CN116348123A - 樟芝酸h及其衍生物用于治疗中枢神经系统疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

提供了一种治疗受试者的中枢神经系统(CNS)疾病的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的樟芝酸H和/或其衍生物。还提供了樟芝酸H和/或其衍生物的新用途。

Description

樟芝酸H及其衍生物用于治疗中枢神经系统疾病的用途
本申请要求2020年9月29日提交的美国临时申请序列号63/084,969的权益，其公开通过引用全文并入本文中。
背景技术
技术领域
本公开一般地涉及治疗受试者的中枢神经系统的方法，且更特别地涉及治疗受试者的神经退化性疾病如亨廷顿舞蹈症和/或三核苷酸重复障碍(trinucleotide repeatdisorder)的方法。
相关技术的描述
亨廷顿舞蹈症(HD)是一种常染色体显性神经退化性疾病，其在临床上的表现为进行性不随意动作障碍、痴呆和最终死亡[1]。这是由位于人类4号染色体短臂(4p63)上的亨廷顿(Htt)基因外显子1中的CAG三核苷酸扩展所引起的。当CAG重复数超过36时，所翻译的含多谷氨酰胺(polyQ)-的Htt蛋白[突变体Htt(mHtt)]干扰许多细胞蛋白的正常功能，并随后损害重要的细胞机制[2]。polyQ扩展的突变体Htt的异常累积也导致神经元、星形胶质细胞、耳蜗神经元和许多不同类型的外周细胞的细胞核中的聚集体形成[3]。
突变体Htt已知促进蛋白质错误折叠，且因此抑制蛋白酶体活性的作用，使转录失调、损害突触功能、提高氧化应激、使轴突退化和最终导致神经退化和神经元丧失[3]。皮质-纹状体末端大量释放谷氨酸以及神经元存活的受损据信造成了触发HD的初始症状的纹状体神经变性。黑质-纹状体途径的功能失调也造成纹状体兴奋性毒性。总之，由突变体Htt诱导的神经元退化主要发生于非纹状体脑区域(例如皮层和黑质)中[4,5]，并导致运动障碍、痴呆和最终死亡[1,6]。
除了神经元失调外，代谢异常是HD的另一个重要标志[7]。在几种HD小鼠模型中和在HD患者中观察到了高血糖和葡萄糖代谢异常[8]。其他几种代谢途径(例如，胆固醇生物合成和尿素循环代谢)中的缺陷也充分证明[9,10]。能量代谢的缺陷被提议为许多神经性障碍的重要致病因素。近来，能量不足呈现为HD中的重要致病因素[7]。在几种转基因小鼠模型中，已报告高血糖和胰岛素的减少[8]。在几种HD小鼠模型以及HD患者中也观察到与葡萄糖代谢相关的异常蛋白质表达[8]。尽管HD的研究近来受到许多关注，但用于治愈HD的非常有限的有效治疗仍是不可得的。
到目前为止，没有现有技术参考文献报导樟芝酸H(Antcin H)在HD治疗中的效果。本公开使用细胞实验(体外)证明樟芝酸H是NLRP3炎性体(inflammasome)的良好抑制剂，且因此可用于治疗中枢神经系统疾病，如脑血管疾病(缺血性中风和出血性中风)、神经退化性疾病(阿尔兹海默症、亨廷顿舞蹈症和帕金森氏症)、多发性硬化症和抑郁症[15,16,17]。
参考文献：
1.Martin JB,Gusella JF:Huntington's disease.Pathogenesis andmanagement.N Engl J Med 1986,315:1267-1276.
2.Group.THsDCR:A novel gene containing a trinucleotide repeat that isexpanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.The Huntington'sDisease Collaborative Research Group.Cell 1993,72:971-983.
3.Li H,Li SH,Yu ZX,Shelbourne P,Li XJ:Huntingtin aggregate-associatedaxonal degeneration is an early pathological event in Huntington's diseasemice.J Neurosci 2001,21:8473-8481.
4.Gil JM,Rego AC:Mechanisms of neurodegeneration in Huntington'sdisease.Eur J Neurosci 2008,27:2803-2820.
5.Estrada Sanchez AM,Mejia-Toiber J,Massieu L:Excitotoxic neuronaldeath and the pathogenesis of Huntington's disease.Arch MedRes 2008,39:265-276.
6.Vonsattel JP,Myers RH,Stevens TJ,Ferrante RJ,Bird ED,Richardson EP,Jr.:Neuropathological classification of Huntington'sdisease.J Neuropathol ExpNeurol 1985,44:559-577.
7.Pratley RE,Salbe AD,Ravussin E,Caviness JN:Highersedentary energyexpenditure in patients with Huntington's disease.AnnNeurol 2000,47:64-70.
