении 9 - Беи или 11е,

Хаа в положении 10 - С1у, 8ет или А1а,

Хаа в положении 11 - 11е или С1у,

Хаа в положении 12 - 8ет, Рйе или Туг,

Хаа,, вставленный перед положением 14, - это Беи, 11е, Ме,

Хаа в положении 15 - Агд, Бук, 8ет или цитруллин (С1!),

Хаа в положении 19 - Агд, Бук, 8ет, С1у или Сй,

Хаа в положении 20 - С1п, Агд или Рго,

Хаа в положении 21 - 11е или Беи,

Хаа в положении 22 - С1у, Беи, 11е, Сук или отсутствует,

Хаа в положении 23 - С1у или отсутствует, причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из δ ЕС ΙΌ №. 4, а -Ζ- означает необязательный линкер, которым может быть РЕС, модифицированный РЕС и/или [С1у]_п, где п=1, 2 или 3,

- 6 006210 кроме того, два или более остатков Сук могут образовывать внутрицепочечную или межцепочечную дисульфидную связь либо мостик -8-(СН₂)_р-8- или -(СН₂)_р-, где р=1-8, необязательно с одним или более гетероатомами типа О, N или 8 между ними;

Хаа₁ 11е Ьеи Хаа₄ Хаа₅ Хаа₆ Ьеи С1у Агд Хаа₁₀ Хаа₁₁ -Ζ- Хаа₁₂ Ьеи Хаа₁ Хаа₁ Хаа₁₄ Хаа₁₅ Хаа₁₆ Хаа₁₇Хаа₁₈ Хаа₁₉ Ьеи Рго Рго Ьеи (8ЕР ΙΌ N0: 7), где Хаа в положении 1 - это РНе. Туг, Тгр или Агд,

Хаа в положении 4 - С1у, 8ег, Аки, Акр, Сук, Уа1, ТНг, А1а или Агд,

Хаа в положении 5 - ТНг, А1а, Акр, Акп или 8ег,

Хаа в положении 6 - Туг, Сук, РНе, Агд, Н1к, 8ег, Уа1 или Ьеи,

Хаа в положении 10 - 8ег, Рго, РНе, Ьеи или Не,

Хаа в положении 11 - А1а, ТНг, С1и, С1п, Уа1, Рго или 8ег,

Хаа в положении 12 - С1и, Ьук, С1п, Акр, Акп, Туг, Тгр или РНе,

Хаа₁, вставленный после положения 13, - это 8ег, Рго, РНе, Ьеи или Не,

Хаа,, вставленный перед положением 14, - это А1а, ТНг, С1и, С1п, Уа1, Рго или 8ег,

Хаа в положении 14 - С1и, Ьук, С1п, Акр или Акп,

Хаа в положении 15 - Рго, 8ег, А1а или Акп,

Хаа в положении 16 - Уа1, Акп, С1у или Рго,

Хаа в положении 17 - Рго, С1п, Н1к, 8ег, Ьеи, Агд, ТНг, Акр или Не,

Хаа в положении 18 - Ьеи, РНе или Уа1,

Хаа в положении 19 - С1п, Ьеи, Рго, Н1к, Акр или С1и, причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из 8 Ер ΙΌ №. 7, а -Ζ- означает необязательный линкер, которым может быть РЕС, модифицированный РЕС и/или [С1у]_п, где п=1, 2 или 3;

Хаа1 Ьеи Уа1 С1у Хаа₅ Рго Хаа₇ Хаа₈ Рго Хаа_!0 Хаац Рго -Ζ-|Λγ§|_μ Хаа₁ Хаа_в Хаа_!4 Рго Хаа,₆ Хаа,Хаа1₈ Хаа1₉ Хаа₂₀ Хаа₂1 (8ЕР ΙΌ №: 10), где Хаа в положении 1 - это Ьук или Агд,

Хаа в положении 5 - РНе или Ьеи,

Хаа в положении 7 - 11е или Уа1,

Хаа в положении 8 - ТНг, Агд, Ьук, А1а или Ме1,

Хаа в положении 10 - С1п или Н1к,

Хаа в положении 11 -Уа1, Ьеи или Не,

Хаа,, вставленный перед положением 13, - это Ьеи,

Хаа в положении 13 - Ьеи, Уа1 или ТНг,

Хаа в положении 14 - Агд или цитрулин (СН),

Хаа в положении 16 - Ме1, Уа1, 11е или N10, Ьеи,

Хаа в положении 17 - ТНг или Акп,

Хаа в положении 18 - Туг, РНе или Агд,

Хаа в положении 19 - Ьук или Агд,

Хаа в положении 20 - А1а, С1у, 8ег, С1и или С1п,

Хаа в положении 21 - А1а, 8ег или Уа1, причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из 8Ер ΙΌ №. 10, а -Ζ- означает необязательный линкер, которым может быть РЕС, модифицированный РЕС и/или [С1у]_п, где п=1, 2 или 3 и, независимо от п, т в [Агд]_т=0, 1, 2 или 3, терминальные концы последовательностей могут быть представлены свободными карбоксильными или аминогруппами, амидами, ацилами, ацетилами или их солями, и/или указанные пептидные последовательности иммобилизованы на твердой основе.

Новые пептидные последовательности способны служить хорошими антигенами, причем такой антиген содержит по меньшей мере один пептид, выбранный из числа последовательностей 8Ер ΙΌ №. 1, 8Ер ΙΌ №. 4, 8Ер ΙΌ №. 7 или 8Ер ΙΌ №. 10. Антигенность можно адаптировать, подбирая соотношения или концентрации различных пептидов или размера пептидов путем, например, димеризации или полимеризации и/или иммобилизации на твердой фазе. Антиген включает две или несколько полипептидных последовательностей по изобретению, которые могут быть связаны через мостик, к примеру дисульфидный мостик между остатками Сук этих цепей или мостик типа алкиленов С1-С8, возможно, с одним или несколькими гетероатомами О, 8 или N между ними, но предпочтительно они не связаны. Цепи могут быть иммобилизованы на твердой фазе в мономерной, димерной или олигомерной форме. На концах могут быть добавлены дополнительные аминокислоты, чтобы получить ножку для лучшей иммобилизации.

ПЭГ - это полиэтиленгликоль НО(СН₂СН₂О)_аН, который может входить в состав линкера -Ζ-, причем ПЭГ необязательно модифицирован дикарбоновой кислотой в виде НО(СН₂СН₂О)_аСО(СН₂)_ЬСООН или терминальной карбоксильной группой в виде НО(СН₂СН₂О)_а-!СН₂СООН, где а=1-10 и Ь=2-6, перед присоединением линкера.

- 7 006210

Линкер -Ζ- может состоять из ПЭГ, модифицированного ПЭГ или их комбинации и/или в сочетании с одним или несколькими остатками С1у. Альтернативно, линкер -Ζ- может состоять из глицинового мостика [С1у]_п, где п=1, 2 или 3.

Все аминокислоты в пептидах изобретения могут находиться в виде Ό- или Ь-форм, хотя предпочтительна природная Ь-форма.

С- и Ν-терминальные концы пептидных последовательностей могут отклоняться от природных последовательностей модификацией терминальной NΗ₂-группы и/или СООН-группы, например они могут быть ацилированы, ацетилированы, амидированы или модифицированы с целью получения сайта связывания для носителя или другой молекулы.

