TWI494109B - 樟芝酸衍生物與抗癌藥物組合用於治療和／或預防腫瘤 - Google Patents

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Description

樟芝酸衍生物與抗癌藥物組合用於治療和/或預防腫瘤
本發明涉及一種抑制和/或治療腫瘤的組合和方法。特地言之，本發明提供一種抗腫瘤藥物與樟芝酸(antcin)或其衍生物、鹽或組合物的組合，用於抑制和/或治療腫瘤。
儘管近來醫學進展，但癌症仍然是最常見和致命的疾病之一。癌症的發病率在生命期內隨衰老而增加(“終生風險”)。咸信其他風險因素包括遺傳、飲食和環境暴露(例如暴露於致突變化學物(mutagenic chemical)、輻射、轉化病毒等)。癌症是用以描述各自以特定類型細胞的不受控制生長為特徵的多種疾病的術語。其開始於含有此種細胞的組織，並且癌症如果在診斷時未曾蔓延到任何其他組織，那麼可以透過例如手術、輻射或另一類型的局部治療來治療。然而，當有癌症已從其來源組織轉移的跡象時，典型地會使用不同治療方法。實際上，因為不可能測定轉移程度，所以當檢測到任何蔓延跡象時，通常進行全身性治療方法。這些方法涉及投與干擾快速分裂細胞(如癌細胞)生長的化學治療藥物。
例如，原發性肝細胞癌(在下文中可以稱為“肝癌”)最通常在慢性肝炎向肝硬化的發展之後出現。已確診許多病毒性肝炎和肝硬化患者，並且近年來肝癌的發病率漸增。肝癌已用例如肝切除術、經皮局部治療(例如射頻消融治療或乙醇注射治療)、經導管肝動脈栓塞術 (transcatheter hepatic arterial embolization，TAE)、連續動脈輸注化學治療或放射治療來治療。另一實例是乳癌，小葉原位癌和乳腺管原位癌是分別在小葉和乳腺管中出現但未曾蔓延到乳房周圍的脂肪組織或蔓延到身體的其他區域的乳癌。浸潤性(或侵襲性)小葉和乳腺管癌是分別在小葉和乳腺管中出現並且已蔓延到乳房的脂肪組織和/或身體的其他部分的癌症。其他乳癌包括髓樣癌、膠樣癌、管狀癌和發炎性乳癌。可用於乳癌患者的治療是手術、免疫治療、放射治療、化學治療、內分泌治療或其組合。若干化學治療劑用於治療癌症，包括烷基化劑、抗代謝物拮抗劑、抗癌抗生素和植物衍生的抗癌劑。然而，大多數用於癌症化學治療中的細胞毒性藥物具有狹窄的化學治療效用並且在高劑量下具有嚴重副作用。
植物和蕈類是用於發現和開發新穎天然衍生的治療癌症的藥劑的有價值資源。樟芝(Taiwanofungus camphoratus ，亦稱為Ganoderma comphoratum 、Antrodia cinnamomea 或Antrodia camphorate )稱為牛樟芝(niu-chang-chih)或牛樟菇(niuchang-ku)，且寄主植物牛樟(niu-chang)為牛樟樹(Cinnamomum kanehirai )的中國通用名，其在臺灣為瀕危物種。傳統上，樟芝用作食物、酒精和藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚發癢和肝癌的中國療法。三萜系化合物是樟芝的主要組分。三種三萜系化合物，即樟芝酸A、樟芝酸B和樟芝酸C，是麥角甾烷型類似物並且從樟芝的子實體(fruiting body)分離。樟芝酸A和樟芝酸C具有針對反應性氧物質的有效免疫調節作用。Yun-Chih Hsieh等人進一步報導，樟芝酸A、樟芝酸C和樟芝酸A甲酯可以選擇性抑制人類癌細胞而不是正常細胞的增殖(Yun-Chih Hsieh等人，“Methyl Antcinate A from Antrodia camphorate Induces Apoptosis in Human Liver Cancer Cells through Oxidant-Mediated Cofilin-and Bax-Triggered Mitochondrial Pathway,Chem.Res.Toxicol.,2010,23,第 1256-1267頁)。
然而，需要一種相對低毒性並且有效的治療和/或預防腫瘤和抑制腫瘤生長的方法；具體而言，需要另外改善通常與全身性化學治療相關的毒性。
本發明提供一種包含抗腫瘤藥物以及樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物的組合，其中所述樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物的量可減少所述抗腫瘤藥物的量並且對正常細胞提供低細胞毒性。
本發明還提供一種對個體的腫瘤具選擇性的情況下抑制和/或治療腫瘤的方法，其包含向個體投與有效量的本發明的組合。
本發明驚訝地發現，抗腫瘤藥物與樟芝酸或其酯衍生物、鹽或組合物組合在抑制腫瘤細胞方面提供出乎意料的功效，同時使正常細胞維持在高生存力下。另外，鑒於樟芝酸或其酯衍生物、鹽或組合物在輔助療法中起一定作用的事實，所述抗腫瘤藥物在化學療法中的量可通過組合地使用樟芝酸或其酯衍生物、鹽或組合物而減少。此外，包含樟芝酸或其酯衍生物、鹽或組合物以及抗腫瘤藥物的本發明的組合可選擇性抑制腫瘤細胞。
圖1顯示分別用50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml的5FU處理的HepG2細胞的細胞存活率。“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05，並且“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖2顯示分別用200μg/ml 5FU以及5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml的樟芝酸A處理的HepG2細胞的細胞存活率。“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05，並且“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖3顯示分別用100μg/ml 5FU以及5μg/ml、10μg/ml、15 μg/ml、20μg/ml和25μg/ml的樟芝酸A處理的HepG2細胞和CCD-966SK細胞的細胞存活率。