ES2748423T3

ES2748423T3 - Tratamiento de trastornos inflamatorios, autoinmunitarios y neurodegenerativos con polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores

Info

Publication number: ES2748423T3
Application number: ES13860686T
Authority: ES
Inventors: Joshua Goldberg; Colin Bier; Christoph Hotz-Behofsits; Sophie Hanscom
Original assignee: PIN Pharma Inc
Current assignee: PIN Pharma Inc
Priority date: 2012-12-06
Filing date: 2013-12-06
Publication date: 2020-03-16
Anticipated expiration: 2033-12-06
Also published as: WO2014089480A1; RU2015126776A; AU2013355039B2; JP2019163259A; ZA201504100B; CN104981479B; JP2016508121A; IL239271B; AU2013355039A1; CA2894166A1; EP2928910B1; US20180185441A1; US9878001B2; NZ708836A; RU2653754C2; EP2928910A1; IL239271A0; HK1216318A1; US20140178420A1; EP2928910A4

Abstract

Un polipéptido derivado del trans-activador de la transcripción (Tat) inmunosupresor, comprendiendo el polipéptido derivado de Tat una secuencia de aminoácidos que comprende los siguientes dominios en el orden indicado: un dominio del factor de transcripción (TF), un dominio rico en cisteína y un dominio C-terminal, en donde la secuencia de aminoácidos comprende la SEQ ID NO: 9.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de trastornos inflamatorios, autoinmunitarios y neurodegenerativos con polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores

Campo

La presente solicitud se refiere a polipéptidos derivados del transactivador de la transcripción (Tat) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) inmunosupresores para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por respuestas inmunitarias anómalas, tales como enfermedades neurodegenerativas y autoinmunitarias y enfermedades asociadas a la inflamación.

Antecedentes

El transactivador de la transcripción (Tat) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) media en al menos dos actividades independientes, un episodio desencadenante mediado por un receptor en la superficie celular y una actividad de transactivación intracelular que controla la diferenciación de las células presentadoras de antígenos (APC). El episodio desencadenante mediado por un receptor mediado por Tat es específico de las APC, haciendo que se activen y diferencien en macrófagos reguladores de células presentadoras de antígenos altamente inmunosupresores (AReg) o en células dendríticas (DC) que estimulan linfocitos T citotóxicos específicos.

Las células presentadoras de antígenos, los macrófagos y las células dendríticas son críticas en la patogénesis o respuesta a una variedad de enfermedades, trastornos y respuestas inmunitarias no deseadas. El Tat desencadena la diferenciación de los monocitos en macrófagos presentadores de antígenos que expresan moléculas que suprimen específicamente la respuesta inmunitaria al (a los) antígeno(s) presentado(s). En las enfermedades autoinmunitarias, algunas de las moléculas endógenas propias del cuerpo son reconocidas incorrectamente como extrañas, dando como resultado una inflamación y un daño tisular generalizados. En un ejemplo, la degradación del colágeno tipo II en péptidos inmunogénicos puede provocar artritis reumatoide (RA) en animales y se ha asociado a la RA humana. Una investigación considerable se ha centrado en reducir la respuesta inmunitaria a estas proteínas. La supresión inducida por macrófagos específicos de antígenos atribuida al Tat se puede aplicar a la reducción de la respuesta inmunitaria no deseada a moléculas extrañas y endógenas asociadas con inflamación y neurodegeneración.

Los intentos de tratar la inflamación y los trastornos autoinmunitarios han tenido un éxito limitado. Esto se debe, en parte, al hecho de que la etiología de la inflamación y los trastornos autoinmunitarios es una respuesta compleja basada en parte en las diversas moléculas inductoras de la inflamación y la multitud de moléculas mediadoras y sensibilizadoras de la inflamación que parecen provocar inflamación por medio de mecanismos redundantes. Por tanto, serían muy deseables compuestos, composiciones y métodos que puedan tratar la inflamación, la enfermedad neurodegenerativa o un trastorno autoinmunitario. El documento WO 02/090558 describe vectores de expresión que comprenden una secuencia de DNA que codifica una proteína de anclaje nuclear unida operativamente a un promotor heterólogo y una secuencia de DNA multimerizada que forma un sitio de unión para la proteína de anclaje nuclear. El documento US 6193981 describe una composición que comprende al menos un péptido o polipéptido del HIV-1. Los documentos WO 2015/051245 y US 2011/0009336 describen polipéptidos derivados de Tat de1HIV inmunoestimuladores para uso en el tratamiento del cáncer. Se conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína Tat del HIV-1 (NCBI, número de registro de GenBank, ACN63364.1).

Sumario

La presente memoria descriptiva se refiere a compuestos y composiciones útiles en el tratamiento de un individuo que padece enfermedades asociadas a respuestas inmunitarias anómalas, tales como trastornos neurodegenerativos o autoinmunitarios o enfermedades asociadas a la inflamación. Esto se logra administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor o una composición que comprenda dichos polipéptidos a un individuo que padece la enfermedad. Como se describe en la presente memoria, los polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores descritos han demostrado actividad inmunosupresora. La invención proporciona polipéptidos derivados del transactivador de la transcripción (Tat) inmunosupresores que comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende los siguientes dominios en el orden indicado: un dominio del factor de transcripción (TF) que comprende una secuencia de un virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) inmunosupresor, la proteína Tat del SIV, hairless o una secuencia inmunosupresora artificial; una región rica en cisteína de Tat lentiviral o una molécula de defensina; y una región C-terminal de una proteína Tat lentiviral, en donde la secuencia de aminoácidos comprende la SEQ ID NO: 9.

En otra realización, el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor, comprende además un dominio rico en arginina de una proteína Tat lentiviral. En otra realización, el dominio TF comprende además una secuencia repetida que comprende (PVDPRLEPWKHPGSQP)n en el extremo N, en donde n = 2-10.

El HIV puede ser HIV-1 o HIV-2. En otra realización, el Tat lentiviral es de HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV o EIAV.

También se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se describen en la presente memoria polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores para uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por respuestas inmunitarias anómalas en un sujeto que lo necesita; en donde el uno o más polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores son al menos 85% idénticos a un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor de la reivindicación 1, y en donde la administración del polipéptido derivado de Tat inmunosupresor trata la enfermedad suprimiendo el sistema inmunitario en el sujeto.

En otra realización, el tratamiento aumenta la expresión del ligando Fas en los macrófagos reguladores de células presentadoras de antígenos (AReg). En otra realización, los AReg son macrófagos CD14+. En otra realización, se disminuye la secreción de citoquinas por los AReg. Incluso en otra realización, el sujeto no está inmunocomprometido. Incluso en otra realización, el sistema inmunitario del sujeto no está comprometido como resultado de la administración.

En otra realización, la enfermedad es un trastorno autoinmunitario, neurodegenerativo o asociado a la inflamación. En otra realización, el trastorno autoinmunitario es una encefalomielitis aguda diseminada (ADEM), una enfermedad de Addison, una alergia, rinitis alérgica, una enfermedad de Alzheimer, un síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (APS), una artritis, un asma, un síndrome de deficiencia autoinmunitaria, una anemia hemolítica autoinmunitaria, una hepatitis autoinmunitaria, una enfermedad autoinmunitaria del oído interno, un penfigoide ampolloso, una enfermedad celíaca, una enfermedad de Chagas, una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), una diabetes mellitus tipo 1 (IDDM), un eczema, una endometriosis, un trastorno gastrointestinal, un síndrome de Goodpasture, una enfermedad de Graves, un síndrome de Guillain-Barré (GBS), una tiroiditis de Hashimoto, una hidrosadenitis supurante, una púrpura trombocitopénica idiopática, una enfermedad inflamatoria intestinal, una enfermedad inflamatoria dermatológica, una cistitis intersticial, un lupus, una morfea, una esclerosis múltiple (ME), una miastenia grave, una miopatía, una narcolepsia, una neuromiotonía, un pénfigo vulgar, una anemia perniciosa, una cirrosis biliar primaria, una psoriasis, una encefalomielitis diseminada recurrente, una fiebre reumática, una esquizofrenia, una esclerodermia, un síndrome de Sjogren, un trastorno de la piel, una tenosinovitis, una uveítis, una vasculitis o un vitiligo. En otra realización, la enfermedad asociada con la inflamación es un acné, un reflujo de ácido/acidez gástrica, una alergia, una rinitis alérgica, una enfermedad de Alzheimer, una apendicitis, una arteritis, una artritis, un asma, una ateroesclerosis, un trastorno autoinmunitario, una balanitis, una blefaritis, una bronquiolitis, una bronquitis, una bursitis, un cáncer, una carditis, una enfermedad celíaca, una celulitis, una cervicitis, una colangitis, una colecistitis, una corioamnionitis, una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), una cirrosis, una colitis, una conjuntivitis, una cistitis, un resfriado común, una dacrioadenitis, una demencia, una dermatitis, una dermatomiositis, un eczema, un enfisema, una encefalitis, una endocarditis, una endometritis, una enteritis, una enterocolitis, una epicondilitis, una epididimitis, una fascitis, una fibrositis, una gastritis, una gastroenteritis, una gingivitis, una glomerulonefritis, una glositis, una enfermedad cardíaca, una hepatitis, una hidrosadenitis supurante, una presión arterial alta, una ileitis, una resistencia a la insulina, una cistitis intersticial, una iritis, una cardiopatía isquémica, una queratitis, una queratoconjuntivitis, una laringitis, un lupus, una mastitis, una mastoiditis, una meningitis, un síndrome metabólico (síndrome X), una migraña, una esclerosis múltiple, una mielitis, una miocarditis, una miopatía, una miositis, una nefritis, una neuropatía, una obesidad, una onfalitis, una ooforitis, una orquitis, una osteocondritis, una osteopenia, una osteoporosis, una osteitis, una otitis, una pancreatitis, una enfermedad de Parkinson, una parotitis, una enfermedad inflamatoria pélvica, una pericarditis, una peritonitis, una faringitis, una flebitis, una pleuritis, una neumonitis, una proctitis, una prostatitis, una psoriasis, una pulpitis, una pielonefritis, una pileflebitis, una fiebre reumática, una rinitis, una salpingitis, una sialadenitis, una sinusitis, un colon espástico, una estomatitis, una sinovitis, una tendonitis, una tendinosis, una tenosinovitis, una tromboflebitis, una amigdalitis, una trigonitis, un tumor, una uretritis, una uveítis, una vaginitis, una vasculitis o una vulvitis. Incluso en otra realización más, la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, amiloidosis, esclerosis lateral amiotrófica, ansiedad, ataxia telangiectasia, trastornos por déficit de atención, enfermedad de Canavan, lesiones del sistema nervioso central, enfermedad de Charcot Marie Tooth, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, depresión, encefalitis (por ejemplo, bacteriana, parasitaria, fúngica o viral), ataxia de Friedreich, demencia frontotemporal, paraparesia espástica hereditaria, síndrome de Guillain-Barré (y sus variantes, neuropatía axonal motora aguda, polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda y síndrome de Fisher), complejo de demencias por HIV/AIDS, enfermedad de Huntington, lesión isquémica en el sistema nervioso, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph, meningitis (por ejemplo, bacteriana, parasitaria, fúngica o viral), esclerosis múltiple, atrofia multisistémica, traumatismo neural, por ejemplo, lesión cerebral percusiva, lesión de la médula espinal y lesión traumática en el sistema nervioso, una neuropatía, tal como por ejemplo, neuropatía inducida por quimioterapia, neuropatía asociada a la diabetes y neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, trastornos priónicos, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, esquizofrenia, enfermedad de Schilder, atrofias espinocerebelosas, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, accidente cerebrovascular, tabes dorsal o demencia vascular.

En otra realización, el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor causa además la reducción de al menos un síntoma asociado a la enfermedad autoinmunitaria, enfermedad neurodegenerativa o enfermedad asociada a la inflamación y en donde el síntoma es inflamación, fatiga, mareos, malestar, fiebre elevada y alta temperatura corporal, sensibilidad extrema al frío en las manos y los pies, debilidad y rigidez en músculos y articulaciones, cambios de peso, problemas digestivos o gastrointestinales, presión arterial baja o alta, irritabilidad, ansiedad o depresión, infertilidad o disminución del deseo sexual (baja libido), cambios de azúcar en la sangre y, dependiendo del tipo de enfermedad autoinmunitaria, un aumento en el tamaño de un órgano o tejido o la destrucción de un órgano o tejido.

En otra realización, el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor se administra en una pluralidad de dosis. En otra realización, el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor se administra diariamente, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o bimensualmente. Incluso en otra realización, la etapa de administración comprende un ciclo de administración repetitivo en el que cada ciclo comprende administrar una pluralidad de dosis del polipéptido derivado de Tat inmunosupresor en un período de tiempo definido seguido de un período de descanso y en el que el ciclo se repite una pluralidad de veces.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 representa el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de los resultados de la activación por Tat de monocitos. A los monocitos de la sangre periférica humana se les hizo diferenciarse en células dendríticas (DC) durante cinco días de cultivo en GM-CSF e IL-4. Las DC afectadas se cultivaron durante una noche bien en medio solo (control), lipopolisacárido (LPS) o Tat, después de lo cual se tiñeron con un anticuerpo anti-CD86 y se analizaron por un citómetro FACScan para CD86, un marcador específico de activación de las DC, inducción (panel izquierdo) o activación generalizada (panel derecho, ampliación en el recuadro R2, mostrada para las células estimuladas por Tat).

La FIG. 2 representa la mejora de la activación específica de antígenos de linfocitos T citotóxicos (CTL) por complejos de Tat*-antígeno (Ag). La actividad de los CTL se cuantificó como el número de colonias formadoras de puntos secretoras del interferón ^y(SFC)/106 células cultivadas en placa usando ensayos ELISPOT.

La FIG. 3 representa la fluorescencia mediana de monocitos, cultivados durante seis días bien sin estímulo (0), con factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), LPS, concentraciones decrecientes de C-Tat (Tat inmunosupresor natural convencional del HIV) o C-Tat oxidado (ox-C-Tat) y teñidos con un anticuerpo monoclonal (Mab) ligando anti-Fas (FasL) seguido por un anticuerpo policlonal anti-ratón de cabra teñido con fluoresceína.

Las FIG. 4A-B representan el título de anticuerpos contra un antígeno inmunogénico en presencia del Tat inmunosupresor (PT) o con ox-Tat* (Ag) no inmunosupresor después de dos semanas (FIG. 4A) o seis semanas (FIG. 4B).

La FIG. 5 representa el análisis por FACS de macrófagos peritoneales de ratón que se aislaron bien después de la estimulación con tioglicolato in vivo (estimulado adyuvante) o sin estimulación in vivo (reposo). Los macrófagos peritoneales de ratón se cultivaron durante cinco días en ausencia de estimulación adicional (C), con LPS o con Tat. La activación se determinó como el porcentaje de células agrandadas (fracción M1).

La FIG. 6 representa la supresión estable de linfocitos T estimulados por antígenos por complejos Tat-Ag dos semanas después de la inmunización con Tat inmunosupresor.

La FIG. 7 representa la especificidad antigénica de la supresión por Tat. Los ratones se inmunizaron el día 0 y se reinmunizaron el día 7 con una emulsión adyuvante que contenía Tat (Ag+Tat), o con Ag solo como control. El día 14, células de ganglios linfáticos drenantes se recogieron y estimularon con antígeno específico o no específico y se midió la proliferación por la absorción de 3H timidina (CPM) después de cuatro días de cultivo.