Пептиды по изобретению состоят из 6-50 аминокислот, предпочтительно от 10 до 30 аминокислот. Они охватывают все естественные вариации аминокислот в идентифицированных положениях.

Полипептидный антиген согласно изобретению может быть как в свободной, так и в связанной с носителем форме. Носитель или твердую фазу, с которой пептид необязательно связан, можно выбирать из широкого круга известных носителей. Его следует выбирать с учетом намеченного применения иммобилизованного полипептида в качестве диагностического антигена или иммунизирующего компонента вакцины.

Примеры носителей, которые могут применяться, к примеру, в диагностических целях, - это магнитные бусины или латекс из сополимеров типа стирендивинилбензол, гидроксилированный стирендивинилбензол, полистирен, карбоксилированный полистирен, бусины из технического углерода, неактивированного или активированного полистиреном или поливинилхлоридом стекла, эпоксиактивированного пористого магнитного стекла, частицы из желатина или полисахаридов либо белковые частицы, эритроциты, моно- или поликлональные антитела или £аЬ-фрагменты таких антител.

Согласно следующему воплощению настоящего изобретения антигены могут входить в состав вакцины, возможно, в сочетании с носителями, адъювантами или в комбинации с другими иммуностимулирующими элементами, такими как оспенный вирус канарейки, несущий ген епу. Примерами носителей и/или адъювантов для вакцин служат и такие белки, как бычий или человеческий сывороточный альбумин, гемоцианин и жирные кислоты моллюска Г188ше11а.

Иммуностимулирующие вещества можно подразделить на три группы: адьюванты, носители для антигенов и наполнители. Примеры адъювантов включают гидроксид алюминия, соли алюминия, сапонин, мурамиловые ди- и трипептиды, монофосфорилированный липид А, пальмитиновая кислота, В. рейи8818 и различные цитокины, включая цитокин 1Ь-12 и Ш-1 класса ТЬ1. Для переноса белков через клеточные мембраны в цитозоль может служить целый ряд белковых токсинов, которые полезны при разработке вакцин СТЬ. Носители включают бактериальные токсоиды, такие как инактивированные столбнячный и холерный токсины, генетически детоксифицированные бактериальные токсины, такие как термолабильный энтеротоксин из Е. сой, жирные кислоты, живые векторы типа химерного полиовируса, и гибридные белки, образующие частицы, например гибридные частицы ΤΥ и НВсАд с ретротранспозоном дрожжей. Часто применяемые наполнители в современных вакцинах состоят из эмульсии минерального масла, полного и неполного адъюванта Фрейнда, эмульсий растительных масел, неионных поверхностноактивных блоксополимеров, сквалена или сквалана, липопептидов, липосом и биодеградируемых микросфер. Два новых адъюванта, обладающих значительным потенциалом для разработки новых вакцин, это микроэмульсия масло-в-воде МГ59 и полимерные микрочастицы. Можно использовать любые вещества, усиливающие иммуногенность антигена, и в Фармакопее США и Европейской Фармакопее приведены еще несколько других альтернативных носителей или адъювантов.

В состав композиции антигена для применения в качестве иммуностимулятора также могут входить интерфероны типа γ-ΙΝΓ, антивирусные хемокины или гемопоэтические факторы роста, такие как фактор роста гранулоцитов/макрофагов.

Другой подход для усиления стимуляции и всасывания, к примеру, в кишечнике, состоит во введении пептидов изобретения вместе с небольшими пептидами, такими как ди-, три- или тетрапептиды. Эти пептиды можно вводить в дополнение к пептидам изобретения или в комбинации с ними. Предпочтительно пептиды вводят вместе с трипептидом Υ ОС, состоящим из аминокислот в Ό- или Ь-форме, предпочтительно в Ό-форме.

Последние подходы к непарентеральному введению вакцин, к примеру, через слизистую оболочку включают технологию слияния генов для создания нетоксичных производных мукозных адъювантов, генетическую инактивацию антигенов путем делеции в основном гене, коэкспрессию антигена и специфического цитокина, играющего важную роль в модуляции и контроле иммунного ответа в слизистой оболочке, и получение самого генетического материала, позволяющего захват ДНК или РНК и эндогенную экспрессию их в клетках хозяина.

Один из подходов к получению продолжительных ответов, когда требуется клеточный иммунитет, заключается в вакцинации при помощи плазмидной ДНК, кодирующей один или несколько специфических антигенов.

Для защиты от ВИЧ-инфекции вакцина должна индуцировать и мукозный, и системный иммунный ответ и может вводиться любым общепринятым способом, парентерально или непарентерально, напри

- 8 006210 мер подкожно, внутрикожно, внутривенно, внутримышечно, перорально, в слизистую оболочку или интраназально.

В предпочтительном воплощении вакцина согласно настоящему изобретению включает антигены, содержащие пептиды, выбранные по меньшей мере из одной из групп 8ЕО Ш Νο. 1, 4, 7 и 10, более предпочтительно различные пептиды находятся в равном количестве.

В следующем предпочтительном воплощении вакцинная композиция содержит следующие антигены:

Р V I Н К Ь Е Р № Ь Η Р 6 8 О Н N1 Т А 8 Т Ν-ΝΗ₂ (8ЕО ГО Νο. 14) и

К Ь V 6 Р Р V К Р О V Р 6 Ь Ь К Р Ь Т Υ К А Α-ΝΗ₂ (8ЕО ГО Νο. 15)

Эти последовательности могут активировать клеточную иммунную систему и привносить СТЬэпитопы. Аминокислотные изменения, проведенные в рамках СТЬ-эпитопов, предназначены для усиления связывания. Другие аминокислотные изменения проводились для облегчения синтеза пептида и/или увеличения растворимости пептида.

Способ обнаружения антител, индуцируемых ВИЧ-1, или специфическими пептидами, или белками ВИЧ-1, в образце жидкой среды организма при помощи данных антигенов составляет следующее воплощение изобретения. Настоящее изобретение также охватывает набор для иммуноанализа, предназначенный для такого обнаружения, и антитела, способные избирательно реагировать с указанными антигенами.

Получение пептидов

Пептиды изобретения можно получить любым известным способом получения линейных аминокислотных последовательностей, таким как методы рекомбинантной ДНК. Нуклеотидная последовательность, кодирующая один или несколько пептидов изобретения или мультимер из таких пептидов, вводится в экспрессионный вектор. Подходящими экспрессионными векторами могут служить, к примеру, плазмиды, космиды, вирусы и ΥΑС (искусственные хромосомы дрожжей), содержащие необходимые элементы для контроля репликации и экспрессии. Экспрессионный вектор может подвергаться стимуляции для экспрессии в клетках хозяина. Подходящими клетками хозяина являются, к примеру, бактерии, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих. Такие методы хорошо известны в данной области и описаны, к примеру, в 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, Со1й 8рппд НагЬог, 1989. Другие хорошо известные методы - это деградация или синтез путем присоединения одного аминокислотного остатка к следующему в жидкой фазе или предпочтительно на твердой фазе (смола), например, при помощи так называемого синтеза по МетГ1е1й. См., к примеру, Вагапу апй МетйеИ ίη !йе Рерййез, Апа1уз1з, 8уп1йез1з, Вю1оду, ^1. 2, Е. 6гозз апй МетйоГег. Ей. (Асай. Ргезз, Ν.Υ., 1980), КпеФ-Согошег апй Ми11еп, 1п1. 1. Рерййе Рго1еш Кез., 30, р. 705-739 (1987) и Р1е1йз апй №Ь1е, 1п1. 1. Рерййе Рго1еш Кез., 35, р. 161-214 (1990).