8.Hurlbert MS,Zhou W,Wasmeier C,Kaddis FG,Hutton JC,FreedCR:Micetransgenic for an expanded CAG repeat in the Huntington'sdisease gene developdiabetes.Diabetes 1999,48:649-651.
9.Subhramanyam CS,Wang C,Hu Q,Dheen ST.Microglia-mediatedneuroinflammation in neurodegenerative diseases.Semin Cell Dev Biol 2019,94:112-120.
10.Siew JJ,Chen HM,Chen HY,Chen HL,Chen CM,Soong BW,Wu YR,Chang CP,Chan YC,Lin CH,Liu FT,Chern Y.Galectin-3 isrequired for the microglia-mediated brain inflammation in a model ofHuntington's disease.Nat Commun2019,10(1):3473.
11.Mangan MSJ,Olhava EJ,Roush WR,Seidel HM,Glick GD,Latz E.Targetingthe NLRP3 inflammasome in inflammatory diseases.Nat Rev Drug Discov 2018,17(8):588-606.
12.Guo H,Callaway JB,Ting JP.Inflammasomes:mechanism ofaction,role indisease,and therapeutics.Nat Med 2015,21(7):677-687.
13.Tschopp J,Schroder K.NLRP3 inflammasome activation:Theconvergenceof multiple signalling pathways on ROS production？NatRev Immunol 2010,10(3):210-215.
14.Ju TC,Chen HM,Lin JT,Chang CP,Chang WC,Kang JJ,SunCP,Tao MH,Tu PH,Chang C,Dickson DW,Chern Y.Nucleartranslocation of AMPK-alpha1 potentiatesstriatal neurodegeneration inHuntington's disease.J Cell Biol 2011,194(2):209-227.
15.Heneka,M.T.,McManus,R.M.&Latz,E.Inflammasome signalling in brainfunction and neurodegenerative disease.Nat Rev Neurosci 19,610-621(2018).
16.Song L,Pei L,Yao S,Wu Y and Shang Y(2017)NLRP3Inflammasome inNeurological Diseases,from Functions to Therapies.Front.Cell.Neurosci.11:63.
17.Shao B-Z,Cao Q and Liu C(2018)Targeting NLRP3Inflammasome in theTreatment of CNS Diseases.Front.Mol.Neurosci.11:320.
在本文内所提及的所有公开出版物、专利和专利申请通过引用全文并入，达到如同各单个公开出版物、专利和专利申请具体并单独地表明通过引用全文并入的程度。
发明内容
本公开涉及治疗受试者的中枢神经系统(CNS)疾病的新方法。
根据一个实施方案，该方法包括向受试者施用治疗有效量的樟芝酸H和/或其衍生物。
在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物或人类。
在一些实施方案中，所述中枢神经系统疾病包括脑血管疾病、神经退化性疾病、多发性硬化症和抑郁症。
在一些实施方案中，所述神经退化性疾病为亨廷顿舞蹈症(HD)，且所述受试者具有Htt基因中的突变，且表现出至少一种HD的症状。
在一些实施方案中，所述樟芝酸H和/或其衍生物为天然衍生的或合成的。
在一些实施方案中，所述樟芝酸H和/或其衍生物的治疗有效量范围为约0.001mg/kg/天至约500mg/kg/天。
在一些实施方案中，所述樟芝酸H和/或其衍生物通过至少一种选自以下的途径施用于所述受试者：肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、口服、吸入、直肠、局部、口腔、舌下和经皮。