La FIG. 8 representa el análisis por FACS de monocitos de la sangre periférica humana cultivados durante cuatro días en medio de control (control) o en medio que contiene Tat o LPS. Las células recogidas se tiñeron doblemente con un Mab anti-FasL teñido con fluoresceína (aFasL-FITC) y con un Mab anti-CD14 marcado con rodamina. Las células se analizaron por FACScan para determinar la activación (difusión frontal), la expresión de CD14 (% de macrófagos, R2) y la inducción de FasL (MFI). La población de linfocitos T se denomina R1.

Las FIG. 9A-B representan las características reguladoras e inmunosupresoras de los macrófagos activados por Tat. (A) Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana de un individuo (PBMC N° 3) cultivadas durante cinco días bien en medio con antígeno tetánico (Ag), antígeno con adición adicional de Tat (Ag+Tat) o Ag con Tat y proteína sFas recombinante (Ag+Tat+sFas). Los resultados se representan en gráficos como índice de estimulación (cultivo estimulado en cpm medias/control medio en cpm medias). (B) Proliferación de las PBMC cultivadas 6 días con antígeno tetánico o Candida solo (Ag), en comparación con cultivos en los que se añadieron Tat (Ag+Tat) o Tat y el anticuerpo antagonista anti-Fas, ZB4 (Ag+Tat+aFas).

La FIG. 10 representa la estimulación de monocitos humanos con derivados de Tat.

La FIG. 11 representa una curva dosis-respuesta de estimulación de monocitos humanos con derivados de Tat.

Las FIG. 12A-C representan la tinción de células de Jurkat con Hoechst-NucBIue y el derivado de Tat marcado con Alexa488 SEQ ID NO: 9 (FIG. 12A), derivado de Tat marcado con Alexa488 SEQ ID NO: 11 (FIG. 12B) o de control (sin derivado de Tat, FIG. 12C). La columna izquierda representa la tinción nuclear con Hoechst-NucBlue, la columna central representa la tinción con Alexa488 y la columna derecha representa una fusión de las imágenes izquierda y central.

Las FIG. 13A-C representan la tinción de células U937 con Hoechst-NucBlue y el derivado de Tat marcado con Alexa488 SEQ ID N^o: 9 (FIG. 13A), derivado de Tat marcado con Alexa488 S^eQ ID NO: 11 (FIG. 13B) o de control (sin derivado de Tat, FIG. 13C). La columna izquierda representa la tinción nuclear con Hoechst-NucBlue, la columna central representa la tinción con Alexa488 y la columna derecha representa una fusión de las imágenes izquierda y central.

Las FIG. 14A-C representan la activación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana medida por la expresión de FasL, sin estímulo (FIG. 14A), con LPS (FIG. 14B) o con derivado de Tat SEQ ID NO: 9 (FIG.

14C).

La FIG. 15 representa la proliferación de las PBMC CD14+, medida por la expresión de CD14 en la superficie celular, sin estímulo, con lPs o con derivado de Tat SEQ ID NO: 9.

La FIG. 16 representa el porcentaje de células CD14+ en cultivos durante tres días en las PBMC tratadas con LPS, derivado de Tat SEQ ID NO: 9 o sin estímulo.

Las FIG. 17A-E representan las PBMC que expresan tanto FasL como CD14 después de tratamiento con TNF-alfa (FIG. 17B), con LPS (FIG. 17C), con derivado de Tat SEQ ID NO: 9 (FIG. 17D) o sin estimulación (FIG. 17A) después de cinco días de cultivo. La FIG. 17E representa los datos de las FIG. 27A-D en formato gráfico.

Descripción

La presente memoria descriptiva se refiere a compuestos, composiciones y métodos para tratar a un individuo que padece enfermedades asociadas con respuestas inmunitarias anómalas, tales como trastornos autoinmunitarios que incluyen trastornos neurodegenerativos o trastornos asociados a la inflamación. Esto se consigue administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor o una composición que comprende dichos polipéptidos a un individuo que padece las enfermedades. Como se describe en la presente memoria, los polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores descritos tienen actividades anti-inflamatorias. Los péptidos del derivado inmunosupresor dentro del alcance de la presente descripción son inmunosupresores.

Como se usa en la presente memoria, el término “respuestas inmunitarias anómalas” se refiere a respuestas inmunitarias aumentadas, indeseables, excesivas o inapropiadas en las que la respuesta inmunitaria a antígenos, tales como autoantígenos, aumenta de tal manera que se observa inflamación y/o enfermedad autoinmunitaria o enfermedad neurodegenerativa. Las respuestas inmunitarias anómalas, como se usan en la presente memoria, se caracterizan por una cascada inmunitaria que da como resultado la destrucción del tejido corporal. En general, un resultado inmunitario anómalo no se observa en una respuesta normal a una infección, pero se puede desencadenar por una infección.

La proteína Tat del HIV es un péptido de unión al RNA variable con una longitud de 86-110 aminoácidos que está codificado en dos exones separados del genoma del HIV. Basándose en el análisis molecular, la proteína Tat (SEQ ID NO: 2) codifica actividades peptídicas distintas y ligadas. Esta presente descripción se refiere a composiciones de polipéptidos que proceden de la estructura canónica del Tat del HIV-1 al menos en la porción primera o amino terminal, de manera que mejora el potencial inmunoterapéutico del polipéptido. La porción amino terminal del Tat incluye una región peptídica corta de un factor de transcripción (TF) nuclear típicamente flanqueado por residuos de prolina. Esta región determina, al menos en parte, como es de estimulante o supresor el polipéptido Tat para las células del sistema inmunitario, particularmente las células inmunitarias innatas tales como las células dendríticas (DC) y los macrófagos (células presentadoras de antígenos o APC). En consecuencia, se predice que las modificaciones en la región TF pueden hacer que los polipéptidos sean más activos en la terapia de la enfermedad. Estudios previos determinaron que el Tat del HIV es inmunosupresor en la mayoría de las cepas de HIV humano. Sin embargo, en los no progresores a largo plazo (LTNP), un subconjunto de individuos infectados por e1HIV con altas cargas virales que no tienen una reducción significativa en los linfocitos T4 y no progresan en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS), la proteína Tat del HIV es inmunoestimulante. La proteína Tat encontrada en los LTNP es capaz de trans-activar el RNA viral; sin embargo, el Tat de los LTNP (designado de aquí en adelante en esta memoria “IS-Tat” por la expresión “Immunostimulatory Tat") no induce la apoptosis en linfocitos T4 o macrófagos y no es inmunosupresor. Además, los linfocitos T4 infectados ex vivo con HIV aislado de los LTNP (dichas líneas celulares se denominan “Tat TcL”) sobre-expresan proteínas IS-Tat, a menudo con la exclusión virtual de otras proteínas virales, que promueven fuertemente el crecimiento en lugar de ser pro-apoptósicas. Los genes tat clonados a partir de estos Tat TcL revelan variaciones de secuencias en dos regiones tat, en el extremo amino y dentro de la primera parte del segundo exón.

Basándose en el análisis molecular, la proteína Tat del HIV (SEQ ID NO: 2) contiene tres regiones de interés distintas. La primera región de interés es el dominio de transducción en el extremo amino del Tat (aminoácidos 3 19). Una segunda región de interés es un dominio de unión a ligandos rico en cisteína (aminoácidos 22-37) que contiene siete cisteínas conservadas. Una tercera región de interés es la secuencia de translocación de membranas (MTS) que abarca los aminoácidos 47-57.

El tramo rico en prolina próximo al extremo amino (aminoácidos 3-19) del Tat de HIV-1 y HIV-2 dentro del dominio de transducción es un dominio de unión a SH3 que tiene una homología significativa con el dominio de unión a SH3 del gen hairless (hr) de ratón (SEQ ID NO: 72). El dominio de unión a SH3 presenta un objetivo importante para el desarrollo farmacéutico con potencial para el diagnóstico, la profilaxis y el tratamiento de procesos celulares indeseables, tal como la autoinmunidad.

Inesperadamente, los ratones que expresan la mutación del gen hr desarrollan un síndrome similar al AIDS caracterizado por una deficiente función de los CTL, un cambio en los linfocitos T auxiliares desde los que regulan la inmunidad mediada por células (TH1) a los que regulan la inmunidad mediada por anticuerpos (TH2), y una mayor susceptibilidad a los cánceres de piel inducidos por productos químicos y por luz ultravioleta. Adicionalmente, se encuentran variantes del Tat en monos infectados con retrovirus que no desarrollan inmunodeficiencia y que no tienen infección epidémica. Sin embargo, estas variantes del Tat no tienen el dominio de unión a SH3 y, en su lugar, sustituyen una secuencia diferente, también activada por prolinas en cualquier extremo de la secuencia, en el dominio de la transducción. Por tanto, el dominio de unión a SH3 es central para la actividad inmunosupresora del Tat. Los datos genéticos indican que el dominio de unión a SH3 regula la diferenciación de monocitos en los macrófagos reguladores de células presentadoras de antígenos (AReg). En las proteínas Tat que no contienen este dominio SH3, o este dominio está mutado, la diferenciación de monocitos se dirige a las DC que estimulan las respuestas de los CTL.

La región MTS permite que Tat transite libremente a través de la membrana endosómica en el citoplasma después de la unión al receptor, donde transactiva la expresión génica, incluyendo aunque sin restricción, genes de HIV-1. Se ha supuesto erróneamente que la MTS facilita la entrada del Tat en la célula, lo que solo puede lograr a altas concentraciones que han sido imposibles de alcanzar in vivo.

A diferencia de las terapias inmunosupresoras actuales, las composiciones basadas en Tat descritas, los polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores, tienen el potencial de suprimir las respuestas inmunitarias específicas de antígenos sin inmunocomprometer al paciente. Conservan la actividad inmunosupresora del Tat de HIV convencional en ausencia del virus y, por tanto, los derivados de Tat inmunosupresores modulan la especificidad de la respuesta inmunitaria, un componente clave para la defensa natural del cuerpo. Esto es particularmente importante cuando se necesita terapia inmunosupresora crónica, tal como en enfermedades autoinmunitarias, neurodegenerativas o relacionadas con la inflamación.

Los efectos inmunosupresores del Tat están mediados por macrófagos. Cuando son estimulados por el Tat, bien por infección natural por HIV-1 o por absorción de Tat, los macrófagos inducen el ligando Fas (FasL), que a su vez induce la muerte celular programada (apoptosis) de los linfocitos T auxiliares que expresan Fas que reaccionan con antígenos (FIG. 3). Tat mejora la viabilidad de los macrófagos de múridos cultivados siempre que los macrófagos hayan sido activados en primer lugar in vivo en comparación con ninguna activación previa y estimulados con concentraciones relativamente altas de Tat. En comparación, LPS promueve la viabilidad de los macrófagos de múridos independientemente de la estimulación in vivo y a la misma concentración eficaz para los macrófagos humanos. Ciertas de las composiciones basadas en Tat descritas en la presente memoria producen una supresión estable de la proliferación de linfocitos de ratón y pueden servir también para suprimir una respuesta inmunitaria específica de antígenos para una variedad de antígenos.

Los macrófagos responsables de estas respuestas han sido identificados como macrófagos reguladores de células presentadoras de antígenos (AReg). Los AReg también se conocen como macrófagos “activados alternativamente”. Los AReg son macrófagos estables que expresan FasL y segregan las citoquinas IL-10 e IL-6. Los AReg son estables y responden de manera autocrina y paracrina a estas dos citoquinas, así como de manera paracrina a IL-4. Estas citoquinas se acumulan y cambian la respuesta inmunitaria de TH1 (basada en linfocitos T auxiliares) a TH2 (basada en linfocitos T supresores). A medida que se acumulan estas citoquinas, superan y suprimen la respuesta inmunitaria y explican por qué las respuestas inmunitarias son normalmente autolimitantes de una manera específica de antígenos.

Una observación inesperada es que concentraciones 1000 veces menores de Tat (500 pM) desencadenan este efecto en los macrófagos, en comparación con la concentración requerida para iniciar la apoptosis directa de los linfocitos T CD4+ (aproximadamente 500 nM). Por tanto, a concentraciones de Tat alcanzables como un inmunomodulador administrado sistémicamente, el efecto de los macrófagos se producirá preferentemente sobre el efecto de los linfocitos T.

La supresión específica de antígenos mediada por Tat está mediada por la activación trans-(intracelular) de un macrófago CD14+ FasL+. Los macrófagos activados por Tat son AReg inmunosupresores. A bajas concentraciones de Tat (50 nM), la inmunosupresión inducida por Tat no solo se revirtió completamente por la adición de Fas soluble, sino que en estas condiciones, Tat se volvió en realidad ligeramente estimulante (con relación al tratamiento con antígeno solo). Los anticuerpos contra FasL revirtieron la inmunosupresión de Tat de las respuestas al tétano y mejoraron la respuesta a Candida con relación al tratamiento con Tat solo. La supresión podría ser revertida completamente (> 95% del control) con la adición adicional a los cultivos de anticuerpos anti-IL-10 y anti-IL-6, procediendo ambas citoquinas de macrófagos en estas condiciones de cultivo. Una porción de la inmunosupresión inducida por Tat es aportada por la inducción de FasL, aunque otros factores inducidos por Tat pueden participar en la supresión de las respuestas proliferantes de linfocitos T, especialmente a mayores concentraciones de Tat.

A continuación se enumera la secuencia de aminoácidos completa de Tat del HIV-1 codificada por los exones 1 y 2 del gen Tat:

ATG GAG CCCGTGGAC CCTCGC CTG GAGCCC TGG AAG CACCCG GGCAGC

Met Glu ProValAsp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser

1 5 10/30 15

CAG CCC AAGACCGCC TGCACC ACA TGTTACT GC AAG AAGTGC TGCTTC

Gln Pro LysThrAla Cys Thr Thr Cys Tyr Cys Lys LysCys Cys Phe

20/60 25 30/90

CAC TGC CAGGTGTGC TTCACC AAG AAGGCC TTG GGC ATCAGC TACGGC

His Cys GlnValCys PheThr Lys Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly

35 40/120 45

CGC AAG AAGCGCCGG CAGCGC CGC CGGGCC CCT GAG GACAGC CAGACC

Arg Lys LysArg Arg GlnArg Arg ArgAla Pro Glu AspSer Gln Thr

50/150 55 60/180

CAC CAG GTGAGCCCT CCCAAG CAG CCCGCT CCA CAG TTCCGC GGCGAC

His Gln ValSer Pro ProLys Gln Pro Ala Pro Gln PheArg Gly Asp

65 70/210 75 80/240

CCT ACC GGTCCCAAG GAGAGC AAG AAGAAG GTG GAG CGCGAG ACCGAG

Pro Thr GlyPro Lys Glu Ser Lys LysLys Val Glu ArgGlu Thr Glu

85 90/270 95

ACC CAT CCC GTC GAC SEQ ID NO: 1

Thr His Pro Val Asp SEQ ID NO:2

100/300

Tat tiene un segmento rico en prolina (P) próximo al extremo amino (aminoácidos 3-19, subrayados anteriormente). Esta región altamente conservada de Tat de HIV-1 es un dominio canónico de unión a SH3 denominado también en la presente memoria dominio del factor de transcripción nuclear (TF). El gen hairless (hr) de ratón tiene también un resto de unión a SH3 (TF, aminoácidos 176-196 de hr, SEQ ID NO: 72). Existe homología entre el dominio de unión a SH3 del Tat humano (SEQ ID NO: 4) y el dominio de unión a SH3 del gen hr de ratón:

Humano 3 Pro Val Arg Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro 18

De ratón 180 Pro Leu Thr Pro Asn---------Pro Trp Val Tyr Ser Gly Ser Gln Pro 193

Las variantes de Tat encontradas en retrovirus de simios, que no causan inmunodeficiencia, no tienen un dominio de unión a SH3, sino que en su lugar tienen la siguiente secuencia flanqueada por prolina:

Pro Leu Arg Glu Gln Glu Asn Ser Leu Glu Ser Ser Asn Glu Arg Ser Ser Cys lie Leu Glu Ala

Asp Ala Thr Thr Pro (SEQ ID NO:3)

El equivalente humano de la secuencia de simio (SEQ ID NO: 3) anterior es:

Ser Asn Glu Arg Ser Ser Cys Glu Leu Glu Val (SEQ ID NO: 4)

Otra región de interés es un dominio de unión al ligando propuesto rico en cisteína (aminoácidos 22-37) que contiene siete cisteínas.