В случае, когда нужен связанный или циклический пептид, аминокислотная последовательность подвергается стадии химического окисления для циклизации или связывания двух остатков цистеина внутри одной или между двумя пептидными последовательностями, когда синтезируют соответствующие линейные аминокислотные последовательности, см. Акар е! а1., ТеЧайейгоп ЬеЧег, 33, 8, р. 10731076, 1992.

Общее описание синтеза

Все пептидные производные, полученные в описанных ниже примерах, были синтезированы в синтезаторе М1Шдеп 9050 Рерййе 8уп1йез1/ег по стандартной программе. Использовали смолу Теп!а 6е1 Р КАМ с теоретической нагрузкой 0,20 мэк/г (КАРР Ро1утеге 6тЬН, ТиЬшдеп). Конечный продукт синтеза высушивали под вакуумом в течение ночи. Затем пептид отделяли от смолы путем обработки 90% трифторуксусной кислотой в присутствии этандитиола (5%) и воды (5%) в качестве перехватчиков (1,5 ч при комнатной температуре). Затем смолу фильтровали и промывали на фильтре дополнительным объемом трифторуксусной кислоты (100%) (2х20 мл). Фильтраты объединяли и упаривали под вакуумом (водяная баня при комнатной температуре), а остаток растирали в этиловом эфире (200 мл) и отфильтровывали осажденный продукт. Твердое вещество сразу растворяли на фильтре в ледяной уксусной кислоте (100 мл), вносили в 1,5 л 20% уксусной кислоты в метаноле и обрабатывали 0,1 М раствором йода в метаноле до получения легкого коричневого оттенка. Затем добавляли ионообменник Ωο\\όχ 1х8 в ацетатной форме (15 г) (Βίο-Кай, Кюйтопй, СА) и смесь фильтровали. Фильтрат упаривали, а остаток лиофилизировали из уксусной кислоты. Затем продукт очищали методом обратнофазовой жидкостной хроматографии на колонке, заполненной Кготазй® 100-5 С8 (ЕКА №Ье1, 8иг1е, 8\\сйеп) в соответствующей системе, содержащей ацетонитрил в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты. Образцы собирали с колонки и анализировали методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРЬС) (Весктап 8уз1ет 6о1й, И8А), снабженной колонкой Кготазй® 100-5 С8 (ЕКА №Ье1, 8иг1е, 8\\'ейеп). Фракции, содержащие чистое вещество, объединяли, растворитель выпаривали и продукт лиофилизировали из уксусной кислоты. Конечный продукт подвергали анализу НРЬС и структуру пептида проверяли при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (ЬП1-М8).

Для синтеза использовали только Ь-аминокислоты, которые были защищены фторенилметоксикарбонильной группой в положении α-аминогруппы. Боковые цепи были защищены следующим образом:

Суз(Тй), 61п(Тй), 61и(0!Ви), Тйг(1Ви),

- 9 006210 где сокращения в скобках означают

Тг1=трифенилметил

1-Ви=трет-бутил

О1Ви=трет-бутиловый эфир.

Аминокислотные производные были получены у фирмы ВасНсш АС, 8\\йхсг1апй.

Пример 1. Получение С 8 № V N Р К Ь Е Р № N1 Η Р С 8 О Н N1 Т А С Т Ν-ΝΗ₂ (8ЕО ΙΌ Νο. 2).

Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Затем пептид переводили в циклическую форму окислением с помощью Ι₂. Пептид растворяли в смеси уксусной кислоты/метанола (1:4) и добавляли 0,1 М Ι₂ в метаноле. Чистоту определяли методом НРЬС и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и массспектрометрии (ΕΌΙ-Μ8).

Чистота (НРЬС): более 97% (отдельные примеси менее 1%).

Молекулярный вес (свободное основание): 2746,2.

Пример 2. Получение Е V I Р К Ь Е Р № N1 Н Р С 8 О Р ΝΙ Т А С Т Ν-ΝΗ₂ (8ЕО ΙΌ Νο. 3).

Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом НРЬС и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (ΕΌΙ-Μ8).

Молекулярный вес (свободное основание): 2538,0.

Пример 3. Получение Υ Ь Ь Е Ь Т К С Ь С Ι 8 С С С Υ N1 С Сй К К К Сй Ω Ш С1-Х1Е (8ЕО ΙΌ Νο. 5).

Пример 4. Получение Υ Ь N1 Е Ь Т К С Ь С Ι 8 С С С Υ N1 С Сй К К К Сй С Ι С 6-Х1Е (8ЕО ΙΌ Νο. 6).

Молекулярный вес (свободное основание): 3097,7.

Пример 5. Получение К Ι Ь 8 Т Υ Ь С К Ι 8 С С С № Ь 8 А Е Р V Р Ь С Ь Р Р Е-Х1Е (8ЕО ΙΌ Νο. 8).

Молекулярный вес (свободное основание): 2990,6.

Пример 6. Получение К Ι Ь 8 Т Υ Ь С К Ι 8 С С С Υ Ь 8 А Е Р V Р Ь С Ь Р Р Е-Х1Е (8ЕО ΙΌ Νο. 9).

Пример 7. Получение К Ь V С Е Р V К Р р V Р С С С К Ь Ь Сй Р N1 Т Υ К А А-ИН₂ (8ЕО ΙΌ Νο. 11).

Пример 8. Получение К Ь V С Е Р V К Р р V Р С С С К Ь Ь К Р Ь Т Υ К А А-ЛН₂ (8ЕО ΙΌ Νο. 12).

Молекулярный вес (свободное основание): 2790,4.

Молекулярная формула: С1₃₀Н₂₁₇О₃9^₉.

Пример 9. Димеризация через дисульфидный мостик.

Пептидные последовательности из примера 2 соединяли путем окисления с образованием дипептида, в котором цистеиновые остатки образуют дисульфидный мостик. Мостик формировали любым из следующих способов.

A) Окисление с помощью Ι₂.

Пептиды (в равных количествах, если они различны) растворяли в смеси уксусная кислота/метанол (1:4) и добавляли 0,1 М Ι₂ в метаноле, получая смесь гомодимера.

B) Окисление через |Су5(8ру)^::|-8ЕО ΙΌ Νο. 3.

Растворяли 2,3 мМ пептида 8ЕО ΙΌ Νο. 3 в смеси из 2 М водного АсОН и 2-пропанола (1:1) и обрабатывали 2,2-дитиодипиридином (3 экв.), получая |Су5(8ру)^::|-8ЕО ΙΌ Νο. 3. |Су5(8ру)^::|-8ЕО ΙΌ Νο. 3 растворяли в смеси из 10 мМ NΗ₄ОАс (водный, рН=6,5) и метанола (5:2), получая димер 8ЕО ΙΌ Νο. 13.

- 10 006210

Чистоту полученного димера определяли методом НРЬС и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (ΕΌΙ-Μ8).

Пример 10. Получение Р V I Н К Ь Е Р Ж Ь Н Р 6 8 О Н N1 Т А 8 Т Ν-ΝΗ₂ (8ЕО ΙΌ Νο. 14).

Чистота (НРЬС): более 98% (отдельные примеси менее 1%).