在一些实施方案中，所述樟芝酸H和/或其衍生物用作NLRP3炎性体的抑制剂。
根据另一个实施方案，提供了樟芝酸H和/或其衍生物的用途。樟芝酸H和/或其衍生物用于制备治疗CNS疾病的药物。
在一些实施方案中，所述药物每天多于一次、至少每天一次、至少每周一次或至少每月一次施用于受试者。
根据替代实施方案，提供了一种包装。该包装包括包含一个或多个单位剂量的药物组合物，每个这种单位剂量包含0.001-500mg樟芝酸H和/或其衍生物，及药物组合物用于治疗患有CNS疾病的受试者的使用说明。
根据替代实施方案，提供了一种药物组合物。该药物组合物包含一个或多个单位剂量，每个这种单位剂量包含0.001-500mg樟芝酸H和/或其衍生物，其用于治疗患有CNS疾病的受试者。
本发明的一个或是多个实施方案的细节在以下说明中阐述。本发明的其他特征或优势从以下几个实施方案的详细说明以及从附加权利要求是清楚的。
附图说明
图1显示在HD细胞模型中，樟芝酸H(AH)防止细胞死亡并减少氧化应激。图1A：STHdhQ7和ST HdhQ109细胞用或不用5或10μM樟芝酸H处理24小时。所示细胞的数据针对未处理的ST HdhQ7细胞的那些数据标准化；图1B：ST HdhQ7和ST HdhQ109细胞用或不用5或10μM樟芝酸H处理24小时。
图2显示樟芝酸H(AH)显著降低HD转基因小鼠模型的疾病进展。R6/2小鼠或野生型(WT)小鼠从7周龄开始到12周龄每天通过口服灌胃用AH(10mg/kg体重)或溶媒治疗。测量了：图2A：体重；图2B：旋转棒性能(rotarod performance)；图2C：存活率；图2D：紧握评分(clasping score)。
图3显示樟芝酸H(AH)在HD转基因小鼠模型中抑制神经元死亡和突变亨廷顿蛋白(mHtt)聚集。图3A：通过共焦显微镜分析小鼠纹状体中神经元的数量(通过NeuN的表达确定；绿色)和突变亨廷顿蛋白的水平(红色)。细胞核用Hoechst染色(蓝色)。图3B：直方图显示了纹状体神经元的数量；图3C：直方图显示了mHtt的累积强度；图3D：总裂解产物从12周龄的小鼠脑收集，并通过蛋白质印迹评估NeuN蛋白表达水平；图3E：通过过滤延迟试验(filter retardation assay)分析纹状体裂解产物中mHtt聚集物的水平。
图4显示樟芝酸H(AH)降低了R6/2小鼠的小神经胶质细胞中的NLRP3表达。图4A：通过Iba1染色(绿色)确定纹状体中激活小神经胶质细胞的数量，且通过NLRP3染色(红色)确定纹状体中NLRP3阳性细胞的数量。细胞核用Hoechst染色(蓝色)。双重染色的小神经胶质细胞用箭头标记；图4B：与WT小鼠相比，在溶媒处理的R6/2小鼠中纹状体区域的NLRP3阳性细胞数量显著增加，并且在R6/2小鼠中细胞也通过AH处理减少。
图5显示樟芝酸H减少BV2小神经胶质细胞中的炎症。图5A：通过ELISA测量上清液中的IL-1β水平；图5B：通过蛋白质印迹测量细胞裂解产物中iNOS和NLRP3的水平。
图6显示樟芝酸H抑制巨噬细胞中的NLRP3炎性体。图6A：J774A.1巨噬细胞用或不用1μg/ml LPS处理5小时，然后用或不用樟芝酸H处理0.5小时。细胞然后通过5mM ATP激活0.5小时；图6B：J774A.1巨噬细胞用或不用1μg/ml LPS处理5小时，然后用或不用50μM樟芝酸H处理0.5小时。细胞然后通过5mM ATP激活0-60分钟。
在以下详细说明中，为了解释的目的，阐述了许多具体细节以提供对所公开实施方案的透彻理解。然而，显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下实施一个或多个实施方案。在其他情况下，为了简化附图，示意性地显示出公知的结构和装置。
具体实施方式
如下文更详细地描述的，本发明涉及用于治疗受试者的中枢神经系统(CNS)疾病的化合物、组合物、方法、包装等等。
本文所用的术语“受试者”指的是任何从治疗和/或诊断获益的动物。受试者的非限制性实例包括哺乳动物，例如灵长动物(人类、猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在具体实施例中，受试者为人类。
本文所用的术语“治疗”或“处理”指的是预防、减少、改善、消除、延迟疾病进展、延迟疾病发作和/或减轻疼痛。治疗或处理可进一步包括延长患有CNS疾病的受试者的存活时间，或是延长易患CNS疾病的个体的存活时间。
包含本公开的组合的药物组合物通常包含一种或多种载体或赋形剂及任选地其他治疗成分，载体在与配方的其他成分相容并且对其接受者生理上无害的意义上一般是“可接受的”。这类载体或赋形剂是已知的，例如，填充剂、润滑剂、粘合剂和用于液体制剂的各种液体赋形剂。合适的载体包括本文引用的参考文献中公开的那些。