Cys Thr Thr Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys (SEQ ID NO: 5)

Los derivados de Tat, generados por la modulación del resto de transducción de la señal definido por el dominio de unión a SH3, conducen predominantemente a la diferenciación a células dendríticas o a AReg inmunosupresores. Los AReg son también contribuidores críticos a la invasión de tumores de mama infiltrantes gástricos, pancreáticos y ductales, así como componentes de la tolerancia en el trasplante de órganos. Las dos prolinas externas en las posiciones 3 y 18 que flanquean el dominio SH3 se mantienen con el fin de facilitar la estructura adecuada para la unión a SH3. Además, el dominio de transducción de una variante humana no inmunosupresora de Tat, o el dominio de la mutación de hr, puede reemplazar los aminoácidos 3-19 de Tat, aunque se predice que la secuencia de hr aumentará la supresión. Además, se puede sustituir en este dominio la forma simia estimuladora de Tat (SEQ ID NO: 3), o su secuencia humana equivalente (SEQ ID NO: 4). Se pueden usar modificaciones químicas adicionales, tales como ox-Tat (Tat químicamente oxidado como se describe en el documento US 2006/0160183), para la estimulación de respuestas dendríticas/CTL.

El derivado de Tat inmunosupresor descrito puede ser un péptido de Tat en el que están alterados los aminoácidos 3-19. Estas alteraciones incluyen la sustitución de aminoácidos individuales por aminoácidos alternativos o la sustitución de todos los aminoácidos 3-19 por otra secuencia. Los péptidos de Tat adecuados para uso en la construcción de los derivados de Tat inmunosupresores descritos incluyen Tat de variantes de HIV-1, variantes de HIV-2 y variantes de SIV. Las variantes de SIV pueden ser de cualquier especie de primate que esté infectada con SIV como se enumera en la Tabla 4. También son útiles las secuencias de Tat lentiviral inmunosupresor de especies no primates que incluyen, aunque sin limitación, de felino (Tat del virus de inmunodeficiencia felina, FIV), bovino (Tat del virus de inmunodeficiencia bovina, BIV) o equino (Tat del virus de la anemia infecciosa equina, EiAv ). Para los fines de la presente descripción, el término “variantes” se refiere a péptidos correspondientes a la secuencia de diferentes cepas, de origen natural o mutado, de los virus indicados.

Las proteínas de unión a SH3 contienen una serie de prolinas internas necesarias para la función del factor de transcripción nuclear (TF).

En la Tabla 1 se presentan derivados de Tat inmunosupresores ilustrativos dentro del alcance de la presente descripción. En general, un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor para el tratamiento de inflamación, trastornos autoinmunitarios y neurodegeneración comprende tres regiones. La primera región es un TF derivatizado, la segunda región es una región rica en cisteína y la tercera región es una región de Tat C-terminal.

La región de TF, la región rica en cisteína y una región C-terminal están dispuestas en el polipéptido derivado de Tat en ese orden. La región de TF puede proceder de una fuente que incluya, aunque sin limitación, Tat de HIV-1, Tat de HIV-2, Tat de SIV, el gen hairless o una secuencia inmunosupresora artificial. La región rica en cisteína puede proceder de un Tat de lentivirus o una molécula de defensina rica en cisteína. La región C-terminal puede proceder del Tat de lentivirus. Adicionalmente, las regiones C-terminales derivadas de Tat pueden contener una región rica en arginina del Tat de HIV-1, del Tat de HIV-2 o del Tat de SIV (también denominada secuencia de translocación de membranas).

Como se usa en la presente memoria, el término “molécula de defensina” se refiere a pequeñas proteínas catiónicas ricas en cisteína que se encuentran tanto en vertebrados como en invertebrados. Las defensinas comprenden 18-45 aminoácidos que incluyen de seis a ocho residuos de cisteína conservados. Las defensinas se clasifican en tres grupos, a-defensinas, p-defensinas y 0-defensinas.

En otra realización, la región de TF contiene además una secuencia de repetición que incluye, aunque sin limitación, (PVDPRLEPWKHPGSQP)n (SEQ ID NO: 12) en donde n = 2-10 en el extremo N. Además, la secuencia de repetición puede estar separada del extremo N de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor por uno o más aminoácidos que actúan como separadores.

Tabla 1.

aagm = Mono verde africano; bsmm = mono mangabey gris; ccpz = chimpancé; dVIVIT = secuencia del TF artificial; egor = gorila; fsyk = mono de Sykes; gde Macaca mulatta; hmac = macaco; imon = cercopiteco mona; jde Chlorocebus aethiops; kde Pongo abelli.

Como se usa en la presente memoria, el término “variantes modificadas de modo conservador” se refiere a péptidos variantes que tienen la misma o similar actividad biológica que los péptidos originales. Por ejemplo, se pueden realizar cambios de aminoácidos conservadores que, aunque alteran la secuencia primaria de la proteína o péptido, no alteran su función. Una variante conservadora tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de un péptido de referencia ilustrativo. Los ejemplos de propiedades incluyen, aunque sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilia, lipofilia, capacidad de enlace covalente, capacidad de puente de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares, o cualquiera de sus combinaciones. Una sustitución conservadora puede ser evaluada por una variedad de factores, tales como, por ejemplo, las propiedades físicas del aminoácido que se sustituye (Tabla 2) o cómo el aminoácido original toleraría una sustitución (Tabla 3). Las selecciones de qué aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido en un péptido descrito en la presente memoria son conocidas por un experto en la técnica. Una variante conservadora puede actuar sustancialmente de la misma manera que el péptido de referencia ilustrativo, y puede ser sustituida por el péptido de referencia ilustrativo en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva.

Tabla 2. Propiedades de los aminoácidos

Tabla 3. Sustituciones de aminoácidos

Matthew J. Betts and Robert, B. Russell, Amino Acid Properties and Consequences of Substitutions, pp. 289-316, en Bioinformatics for Geneticists, (eds Michael R. Barnes, Ian C. Gray, Wiley, 2003).

Tabla 4. Abreviaturas de las cepas del SIV útiles en péptidos derivados del Tat

Los polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores se describen en la Tabla 1. Un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor puede comprender también variantes conservadoras de un polipéptido derivado de Tat. Una variante conservadora de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor es una variante conservadora de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor descrito en la presente memoria. Una variante conservadora de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor puede ser, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 98% o al menos 99% con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor. Una variante conservadora de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor puede ser, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de como máximo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, como máximo 95%, como máximo 97% o como máximo 98% o como máximo 99% con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor.

Una variante conservadora de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor puede ser, por ejemplo, un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 o más sustituciones conservadoras, en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor. Una variante conservadora de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor puede ser, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 sustituciones conservadoras en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor. Una variante conservadora de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor puede ser, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene como máximo 1, como máximo 2, como máximo 3, como máximo 4, como máximo 5, como máximo 6, como máximo 7, como máximo 8, como máximo 9, como máximo 10, como máximo 11, como máximo 12, como máximo 13, como máximo 14, como máximo 15, como máximo 20, como máximo 25 o como máximo 30 sustituciones conservadoras en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor.

Las modificaciones (que normalmente no alteran la secuencia primaria) incluyen la derivatización química de los polipéptidos in vivo o in vitro, por ejemplo, acetilación o carboxilación. También se incluyen modificaciones de la glicosilación, por ejemplo, las realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento adicionales; por ejemplo exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan a la glicosilación, por ejemplo, enzimas de glicosilación o desglicosilación de mamíferos. También abarcan secuencias que tienen residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

También se incluyen polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores que han sido modificados utilizando técnicas de biología molecular habituales de modo que mejoren su resistencia a la degradación proteolítica o que optimicen las propiedades de solubilidad. Los análogos de dichos polipéptidos incluyen los que contienen residuos distintos de los L-aminoácidos que existen de modo natural, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos que no existen de modo natural. Los péptidos descritos en la presente memoria no están limitados a productos de ninguno de los procesos ilustrativos específicos citados en la presente memoria.

Además de polipéptidos de longitud sustancialmente completa, la presente descripción también proporciona fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores.

Como se usa en la presente memoria, las secuencias de aminoácidos que son sustancialmente iguales comparten típicamente una identidad de aminoácidos de más del 95%. Sin embargo, se reconoce que las proteínas (y el DNA o el mRNA que codifican dichas proteínas) que contienen un nivel de identidad menor que el descrito anteriormente que surgen como variantes por empalme o que son modificadas por sustituciones conservadoras de aminoácidos (o sustitución de codones degenerados) se consideran que están dentro del alcance de la presente descripción. Como reconocen fácilmente los expertos en la técnica, se han ideado diversos modos de alinear las secuencias para su comparación, por ejemplo, la matriz de puntuación Blosum 62, como han descrito Henikoff and Henikoff en Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915 (1992). Los algoritmos empleados convenientemente para este fin están ampliamente disponibles (véase, por ejemplo, Needleman and Wunsch en J. Mol. Bio. 48:443 (1970).

Por tanto, en la presente memoria se describen secuencias de aminoácidos con una identidad del 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con los derivados de Tat inmunosupresores descritos en la Tabla 1.

Un derivado de Tat inmunosupresor comprende un péptido de Tat alterado. Un derivado de Tat inmunosupresor comprende un péptido de Tat en el que están alterados los aminoácidos 3-19. Un derivado de Tat inmunosupresor comprende un péptido de Tat en el que están alterados los aminoácidos 3-19 de las SEQ ID N°: 6-11, 13-35 o 69.

Un derivado de Tat inmunosupresor puede tener, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% con las SEQ ID NO: 6-11, 13-35 o 69. Un derivado de Tat inmunosupresor puede tener, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85 %, como máximo 90%, como máximo 93%, como máximo 95%, como máximo 97% o como máximo 99% con las SEQ ID NO: 6-11, 13-35 o 69.

Un derivado de Tat inmunosupresor puede tener, por ejemplo, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos contiguos con relación a las SEQ ID NO: 6-11, 13-35 o 69. Un derivado de Tat inmunosupresor puede tener, por ejemplo, como máximo uno, como máximo dos, como máximo tres, como máximo cuatro, como máximo cinco, como máximo seis, como máximo siete, como máximo ocho, como máximo nueve o como máximo diez sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos contiguos con relación a las SEQ ID NO: 6-11, 13-35 o 69.

Un derivado de Tat inmunosupresor puede tener, por ejemplo, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos no contiguos con relación a las SEQ ID NO: 6-11, 13-35 o 69. Un derivado de Tat inmunosupresor puede tener, por ejemplo, como máximo uno, como máximo dos, como máximo tres, como máximo cuatro, como máximo cinco, como máximo seis, como máximo siete, como máximo ocho, como máximo nueve o como máximo diez sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos no contiguos con relación a las SEQ ID NO: 6-11, 13 -35 o 69.

Además, los péptidos descritos en la presente memoria se pueden autoasociar. en multímeros, incluyendo aunque sin limitación, dímeros, trímeros y tetrámeros, además de existir en forma de monómero. La multimerización de péptidos puede suceder espontáneamente o puede ser facilitada sometiendo los péptidos a condiciones que conduzcan a la multimerización. Estas condiciones son conocidas por los expertos en química de péptidos. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden incluir monómeros o multímeros de los péptidos, o una mezcla de monómeros y multímeros.

Los siguientes sistemas de expresión son adecuados para uso en la expresión de los derivados de Tat inmunosupresores descritos: sistemas de expresión en células de mamífero tales como, aunque sin limitación, sistemas de expresión en células de insectos tales como, aunque sin limitación, sistema de expresión Bac-to-Bac, sistema de expresión en baculovirus y sistemas de expresión DES; y sistemas de expresión en E. coli que incluyen, aunque sin limitación, sistemas de expresión en pET, pSUMO y GST. Los derivados de Tat se pueden expresar con una etiqueta de histidina útil para el aislamiento del polipéptido. Los sistemas de purificación de la etiqueta de histidina son conocidos por los expertos en la técnica. Además, los derivados de Tat inmunosupresores se pueden sintetizar por métodos de síntesis química convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, los términos “tratar” o “tratamiento” cuando se usan con referencia a un trastorno incluyen prevenir al menos un síntoma de la afección, es decir, hacer que un síntoma clínico no se desarrolle significativamente en un sujeto que pueda estar expuesto, o predispuesto, a la enfermedad, pero que aún no experimenta ni muestra síntomas de la enfermedad, inhibir la enfermedad, es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas, o aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos. El tratamiento, la prevención y la mejora de una afección, como se usa en la presente memoria, pueden incluir, por ejemplo, disminuir o erradicar una afección perjudicial o nociva asociada a la inflamación, a un trastorno autoinmunitario o a una enfermedad neurodegenerativa.

Se entiende por “cantidad terapéuticamente eficaz” la cantidad requerida para lograr un efecto terapéutico.

La presente descripción también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores descritos anteriormente. Las dosificaciones y las concentraciones deseadas del fármaco de las composiciones farmacéuticas descritas pueden variar dependiendo del uso particular considerado. La determinación de la dosificación o vía de administración apropiada está dentro del alcance de un médico general. Los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la determinación de dosis eficaces para la terapia humana. La modificación de la escala entre especies de las dosis eficaces se puede realizar siguiendo los principios establecidos por Mardenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al, Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96. En una realización, la enfermedad está presente. En otra realización, se prolonga la vida de una célula o de un individuo debido a los métodos descritos en la presente memoria.

En consecuencia, las composiciones diseñadas para administración oral, nasal, lingual, sublingual, bucal, intrabucal, intravenosa, subcutánea, intramuscular y pulmonar se pueden preparar sin experimentación excesiva por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo con un diluyente inerte o con un vehículo farmacéuticamente aceptable Para fines de administración terapéutica, a las composiciones farmacéuticas se pueden incorporar excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, soluciones, jarabes y similares. Un “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándares.