Молекулярный вес (свободное основание): 2540,2.

Пример 11. Получение К Ь V 6 Р Р V К Р О V Р 6 Ь Ь К Р Ь Т Υ К А Α-ΝΠ₂ (8ЕО ΙΌ Νο. 15).

Чистота (НРЬС): более 99% (отдельные примеси менее 1%).

Молекулярный вес (свободное основание): 2520,3.

Пример 12. Контрольный пример.

Получение нативной последовательности Та11: Μ Е 8 V Ό Р К Ь Е Р Ж К Н Р 6 8 О Р К Т А С Т Ν-ΝΉ₂(8ЕО ΙΌ Νο. 16).

Молекулярный вес (свободное основание): 2708,1.

Пример 13. Контрольный пример.

Получение нативной последовательности Та12: О V С Р Ι Т К 6 Ь 6 Ι 8 Υ 6 К К К К К О К К Κ-ΝΉ₂(8ЕО ΙΌ Νο. 17).

Чистота (НРЬС): более 94%.

Молекулярный вес (свободное основание): 2806,4.

Пример 14. Контрольный пример.

Получение нативной №£-последовательности: Е Е V 6 Р Р V К Р О V Р Ь К Р М Т Υ К А Α-ΝΉ₂(8ЕО ΙΌ Νο. 18).

Чистота (НРЬС): более 95%.

Молекулярный вес (свободное основание): 2384,8.

Пример 15. Получение вакцины, содержащей пептиды 8ЕО ΙΌ Νο. 3 и 12.

Лиофилизованные пептиды растворяли в стерильной воде до конечной концентрации 4 мг/мл. Также готовили препарат колониестимулирующего фактора гранулоцитов/макрофагов (ΟΜ-ί’8Ε) согласно инструкции производителя до конечной концентрации 0,3 мг/мл. Два раствора вводили внутрикожно. Обычная доза для инъекции составляла 100 мкл.

Пример 16. Получение вакцины, содержащей пептиды 8ЕО ΙΌ Νο. 14 и 15.

Пример 17.

Раствор или суспензию антигена смешивали с равным количеством адъюванта Фрейнда фирмы Ве11ппд. полного или неполного, а затем тщательно эмульгировали, набирая в шприц для инъекций и энергично выпуская из него, или при помощи гомогенизатора. Эмульсия должна оставаться стабильной не менее 30 мин. Эмульсии антиген-адъювант лучше всего вводить подкожно как депо.

Пример 18. Иммуноанализ для обнаружения антител, индуцируемых ВИЧ-1.

Реагенты для магнитных частиц следует готовить по методике, рекомендованной производителем. Использовали частицы ЭупаЬеабх фирмы Эупа1 А8. Покрытые лигандом магнитные частицы называют реагентом 1. Пептид согласно изобретению ковалентно связывается с преактивированной поверхностью магнитных частиц. Также возможно физически абсорбировать пептид на поверхности магнитных частиц. Концентрация частиц в реагенте 1 находится в пределах от 1 до 15 мг/мл. Размер частиц варьирует от 0,2 до 15 мкм. Концентрация пептидов находится в пределах от 0,01 до 1 мг/мл частиц.

- 11 006210

Реагент конъюгированного с щелочной фосфатазой антитела против 1д человека готовили по методике, рекомендованной фирмой Пако АЗ. Эта методика является стандартной в данной области. Данный реагент называется реагент 2.

Раствор субстрата - фенолфталеинмонофосфата - готовили согласно методике, рекомендованной фирмой Р1ика АС. Эта методика является стандартной в данной области. Данный реагент называется реагент 3.

Используемый для отмывки и инкубации буфер представляет собой стандартный 0,05 М трисбуфер со следующими дополнительными компонентами: Твин 20 (от 0,01 до 0,1%), глицерин (от 0,1 до 10%) и хлористый натрий (от 0,2 до 0,1%).

Процедура определения включает стадию инкубации, на которой 1 каплю реагента 1 смешивают с 2 каплями отмывочного буфера в каждой лунке. После перемешивания добавляют 30 мкл образца и раствор инкубируют 5 мин. Магнитные частицы удерживают магнитом и удаляют жидкость, а затем убирают магнит. Затем ячейки дважды отмывают 4 каплями отмывочного буфера перед инкубацией с реагентом 2. Вносят 1 каплю реагента 2 вместе с 2 каплями отмывочного буфера и раствор инкубируют 5 мин. Магнитные частицы удерживают магнитом и удаляют жидкость, а затем убирают магнит. Затем стадию отмывки повторяют перед инкубацией с реагентом 3. Вносят 2 капли реагента 3 в каждую ячейку и раствор инкубируют 3 мин. Результат определяют на белом фоне. Положительный результат - красный раствор (3+=интенсивно красный), тогда как отрицательный результат - бледный светло -желтый/коричневый раствор, как у отрицательного контроля.

Набор для иммуноанализа может применяться для обнаружения антител, индуцируемых вирусом ВИЧ-1 или ВИЧ-специфичными пептидами или белками, например пептидами настоящего изобретения.

Пример 19. Терапевтическая или профилактическая вакцина.

По меньшей мере один из полипептидов изобретения, выбранный из группы последовательностей ЗЕО Ш Νο. 1, ЗЕО Ш Νο. 4, ЗЕО Ш Νο. 7 или ЗЕО Ш Νο. 10, могут служить в качестве антигена и составлять действующее начало терапевтической или профилактической вакцины, предназначенной для защиты от вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1). Вакцина может включать соединения, обладающие благотворным эффектом защиты или стимуляции иммунной системы хозяина (человека или позвоночных животных), например интерлейкины, интерфероны, факторы роста гранулоцитов/макрофагов, гемопоэтические факторы роста и др. Предпочтительно вакцинная композиция дополнительно содержит адъювант или носитель, более предпочтительно адъювантом или носителем служит монофосфорилированный липид А (МРЬ®), возможно, вместе с квасцами, адъювантом Фрейнда (полным или неполным) или гидроксидом алюминия. Оптимальное количество адъюванта/носителя зависит от выбранного типа.

Пептиды изобретения могут быть модифицированы добавлением к С-концу одной жирной кислоты, например цепи пальмитоила, для получения липопептидной вакцины. Затем липопептиды могут быть введены в мембраны липосом методом замораживания-оттаивания, в результате чего образуются липосомы, несущие пептидные лиганды на своей поверхности.