优选地，本公开的组合为单位剂量形式，例如片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、无菌肠胃外溶液或悬浮液、定量气雾剂或液体喷雾、滴剂、安瓿、自动注射器装置或栓剂；用于口服、肠胃外、鼻内、舌下、直肠施用，或者用于通过吸入或吹入施用。或者，组合可以以适合每周一次或每月一次施用的形式存在。可设想含有活性成分的易蚀聚合物。为了制备固体组合如片剂，主要的活性成分与药物载体混合，例如常规压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其他稀释剂，例如水，以形成含有本发明化合物或其盐、衍生物或组合物的均匀混和物的固体预制剂组合。当将这些预制剂组合称为均质时，意味着该成分均匀地分散在整个组合中，使得该组合可轻易地细分成同等有效的单位剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊。新型组合的片剂或丸剂可以包衣，或者另外复合以提供发挥长效作用的优势的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内剂量和外剂量组分，后者是前者的包覆层的形式。这两种组分可被用于抵抗胃中的崩解及允许内部组分完整地进入到十二指肠中或延迟释放的肠溶层分开。多种材料可用于这类肠溶层或包衣，这类材料包括多种聚合酸及聚合酸与其他材料如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。
适合的组合物包括本公开组合的水性或油性溶液，适合肠胃外递送活性成分的组合物包括水性和非水性组合物，其中活性成分溶解或悬浮在溶液中。适合肠胃外施用的组合物包括可能含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂或溶质(其使得制剂与预期接受者的血液等渗)的水性和非水性无菌注射液。其他肠胃外组合物可包含水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。
当CNS疾病为亨廷顿舞蹈症(HD)时，可通过一个或多个HD的指标(包括分子标志物或疾病症状)缺乏可测量的变化或该指标的改善来指示疾病进展的延迟。HD指标的改善可包括不存在不希望的变化，或存在希望的变化。治疗或处理可以指任何一种明显的HD症状的减少和/或改善，包括但不限于精神、心理认知或身体运动障碍。非限制性的HD症状包括但不限于痴呆或精神障碍(范围从冷漠和易怒到双相或精神分裂症样障碍)、身体运动障碍(包括舞蹈病)、运动机能减退、认知障碍、运动表现(包括四肢的弹跳动作)、顿挫的步态、运动保持困难、鬼脸、共济失调和/或肌张力不全。应理解由本文公开的方法、化合物、组合物和试剂盒导致的任何临床上有益的效果都被认为涵盖在本发明中。
如本文所用的“患CNS疾病的受试者”指的是患有CNS疾病的受试者。在一个实例中，患有CNS疾病的受试者接受例如健康专业人员如医生的CNS疾病的诊断。相关诊断测试是本领域已知的且包括但不限于用来确定亨廷顿蛋白基因中突变的存在的基因测试、神经学检查和脑成像。
如本文所用的“易患CNS疾病的受试者”指的是基于基因测试和/或家族史很可能发生CNS疾病的受试者。
樟芝酸H是源自药用真菌牛樟芝(Antrodia cinnamomea)的天然三萜。樟芝酸H的化学结构如下：
Figure BDA0004149645960000091
樟芝酸H具有各种衍生物，包括但不限于樟芝酸A、樟芝酸B、樟芝酸C、樟芝酸D、樟芝酸E、樟芝酸F和樟芝酸K。樟芝酸H的衍生物可用下式表示：
Figure BDA0004149645960000092
其中R1是＝O或OH；R2是H或OH；R3是H、＝O、OH或O-乙酰基；R4是H或OH；R5是H；R6是H或OH；和R7是＝O或OH。天然衍生的或合成的樟芝酸H和/或其衍生物均可用于本公开。
施用樟芝酸H的途径的实例包括肠胃外(例如，皮下、肌肉内、皮内或是静脉内)、口服、吸入(以固体和液体形式)、直肠、局部、口腔(例如，舌下)和经皮施用，虽然任何给定情况中最合适的途径可能取决于所治疗病症的性质和严重性，以及所使用的樟芝酸H、其衍生物或其药学上可接受的盐的特定形式的性质。
适合于口服施用的本公开组合物制备为离散的单元，如胶囊、扁囊、香口胶或片剂，其各自含有预定量的低极性部分的樟芝酸H和/或其衍生物；为粉末或颗粒；为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或为水包油液体乳液或油包水液体乳液。
用于直肠施用的组合物可以具有适合基质的栓剂形式呈现。
适于肺内或鼻施用的组合物具有例如在0.01至200微米范围内的颗粒大小(包括以0.1微米如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、30微米、35微米等的增量在0.01至500微米范围内的颗粒大小)，其通过鼻道吸入或通过口吸入以到达各种支气管或肺泡囊来施用。适用于气溶胶或干粉施用的制剂可根据常规方法来制备，并且可与其他治疗剂一起递送。