Los ejemplos de vehículos adecuados son muy conocidos en la técnica y pueden incluir, aunque sin limitación, cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándares como soluciones salinas tamponadas con fosfato, solución salina tamponada con fosfato que contiene Polysorb 80, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y varios tipos. de agentes humectantes. Otros vehículos pueden incluir también soluciones estériles, comprimidos, comprimidos recubiertos y cápsulas. Típicamente, dichos vehículos contienen excipientes como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sus sales, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Las composiciones que comprenden dichos vehículos son formuladas por métodos convencionales muy conocidos.

Las composiciones de polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores se pueden administrar fácilmente por vía parenteral, tal como, por ejemplo, por inyección intravenosa, intramuscular, intratecal o subcutánea. La administración parenteral se puede realizar incorporando los compuestos a una solución o suspensión. Dichas soluciones o suspensiones pueden incluir también diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos. Las formulaciones parenterales pueden incluir también agentes antibacterianos tales como, por ejemplo, alcohol bencílico o metilparabenos, antioxidantes tales como, por ejemplo, ácido ascórbico o bisulfito de sodio, y agentes quelantes tal como EDTA. También se pueden añadir tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tal como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.

La administración transdérmica incluye la absorción percutánea de la composición a través de la piel. Las formulaciones transdérmicas incluyen parches, dispositivos de iontoforesis, pomadas, cremas, geles, ungüentos y similares.

La composición puede incluir diversos materiales que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una cubierta de recubrimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la cubierta de recubrimiento son típicamente inertes y se pueden seleccionar de, por ejemplo, azúcar, goma laca y otros agentes de recubrimiento entérico. Alternativamente, los ingredientes activos pueden estar encerrados en una cápsula o sello de gelatina.

Las composiciones de polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores de la presente descripción se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz, de acuerdo con un régimen de dosificación apropiado. Según entenderá un experto en la técnica, la cantidad exacta requerida puede variar de un sujeto a otro, dependiendo de la especie del sujeto, la edad y el estado general, la gravedad de la enfermedad, el agente o agentes particulares y el modo de administración. En algunas realizaciones, se administran desde aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de la composición basada en el peso del sujeto, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado. En otras realizaciones, se administra aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de la composición basada en el peso del sujeto, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.

La dosificación diaria total de las composiciones será determinada por el médico responsable dentro del alcance del buen criterio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente o sujeto particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se ha de tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente o sujeto; el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado y otros factores muy conocidos en las técnicas médicas.

Las composiciones descritas se pueden emplear también en terapias de combinación. Es decir, las composiciones actualmente descritas se pueden administrar simultáneamente, antes o después de una o más de otras composiciones, terapias, tratamientos o procedimientos médicos deseados. La combinación particular de terapias administradas será determinada por el médico responsable y tendrá en cuenta la compatibilidad de los tratamientos y el efecto terapéutico deseado que se quiere conseguir. Se apreciará que los agentes terapéuticamente activos utilizados en combinación se pueden administrar juntos en una única composición, tratamiento o procedimiento, o alternativamente se pueden administrar por separado. Los agentes terapéuticos adecuados incluyen, aunque sin limitación, agentes inmunosupresores, agentes anti-inflamatorios, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunomoduladores, agentes biológicos y moléculas pequeñas.

En otra realización, se propone la dosificación, repetitiva o frecuente, de los derivados de Tat inmunosupresores descritos. La dosificación frecuente es un procedimiento utilizado, por ejemplo, en la terapia de alergias que puede apoyar la tolerancia inmunológica a un agente.

El número de dosis repetidas de los derivados de Tat inmunosupresores puede ser establecido por el profesional médico basándose en la respuesta del paciente a las dosis. En una realización, el derivado de Tat inmunosupresor se administra una vez cada tres días en 3 dosis en un período de diez días. Este esquema de administración se repite luego durante una pluralidad de ciclos. La presente descripción prevé una variedad de diferentes esquemas de administración en donde el derivado de Tat inmunosupresor se administra múltiples veces dentro de un marco de tiempo seleccionado y luego el esquema de administración se repite durante una pluralidad de ciclos. En otra realización, la administración del derivado de Tat inmunosupresor puede ser alternada con la administración de uno o más de otros agentes terapéuticos.

Ciertos aspectos de la presente memoria se refieren, en parte, a una composición que comprende un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor. Un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor incluye los compuestos descritos en la presente memoria. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden comprender, o no, cualquier número y combinación de compuestos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, una composición puede comprender dos o más compuestos descritos en la presente memoria o tres o más compuestos descritos en la presente memoria.

Un compuesto descrito en la presente memoria, o una composición que comprende dicho compuesto, se administra generalmente a un individuo como una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar combinando una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto como se describe en la presente memoria como ingrediente activo, con excipientes farmacéuticos aceptables convencionales, y mediante la preparación de formas farmacéuticas unitarias adecuadas para uso terapéutico. Como se usa en la presente memoria, el término "composición farmacéutica" se refiere a una concentración terapéuticamente eficaz de un compuesto activo, tal como por ejemplo, cualquiera de los compuestos descritos en la presente memoria. Preferiblemente, la composición farmacéutica no produce una reacción adversa, alérgica u otra reacción inapropiada o no deseada cuando se administra a un individuo. Una composición farmacéutica descrita en la presente memoria es útil para aplicaciones médicas y veterinarias. Una composición farmacéutica se puede administrar a un individuo sola, o en combinación con otros compuestos activos, agentes, fármacos u hormonas suplementarios. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar usando cualquiera de una variedad de procesos, que incluyen, sin limitación, mezclamiento, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento y liofilización convencionales. La composición farmacéutica puede tomar cualquiera de una variedad de formas que incluyen, sin limitación, una solución, suspensión, emulsión, liofilizado, polvo, jarabe, elixir estériles o cualquier otra forma farmacéutica adecuada para la administración.

Las formas farmacéuticas líquidas adecuadas para inyección parenteral pueden comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables y polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol (PEG), glicerol y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tal como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En las formulaciones líquidas, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en la presente memoria puede estar entre aproximadamente 0,0001% (p/v) a aproximadamente 50% (p/v), aproximadamente 0,001% (p/v) a aproximadamente 10,0% (p/v) o aproximadamente 0,01% (p/v) a aproximadamente 1,0% (p/v).

Una composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede incluir opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable que facilita el procesamiento de un compuesto activo en composiciones farmacéuticamente aceptables. Como se usa en la presente memoria, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para el contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivas u otras complicaciones problemáticas correspondientes a una relación beneficio/riesgo razonable. Como se usa en la presente memoria, el término "vehículo farmacológicamente aceptable" es sinónimo de "vehículo farmacológico" y se refiere a cualquier vehículo que no tenga sustancialmente ningún efecto perjudicial a largo plazo o permanente cuando se administra y abarca términos tales como "vehículo, estabilizador, diluyente, aditivo, auxiliar o excipiente farmacológicamente aceptables". Dicho vehículo se mezcla generalmente con un compuesto activo o permite que diluya o envuelva al compuesto activo y puede ser un agente sólido, semisólido o líquido. Se entiende que los compuestos activos pueden ser solubles o pueden ser suministrados como una suspensión en el vehículo o diluyente deseado. Se puede usar cualquiera de una variedad de vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen, sin limitación, medios acuosos, tales como, por ejemplo, agua, solución salina, glicina, ácido hialurónico y similares; vehículos sólidos, tales como, por ejemplo almidón, estearato de magnesio, manitol, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, carbonato de magnesio y similares; disolventes; medios de dispersión; recubrimientos; agentes antibacterianos y antifúngicos; agentes isotónicos y retardantes de la absorción; o cualquier otro ingrediente inactivo. La selección de un vehículo farmacológicamente aceptable puede depender del modo de administración. Excepto en la medida en que cualquier vehículo farmacológicamente aceptable sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en composiciones farmacéuticamente aceptables. Se pueden encontrar ejemplos no limitativos de usos específicos de dichos vehículos farmacéuticos en “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems” (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); Remington: “The Science and Practice of Pharmacy” (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); Goodman & Gilman's “The Pharmacological Basis of Therapeutics” (Joel G. Hardman et al., Eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001); y “Handbook of Pharmaceutical Excipients” (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th ed., 2003). Estos protocolos son habituales y cualquier modificación está dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria

Una composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede incluir opcionalmente, sin limitación, otros componentes farmacéuticamente aceptables (o componentes farmacéuticos), que incluyen, sin limitación, tampones, conservantes, ajustadores de la tonicidad, sales, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, sustancias fisiológicas, sustancias farmacológicas, agentes de voluminosidad, agentes emulsionantes, agentes humectantes, agentes edulcorantes o aromatizantes, y similares. Se pueden usar diversos tampones y medios para ajustar el pH para preparar una composición farmacéutica descrita en la presente memoria, siempre que la preparación resultante sea farmacéuticamente aceptable. Dichos tampones incluyen, sin limitación, tampones de acetato, tampones de borato, tampones de citrato, tampones de fosfato, solución salina tamponada neutra y solución salina tamponada con fosfato. Se entiende que los ácidos o bases se pueden usar para ajustar el pH de una composición según sea necesario. Los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, acetilcisteína, hidroxianisol butilado e hidroxitolueno butilado. Los conservantes útiles incluyen, sin limitación, cloruro de benzalconio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, una composición de oxicloro estabilizada, tal como, por ejemplo, clorito de sodio, y quelantes, tal como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida, DTPA de calcio, y CaNaDTPA-bisamida. Los ajustadores de tonicidad útiles en una composición farmacéutica incluyen, sin limitación, sales, tales como, por ejemplo cloruro de sodio, cloruro de potasio, manitol o glicerina y otros ajustadores de tonicidad farmacéuticamente aceptables.

Un compuesto descrito en la presente memoria, o una composición que comprende dicho compuesto, se puede incorporar también en una plataforma de suministro de fármacos con el fin de lograr un perfil de liberación controlada del compuesto a lo largo del tiempo. Dicha plataforma de suministro de fármacos comprende un compuesto descrito en la presente memoria disperso dentro de una matriz polimérica, típicamente una matriz de polímero biodegradable, bioerosionable y/o biorreabsorbible. Como se usa en la presente memoria, el término "polímero" se refiere a homo- o co-polímeros sintéticos, homo- o co-polímeros naturales, así como a modificaciones sintéticas o sus derivados que tienen una estructura lineal, ramificada o en estrella. Los copolímeros pueden estar dispuestos adicionalmente en cualquier forma, como, por ejemplo, al azar, de bloques, segmentados, bloques cónicos, de injerto o tribloque. Los polímeros son generalmente polímeros de condensación. Los polímeros pueden ser modificados adicionalmente para mejorar sus propiedades mecánicas o de degradación introduciendo agentes de reticulación o cambiando la hidrofobicidad de los residuos laterales. Si están reticulados, los polímeros usualmente tienen menos del 5% de reticulación, usualmente menos del 1% de reticulación.

Los polímeros adecuados incluyen, sin limitación, alginatos, poliésteres alifáticos, oxalatos de polialquileno, poliamidas, poliamidoésteres, polianhídridos, policarbonatos, poliésteres, polietilenglicol, ácidos carboxílicos polihidroxialifáticos, poliortoésteres, polioxaésteres, polipéptidos, polifosfosfazenos, polisacáridos y poliuretanos. El polímero usualmente comprende al menos aproximadamente 10% (p/p), al menos aproximadamente 20% (p/p), al menos aproximadamente 30% (p/p), al menos aproximadamente 40% (p/p), al menos aproximadamente 50% (p/p), al menos aproximadamente 60% (p/p), al menos aproximadamente 70% (p/p), al menos aproximadamente 80% (p/p), o al menos aproximadamente 90% (p/p) de la plataforma de suministro de fármacos. Ejemplos de polímeros biodegradables, bioerosionables y/o biorreabsorbibles y métodos útiles para preparar una plataforma de suministro de fármacos se describen, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. 4.756.911; Patente de EE.UU. 5.378.475; Patente de EE.UU. 7.048.946; Publicación de Patente de EE.UU. 2005/0181017; Publicación de Patente de EE.UU.

2005/0244464; Publicación de Patente de EE.UU. 2011/0008437.

En ciertos aspectos de esta realización, un polímero que compone la matriz es un polipéptido, tal como por ejemplo, fibroína de seda, queratina o colágeno. En otros aspectos de esta realización, un polímero que compone la matriz es un polisacárido, tal como por ejemplo, celulosa, agarosa, elastina, quitosano, quitina o un glicosaminoglicano como condroitin-sulfato, dermatán-sulfato, queratán-sulfato o ácido hialurónico. Incluso en otros aspectos de esta realización, un polímero que compone la matriz es un poliéster, tal como por ejemplo, ácido D-láctico, ácido L-láctico, ácido láctico racémico, ácido glicólico, caprolactona y sus combinaciones.

Un experto en la técnica aprecia que la selección de un polímero adecuado para formar una plataforma de suministro de fármacos descrita adecuada depende de varios factores. Los factores más relevantes en la selección del (de los) polímero(s) apropiado(s) incluyen, sin limitación, compatibilidad del polímero con el fármaco, cinética de liberación deseada del fármaco, cinética de biodegradación deseada de la plataforma en el sitio de implantación, cinética bioerosionable deseada de la plataforma en el sitio de implantación, cinética biorreabsorbible deseada de la plataforma en el sitio de implantación, comportamiento mecánico in vivo de la plataforma, temperaturas de procesamiento, biocompatibilidad de la plataforma y tolerancia por el paciente. Otros factores relevantes que, en cierta medida, dictan el comportamiento in vitro e in vivo del polímero incluyen la composición química, la distribución espacial de los constituyentes, el peso molecular del polímero y el grado de cristalinidad.

Una plataforma de suministro de fármacos incluye tanto una plataforma de suministro de fármacos de liberación prolongada como una plataforma de suministro de fármacos de liberación extendida. Como se usa en la presente memoria, el término "liberación prolongada" se refiere a la liberación de un compuesto descrito en la presente memoria durante un período de aproximadamente siete días o más. Como se usa en la presente memoria, el término "liberación extendida" se refiere a la liberación de un compuesto descrito en la presente memoria durante un período de tiempo de menos de aproximadamente siete días.

En ciertos aspectos de esta realización, una plataforma de suministro de fármacos de liberación prolongada libera un compuesto descrito en la presente memoria con una cinética de liberación sustancialmente de primer orden durante un periodo de, por ejemplo, aproximadamente 7 días después de la administración, aproximadamente 15 días después de la administración, aproximadamente 30 días después de la administración, aproximadamente 45 días después de la administración, aproximadamente 60 días después de la administración, aproximadamente 75 días después de la administración, o aproximadamente 90 días después de la administración. En otros aspectos de esta realización, una plataforma de suministro de fármacos de liberación prolongada libera un compuesto descrito en la presente memoria con una cinética de liberación sustancialmente de primer orden durante un periodo de, por ejemplo, al menos 7 días después de la administración, al menos 15 días después de la administración, al menos 30 días después administración, al menos 45 días después de la administración, al menos 60 días después de la administración, al menos 75 días después de la administración o al menos 90 días después de la administración.