Пептидная или вакцинная композиция может быть лиофилизирована перед хранением. Лиофилизованные пептиды можно растворять в стерильной воде до конечной концентрации 0,1-100 мг/мл. Вакцину можно хранить предпочтительно при низкой температуре, в ампулах, содержащих одну или несколько дозовых единиц, готовых к употреблению. Обычная дозовая единица пептида согласно изобретению находится в пределах от 0,05 мкг до 1 мг на кг веса тела, предпочтительно в пределах от 0,15 мкг до 0,15 мг на кг веса тела. Специалисты в данной области знают, что доза подбирается в зависимости от веса тела пациента, типа заболевания, степени тяжести заболевания, способа введения и некоторых других факторов. При применении в качестве терапевтической вакцины ее можно вводить до 12 раз путем инъекций. Можно назначать дополнительные инъекции для иммунизации и в некоторых случаях продолжать их в течение всей жизни пациента. При приготовлении раствора для инъекции пептиды растворяют в стерильной воде до конечной концентрации пептида 1 мг/мл. Обычно объем раствора для инъекции составляет от 100 до 200 мкл (2x100 мкл). Пептид предпочтительно вводят вместе с подходящим адъювантом и/или фактором роста гранулоцитов/макрофагов, к примеру, Ьеиеотах® фирмы Зйегтд Ρίοιίβΐι. приготовленном в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мг/мл, в соответствии с рекомендациями производителя. Особенно предпочтительно комбинированное лечение, когда данные пептиды вводятся вместе с пептидами, описанными в опубликованной международной патентной заявке Ρ0Τ/ΝΘ00/00075 и/или находящейся на рассмотрении патентной заявке Норвегии № 2000 4413. Эти пептиды можно вводить одновременно или последовательно. К подходящим способам введения относятся внутрикожный, подкожный, внутривенный, пероральный, внутримышечный, интраназальный, мукозальный и др. Для сохранения защитного эффекта могут потребоваться бустерные инъекции. Специалистам в данной области понятно, что вакцинные композиции по изобретению применимы не только для предупреждения инфекции, но также для лечения инфекции.

Не наблюдалось токсических эффектов пептидов по изобретению при введении мышам в дозе 100 мкг на кг веса тела.

- 12 006210

Вышеприведенные примеры предназначаются только для иллюстрации. Предусматривается, что специалист в данной области может модифицировать описанные здесь пептиды, антигены и вакцины, не отклоняясь от замысла и области действия данного изобретения, как изложено в формуле изобретения.

Перечень последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (х) ПОДАТЕЛЬ ЗАЯВКИ (A) ИМЯ: Βίοηοτ 1штипо А8 (B) УЛИЦА: §1г0тс1а18]огс1е14, Р.О.Вох 1893 Сгйзе!

(C) ГОРОД: 3703 8к1еп (Е) СТРАНА: Норвегия (Р) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС: N-3705 (О) ТЕЛЕФОН: + 47 35 50 57 50 (Н) ТЕЛЕФАКС: + 47 35 50 57 01 (ΐ) АВТОР ИЗОБРЕТЕНИЯ (A) ИМЯ: Вй§ег Зягепзеп (B) УЛИЦА: МфгНа 3 (C) ГОРОД: 3727 8к1еп (ϋ) СТРАНА: Норвегия (и) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Регуляторные и вспомогательные пептиды ВИЧ, антигены, вакцинные композиции, иммуноанализ и способ обнаружения антител, индуцируемых ВИЧ (ш) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 18 (ΐν) КОМПЬЮТЕРНАЯ ФОРМА (A) ТИП НОСИТЕЛЯ: Гибкий диск (B) КОМПЬЮТЕР: 1ВМ-совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: УУтдоугс 2000 (О) ПРОГРАММА: АУогд 7.0 (ν) ДАННЫЕ О НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКЕ:

НОМЕР ЗАЯВКИ:

- 13 006210 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е() ΙΟ Νο. 1 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 22-24 аминокислоты (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (О) ТОПОЛОГИЯ: обе (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ, нет (ν) ТИП ФРАГМЕНТА: внутренний (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 1 = Ме1, 8ег, Суз или отсутствует (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 2 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 2 = О1и, Азр, Уа1, 8ег или отсутствует (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 3 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 3 = 8ег, О1п, Рго, Ьеи, Уа1, А1а, Тгр, Туг или РЬе (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 4

- 14 006210 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 4 = Уа1 или Не (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 5 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 5 = Азр, Азп или Не (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ.· Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 6 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' Хаа в положении 6 = Рго, ΗΪ8 или А1а (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 7 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 7 = Аг§, Азп, 8ег, Ьуз, С1и или Азр (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 12 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 12 = Ьеи, Не или Νΐε (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 15 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 15 = О1у или Рго (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 16 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' Хаа в положении 16 = 8ег, Азп или А1а (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(А) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт

- 15 006210 (В) ПОЛОЖЕНИЕ 17 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = Хаа в положении 17 = О1п, Ьуз или ТЬг (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ (A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ 18 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = Хаа в положении 18 = Рго или ΗΪ8 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ (A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ 19 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = Хаа в положении 19 = Ьуз, ТЬг, Зег, Сг1п, А1а, Аг§, Рго, Ст1и, Ьеи, Не или Ы1е (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ (A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ 20 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = Хаа в положении 20 = ТЬг, А1а или Не (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ (A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ 21 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = Хаа в положении 21 = А1а, Рго, Азр или Уа1 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ (A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ 22 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = Хаа в положении 22 = Суз или Зег (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ (A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ 23 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = Хаа в положении 23 = ТЬг, Азп или Зег

- 16 006210 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 24 (Ό) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 24 = Азп, Ьуз, Аг§, СИп, А1а, Рго или ТЬг (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Суз в положении 1 может входить в состав дисульфидного мостика (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 22 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Суз в положении 22 может входить в состав дисульфидного мостика (χΐ)ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер Ю Νο. 1

Хаа1 Хааг Хааз Хаа₄ Хаа5 Хааб Хаа7 Ьеи О1и Рго Тгр Хаа12 Ηΐβ Рго Хаа_!5 Хаа1б Хаап

5 10 15

Хаа18 Хаа 19 Хаа2о Хаа21 Хаа22 Хаа2з Хаа24 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8 Ер Ш Νο. 2 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 24 аминокислоты (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет

- 17 006210 (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1. 22 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим/¹ Суз в положениях 1 и 22 может входить в состав внутрицепочечного дисульфидного мостика (χϊ)ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е0 ГО Νο. 2

Суз 8ег Тгр Уа1 Азп Рго Аг§ Ьеи О1и Рго Тгр ΝΙε Из Рго СЙу Зег θΐη Из Νΐε ТЬг

10 15 20

А1а Суз ТЬг Азп (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8ЕЦ ГО Νο. 3 (ϊ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 22 аминокислоты (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (О) ТОПОЛОГИЯ, обе (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (χϊ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е() ГО Νο. 3

Рйе Уа1 Не Рго Аг§ Ьеи О1и Рго Тгр ΝΙε Из Рго О1у 8ег О1п Рго Νίβ ТЬг А1а Суз 15 10 15 20

ТЬг Азп (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е() ГО Νο. 4 (ϊ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 24-27 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (О) ТОПОЛОГИЯ: обе (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид

- 18 006210 (ϋί) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 1 = Рго, Не, Ьеи, ТЬг, Туг или Уа1 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 2 (Е>) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 2 = Уа1, А1а, Суз, Ьеи (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 3 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 3 = Суз, Не, Ьеи, Уа1 или Νίβ (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 5 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' Хаа в положении 5 = Не, Ьеи, О1п, Ме1 или

ТЬг (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(А) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (В) ПОЛОЖЕНИЕ: 6 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' Хаа в положении 6 = ТЬг, Азп, Ьуз или Аг§ (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 7 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-'Хаа в положении 7 = Ьуз, Аг§ или О1п

- 19 006210 (ίχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 8 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 8 = 61у или А1а (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 9 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.=^?| Хаа в положении 9 = Ьеи или Не (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 10 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 10 = О1у, 8ег или А1а (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 11 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 11 = Не или О1у (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 12 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ. /прим.= Хаа в положении 12 = 8ег, РИе или Туг (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: Хаа, вставленный перед положением 14 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа, вставленный перед положением 14 Ьеи, Не, Νΐε (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 15