适合经皮施用的组合物可以透皮贴片形式呈现。透皮贴片为患者提供基线或稳态的尼古丁水平。在使用期间由贴片释放的低极性部分的樟芝酸H和/或者其衍生物的总量根据使用者的体型、尼古丁接触史及对治疗的反应而变化。贴片的大小根据待递送的尼古丁的量变化。
包含本发明组合的组合物以单位剂量或多剂量容器的形式呈现，例如密封的安瓿和小瓶，且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，其仅需在使用前即时添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液由前面所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。优选的单位剂量制剂是本文中所描述的包含每日剂量或每日单位亚剂量的那些。
如本文所用的术语“药品包装”限定一系列的一个或多个单位剂量的药物组合物，任选地容纳在共同外包装内。在包含两种或更多种化合物/药剂组合的药品包装中，单个化合物/药剂可能是单一或非单一制剂。单位剂量可容纳在泡罩包装内。药物包装可任选地进一步包括使用说明。
以下的材料和方法在本公开中实施：
HD的细胞模型
条件性永生化的表达内源性正常htt的野生型ST HdhQ7纹状体神经元祖细胞(称为野生型纹状体细胞)，和表达具有109个谷氨酰胺的突变体htt的来自纯合ST HdhQ109敲入小鼠的纯合突变体ST HdhQ109纹状体神经元祖细胞(称为突变体纹状体细胞)。ST HdhQ7和STHdhQ109细胞由Dr.Elena Cattaneo和Marta Valenza(意大利米兰大学药理学系和干细胞研究中心)惠赠。这些细胞在33℃的培养室中保持在补充10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中。
细胞存活分析
ST HdhQ7和ST HdhQ109细胞用5或10μM樟芝酸H或溶媒(DMSO)处理24小时。通过CCK-8试验定量ST HdhQ7和ST HdhQ109细胞存活力。所指示细胞的存活率相对于溶媒处理的STHdhQ7细胞存活率标准化。
细胞内ROS分析
ST HdhQ7和ST HdhQ109细胞在10μM细胞内ROS指示剂荧光探针CM-H2DCFDA(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregon,USA)存在下用5或10μM樟芝酸H或溶媒(DMSO)处理1小时。通过使用荧光读板仪(Fluoroskan Ascent；Thermo Electron Corporation，Woburn，MA，USA)检测荧光强度(激发/发射：488nm/510nm)来测量细胞内ROS(反应性氧物质)水平。J774A.1巨噬细胞用或不用1μg/ml LPS处理5小时，然后用或不用50μM樟芝酸H处理0.5小时。然后细胞通过5mM ATP激活0-60分钟。细胞内ROS的水平通过CM-H2DCFDA染色测量并通过荧光读板仪检测。
小鼠运动协调能力试验及体重和寿命的测量
R6/2小鼠或野生型小鼠从7周龄开始到12周龄每日通过口服灌胃用樟芝酸H(10mg/kg体重)或溶媒处理。小鼠每周三次在旋转棒装置上进行测试。运动协调使用旋转棒装置试验〔UGO BASILE，Comerio，Italy〕以恒定速度(12rpm)在2分钟内评估。每周监测体重和寿命。
mHtt聚集试验(过滤延迟试验)
脑组织在冰冷的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl、0.25％脱氧胆酸钠、1％ Triton X-100、150mM NaCl、1mM苯甲基磺酰氟、1mM Na3VO4、0.5mg/mL抑肽酶、0.1mM亮抑酶肽和4mM胃酶抑素)中悬浮并均质化，与2％ SDS混合，并通过狭槽歧管(Bio-Rad，Irvine，CA，USA)施加于OE66膜过滤器(0.2mm孔大小；Whatman Schleicher and Schuell,Middlesex,UK)上。印迹用PBS中的5％脱脂乳封闭，并在4℃下与抗EM48抗体(1:500；Millipore BioscienceResearch Reagents，Temecula，CA，USA)一起孵育过夜，然后在RT下与相应的二抗孵育1小时。免疫反应性条带将通过ECL(Pierce,Rockford,IL,USA)检测并使用Kodak XAR-5胶片记录。
免疫组织化学染色
此方法是根据之前的报告[14]。简而言之，在4℃下将脑切片与抗Iba-I多克隆抗体(1:500)、抗NeuN多克隆抗体(1:500)、抗NLRP3单克隆抗体(1:200)或抗EM48单克隆抗体(1:500)在含5％正常山羊血清的PBS中孵育过夜，然后在室温下与相应的二抗孵育2小时。细胞核用Hoechst 33258染色。加载载玻片并用激光共焦显微镜分析。
小神经胶质细胞和巨噬细胞的激活