En ciertos aspectos de esta realización, una plataforma de suministro de fármacos libera un compuesto descrito en la presente memoria con una cinética de liberación sustancialmente de primer orden durante un periodo de, por ejemplo, aproximadamente 1 día después de la administración, aproximadamente 2 días después de la administración, aproximadamente 3 días después de la administración, aproximadamente 4 días después administración, aproximadamente 5 días después de la administración o aproximadamente 6 días después de la administración. En otros aspectos de esta realización, una plataforma de suministro de fármacos libera un compuesto descrito en la presente memoria con una cinética de liberación sustancialmente de primer orden durante un periodo de, por ejemplo, como máximo 1 día después de la administración, como máximo 2 días después de la administración, como máximo 3 días después de la administración, como máximo 4 días después de la administración, como máximo 5 días después de la administración o como máximo 6 días después de la administración.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren, en parte, a un trastorno autoinmunitario. Un trastorno autoinmunitario surge de una respuesta inmunitaria hiperactiva del cuerpo contra sustancias y tejidos normalmente presentes en el cuerpo, dando como resultado una ruptura en la tolerancia hacia los autoantígenos. En otras palabras, el cuerpo ataca realmente a sus propias células porque el sistema inmunitario confunde a alguna parte del cuerpo como un agente patógeno y lo ataca. Los trastornos autoinmunitarios caracterizados por el desarrollo de poblaciones de linfocitos T patógenos que se infiltran en el órgano o tejido diana, pueden estar restringidos a ciertos órganos o involucrar un tejido particular en diferentes sitios.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren, en parte, a una inflamación. La inflamación se refiere a la respuesta real del tejido (edema, eritema, etc.) a un estímulo nocivo. La inflamación neurógena se refiere al hecho de que esta respuesta tisular se inicia y/o mantiene a través de la liberación de mediadores inflamatorios desde los terminales de los nervios sensoriales periféricos (es decir, una función eferente, en contraste con la señalización aferente normal a la médula espinal en estos nervios). La inflamación neurógena abarca una serie de respuestas inflamatorias vasculares y no vasculares mediadas por un proceso biológico complejo que finalmente da como resultado la liberación local de mediadores inflamatorios y compuestos sensibilizantes desde las neuronas sensoriales. Al ser agredido por un estímulo nocivo, tal como, por ejemplo, un agente patógeno, daño a las células o un agente irritante, se liberan moléculas mediadoras y sensibilizadoras de la inflamación, tales como, por ejemplo, histamina, prostaglandinas, leucotrienos, serotonina, proteasas neutras, citoquinas, bradiquinina y óxido nítrico, desde las células mediadoras de la inflamación, tal como por ejemplo, mastocitos, células inmunitarias, células endoteliales vasculares y células de la musculatura lisa vascular. Véase Richardson and Vasko, J. Pharmacol. Exp. Ther. 302: 839-845, (2002). Estas moléculas mediadoras y sensibilizadoras de la inflamación actúan sobre las neuronas sensoriales para estimular la liberación de moléculas inductoras de la inflamación, tal como, por ejemplo, neuropéptidos como la sustancia P (SP) y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), prostaglandinas y aminoácidos como glutamato, desde terminaciones nerviosas periféricas. Tras su liberación, estas moléculas inductoras de la inflamación son responsables de provocar una respuesta inflamatoria, caracterizada típicamente por edema (hinchazón secundaria a la extravasación de plasma), hipersensibilidad (secundaria a alteraciones en la excitabilidad de ciertas neuronas sensoriales) y un eritema (enrojecimiento y calor secundario a vasodilatación) que se extiende más allá del sitio de estimulación (la respuesta de reagudización). Debido a que los síntomas inflamatorios subyacentes se desencadenan por la activación de las neuronas sensoriales primarias y la posterior liberación de moléculas inductoras de la inflamación, la respuesta se denomina inflamación neurógena.

La inflamación incluye tanto inflamación aguda como inflamación crónica. Como se usa en la presente memoria, el término "inflamación aguda" significa una respuesta inflamatoria que tiene efectos fisiopatológicos en donde al menos uno de los síntomas subyacentes que se trata se debe a una etiología de estímulos nocivos, tal como, por ejemplo, una respuesta antimicrobiana. Como se usa en la presente memoria, el término "inflamación crónica" significa una respuesta inflamatoria que tiene efectos fisiopatológicos en los que al menos uno de los síntomas subyacentes que se trata se debe a una etiología basada en nervios sensoriales nociceptivos, tal como, por ejemplo, la liberación de una molécula inductora de la inflamación. La inflamación crónica incluye tanto la inflamación neurógena primaria como la inflamación neurógena secundaria. Como se usa en la presente memoria, el término inflamación neurógena "primaria" se refiere a la inflamación de tejidos (síntomas inflamatorios) que se inicia por, o resulta de, la liberación de sustancias de los terminales nerviosos sensoriales primarios (como las fibras C y A-delta). Como se usa en la presente memoria, el término inflamación neurógena "secundaria" se refiere a la inflamación de tejidos iniciada por fuentes no neuronales (por ejemplo, extravasación desde el lecho vascular o derivada del intersticio de tejidos, tal como desde mastocitos o células inmunitarias) de mediadores inflamatorios, tales como péptidos o citoquinas, que estimulan los terminales nerviosos sensoriales y provocan una liberación de mediadores inflamatorios desde los nervios. Estos mediadores inflamatorios derivados de los nervios pueden, a su vez, estimular los nervios sensoriales, así como actuar sobre dianas no neuronales (por ejemplo, mastocitos). El efecto neto de ambas formas (primaria y secundaria) de inflamación neurógena es tener un estado inflamatorio que se mantiene mediante la sensibilización de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. La consecuencia fisiológica de la inflamación neurógena resultante depende del tejido en cuestión, produciendo, tal como por ejemplo, dolor cutáneo (alodinia, hiperalgesia), artritis articular, dolor y disfunción visceral, disfunción pulmonar (asma, COPD) y disfunción de la vejiga (dolor, vejiga hiperactiva).

Los síntomas de inflamación y/o trastorno autoinmunitario incluyen, sin limitación, edema, hiperemia, eritema, hematomas, sensibilidad, rigidez, hinchazón, fiebre, un escalofrío, congestión del tracto respiratorio, incluyendo nariz y bronquios, congestión de un seno, un problema respiratorio, retención de líquidos, un coágulo sanguíneo, pérdida de apetito, aumento de la frecuencia cardíaca, formación de granulomas, exudado fibrinoso, pus o serosidad no viscosa, formación de una úlcera o dolor. Los síntomas reales asociados a una inflamación y a un trastorno autoinmunitario descritos en la presente memoria son bien conocidos y pueden ser determinados por una persona experta en la técnica teniendo en cuenta factores que incluyen, sin limitación, la localización de la inflamación o el trastorno autoinmunitario, la causa de la inflamación o del trastorno autoinmunitario, la gravedad de la inflamación o del trastorno autoinmunitario, el tejido u órgano afectado por la inflamación o el trastorno autoinmunitario, y el trastorno asociado a la inflamación

Normalmente, la inflamación sirve como mecanismo protector por parte de un organismo para eliminar los estímulos nocivos, así como para iniciar el proceso de curación del tejido lesionado. Esta inflamación neurógena aguda forma la primera línea de defensa, manteniendo la integridad del tejido y contribuyendo a la reparación del tejido. De hecho, en ausencia de inflamación neurógena aguda, las heridas e infecciones nunca sanarían y la destrucción progresiva del tejido comprometería la supervivencia del organismo. Sin embargo, la estimulación nociva grave o prolongada da como resultado una respuesta inflamatoria crónica que provoca lesiones en lugar de mediar la reparación. Esta inflamación ha sido implicada en la fisiopatología de una amplia gama de trastornos no relacionados que subyacen a una amplia variedad de enfermedades humanas.

La inflamación crónica y sus síntomas asociados se pueden asociar a un gran grupo de trastornos no relacionados que subyacen a una variedad de enfermedades humanas. Los ejemplos no limitativos de trastornos que presentan inflamación como síntoma incluyen, sin limitación, acné, reflujo ácido/acidez estomacal, enfermedad de Alzheimer, apendicitis, arteritis, artritis, asma, alergia, rinitis alérgica, aterosclerosis, un trastorno autoinmunitario, balanitis, blefaritis, bronquiolitis, bronquitis, penfigoide ampolloso, ursitis, un cáncer, carditis, enfermedad celíaca, celulitis, cervicitis, colangitis, colecistitis, corioamnionitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), cirrosis, colitis, conjuntivitis, cistitis, resfriado común, dacrioadenitis, demencia, dermatitis, dermatomiositis, eczema, enfisema, encefalitis, endocarditis, endometritis, enteritis, enterocolitis, epicondilitis, epididimitis, fascitis, fibrositis, gastritis, gastroenteritis, gingivitis, glomerulonefritis, glositis, una enfermedad cardíaca, hepatitis, hidrosadenitis supurante, presión arterial alta, ileitis, una enfermedad dermatológica inflamatoria, una neuropatía inflamatoria, resistencia a la insulina, cistitis intersticial, iritis, cardiopatía isquémica, queratitis, queratoconjuntivitis, laringitis, mastitis, mastoiditis, una meningitis, síndrome metabólico (síndrome X), migraña, mielitis, miocarditis, miositis, nefritis, obesidad, onfalitis, ooforitis, orquitis, osteocondritis, ostopenia, osteoporosis, osteitis, otitis, pancreatitis, enfermedad de Parkinson, parotitis, enfermedad inflamatoria pélvica, pénfigo vulgar, pericarditis, peritonitis, faringitis, flebitis, pleuritis, neumonitis, proctitis, prostatitis, una psoriasis, pulpitis, pielonefritis, pilefefebritis, fiebre reumática, rinitis, salpingitis, sialadenitis, sinusitis, un colon espástico, estomatitis, sinovitis, tendonitis, tendinosis, tenosinovitis, tromboflebitis, amigdalitis, trigonitis, un tumor, uretritis, uveítis, vaginitis, vasculitis y vulvitis.

Un tipo de trastorno que presenta un síntoma de inflamación es una artritis. La artritis incluye un grupo de afecciones que implican daño en las articulaciones del cuerpo debido a la inflamación de la sinovia, incluyendo, sin limitación, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, espondiloartropatías como espondilitis anquilosante, artritis reactiva (síndrome de Reiter), artritis psoriásica, artritis enteropática asociada a enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Whipple y enfermedad de Behcet, artritis séptica, gota (también conocida como artritis gotosa, sinovitis cristalina, artritis metabólica), pseudogota (enfermedad por deposición de pirofosfato de calcio) y enfermedad de Still. La artritis puede afectar una sola articulación (monoartritis), dos a cuatro articulaciones (oligoartritis) o cinco o más articulaciones (poliartritis) y puede ser una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad no autoinmunitaria.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren, en parte, a un trastorno autoinmunitario. Los trastornos autoinmunitarios presentan también síntomas de inflamación. Las enfermedades autoinmunitarias se pueden dividir ampliamente en trastornos autoinmunitarios sistémicos y específicos de órganos, dependiendo de las principales características clínico-patológicas de cada enfermedad. Las enfermedades autoinmunitarias sistémicas incluyen, sin limitación, lupus eritematoso sistémico (SLE), síndrome de Sjogren, esclerodermia, artritis reumatoide y polimiositis. Las enfermedades autoinmunitarias locales pueden ser endocrinológicas (diabetes mellitus tipo 1, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison, etc.), dermatológicas (pénfigo vulgar), hematológicas (anemia hemolítica autoinmunitaria), neurales (esclerosis múltiple) o pueden implicar prácticamente cualquier masa circunscrita de tejido corporal. Los tipos de trastornos autoinmunitarios incluyen, sin limitación, encefalomielitis aguda diseminada (ADEM), enfermedad de Addison, una alergia, rinitis alérgica, enfermedad de Alzheimer, síndrome de anticuerpos antifosfolípídos (APS), una artritis, asma, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno, penfigoide ampolloso, enfermedad cardiovascular, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), diabetes mellitus tipo 1 (IDDM), eczema, endometriosis, fibromialgia, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS), tiroiditis de Hashimoto, hidrosadenitis supurante, púrpura trombocitopénica idiopática, una enfermedad inflamatoria intestinal, una enfermedad dermatológica inflamatoria, cistitis intersticial, un lupus (incluyendo lupus eritematoso discoide, lupus eritematoso inducido por fármacos, nefritis por lupus, lupus neonatal, lupus eritematoso cutáneo subagudo y lupus eritomatoso sistémico), morfea, esclerosis múltiple (MS), miastenia grave, miopatías, narcolepsia, neuromiotonía, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, una psoriasis, cirrosis biliar primaria, encefalomielitis diseminada recurrente (encefalomielitis diseminada multifásica), fiebre reumática, esquizofrenia, esclerodermia, síndrome de Sjogren, tenosinovititis, vasculitis y vitiligo.

Otro tipo de trastorno que presenta un síntoma de inflamación es una miopatía inflamatoria. Las miopatías inflamatorias son causadas por problemas con el sistema inmunitario que ataca los componentes del músculo, lo que lleva a signos de inflamación en el músculo. Las miopatías inflamatorias incluyen, sin limitación, dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión y polimiositis.

Otro tipo de trastorno que presenta un síntoma de inflamación es una vasculitis. La vasculitis es un grupo variado de trastornos que presentan inflamación de una pared vascular que incluye vasos linfáticos y vasos sanguíneos como venas (flebitis), arterias (arteritis) y capilares debido a la migración de leucocitos y el daño resultante. La inflamación puede afectar a vasos sanguíneos de cualquier tamaño, en cualquier parte del cuerpo. Puede afectar a arterias y/o venas. La inflamación puede ser focal, lo que significa que afecta una sola localización dentro de un vaso; o puede estar generalizada, con zonas de inflamación dispersas en todo un órgano o tejido particular o incluso afectar a más de un sistema de órganos del cuerpo. Las vasculitis incluyen, sin limitación, enfermedad de Buerger (tromboangiitis obliterante), vasculitis cerebral (vasculitis del sistema nervioso central), arteritis de Churg-Strauss, crioglobulinemia, vasculitis crioglobulinémica esencial, arteritis de células gigantes (temporal), vasculitis de Golferl, púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis por hipersensibilidad (vasculitis alérgica), enfermedad de Kawasaki, poliarteritis/poliangeiitis microscópica, poliarteritis nodosa, polimialgia reumática (PMR), vasculitis reumatoide, arteritis de Takayasu, granulomatosis de Wegener y vasculitis secundaria a trastornos del tejido conjuntivo como lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide (RA), policondritis recidivante, enfermedad de Behget u otros trastornos del tejido conjuntivo, vasculitis secundaria a infección viral.

Otro tipo de trastorno que presenta un síntoma de inflamación es un trastorno de la piel. Los trastornos de la piel incluyen, sin limitación, una dermatitis, que incluye dermatitis actínica crónica, un eczema como eczema atópico, eczema de contacto, eczema xerótico, dermatitis seborreica, dishidrosis, eczema discoide, eczema venoso, dermatitis herpetiforme, neurodermatitis y autoeczematización, y dermatitis por estasis, hidrosadenitis supurante, psoriasis incluyendo psoriasis en placas, psoriasis ungueal, psoriasis en gotas, psoriasis del cuero cabelludo, psoriasis inversa, psoriasis pustulosa y psoriasis eritrodérmica, rosácea y esclerodermia, incluyendo morfea.