- 20 006210 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 15 - Аг§, Ьуз, 8ег или цитруллин (к) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 19 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 19 = Аг§, Ьуз, 8ег, О1у или цитруллин (к) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 20 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 20 = О1п, Аг§ или Рго (к) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 21 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' Хаа в положении 21 = Не или Ьеи (к) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 22 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим -' Хаа в положении 22 = О1у, Ьеи, Не, Суз или отсутствует (к) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 23 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 23 = С31у или отсутствует (к) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 12. . . 13 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' необязательно вставлен линкер -Ζ- 21 006210 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 2, 3 и 22 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Суз в положениях 2, 3 и 22 может входить в состав дисульфидного мостика (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ. 8Е0 ГО Νο. 4

Хаа1 Хааг Хааз РЬе Хаа5 Хааб Хааг Хаа» Хаад Хааю Хаац Хаа^ -Ζ- Туг Хаа; О1у

5 10 15

Хааи Ьуз Ьуз Аг§ Хаа19 Хааго Хааг1 Хаагг Хаагз (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8ΕΩ ГО Νο. 5 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 27 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ, пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ, нет (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 12 .13 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' вставлен О1у-мостик из 3 остатков (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е() ΙΟ Νο 5

Туг Ьеи Ьеи РЬе Ьеи ТЬг Ьуз Ст1у Ьеи О1у Не 8ег О1у О1у Сг1у Туг Νΐε О1у СЙ Ьуз Ьуз 15 10 15 20

Аг§ СЙ О1п Не Ьеи О1у

- 22 006210 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ЗЕр Π) Νο. 6 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 28 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ΐϋ) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 12 .13 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= вставлен О1у-мостик из 3 остатков (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 27 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Суз в положении 27 может входить в состав дисульфидного мостика (χΐ)ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО Νο. 6

Туг Ьеи Νΐε РЬе Ьеи ТЬг Аг§ О1у Ьеи СИу 1Н Бег Ст1у О1у Оу Туг Νΐε С1у Сй Ь^з Ьуз Аг§ СИ СИп Не Суз О1у (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ЗЕО ГО Νο. 7 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 25-28 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна

- 23 006210 (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ΐΐΐ) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 1 = Рйе, Туг, Тгр или Агд (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 4 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 4 = О1у, Бег, Азп, Азр, Суз, Уа1, Тйг, А1а или Аг§ (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 5 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 5 = Тйг, А1а, Азр, Азп или Бег (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 6 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 6 = Туг, Суз, Рйе, Аг§,

ΗΪ8, Бег, Уа1 или Ьеи (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 10 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 10 = Бег, Рго, РЬе, Ьеи или Не

- 24 006210 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 11 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 11 = А1а, Тйг, О1и, О1п,

Уа1, Рго или Зег (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ. 12 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 12 = О1и, Ьуз, О1п, Азр, Азп, Туг, Тгр или РЬе (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: Хаа, вставленный после положения 13 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.='' Хаа, вставленный после положения 13 =

Зег, Рго, РЬе, Ьеи или Не (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: Хаа, вставленный перед положением 14 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.='' Хаа, вставленный перед положением 14 = А1а, ТЬг, О1и, Сг1п, Уа1, Рго или Зег (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 14 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим,-' Хаа в положении 14 = О1и, Ьуз, О1п, Азр или Азп (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 15 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 15 = Рго, Зег, А1а или

Азп

- 25 006210 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 16 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 16 = Уа1, Азп, О1у или

Рго (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 17 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 17 = Рго, С1п, Ыз, Зег, Ьеи, Аг§, ТЬг, Азр или Не (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 18 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.='' Хаа в положении 18 = Ьеи, РЬе или Уа1 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 19 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.='' Хаа в положении 19 = О1п, Ьеи, Рго, Ηΐδ, Азр или О1и (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 11... 12 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= необязательно вставлен линкер -Ζ(ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 4 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Суз в положении 4 и 6 может входить в состав дисульфидного мостика

- 26 006210 (χί)ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е0 ГО Νο. 7

Хаа1 Не Ьеи Хаад Хаа5 Хаа^ Ьеи С1у Аг§ Хаащ Хаац -Ζ- Хаащ Ьеи в Хаа, Хаа; Хаам 1 5 ^{10 15}

Хааи Хаащ Хаащ Хаащ Хаащ Ьеи Рго Рго Ьеи

25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8ЕЦ ГО Νο. 8 (1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 28 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (О) ТОПОЛОГИЯ: обе (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ϋί) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 11... 12 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим,-' вставлен мостик [О1у]_п, где η - 3 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕЦ ГО Νο. 8

Аге Не Ьеи 5ег ТЬг Туг Ьеи О1у Аг§ Не Зег С1у О1у СИу Тгр Ьеи 8ег А1а О1и Рго Уа1 ! 5 10 15 20

Рго Ьеи О1п Ьеи Рго Рго Ьеи (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е0 ГО Νο. 9 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 28 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (О) ТОПОЛОГИЯ: обе

- 27 006210 (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (ίχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 11.12 (Ώ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим. вставлен мостик [Сг1у]_п, где η = 3 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ. 8ЕЦ Π) Νο. 9

Аге Не Ьеи 8ег ТЬг Туг Ьеи О1у Аг§ Не 8ег С1у О1у О1у Туг Ьеи 8ег А1а О1и Рго Уа1 ] 5 10 15 20

Рго Ьеи О1п Ьеи Рго Рго Ьеи (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8ЕЦ ГО Νο. 10 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 22-29 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (О) ТОПОЛОГИЯ: обе (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нетОх) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 1 = Ьуз или Аг§ (ίχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(А) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт

- 28 006210 (В) ПОЛОЖЕНИЕ: 5 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' Хаа в положении 5 = РНе или Ьеи (к) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 7 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 7 = Не или Уа1 (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 8 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 8 = ТЬг, Аг§, Ьуз, А1а или Ме1 (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 10 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.='' Хаа в положении 10 = О1п или ΗΪ8 (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ. 11 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 11= Уа1, Ьеи или Не (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: Хаа, вставленный перед положением 13 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= перед положением 13 вставлен Ьеи (ϊχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 13 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.-' Хаа в положении 13 = Ьеи, Уа1 или ТЬг

- 29 006210 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 14 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 14 = Аг§ или Сй (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 16 (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.='' Хаа в положении 16 = Ме1, Уа1, Не, Ьеи или Νΐε (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 17 (O) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 17 = ТЬг или Азр (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 18 (Ό) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 18 = Туг, РЬе или Аг§ (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ.