BV2小神经胶质细胞用或不用1μg/ml LPS处理5小时，然后用或不用1或5μM樟芝酸H处理0.5小时。细胞然后通过1mM ATP激活24小时。通过ELISA测量上清液中的IL-1β水平，和通过蛋白质印迹测量细胞裂解产物中的iNOS和NLRP3水平。J774A.1巨噬细胞用或不用1μg/ml LPS处理5小时，然后用或不用樟芝酸H处理0.5小时。细胞然后通过5mM ATP激活0.5小时。通过ELISA测量上清液中的IL-1β水平。
统计分析
结果表示为一式三份样品的平均值±SEM。每个实验至少重复3次以确认结果的可重现性。使用单因素方差分析(ANOVA)分析多个组，然后进行事后Student-Newman-Keuls检验。p值<0.05被认为是显著的。
实施例1：樟芝酸H在HD细胞模型中防止细胞死亡并减少氧化应激
为了研究樟芝酸H在CNS疾病中的神经保护潜力，本实施例使用纹状体细胞系作为亨廷顿舞蹈症的体外模型。ST HdhQ109细胞携带polyQ扩展的小鼠基因Htt，其在Htt基因中编码109个CAG重复序列。与ST HdhQ109细胞相比，对照细胞系(ST HdhQ7)仅携带7个拷贝的CAG重复序列。
图1显示HD细胞模型中细胞存活和细胞内ROS实验的结果。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM。图表中的标记“a”表示ST HdhQ7和ST HdhQ109细胞之间的特定比较p<0.05。图表中的标记“b”表示与未处理细胞相比p<0.05。
实验显示用樟芝酸H处理显著阻止ST HdhQ109细胞死亡，因为5-μM和10-μM樟芝酸H处理的细胞显示出比溶媒处理的细胞更高的存活率(图1A)。使用CCK-8试验测定细胞存活，此外，氧化应激已被证明是HD中细胞损伤的主要原因。ST HdhQ109细胞中的细胞内反应性氧物质(ROS)水平高于ST HdhQ7细胞中的ROS水平(图1B)。通过二氢二氯荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)染色测量细胞内ROS。明显地，樟芝酸H显著降低ST HdhQ109细胞中的细胞内ROS水平(图1B)。这些结果表明樟芝酸H通过其抗氧化活性部分地防止ST HdhQ109细胞死亡。
实施例2：樟芝酸H显著降低HD转基因小鼠模型的疾病进展
为了研究樟芝酸H在亨廷顿舞蹈症病理发生中的治疗性潜力，R6/2小鼠被用作HD的动物模型。R6/2小鼠或野生型小鼠从7周龄开始到12周龄每天通过口服灌胃用樟芝酸H(10mg/kg体重)或溶媒处理。图2显示HD转基因小鼠模型的疾病进展。WT-溶媒：n＝10；WT-AH：n＝10；R6/2-溶媒：n＝8；R6/2-AH：n＝10。数据表示为平均值±SEM。图表中的标记“a”表示WT和R6/2小鼠之间p<0.05。图表中的标记“b”表示与R6/2-溶媒相比p<0.05。
体重每周监测，并表示为小鼠的健康状态。据发现溶媒处理的R6/2小鼠的体重从8周龄到12周龄逐渐下降，相反，用樟芝酸H处理的R6/2小鼠显示较高的每周体重增加(图2A)。为评估樟芝酸H在R6/2小鼠中对运动能力(例如平衡和肌肉耐力)的影响，小鼠每周三次在旋转棒装置上进行测试。溶媒处理的R6/2小鼠的旋转棒性能从8周龄开始逐渐下降。重要的是，在樟芝酸H处理的R6/2小鼠中观察到增加的跌倒潜伏时间(latency to fall)(图2B)。此外，据现樟芝酸H处理的R6/2小鼠在12周龄时具有100％存活率，这与野生型小鼠相同；然而，25％的溶媒处理的R6/2小鼠在12周龄时死亡(图2C)。此外，发现樟芝酸H显著减弱R6/2小鼠的紧握行为，因为在12周龄时，樟芝酸H处理的R6/2小鼠的紧握评分与溶媒处理的R6/2小鼠低(图2D)。这些结果表明，樟芝酸H显著减少HD转基因小鼠模型的疾病进展。
实施例3：在HD转基因小鼠模型中樟芝酸H抑制神经元死亡和突变体亨廷顿蛋白聚集
本实施例通过免疫荧光染色进一步研究樟芝酸H对R6/2小鼠脑的神经元死亡的影响。图3显示樟芝酸H(AH)抑制HD转基因小鼠模型中的神经元死亡和突变体亨廷顿蛋白(mHtt)聚集。R6/2小鼠或WT小鼠从7周龄开始到12周龄每天通过口服灌胃用AH(10mg/kg体重)或溶媒处理。WT-溶媒：n＝6；WT-AH：n＝6；R6/2-溶媒：n＝6；R6/2-AH：n＝6。数据表示为平均值±SEM。图表中的标记“a”表示WT和R6/2小鼠之间p<0.05。图表中的标记“b”表示与溶媒处理的R6/2小鼠相比p<0.05。
共焦显微镜图像显示，与野生型小鼠相比，溶媒处理的R6/2小鼠的脑中神经元细胞数量减少，表明R6/2小鼠脑中的神经元死亡增加(图3A和3B)。值得注意的是，与溶媒处理的R6/2小鼠相比，樟芝酸H处理的R6/2小鼠脑中的神经元细胞数量显著增加(图3A和3B)。樟芝酸H的神经元细胞增加效应通过增加脑中NeuN蛋白(神经元核抗原和神经元分化标志物)的表达来证实(图3D)。此外，与野生型小鼠相比，溶媒处理的R6/2小鼠的纹状体中的突变体亨廷顿蛋白聚集显著增加(图3A和3C)。值得注意的是，樟芝酸H的口服施用减少了R6/2小鼠纹状体中的突变体亨廷顿蛋白聚集(图3A、3C、3E)。使用抗HTT抗体检测保留在过滤器上的不溶性聚集物。这些结果表明，樟芝酸H减少了HD转基因小鼠模型中的神经元死亡和突变体亨廷顿蛋白聚集。