Otro tipo de trastorno que presenta un síntoma de inflamación es un trastorno gastrointestinal. Un trastorno gastrointestinal incluye, sin limitación, enfermedad del intestino irritable, una enfermedad inflamatoria intestinal que incluye la enfermedad de Crohn y una colitis ulcerosa como proctitis ulcerosa, colitis del lado izquierdo, pancolitis y colitis fulminante.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren, en parte, a una enfermedad neurodegenerativa. Las enfermedades neurodegenerativas surgen de la pérdida progresiva de estructura o función de las neuronas, que incluyen la muerte de las neuronas. Los ejemplos no limitativos de enfermedades neurodegenerativas incluyen, aunque sin limitación, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, amiloidosis, esclerosis lateral amiotrófica, ansiedad, ataxia telangiectasia, trastornos por déficit de la atención, enfermedad de Canavan, lesiones del sistema nervioso central, enfermedad de Charcot Marie Tooth, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, depresión, encefalitis (por ejemplo, bacteriana, parasitaria, fúngica o viral), ataxia de Friedreich, demencia frontotemporal, paraparesia espástica hereditaria, síndrome de Guillain-Barré (y sus variantes neuropatía axonal motora aguda, polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda y síndrome de Fisher), complejo de demencia por HIV/AIDS, enfermedad de Huntington, daño isquémico al sistema nervioso, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph, meningitis (por ejemplo, bacteriana, parasitaria, fúngica o viral), esclerosis múltiple, atrofia multisistémica, traumatismo neural, por ejemplo, daño percusivo en el cerebro, lesión de la médula espinal y daño traumático en el sistema nervioso, una neuropatía, tal como, por ejemplo, neuropatía inducida por quimioterapia, neuropatía asociada a diabetes y neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, trastornos por priones, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, esquizofrenia, enfermedad de Schilder, atrofias espinocerebelosas, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, accidente cerebrovascular, tabes dorsal y demencia vascular. La neurodegeneración puede estar asociada a una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad no autoinmunitaria, y la neurodegeneración puede ser un trastorno sistémico o un trastorno específico de un órgano. Los ejemplos no limitativos de un síntoma reducido por un método de tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa descrita en la presente memoria incluyen ansiedad, afasia, cognición, confusión, depresión, dolor, parálisis, espasticidad, tics y temblores.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren, en parte, a la reducción de un síntoma asociado a un trastorno autoinmunitario o una enfermedad neurodegenerativa. En un aspecto de esta realización, el síntoma reducido es inflamación, fatiga, mareos, malestar, fiebre elevada y temperatura corporal alta, sensibilidad extrema al frío en manos y pies, debilidad y rigidez en músculos y articulaciones, cambios de peso, problemas digestivos o gastrointestinales, presión arterial baja o alta, irritabilidad, ansiedad o depresión, infertilidad o disminución del deseo sexual (baja libido), cambios de azúcar en la sangre y, dependiendo del tipo de enfermedad autoinmunitaria, un aumento en el tamaño de un órgano o tejido o la destrucción de un órgano o tejido.

En una realización, el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor tiene actividad que da como resultado un aumento de la expresión del ligando Fas (FasL) en macrófagos reguladores de células presentadoras de antígenos (AReg) expuestos al polipéptido derivado de Tat inmunosupresor. En ciertos aspectos de esta realización, un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor aumenta la expresión de FasL en células en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70 %, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500%, en relación con las células no expuestas al mismo polipéptido derivado de Tat inmunosupresor. En otros aspectos de esta realización, un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor aumenta la expresión de FasL en células en aproximadamente 10% a aproximadamente 25%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 75%, aproximadamente 10% a aproximadamente 100%, aproximadamente 10% a aproximadamente 200%, aproximadamente 10% a aproximadamente 300%, aproximadamente 10% a aproximadamente 400%, aproximadamente 10% a aproximadamente 500%, aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, aproximadamente 25% a aproximadamente 75%, aproximadamente 25 % a aproximadamente 100%, aproximadamente 25% a aproximadamente 200%, aproximadamente 25% a aproximadamente 300%, aproximadamente 25% a aproximadamente 400%, aproximadamente 25% a aproximadamente 500%, aproximadamente 50% a aproximadamente 100%, aproximadamente 50% a aproximadamente 200%, aproximadamente 50% a aproximadamente 300%, aproximadamente 50% a aproximadamente 400%, o aproximadamente 50% a aproximadamente 500%, en relación con células no expuestas al mismo derivado de Tat inmunosupresor. En ciertas realizaciones, los AReg son macrófagos CD14+.

Las enfermedades autoinmunitarias, neurodegenerativas y asociadas a la inflamación descritas son trastornos inmunomediados caracterizados por un aumento de la inflamación, mediada por linfocitos T, que se desea reducir. Un agente terapéutico que aumenta o induce la expresión de FasL en los AReg o células dendríticas, disminuye la inflamación mediada por linfocitos T y, por lo tanto, trata la enfermedad autoinmunitaria, neurodegenerativa o asociada a la inflamación. Por lo tanto, en una realización, la presente descripción proporciona un método para disminuir la inflamación mediada por linfocitos T en un sujeto con una enfermedad autoinmunitaria, neurodegenerativa o asociada a la inflamación mediante la administración de uno o más de los polipéptidos derivado de Tat inmunosupresores descritos, tratando de este modo la enfermedad autoinmunitaria, neurodegenerativa o asociada a la inflamación. En otra realización, la presente descripción proporciona un método para inducir la expresión de FasL en los AReg en un sujeto con una enfermedad autoinmunitaria, neurodegenerativa o asociada a la inflamación mediante la administración de uno o más de los polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores descritos, tratando de ese modo la enfermedad autoinmunitaria, neurodegenerativa o asociada a la inflamación.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren adicionalmente, en parte, a la reducción de un síntoma asociado a la inflamación. En un aspecto de esta realización, el síntoma reducido es edema, hiperemia, eritema, hematomas, sensibilidad, rigidez, hinchazón, fiebre, un escalofrío, congestión del tracto respiratorio, incluyendo nariz y bronquios, congestión de un seno, un problema respiratorio, retención de líquidos, un coágulo sanguíneo, una pérdida de apetito, un aumento de la frecuencia cardíaca, una formación de granulomas, exudado fibrinoso, pus o serosidad no viscosa, una formación de una úlcera o dolor.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren, en parte, a un mamífero. Un mamífero incluye un ser humano, y un ser humano puede ser un paciente. Otros aspectos de la presente descripción se refieren, en parte, a un individuo. Un individuo incluye un mamífero y un ser humano, y un ser humano puede ser un paciente. En otras realizaciones, los mamíferos incluyen animales domesticados, tales como perros, gatos, caballos, ganado, ovejas, cabras y primates.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren, en parte, a la administración de un compuesto o una composición descrita en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, el término "administración" significa cualquier mecanismo de suministro que proporciona un compuesto o una composición descrita en la presente memoria a un individuo que potencialmente da un resultado clínica, terapéutica o experimentalmente beneficioso.

La administración de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria incluye una variedad de métodos enterales o parenterales que incluyen, sin limitación, administración oral en cualquier forma aceptable, tal como, por ejemplo, comprimido, líquido, cápsula, polvo o similares; administración tópica en cualquier forma aceptable, tal como, por ejemplo, gotas, pulverización, cremas, geles o pomadas; administración bucal, nasal y/o por inhalación en cualquier forma aceptable; administración rectal en cualquier forma aceptable; administración vaginal en cualquier forma aceptable; administración intravascular en cualquier forma aceptable, tal como, por ejemplo, inyección intravenosa de bolo, infusión intravenosa, inyección intra-arterial de bolo, infusión intra-arterial e instilación por catéter en la vasculatura; administración peri- e intra-tisular en cualquier forma aceptable, tal como, por ejemplo, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea, infusión subcutánea, inyección intraocular, inyección retinal o inyección sub-retinal o inyección epidural; administración intravesicular en cualquier forma aceptable, tal como, por ejemplo, instilación por catéter; y mediante un dispositivo de colocación, como, por ejemplo, un implante, un stent, un parche, un pelet, un catéter, una bomba osmótica, un supositorio, un sistema de suministro bioerosionable, un sistema de suministro no bioerosionable u otro sistema implantado de liberación extendida o lenta. Una lista ilustrativa de polímeros biodegradables y métodos de uso se describen, por ejemplo, en Handbook of Biodegradable Polymers (Abraham J. Domb et al., Eds., Overseas Publishers Association, 1997).

Un compuesto o una composición descritos en la presente memoria se puede administrar a un mamífero usando una variedad de vías. Las vías de administración adecuadas para tratar la inflamación, un trastorno autoinmunitario o una enfermedad neurodegenerativa como se describe en la presente memoria incluyen tanto administración local como sistémica. La administración local da como resultado un suministro significativamente mayor de una composición a una localización específica en comparación con todo el cuerpo del mamífero, mientras que la administración sistémica da como resultado el suministro de una composición a esencialmente todo el cuerpo del individuo. Las vías de administración adecuadas también incluyen tanto administración central como periférica. La administración central da como resultado el suministro de un compuesto o una composición esencialmente al sistema nervioso central del individuo e incluye, por ejemplo, administración intratecal, administración epidural, así como una inyección o implante craneal. La administración periférica da como resultado el suministro de un compuesto o una composición a esencialmente cualquier zona de un individuo fuera del sistema nervioso central y abarca cualquier vía de administración distinta de la administración directa a la columna vertebral o al cerebro. Una persona experta en la técnica puede determinar la vía real de administración utilizada de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria, teniendo en cuenta factores que incluyen, sin limitación, el tipo, localización, causa y gravedad de la inflamación o de un trastorno autoinmunitario o neurodegenerativo, la duración del tratamiento deseado, el grado de alivio deseado, la duración del alivio deseado, el compuesto o composición particular utilizado, la tasa de excreción del compuesto o composición utilizado, la farmacodinámica del compuesto o composición utilizado, la naturaleza de los otros compuestos que han de ser incluidos en la composición, la vía particular de administración, las características particulares, el historial y los factores de riesgo del individuo, tales como, por ejemplo, edad, peso, salud general y similares, la respuesta del individuo al tratamiento, o cualquiera de sus combinaciones. Una cantidad de dosificación eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria puede ser así determinar fácilmente por la persona con experiencia en la técnica considerando todos los criterios y utilizando su mejor juicio para el individuo.

En una realización, un compuesto o una composición descritos en la presente memoria se administra sistémicamente a un mamífero. En otra realización, un compuesto o una composición descritos en la presente memoria se administra localmente a un mamífero. En un aspecto de esta realización, un compuesto o una composición descritos en la presente memoria se administra a un sitio de inflamación, neurodegeneración o trastorno autoinmunitario de un mamífero. En otro aspecto de esta realización, un compuesto o una composición descritos en la presente memoria se administra a la zona que rodea una inflamación, enfermedad neurodegenerativa o trastorno autoinmunitario de un mamífero.

Ciertos aspectos de la presente memoria descriptiva se refieren, en parte, a la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" es sinónimo de "dosis terapéuticamente eficaz" y cuando se usa con referencia al tratamiento de la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario significa la dosis mínima de un compuesto o composición descritos en la presente memoria necesaria para lograr el deseado efecto terapéutico e incluye una dosis suficiente para reducir un síntoma asociado a la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario. En ciertos aspectos de esta realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria reduce un síntoma asociado a la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario en, por ejemplo, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 100%. En otros aspectos de esta realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria reduce un síntoma asociado a la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario en, por ejemplo, como máximo 10%, como máximo 20%, como máximo 30%, como máximo 40%, como máximo 50%, como máximo 60%, como máximo 70%, como máximo 80%, como máximo 90% o como máximo 100%. Incluso en otros aspectos de esta realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria reduce un síntoma asociado a la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario en, por ejemplo, aproximadamente 10% a aproximadamente 100%, aproximadamente 10% a aproximadamente 90%, aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, aproximadamente 10% a aproximadamente 60%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, aproximadamente 20% a aproximadamente 100% , aproximadamente 20% a aproximadamente 90%, aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, aproximadamente 20% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 60%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente 30% a aproximadamente 100%, aproximadamente 30% a aproximadamente 90%, aproximadamente 30% a aproximadamente 80%, aproximadamente 30% a aproximadamente 70%, aproximadamente 30% a aproximadamente 60%, o aproximadamente 30% a aproximadamente 50%. En incluso otros aspectos de esta realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria es la dosis suficiente para reducir un síntoma asociado a la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario durante, por ejemplo, al menos una semana, al menos uno mes, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses, al menos diez meses, al menos once meses, o al menos doce meses.

La cantidad de componente activo en un compuesto o una composición descritos en la presente memoria para tratar la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario se puede variar de modo que se obtenga una dosificación adecuada. Una persona experta en la técnica puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz real de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria que se ha ser administrada a un mamífero, teniendo en cuenta factores que incluyen, sin limitación, el tipo, localización, causa o gravedad de la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario, la duración del tratamiento deseado, el grado de alivio deseado, la duración del alivio deseado, el compuesto o composición particular utilizado, la tasa de excreción del compuesto o composición utilizado, la farmacodinámica de compuesto o composición utilizado, la naturaleza de los otros compuestos que se han de incluir en la composición, la vía particular de administración, las características particulares, el historial y los factores de riesgo del individuo, tales como, por ejemplo, edad, peso, salud general y similares, la respuesta del individuo al tratamiento, o cualquiera de sus combinaciones. Una cantidad de dosificación eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria puede ser determinada fácilmente por una persona experta en la técnica considerando todos los criterios y utilizando su mejor juicio para el individuo.

Además, cuando se usa la administración repetida de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria, la cantidad de efecto real de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria dependerá adicionalmente de factores, que incluyen, sin limitación, la frecuencia de administración, la semivida del compuesto o composición descritos en la presente memoria, o cualquiera de sus combinaciones. Es sabido por una persona experta en la técnica que una cantidad eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria puede ser extrapolada de ensayos in vitro y estudios de administración in vivo utilizando modelos animales antes de la administración a seres humanos. Se han de esperar grandes variaciones en la cantidad eficaz necesaria en vista de las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, generalmente se esperaría que la administración oral requiera niveles de dosificación más altos que la administración por inyección intravenosa o intravítrea. Las variaciones de estos niveles de dosificación se pueden ajustar utilizando pautas empíricas estándares de optimización, que son bien conocidas por una persona experta en la técnica. Los niveles y patrones de dosificación terapéuticamente eficaces precisos son determinados preferiblemente por el médico responsable considerando los factores identificados anteriormente.

La dosificación puede ser dosificación única o acumulativa (dosificación en serie), y una persona experta en la técnica puede determinarla fácilmente. Por ejemplo, el tratamiento de la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario puede comprender una única administración de una dosis eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria. Como ejemplo no limitativo, una dosis eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria se puede administrar una vez a un mamífero, por ejemplo, como una única inyección o deposición en o cerca del sitio que presenta un síntoma de inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario o una única administración oral del compuesto o una composición. Alternativamente, el tratamiento de la inflamación, neurodegeneración o un trastorno autoinmunitario puede comprender múltiples administraciones de una dosis eficaz de un compuesto o una composición descrita en la presente memoria realizadas durante un intervalo de períodos de tiempo, tales como, por ejemplo, diariamente, una vez cada pocos días, semanalmente, mensualmente o anualmente. Como ejemplo no limitativo, un compuesto o una composición descritos en la presente memoria se puede administrar una o dos veces por semana a un mamífero. El momento de la administración puede variar de un mamífero a otro, dependiendo de factores tales como la gravedad de los síntomas de un mamífero. Por ejemplo, una dosis eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria se puede administrar a un mamífero una vez al mes durante un período de tiempo indefinido, o hasta que el mamífero ya no requiera terapia. Una persona experta en la técnica reconocerá que el estado del mamífero se puede monitorizar a lo largo del curso del tratamiento y que la cantidad eficaz de un compuesto o una composición descritos en la presente memoria que se administra puede ser ajustada en consecuencia.