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 19 (P) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 19 = Ьуз или Аг§ (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 20 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= Хаа в положении 20 = А1а, О1у, Зег, С1и или Сг1п (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 21

- 30 006210 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим Хаа в положении 21 = А1а, Зег или Уа1 (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ (A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ 12 (ЬеиХаав) (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = необязательно вставлен линкер -Ζ- и/или мостик [Аг§]_т между Хаа12 и (ЬеиХаац), где т = 0, 1,2 или 3 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер Ю Νο 10

Хаа1 Ьеи Уа1 О1у Хаа5 Рго Хаа? Хаа» Рго Хаац» Хаац Рго -2-[Аг§]_т Ьеи1 Хаац

5 10

Хаан Рго Хаа1б Хаац Хаа!» Хаа19 Хааго Хаа21

20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Εζ) Ю Νο 11 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 26 аминокислот (B) ТИП аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ одна (ϋ) ТОПОЛОГИЯ обе (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ пептид (ΐίΐ) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ нет (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ (A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ 12 (ЬеиХаав ) (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /прим = линкер -Ζ- представляет собой [О1у]_п, где η = 3, и [Аг§]_т, где т = 1

- 31 006210 (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕЦ ГО Νο. 11

Ьуз Ьеи Уа1 В1у РЬе Рго Уа1 Ьуз Рго О1п Уа1 Рго О1у О1у О1у Аг§ Ьеи Ьеи Сй Рго Νΐε 15 ю 15 20

ТЬг Туг Ьуз А1а А1а (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Ер ГО Νο. 12 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 26 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна (О) ТОПОЛОГИЯ: обе (п) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 12... (ЬеиХаа,₃) (О) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= линкер -Ζ- представляет собой [О1у]_п, где η = 3, и [Аг§]_т, где т = 1 (χΐ)ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е() ГО Νο. 12

Аг§ Ьеи Уа1 О1у РЬе Рго Уа1 Ьуз Рго О1п Уа1 Рго О1у О1у О1у Аг§ Ьеи Ьеи Аг§ Рго Ьеи 15 10 15 20

ТЬг Туг Ьуз А1а А1а (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е() ГО Νο. 13 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 44 аминокислоты (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: две

- 32 006210 (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: димерный пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (ΐχ) ОСОБЕННОСТЬ:

(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: Модифицированный сайт (B) ПОЛОЖЕНИЕ: дисульфидная связь между положением 20 в 8Е(^ Π)Νο. 3 и положением 20 в 8ЕЦ ГО Νο. 3 (ϋ) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /прим.= линкер -Ζ- представляет собой [О1у]_п, где η = 3, и [Аг§]_т, где т = 1 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е0 ГО Νο. 14 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 22 аминокислоты (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: две (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (п) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕЦ ГО Νο. 14

РИе Уа1 Не ΗΪ8 Аг§ Ьеи О1и Рго Тгр Ьеи Ηΐδ Рго О1у 8ег Οίη НН Νΐε ТЬг А1а 8ег ТЬг Азп 15 10 15 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е() ГО Νο. 15 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 23 аминокислоты (B) ТИП: аминокислотная

- 33 006210 (С) ЧИСЛО НИТЕЙ: две (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет (х1)ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Εζ) Ш Νο. 15

Аг§ Ьеи Уа1 О1у РЬе Рго Уа1 Ьуз Рго О1п Уа1 Рго О1у Ьеи Ьеи Аг§ Рго Ьеи ТЬг Туг Ьуз 15 10 15 20

А1а А1а (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е() Ш Νο. 16 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 24 аминокислоты (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: две (О) ТОПОЛОГИЯ: обе (п) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (πΐ) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет, нативная последовательность Та!1 (χϊ)ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е0 Ю Νο. 16

Ме1 О1и 8ег Уа1 Азр Рго Аг§ Ьеи О1и Рго Тгр Ьуз Ηΐβ Рго О1у 8ег О1п Рго Ьуз ТЬг А1а 15 10 ^{15 20}

Суз ТЬг Азп (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8 ВО Ю Νο. 17 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

- 34 006210 (С) ЧИСЛО НИТЕЙ: две (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (πΐ) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет, нативная последовательность Та12 (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е0 ГО Νο. 17

О1п Уа1 Суз РЬе Не ТЬг Ьуз С1у Ьеи О1у Не 8ег Туг С1у Адг Ьуз Ьуз Агд Агд О1п Агд Агд

5

Агд (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е0 ГО Νο. 18 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 21 аминокислота (B) ТИП: аминокислотная (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: две (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: обе (п) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: нет, нативная последовательность Νεί (χΐ)ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е0 ГО Νο. 18

О1и Сг1и Уа1 О1у РЬе Рго Уа1 Агд Рго О1п Уа1 Рго Ьеи Агд Рго Ме! ТЬг Туг Ьуз А1а А1а

5 Ю 21

Claims

1. Пептид, происходящий из регуляторного и вспомогательного белка ВИЧ-1, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, которая содержит модификации по сравнению с нативной последовательностью и выбрана из следующих групп последовательностей:

Хаа₁ Хаа₂ Хаа₃ Хаа₄ Хаа₅ Хаа₆ Хаа₇ Ьеи С1и Рго Тгр Хаа₁₂ Н1з Рго Хаа₁₅ Хаа₁₆ Хаа₁₇ Хаа₁₈ Хаа₁₉ Хаа₂₀Хаа₂₁ Хаа₂₂ Хаа₂₃ Хаа₂₄ (8Е0 ГО Νο. 1), где аминокислоты цепи имеют следующие значения:

Хаа

Хаа в в в в в в в в в в в в в положении положении положении положении положении положении положении положении положении положении положении положении положении

1 модифицированного пептида - Μεΐ, 8ег, Суз или отсутствует,

С1и, Азр, Vа1, 8ег или отсутствует,

Тгр, Туг или РЬе,

Vа1 или Не,

Не,

Рго, Н1з или А1а,

Агд, Азп, 8ег, Ьуз, С1и или Азр,

12 - Ьеи, Не или Ме,

15 - С1у или Рго,

16 - 8ег, Азп или А1а,

17 - С1п, Ьуз или ТЬг,

18 - Рго или Н1з,

19 - Ьеи, Не или Ме,

- 35 006210

Хаа в положении 20 - Тйг, А1а или 11е,

Хаа в положении 21 - А1а, Рго, Азр или Vа1,

Хаа в положении 22 - Суз или 8ег,

Хаа в положении 23 - Тйг, Азп или 8ег,

Хаа в положении 24 - Азп, Ьуз, Агд, 61п, А1а, Рго или Тйг, причем пептид содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из последовательности 8ЕО ГО Νο. 1,

Хаа1 Хаа₂ Хаа₃ Рйе Хаа₅ Хаа₆ Хаа₇ Хаа₈ Хаа₉ Хаа1₀ Хаац Хаац -Ζ- Туг Хаа! 61у Хаац Ьуз Ьуз Агд Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 (8ЕС ГО Νο. 4), где аминокислоты цепи имеют следующие значения:

Хаа в положении 1 - Рго, 11е, Ьеи, Тйг, Туг или Vа1,

Хаа в положении 2 - Vа1, А1а, Суз, Ьеи,

Хаа в положении 3 - Суз, 11е, Ьеи, Vа1 или ΝΦ,

Хаа в положении 5 - 11е, Ьеи, 61п, Ме! или Тйг,

Хаа в положении 6 - Тйг, Азп, Ьуз или Агд,

Хаа в положении 7 - Ьуз, Агд или 61п,

Хаа в положении 8 - 61у или А1а,

Хаа в положении 9 - Ьеи или 11е,

Хаа в положении 10 - 61у, 8ег или А1а,

Хаа в положении 11 - 11е или 61у,

Хаа в положении 12 - 8ег, Рйе или Туг,

Хаа,, вставленный перед положением 14, - это Ьеи, 11е, Ме,

Хаа в положении 15 - Агд, Ьуз, 8ег или цитруллин (С11),

Хаа в положении 19 - Агд, Ьуз, 8ег, 61у или Сй,

Хаа в положении 20 - 61п, Агд или Рго,

Хаа в положении 21 - 11е или Ьеи,

Хаа в положении 22 - 61у, Ьеи, 11е, Суз или отсутствует,

Хаа в положении 23 - 61у или отсутствует, причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из 8ЕС ГО Νο. 4, а -Ζ- означает необязательный линкер, которым может быть РЕ6, модифицированный РЕ6 и/или [61у]_п, где п=1, 2 или 3,