实施例4：樟芝酸H降低R6/2小鼠的小神经胶质细胞中的NLRP3表达。
HD通常与神经系统中的炎症和活化的小神经胶质细胞相关。为了研究樟芝酸H的抗炎性潜能，进行纹状体的免疫荧光染色以检测Iba-1(在激活的小神经胶质细胞中上调的蛋白质)的表达水平。据发现与WT小鼠相比，溶媒处理的R6/2小鼠中Iba-1阳性细胞的数量增加。图4显示樟芝酸H降低R6/2小鼠的小神经胶质细胞中的NLRP3表达。R6/2小鼠或WT小鼠从7周龄开始到12周龄每天通过口服灌胃用AH(10mg/kg体重)或溶媒处理。WT-溶媒：n＝6；WT-AH：n＝6；R6/2-溶媒：n＝6；R6/2-AH：n＝6。数据表示为平均值±SEM。图表中的标记“a”表示WT和R6/2小鼠之间p<0.05。图表中的标记“b”表示与溶媒处理的R6/2小鼠相比p<0.05。
与溶媒处理的R6/2小鼠相比，樟芝酸H处理的R6/2小鼠中Iba-1阳性细胞的数量减少(图4A)。此外，NLRP3炎性体在炎性反应和神经退化性疾病的发病机理中发挥重要作用。据发现与WT小鼠相比，在溶媒处理的R6/2小鼠中纹状体区域的NLRP3阳性细胞的数量显著增加(图4B)。重要的是，樟芝酸H处理显著减少R6/2小鼠中NLRP3阳性细胞的数量(图4A和4B)。
实施例5：樟芝酸H减少BV2小神经胶质细胞中的炎症
小神经胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞样免疫细胞。已经证明由小神经胶质细胞的活化失调引起的神经炎症促进了各种神经退化性疾病如亨廷顿舞蹈症、阿尔兹海默症和帕金森氏症的发病[9](Subhramanyam等,2019)。另外，过表达的IL-1β(NLRP3炎性体的终产物)在许多疾病(包括神经退化性疾病)的发展中起着重要作用[10](Siew等，2019)。由NLRP3、ASC和半胱天冬酶-1组成的NLRP3炎性体控制IL-1β的成熟和释放。NLRP3炎性体可以通过医学相关刺激如来自损伤组织的ATP和阿尔兹海默症的淀粉样蛋白-β激活[11](Guo等,2015)。图5A显示樟芝酸H减少LPS激发的BV2小神经胶质细胞中ATP诱导的IL-1β表达，表明樟芝酸H抑制BV2小神经胶质细胞中的NLRP3炎性体。BV2小神经胶质细胞用或不用1μg/mlLPS处理5小时，然后用或不用1或5μM樟芝酸H处理0.5小时。细胞然后通过1mM ATP激活细胞24小时。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM。图表中的标记“a”表示与LPS+ATP处理的细胞相比p<0.05。
另外，樟芝酸H降低LPS和ATP激活的BV2小神经胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和NLRP3的表达水平(图5B)。这些结果表明樟芝酸H减少BV2小神经胶质细胞中的炎症。
实施例4和5证明了樟芝酸H是NLRP3炎性体的良好抑制剂，且因此可用于治疗中枢神经系统疾病，如脑血管疾病(缺血性中风和出血性中风)、神经退化性疾病(阿尔兹海默症、亨廷顿舞蹈症和帕金森氏症)、多发性硬化症和抑郁症[15,16,17]。
实施例6：樟芝酸H降低巨噬细胞中的IL-1β表达和ROS产生。
NLRP3炎性体激活的巨噬细胞过度产生IL-1β促进炎性障碍，例如神经退化性疾病[12](Mangan等,2018)。据发现ATP在LPS激发的巨噬细胞中诱导显著的IL-1β分泌，并且这一效应被樟芝酸H以剂量依赖性的方式抑制(图6A)。上清液中的IL-1β水平通过ELISA测量。
另外，ROS是NLRP3炎性体激活的关键元件之一[13](Tschopp和Schroder,2010)。为了确定樟芝酸H对IL-1β分泌的抑制是否通过抑制ATP诱导的ROS产生而发生，LPS激发的巨噬细胞在ATP刺激之前与樟芝酸H一起孵育。据发现樟芝酸H显著减少ATP诱导的ROS产生(图6B)。细胞内ROS的水平通过CM-H2DCFDA染色测量，并在微孔板吸光度仪上在488nm的激发波长和510nm的发射波长下检测。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM。图表中的标记“a”表示与LPS+ATP处理的细胞相比p<0.05。这些数据表明樟芝酸H通过降低巨噬细胞中的ROS产生来抑制NLRP3炎性体。
对本领域技术人员显而易见的是可对所公开的实施方案进行各种修正和变化。预期的是规格和实施例仅为示例性的，本公开的真实范围由以下权利要求和其对应物来决定。

Claims (16)