Un compuesto o una composición descritos en la presente memorias se puede administrar también a un mamífero en combinación con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto terapéutico global del tratamiento. El uso de múltiples compuestos para tratar enfermedades autoinmunitarias, neurodegenerativas y asociadas a la inflamación está dentro del alcance de la presente descripción. Además, la presente descripción incluye el uso de los péptidos descritos para tratar enfermedades autoinmunitarias, neurodegenerativas y asociadas a la inflamación y el uso de los péptidos descritos en la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades autoinmunitarias, neurodegenerativas y asociadas a la inflamación.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitativos se proporcionan solamente con fines ilustrativos para facilitar una comprensión más completa de las realizaciones representativas contempladas ahora. Estos ejemplos no deben interpretarse que limitan cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, incluyendo las relativas a los métodos de tratamiento de un trastorno autoinmunitario, inflamación o enfermedades neurodegenerativas que usan los derivados de Tat descritos en la presente memoria.

Ejemplo 1

Efectos de Tat sobre el linaje de células dendríticas

El Tat induce que los monocitos implicados en el linaje de las células dendríticas (DC) se agranden en las CD86+ DC APC activadas (Figura 1). Los monocitos humanos enriquecidos a partir de las PBMC mediante separación por gradiente de densidad de Percoll y adhesión a perlas magnéticas recubiertas con anti-CD14 (Dynabeads M-450, Dynal Biotech) se hicieron diferenciar en las DC por medio de cinco días de cultivo en GM-CSF (100 ng/mL) e IL-4 (100 ng/mL). Las DC afectadas se cultivaron durante la noche en medio solo (Control), LPS (100 ng/mL) o Tat (50 nM), después de lo cual se tiñeron con un anticuerpo anti-CD86 (BD Pharmingen) y se analizaron por FACScan para la inducción de CD86 (panel izquierdo) o activación generalizada (panel derecho, ampliación en el recuadro R2, que se muestra para las células estimuladas con Tat). Los MFI para la expresión de CD86 son 9 (Control), 30 (LPS) y 187 (Tat), siendo CD86 un determinante específico de la activación de las DC.

Tat derivatizado reduce la diferenciación de los AReg y mejora potentemente la activación específica de antígenos de los CTL (Figura 2). Tat se derivatiza químicamente por oxidación (Tat* u ox-Tat) para que no induzca a los AReg a partir de precursores de las APC de monocitos (Figura 3). Se administraron diez microgramos de conjugado de Tat/p24 Tat*-Ag (Ag-Tat*) en costados de ratones Balb/C en adyuvante el día 0 y el día 7. Los grupos experimentales se inmunizaron comparativamente en adyuvante con 5 |jg de p24 en un costado y 5 |jg de Tat derivatizado en el otro costado (Ag&Tat*), o 10 jg de p24 en adyuvante (Ag). Los ratones de control recibieron dos inyecciones de adyuvante. En cada grupo se trataron cuatro ratones. El día 14, las células de los ganglios linfáticos drenantes de cada animal se recogieron y se reestimularon durante la noche en cultivos de células Ap24 irradiadas (células H-2d transfectadas de manera estable para expresar el antígeno p24) o células no transfectadas de control. La actividad de los CTL se cuantificó como el número de colonias formadoras de puntos (SFC) segregadoras de yinterferón/106 células en cultivadas en placa usando ensayos ELISPOT. El valor de fondo con re-estimuladores no transfectados, que en todos los casos era <10 SFC/106, se resta de cada punto. Los resultados son indicativos de tres experimentos similares.

Ejemplo 2

Activación por Tat de macrófagos y supresión de la respuesta inmunitaria

La proteína Tat recombinante se prepara como se ha descrito previamente (Li, C.J. et al. (1995), Science 268:429-31) en condiciones moderadamente desnaturalizantes y se renaturalizó en presencia de DTT 0,1 mM.

La activación por Tat de los monocitos es dependiente de la dosis y es saturable (Figura 3). Los monocitos humanos se cultivaron en concentraciones crecientes de Tat recombinante durante seis días, en cuyo momento se analizaron la inducción del ligando Fas (FasL) como una medida de la activación usando citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson) para cuantificar la intensidad de la tinción (índice de fluorescencia medio (MFI)) con un anticuerpo monoclonal anti-ligando Fas (Nok 1, BD Pharmingen). Concentraciones más altas de Tat no aumentaron el MFI (no mostrado), y los linfocitos T no se pudieron activar con Tat 50 nM (no mostrado), la concentración estimuladora de la constante para las APC.

Tat suprime la respuesta inmunitaria humoral específica de antígeno al p24 de1HIV-1 (Figura 4). La semana 0, los ratones (4 en cada grupo) se inmunizaron con 5 |jg de proteína p24 recombinante (Chiron, Emeryville, CA) y 5 |jg de proteína Tat (PT) recombinante o 5 jg de proteína ox-Tat* recombinante (Ag) mezclada en 100 jL de adyuvante de Freund completo y se administraron por vía subcutánea en el costado. Después de la inmunización, se recogieron sueros cada dos semanas durante 10 semanas y se analizaron para determinar una respuesta a anticuerpos específica a p24 por ELISA disponible comercialmente (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). El título de anticuerpo de p24 a las 2 semanas (Figura 4A) fue completamente suprimido por la proteína Tat (PT) en comparación con el control ox-Tat* (Ag). Esta respuesta se mantuvo durante al menos 6 semanas. Los títulos de anticuerpos a las 6 semanas son aproximadamente diez veces mayores que en la semana 2 debido a la maduración de la respuesta inmunitaria.

El Tat potencia la viabilidad de los macrófagos de múrido cultivados siempre que los macrófagos se hayan activado por primera vez in vivo en comparación con ninguna activación previa y estimulados con concentraciones relativamente altas de Tat (Figura 5). Las APC se aislaron mediante lavado peritoneal de ratones inyectados por vía intraperitoneal cuatro días antes con tioglicolato al 2,9% (como adyuvante) o solución salina al 0,85% (en reposo). Las células de lavado recogidas se cultivaron hasta 106 células/mL durante cinco días en medio solo (Control, C), lipopolisacárido (LPS, 100 ng/mL) o Tat producido como proteína recombinante en E. coli (Tat, 500 ng/mL). La activación se determinó como % de células agrandadas (fracción M1).

El Tat inmunosupresor produce una supresión estable de la proliferación de linfocitos de ratón (Figura 6). Los ratones se inmunizaron por cuadruplicado con una emulsión adyuvante de Freund que contenía 5 jg de Tat/tolerógeno p24 (proteína gag p24 de HIV-1 recombinante) (GRP2) o con 5 jg de avidina-p24 (GRP 1) como control. A las dos semanas, se recogieron células de ganglios linfáticos drenantes residuales, se agruparon dentro de cada grupo y se cultivaron hasta 105 células/pocillo de microtitulación durante cuatro días en presencia de concentraciones graduadas de proteína p24 recombinante (p24, jg/mL). La proliferación se analizó como un determinante de la respuesta de linfocitos T de recuerdo cuantificando la absorción de timidina 3H (CPM) durante la noche en un contador de centelleo líquido. Esta respuesta se mantiene hasta seis semanas.

Además, el Tat inmunosupresor genera una supresión inmunitaria específica de antígenos (Figura 7). Los ratones por cuadruplicado se inmunizaron el día 0 y se les aplicó una dosis de recuerdo el día 7 con una emulsión adyuvante que contenía 5 jg del Tat tolerógeno /p24 (Ag+Tol) o con 5 jg de avidina-p24 (Ag solo) como control. El día 14, se recogieron y estimularon células de ganglios linfáticos drenantes hasta 105 células/pocillo de cultivo de microtitulación con adición de antígeno (específico, p24 recombinante, 1 jg/mL) o con adición de anticuerpo monoclonal anti-receptor de linfocitos T (no específico, 2C11, 10 jg/mL). La absorción de timidina tritiada (CPM) se determinó por centelleo líquido el día 4 de cultivo. La respuesta específica de Ag+Tol es suprimida en 98% en relación con Ag solo, y no es distinguible de las células cultivadas en ausencia de estimulantes.

Ejemplo 3

La supresión por Tat es mediada por los AReg

La supresión específica de antígenos mediada por Tat es mediada a través de la activación trans-(intracelular) de un macrófago CD14 FasL (Figura 8). En ratones, Tat induce la tolerancia inmunitaria a nivel de los linfocitos T y se mantiene durante al menos seis semanas después del tratamiento inicial en las condiciones demostradas en la FIG.

6. Una población de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) enriquecida en monocitos por centrifugación Percoll se cultivó durante cuatro días en un medio que contenía suero de ternera fetal al 5% (fCs, Control), Tat (50 nM) o LPS (100 ng/mL). Las células recogidas se tiñeron doblemente con un anticuerpo monoclonal (Mab) anti-FasL tratado con fluoresceína (anti-fl1), (aFasL-FITC, Nok 1, BD Pharmingen) y con un Mab marcado con rodamina anti-CD14 (aCD14fl2, BD Biosciences), siendo CD14 un determinante específico de los macrófagos (MO). Las células se analizaron por FACScan (Becton Dickinson) para la activación (dispersión directa), la expresión de CD14 (R2, porcentaje de los MO) y para la inducción de FasL (MFI). La población de linfocitos T (R1) era CD14- y no expresaba FasL. Se obtuvieron resultados similares con las células recogidas después de 2, 3, 5 o 6 días de cultivo como para las PBMC recogidas en el día cuatro.

En células humanas, los macrófagos activados por Tat son reguladores de macrófagos APC (AReg) inmunosupresores y reguladores (Figura 9). Para definir la vía de la inmunosupresión por Tat, a través de la inducción de FasL en el macrófago, dando como resultado la pérdida de respuestas de recuerdo de linfocitos T auxiliares, se usaron ensayos de proliferación de linfocitos T con antígenos de recuerdo, antagonistas de Tat y FasL. En la Figura 9A PBMC humanas de un individuo se cultivaron por triplicado durante 5 días en un medio (no mostrado), antígeno tetánico (Ag, 0.3 Lf/mL), antígeno con la adición adicional de Tat 50 nM (Ag+Tat) o Ag con Tat 50 nM y proteína sFas recombinante (25 pg/mL) para bloquear FasL superficial expresado en macrófagos (Ag+Tat+sFas). Se añadió timidina tritiada durante las últimas 18 horas, y los resultados se representan gráficamente como índice de estimulación (valor medio de las cpm del cultivo estimulado/valor medio de las cpm del medio de control). Los resultados son representativos de tres experimentos similares. A bajas concentraciones de Tat (50 nM), la inmunosupresión inducida por Tat no solo se revirtió por completo por la adición de Fas soluble, sino que en estas condiciones, Tat se volvió realmente estimulante (141% en relación con el tratamiento con antígeno solo). Figura 9B: Proliferación de PBMC cultivadas durante 6 días con antígeno de tetánico o de Candida (Ag), en comparación con cultivos en los que Tat (Ag+Tat, 125 nM) o Tat (125 nM) y el anticuerpo anti-Fas antagonista, ZB4 (también se añadieron 250 pg/mL, Upstate Biotechnology (Ag+Tat+aFas). Los resultados son representativos de tres experimentos similares.

Ejemplo 4

Bioensayo in vitro para la diferenciación de monocitos

El bioensayo con Tat de monocitos ultrasensibles in vitro se usa para evaluar la actividad inmunosupresora o inmunoestimuladora de las proteínas Tat descritas en la presente memoria. Este ensayo utiliza células monocíticas de nueva aportación sustancialmente purificadas procedentes de sangre periférica humana usando procedimientos de enriquecimiento en gradiente de densidad estándares u otros protocolos de aislamiento de células conocidos en la técnica. Los monocitos sustancialmente purificados se lavan y luego se cultivan en RPMI-1640 suplementado con FBS al 10% a 37°C.

El bioensayo con Tat con monocitos ultrasensibles in vitro se realiza usando un control positivo (FasL, compuesto inductor) y un control negativo (no se añade compuesto activo al cultivo). Los controles positivos adecuados adicionales incluyen, pero sin limitación, lipopolisacárido (LPS) y/o factor de necrosis tumoral (TNF-a) a una concentración final de 100 ng/mL y 50 ng/mL, respectivamente. Las muestras de ensayo (preparaciones de Tat) se procesan a concentraciones finales de 50 pM a 50nM e incluyen Tat, ox-Tat y otros derivados y mutantes de Tat. Las muestras de ensayo y los controles se mezclan individualmente con monocitos sustancialmente puros sembrados a una densidad de 106 células/mL en tubos de fondo redondo que contienen RPMI-1640 con FBS al 10% (en presente memoria denominado colectivamente cultivos de ensayo). Los cultivos de ensayo se incuban luego durante un período de tiempo adecuado, preferiblemente de cinco a seis días, a 37°C, en un entorno de CO2 al 5%. Al final del período de incubación, las células se retiran de cada cultivo de ensayo y la presencia de cualquier expresión de FasL inducida (para medir la diferenciación en los AReg) o la expresión de CD86 (para la diferenciación en células dendríticas) se detecta mediante tinción con anticuerpos anti-FasL o anti-CD86 y agentes de detección fluorescentes apropiados. Después de que los cultivos se han teñido, la fluorescencia se detecta usando un sistema clasificador de células activado por fluorescencia (FACS). La tinción de control se realiza usando el sistema de detección fluorescente solo y se resta de la tinción específica anti-FasL o anti-CD86 observada en los cultivos de ensayo. Cuanto mayor es el porcentaje de células positivas para FasL en un cultivo de ensayo dado, más inmunosupresora es la muestra de ensayo en el cultivo de ensayo. Por el contrario, si el cultivo de ensayo contiene un predominio de células positivas para CD86, se identifica que la muestra de ensayo es inmunoestimuladora. Los controles negativos siempre deben permanecer no reactivos con los anticuerpos y el control positivo debe estar dentro de los intervalos predeterminados.

Ejemplo 5

Síntesis de derivados de Tat

Se ensamblaron péptidos sintéticos por química Fmoc estándar usando un sintetizador automático CS336X (C S Bio Co., Menlo Park, CA). Los péptidos se escindieron de la resina usando un cóctel de escisión/desprotección con ácido trifluoroacético compatible con la presencia de siete cisteínas. La purificación se realizó usando HPLC en fase inversa. El producto final se liofilizó a partir de H2O/acetonitrilo. Una porción de cada síntesis se marcó con Alexa-488. Todos los derivados sintéticos de Tat alcanzaron una pureza> 95%. Los péptidos sintéticos se reconstituyeron en tampón de fosfato en presencia de ditiotreitol 0,1 mM antes de su uso.