Хаа1 11е Ьеи Хаа₄ Хаа₅ Хаа₆ Ьеи 61у Агд Хаац Хаац -Ζ- Хаац Ьеи Хаа! Хаа! Хаац Хаац Хаац Хаац Хаац Хаац Ьеи Рго Рго Ьеи (8ЕО ГО Νο. 7), где Хаа в положении 1 - это Рйе, Туг, Тгр или Агд,

Хаа в положении 4 - 61у, 8ег, Азп, Азр, Суз, Vа1, Тйг, А1а или Агд,

Хаа в положении 5 - Тйг, А1а, Азр, Азп или 8ег,

Хаа в положении 6 - Туг, Суз, Рйе, Агд, Н1з, 8ег, Vа1 или Ьеи,

Хаа в положении 10 - 8ег, Рго, Рйе, Ьеи или 11е,

Хаа в положении 11 - А1а, Тйг, 61и, 61п, Vа1, Рго или 8ег,

Хаа в положении 12 - 61и, Ьуз, 61п, Азр, Азп, Туг, Тгр или Рйе,

Хаа,, вставленный после положения 13, - это 8ег, Рго, Рйе, Ьеи или 11е,

Хаа,, вставленный перед положением 14, - это А1а, Тйг, 61и, 61п, Vа1, Рго или 8ег,

Хаа в положении 14 - 61и, Ьуз, 61п, Азр или Азп,

Хаа в положении 15 - Рго, 8ег, А1а или Азп,

Хаа в положении 16 - Vа1, Азп, 61у или Рго,

Хаа в положении 17 - Рго, 61п, Н1з, 8ег, Ьеи, Агд, Тйг, Азр или 11е,

Хаа в положении 18 - Ьеи, Рйе или Vа1,

Хаа в положении 19 - 61п, Ьеи, Рго, Н1з, Азр или 61и, причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из 8ЕС ГО Νο. 7, а -Ζ- означает необязательный линкер, которым может быть РЕ6, модифицированный РЕ6 и/или [61у]_п, где п=1, 2 или 3;

Хаа1 Ьеи Vа1 61у Хаа₅ Рго Хаа₇ Хаа₈ Рго Хаац Хаац Рго ^-[Агд]_т Хаа! Хаац Хаац Рго Хаац Хаа_гХаац Хаац Хаа₂₀ Хаа₂1 (8ЕО ГО Νο. 10), где Хаа в положении 1 - это Ьуз или Агд,

Хаа в положении 5 - Рйе или Ьеи,

Хаа в положении 7 - 11е или Vа1,

Хаа в положении 8 - Тйг, Агд, Ьуз, А1а или Ме!,

Хаа в положении 10 - 61п или Н1з,

Хаа в положении 11 -Уа1, Ьеи или 11е,

Хаа!, вставленный перед положением 13, - это Ьеи,

Хаа в положении 13 - Ьеи, Vа1 или Тйг,

Хаа в положении 14 - Агд или цитрулин (Сй),

- 36 006210

Хаа в положении 16 - Ме!, Уа1, Не, И1е или Ьеи,

Хаа в положении 17 - Тйг или Акр,

Хаа в положении 18 - Туг, РНе или Агд,

Хаа в положении 19 - Ьук или Агд,

Хаа в положении 20 - А1а, С1у, 8ег, С1и или С1п,

Хаа в положении 21 - А1а, 8ег или Уа1, причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из 8 Ер ΙΌ Ио. 10, а -Ζ- означает необязательный линкер, которым может быть РЕС, модифицированный РЕС и/или [С1у]_п, где п=1, 2 или 3 и, независимо от п, т в [Агд]_т=0, 1, 2 или 3;

терминальные концы последовательностей могут быть представлены свободными карбоксильными или аминогруппами, амидами, ацилами, ацетилами или их солями, два или более остатков Сук могут образовывать внутрицепочечную или межцепочечную дисульфидную связь либо мостик -8-(СН₂)_р-8- или (СН₂)_р-, где р=1-8, необязательно с одним или более гетероатомами типа О, И или 8 между ними, и/или данные пептидные последовательности иммобилизованы на твердой основе.

2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность 8ЕР ΙΌ Ио. 1 выбрана из групп 8Ер ΙΌ Ио. 2, 8Ер ΙΌ Ио. 3 и 8Ер ΙΌ Ио. 14.

3. Пептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность 8ЕР ΙΌ Ио. 4 выбрана из групп 8Ер ΙΌ Ио. 5 и 8Ер ΙΌ Ио. 6.

4. Пептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность 8ЕР ΙΌ Ио. 7 выбрана из групп 8Ер ΙΌ Ио. 8 и 8Ер ΙΌ Ио. 9.

5. Пептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность 8Ер ΙΌ Ио. 10 выбрана из групп 8Ер ΙΌ Ио. 11, 8Ер ΙΌ Ио. 12 и 8Ер ΙΌ Ио. 15.

6. Антиген, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере один пептид по п.1.

7. Антиген по п.6, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере один пептид, выбранный по меньшей мере из одной из групп 8Ер ΙΌ Ио. 1, 8Ер ΙΌ Ио. 4, 8Ер ΙΌ Ио. 7 и 8Ер ΙΌ Ио. 10.

8. Вакцинная композиция, отличающаяся тем, что она включает антиген по п.6 вместе с фармацевтически приемлемым растворителем и необязательно адъювантом, носителем и/или наполнителем и необязательно дополнительными иммуностимулирующими соединениями.

9. Вакцинная композиция по п.8, отличающаяся тем, что она включает по меньшей мере один пептид, выбранный по меньшей мере из одной из групп 8Ер ΙΌ Ио. 1, 8Ер ΙΌ Ио. 4, 8Ер ΙΌ Ио. 7 и 8Ер ΙΌ Ио. 10.

10. Вакцинная композиция по п.9, отличающаяся тем, что она включает пептиды 8Ер ΙΌ Ио. 14 и 8ЕР ΙΌ Ио. 15.

11. Вакцинная композиция по пп.8-10, отличающаяся тем, что пептиды растворены в стерильном водном растворе, а необязательным иммуностимулирующим соединением является колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов.

12. Вакцинная композиция по пп.8-11, отличающаяся тем, что она включает адъювант, выбранный из числа монофосфорилированного липида А (МРЬ®), полного или неполного адъюванта Фрейнда или гидроксида алюминия.

13. Вакцинная композиция, отличающаяся тем, что антиген по п.6 входит в состав липопептидной и/или липосомной композиции.

14. Способ обнаружения антител, индуцируемых ВИЧ или ВИЧ-специфичными пептидами или белками, в образце жидкой среды организма, отличающийся тем, что данный образец подвергают иммуноанализу, причем антиген(ы) выбирают из пептидов по пп.1-5.

15. Набор для иммуноанализа для обнаружения антител, индуцируемых ВИЧ или ВИЧ-специфичными пептидами или белками, в образце жидкой среды организма, отличающийся тем, что диагностическим антигеном является пептид по любому из предыдущих пп.1-5.

16. Антитело, отличающееся тем, что оно способно избирательно реагировать с антигеном по пп.6 и 7.