1.一种治疗受试者的中枢神经系统(CNS)疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的樟芝酸H和/或其衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述受试者为人类。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述中枢神经系统疾病包括脑血管疾病、神经退化性疾病、多发性硬化症和抑郁症。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述神经退化性疾病是亨廷顿舞蹈症(HD)，并且所述受试者具有Htt基因中的突变且表现出至少一种HD的症状。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述樟芝酸H和/或其衍生物为天然衍生的或合成的。
7.如权利要求1所述的方法，其中樟芝酸H和/或其衍生物的所述治疗有效量范围为约0.001mg/kg/天至约500mg/kg/天。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述樟芝酸H和/或其衍生物通过选自以下的至少一种途径方式施用于所述受试者：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、口服、吸入、直肠、局部、口腔、舌下和经皮。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述樟芝酸H和/或其衍生物用作NLRP3炎性体的抑制剂。
10.樟芝酸H和/或其衍生物在制备用于治疗CNS疾病的药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述CNS疾病包括脑血管疾病、神经退化性疾病、多发性硬化症和抑郁症。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述神经退化性疾病包括亨廷顿舞蹈症(HD)。
13.如权利要求10所述的用途，其中所述药物中所述樟芝酸H和/或其衍生物的治疗有效量范围为约0.001mg/kg/天至约500mg/kg/天。
14.如权利要求10所述的用途，其中所述药物一天多于一次、至少一天一次、至少一周一次或至少一月一次施用于受试者。
15.一种包装，其包含：
a)包含一个或多个单位剂量的药物组合物，每个这种单位剂量包含0.001-500mg的樟芝酸H和/或其衍生物；和
b)使用所述药物组合物治疗患有CNS疾病的受试者的使用说明。
16.一种包含一个或多个单位剂量的药物组合物，每个这种单位剂量包含0.001-500mg的樟芝酸H和/或其衍生物，其用于治疗患有CNS疾病的受试者。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023215227A1 (en) * 2022-05-02 2023-11-09 Epicentrx, Inc. Systems and methods to improve exercise tolerance

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI494109B (zh) * 2012-08-24 2015-08-01 Taiwan Antitumor Biotech Co Ltd 樟芝酸衍生物與抗癌藥物組合用於治療和／或預防腫瘤
ES2748423T3 (es) * 2012-12-06 2020-03-16 Pin Pharma Inc Tratamiento de trastornos inflamatorios, autoinmunitarios y neurodegenerativos con polipéptidos derivados de Tat inmunosupresores
TWI598104B (zh) * 2014-11-28 2017-09-11 Use of Antrodia cinnamomea extract to improve side effects of chemotherapy
CN104606260B (zh) * 2014-12-25 2018-01-30 恩扬生物科技股份有限公司 牛樟芝子实体萃取物用于改善化疗副作用的用途
CN105311036B (zh) * 2015-11-26 2017-11-21 中国农业大学 樟芝酸h在防治药物性肝损伤中的应用
US20180318199A1 (en) * 2017-05-03 2018-11-08 Taiwan Leader Biotech Corp. Pharmaceutical Composition Having Anti-Aging Properties against High-Glucose

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