Ejemplo de referencia 6

Actividad in vitro de derivados de Tat

Se cultivaron monocitos humanos durante 24-28 horas con un derivado de Tat (SEQ ID NO: 7, Nani-P2), (Figura 10) o lipopolisacárido (LPS) (Figura 11) y las células se lavaron y se tiñeron con CD86 marcado fluorescente. El derivado de Tat estimuló una mayor expresión de CD86 que ISS (TLR) o LPS.

Ejemplo 7

Obtención de imágenes en células vivas de derivados de Tat en linfocitos T y líneas celulares monocíticas Se mantuvo una línea celular Jurkat (Clon E6-1, American Type Culture Collection) en RPMI-1640 (GIBCO), FBS al 10% inactivado por calor (GIBCO), 50 U de penicilina/50 pg/mL de estreptomicina (GIBCO) y L-lutamina 2 mM (GIBCO) a 37°C en CO2 al 5%. Se mantuvieron células U937 (American Type Culture Collection) en RPMI-1640 (GIBCO), FBS inactivado por calor al 10%, 50 U de penicilina, 50 pg/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM (GIBCO), HEPES 10 mM (GIBCO y p-mercaptoetanol al 0,005% (Sigma-Aldrich) a 37°C en CO2 al 5%

Se incubaron un millón de células Jurkat o U937 vivas en un medio de cultivo completo durante 60-120 minutos a 37°C en CO2 al 5%, con o sin adición del derivado de Tat sintético marcado con Alexa-488 5 pM. Las células se lavaron en PBS que contenía FBS inactivado por calor al 0,1%, EDTA 1 mM, y se tiñeron con un colorante para células vivas NucBlue de HOECHST (Molecular Probes) añadiendo 2 gotas/mL a la suspensión celular. Las células se mantuvieron en hielo hasta que se obtuvo la imagen de células vivas.

Las células se colocaron en platos con fondo de vidrio (MatTek Corp.) y se tomaron imágenes en un microscopio Zeiss Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss) usando una lente objetivo Plan-Neofluor 100x/1.3. Se usaron LED (Colibri; Carl Zeiss) a 365 nm y 470 nm para excitar el DNA teñido con HOESCHT y la proteína marcada con Alexa-488. La emisión se recogió con filtros de fluorescencia DAPI y FITC estándares. Se tomaron imágenes de fluorescencia y contraste de fases con una cámara CCD enfriada con Orca ER (Hamamatsu Photonics).

Los resultados, representados en la FIG. 12 y 13 demuestran la capacidad de los derivados de Tat sintéticos para entrar en los linfocitos T y en las líneas celulares monocíticas in vitro. Los linfocitos T Jurkat (FIG, 12) y los monocitos U937 (FIG. 13) tratados con derivados Tat marcados con Alexa-488 muestran la absorción celular y la localización nuclear de proteínas marcadas fluorescentemente, destacando la aplicación de estas moléculas como péptidos penetrantes en células dotados de la capacidad de ser localizados dentro y alrededor del núcleo.

Ejemplo 8

Clasificación de células activadas por fluorescencia de células tratadas con derivados de Tat

Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana se aislaron de la sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad con medio de separación Histopaque utilizando un tubo de centrífuga ACCUSPIN™ (Sigma-Aldrich). Se establecieron cultivos de PbMC en RPMI-1640, suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, 50 U penicilina/ 50 pg/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM hasta una densidad celular de 1x106 células/mL en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Las PBMC se incubaron sin estímulo, en presencia 1 pg/mL de LPS (Sigma-Aldrich), 100 ng /mL de TNF-a (Peprotech), o 1 pg/mL de derivado de Tat sintético (SEQ ID NO: 9) a 37°C en CO2 al 5%. Después de 3-5 días, las células se recogieron, se lavaron y se tiñeron con un anticuerpo monoclonal conjugado con aloficocianina (APC) anti-CD14 humano de ratón (clon M5E2, BD Biosciences) o con un anticuerpo monoclonal conjugado con fluoresceína (FITC) anti-ligando Fas humano de ratón (clon SB93a, Southern Biotech). Se añadió yoduro de propidio para evaluar la viabilidad antes de que se realizara la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) en un citómetro de flujo BD LSR II (BD Biosciences). Los resultados, representados en las FIG. 14-17 demuestran la capacidad de los derivados de Tat para estimular y aumentar CD14 y FasL en la superficie celular en las PBMC humanas in vitro en relación con controles no estimulados por ACS lo que indican la presencia de las células AReg capaces de suprimir una respuesta inmunitaria de linfocitos T.

Como conclusión, debe entenderse que, aunque los aspectos de la presente memoria se resaltan haciendo referencia a realizaciones específicas, una persona experta en la técnica apreciará fácilmente que estas realizaciones divulgadas son solo ilustrativas de los principios de la materia objeto de la presente memoria. Por lo tanto, debe entenderse que la materia objeto descrita no está limitada de ninguna manera a una metodología, protocolo y/o reactivo particular, etc., descritos en la presente memoria.

En la presente memoria se describen ciertas realizaciones de la presente invención, que incluyen el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Por supuesto, las variaciones en estas realizaciones descritas serán evidentes para las personas expertas en la técnica al leer la descripción anterior. Los inventores esperan que las personas expertas empleen tales variaciones según sea apropiado, y los inventores piensan que la intención de que la presente invención sea practicada de otra manera que la específicamente descrita en la presente memoria. En consecuencia, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia objeto descrita en las reivindicaciones adjuntas, según lo permitido por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de las realizaciones descritas anteriormente en todas sus variaciones posibles está incluida en la invención a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o que el contexto lo contradiga claramente

Las agrupaciones de realizaciones, elementos o etapas alternativos de la presente invención no deben interpretarse como limitaciones. Cada miembro del grupo puede ser citado y reivindicado individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo descritos en la presente memoria. Se anticipa que uno o más miembros de un grupo pueden ser incluidos o eliminados de un grupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se produce dicha inclusión o eliminación, se considera que la memoria descriptiva contiene el grupo modificado, cumpliendo así la descripción escrita de todos los grupos Markush utilizados en las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan una característica, elemento, cantidad, parámetro, propiedad, término, etc. utilizados en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" significa que la característica, elemento, cantidad, parámetro, propiedad o término así calificado abarca un intervalo de más o menos diez por ciento por encima y por debajo del valor de la característica, elemento, cantidad, parámetro, propiedad o término indicados. En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la memoria y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar. Como mínimo, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada indicación numérica debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos citados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo ordinarias. A pesar de que los intervalos numéricos y los valores que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los intervalos numéricos y los valores establecidos en los ejemplos específicos se facilitan con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier intervalo o valor numérico contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de ensayos. La cita de intervalos numéricos de valores en la presente memoria solo pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor numérico separado que está dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en esta memoria, cada valor individual de un intervalo numérico se incorpora a la presente memoria como si se mencionara individualmente en ella.

Los términos "un", "una", "unos", "unas" "el", "la", "las”, "los" y referentes similares utilizados en el contexto de la descripción de la presente invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse en su significado preciso, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o claramente contradicho por el contexto. Todos los métodos descritos en la presente memoria pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente memoria tiene la intención de iluminar mejor la presente invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención reivindicada de otra manera. Ningún lenguaje en la presente memoria debe interpretarse como que indica cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria pueden estar limitadas adicionalmente en las reivindicaciones utilizando en el lenguaje "que consiste en" o "que consiste esencialmente en". Cuando se usa en las reivindicaciones, ya sea como presentado o añadido por enmienda, el término de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en las reivindicaciones. El término de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y a los que no afectan materialmente a las características básicas y nuevas. Las realizaciones de la presente invención así reivindicadas se describen inherente o expresamente y se permiten en la presente memoria.

Todas las patentes, publicaciones de patentes y otras publicaciones a las que se hace referencia e identifican en la presente memoria tienen el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las composiciones y metodologías descritas en dichas publicaciones que podrían usarse en conexión con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe interpretarse como una admisión de que los inventores no están facultados a anteceder a dicha descripción en virtud de una invención previa o por cualquier otro motivo. Todas las declaraciones sobre la fecha o la representación del contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido derivado del trans-activador de la transcripción (Tat) inmunosupresor, comprendiendo el polipéptido derivado de Tat una secuencia de aminoácidos que comprende los siguientes dominios en el orden indicado: un dominio del factor de transcripción (TF), un dominio rico en cisteína y un dominio C-terminal, en donde la secuencia de aminoácidos comprende la SEQ ID NO: 9.

2. El polipéptido derivado de Tat inmunosupresor de la reivindicación 1, que comprende además un dominio rico en arginina procedente de una proteína Tat lentiviral.

3. El polipéptido derivado de Tat inmunosupresor de la reivindicación 1, en donde el Tat lentiviral es de HIV-1, HIV-2, SIV, SIV o EIAV.

4. El polipéptido derivado de Tat inmunosupresor de la reivindicación 1, en donde el dominio de TF comprende además una secuencia repetida que comprende (PVDPRLEPWKHPGSQP)n en el extremo N, en donde n = 2-10.

5. Una composición farmacéutica que comprende uno o más de un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor de acuerdo con la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. Un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor para uso en el tratamiento de una enfermedad, caracterizada por respuestas inmunitarias anómalas en un sujeto que lo necesita; en donde el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor es al menos 85% idéntico al polipéptido derivado de Tat inmunosupresor de la reivindicación 1, y en donde la administración del polipéptido derivado de Tat inmunosupresor trata la enfermedad suprimiendo el sistema inmunitario del sujeto, en donde la enfermedad caracterizada por respuestas inmunitarias anómalas es una enfermedad seleccionada de: una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurodegenerativa o una enfermedad asociada a la inflamación en donde la enfermedad asociada a la inflamación es: un acné, un reflujo ácido/acidez estomacal, una alergia, una rinitis alérgica, una enfermedad de Alzheimer, una apendicitis, una arteritis, una artritis, un asma, una ateroesclerosis, un trastorno autoinmunitario, una balanitis, una blefaritis, una bronquiolitis, una bronquitis, una bursitis, un cáncer, una carditis, una enfermedad celíaca, una celulitis, una cervicitis, una colangitis, una colecistitis, una corioamnionitis, una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), una cirrosis, una colitis, una conjuntivitis, una cististis, un resfriado común, una dacrioadenitis, una demencia, una dermatitis, una dermatomiositis, un eczema, un enfisema, una encefalitis, una endocarditis, una endometritis, una enteritis, una enterocolitis, una epicondilitis, una epididimitis, una fascitis, una fibrositis, una gastritis, una gastroenteritis, una gingivitis, una glomerulonefritis, una glositis, una enfermedad cardíaca, una hepatitis, una hidrosadenitis supurante, una presión arterial alta, una ileitis, una resistencia a la insulina, una cistitis intersticial, una iritis, una cardiopatía isquémica, una queratitis, una queratoconjuntivitis, una laringitis, un lupus, una mastitis, una mastoiditis, una meningitis, un síndrome metabólico (síndrome X), una migraña, una esclerosis múltiple, una mielitis, una miocarditis, una miopatía, una miositis, un nefritis, una neuropatía, una obesidad, una onfalitis, una ooforitis, una orquitis, una osteocondritis, una osteopenia, una osteoporosis, una osteitis, una otitis, una pancreatitis, una enfermedad de Parkinson, una parotitis, una enfermedad inflamatoria pélvica, una pericarditis, un peritonitis, una faringitis, una flebitis, una pleuritis, una neumonitis, una proctitis, una prostatitis, una psoriasis, una pulpitis, una pielonefritis, una pileflebitis, una fiebre reumática, una rinitis, una salpingitis, una sialadenitis, una sinusitis, un colon espástico, una estomatitis, una sinovitis, una tendonitis, una tendinosis, una tenosinovitis, una tromboflebitis, una amigdalitis, una trigonitis, un tumor, una uretritis, una uveítis, una vaginitis, una vasculitis o una vulvitis.

7. Un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad autoinmunitaria es una encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), una enfermedad de Addison, una alergia, rinitis alérgica, una enfermedad de Alzheimer, un síndrome de anticuerpo antifosfolípido (APS), una artritis, un asma, un síndrome de deficiencia autoinmunitaria, una anemia hemolítica autoinmunitaria, una hepatitis autoinmunitaria, una enfermedad autoinmunitaria del oído interno, un penfigoide ampolloso, una enfermedad celíaca, una enfermedad de Chagas, una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), una diabetes mellitus tipo 1 (IDDM), un eczema, una endometriosis, un trastorno gastrointestinal, un síndrome de Goodpasture, una enfermedad de Graves, un síndrome de Guillain-Barré (GBS), una tiroiditis de Hashimoto, una hidrosadenitis supurante, una púrpura trombocitopénica idiopática, una enfermedad intestinal inflamatoria, una enfermedad dermatológica inflamatoria, una cistitis intersticial, un lupus, una morfea, una esclerosis múltiple (MS), una miastenia grave, una miopatía, una narcolepsia, un neuromiotonía, un pénfigo vulgar, una anemia perniciosa, una cirrosis biliar primaria, una psoriasis, una encefalomielitis diseminada recurrente, una fiebre reumática, una esquizofrenia, una esclerodermia, un síndrome de Sjogren, un trastorno de la piel, una tenosinovitis, una uveítis, una vasculitis o un vitiligo.

8. Un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, amiloidosis, esclerosis lateral amiotrófica, ansiedad, ataxia telangiectasia, trastornos por déficit de atención, enfermedad de Canavan, lesiones del sistema nervioso central, enfermedad de Charcot Marie Tooth, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, depresión, encefalitis (por ejemplo, bacteriana, parasitaria, fúngica o viral), ataxia de Friedreich, demencia frontotemporal, paraparesia espástica hereditaria, síndrome de Guillain-Barré (y sus variantes neuropatía axonal motora aguda, polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda y síndrome de Fisher), complejo de demencia por HIV/AIDS, enfermedad de Huntington, daño isquémico al sistema nervioso, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph, meningitis (por ejemplo, bacteriana, parasitaria, fúngica o viral), esclerosis múltiple, atrofia multisistémica, traumatismo neuronal, por ejemplo, daño cerebral percusivo, lesión de la médula espinal y daño traumático del sistema nervioso, una neuropatía, tal como por ejemplo, neuropatía inducida por quimioterapia, neuropatía asociada a diabetes y neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, trastornos por priones, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, esquizofrenia, enfermedad de Schilder, atrofias espinocerebelosas, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, accidente cerebrovascular, tabes dorsal o demencia vascular.

9. Un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor causa además la reducción de al menos un síntoma asociado con la enfermedad, y en donde el síntoma es inflamación, fatiga, mareos, malestar, fiebre elevada y temperatura corporal alta, sensibilidad extrema al frío en manos y pies, debilidad y rigidez en músculos y articulaciones, cambios de peso, problemas digestivos o gastrointestinales, presión arterial baja o alta, irritabilidad, ansiedad o depresión, infertilidad o disminución del deseo sexual (baja libido), cambios de azúcar en la sangre, y donde la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, un aumento en el tamaño de un órgano o tejido, o la destrucción de un órgano o tejido, dependiendo del tipo de enfermedad autoinmunitaria.

10. Un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor se administra en una pluralidad de dosis.

11. Un polipéptido derivado de Tat inmunosupresor para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polipéptido derivado de Tat inmunosupresor se administra diariamente, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o bimensualmente.