“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖4顯示用200μg/ml 5FU、100μg/ml 5FU和100μg/ml 5FU以及25μg/ml樟芝酸A處理的正常細胞株CCD-966SK的細胞存活率。“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05，並且“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖5顯示用10μg/ml的樟芝酸A和不同濃度的5FU處理的HepG2和CCD-966SK的細胞存活率。“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖6顯示用他莫昔芬(tamoxifen)處理的HepG2細胞的細胞存活率。“*”表示統計顯著性檢驗中的P值小於0.01；並且“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖7顯示分別用3.13μg/ml他莫昔芬以及5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml的樟芝酸A處理的HepG2細胞的細胞存活率。“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05，並且“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖8顯示用3.13μg/ml TAM和3.13μg/ml TAM以及15μg/ml樟芝酸A處理的正常細胞株CCD-966SK的細胞存活率。“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05。
圖9顯示用10μg/ml的樟芝酸A和不同濃度的TAM處理的HepG2和CCD-966SK的細胞存活率。“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖10顯示用舒尼替尼(sunitinib)處理的HepG2細胞和CCD-966SK的細胞存活率。“*”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.01，並且“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05。
圖11顯示用10μg/ml的樟芝酸A和不同濃度的舒尼替尼處理的HepG2和CCD-966SK的細胞存活率。“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05，並且“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖12顯示用米托蒽醌(mitoxantrone)處理的HepG2和CCD-966SK細胞的細胞存活率。“*”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.01；“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05；並且“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
圖13顯示用10μg/ml的樟芝酸A和不同濃度的米托蒽醌處理的HepG2和CCD-966SK的細胞存活率。“**”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.05，並且“***”表示統計顯著性檢驗中的p值小於0.001。
除非另外定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解相同的含義。儘管任何類似或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料均可以用於實施或測試本發明，但對較佳的方法和材料加以描述。出於本發明目的，下文定義下列術語。
術語“一個(種)(a/an)”指代一個(種)或一個(種)以上(即，至少一個(種))的主題物件。
術語“治療(treat)”、“治療(treatment)”、“治療(treating)”意指減少患者所經歷的癌症症狀的頻率、程度、嚴重度和/或持續時間。
術語“預防(prevent)”、“預防(prevention)”、“預防(preventing)”意指抑制或避免與癌症相關的症狀。
術語“減輕(alleviate)”、“減輕(alleviation)”或“減輕(alleviating)”意指減小疾病、病症或病狀的一種或一種以上症狀的嚴重度。
術語“鹽”是指維持游離堿的生物有效性和性質的鹽，且其通過與無機或有機酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲烷磺酸、乙 烷磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、蘋果酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸等)發生反應而獲得。
術語“有效量”意指在低毒性情況下有效抑制或治療和/或預防癌症的本發明的組合的量。舉例來說，本發明的組合的有效量可減少癌細胞數目；減小腫瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上減緩且優選地中止)癌細胞浸潤到外周器官中；抑制(即，至少在一定程度上減緩且優選地中止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；促進細胞凋亡；和/或在一定程度上緩解與病症相關的一種或一種以上症狀。
術語“個體”應理解為動物，通常為哺乳動物，如靈長類動物(人類、猿、長臂猿、黑猩猩、猩猩、獼猴)、家養動物(狗和貓)、家畜(馬、牛、山羊、綿羊、豬)和實驗動物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。個體包括動物疾病模型(例如易患腫瘤小鼠、負載腫瘤小鼠或接受異種移植物腫瘤的小鼠)。
術語“腫瘤”在本文中用於包括(但不限於)起源於乳房、前列腺、結腸、肺、胰臟、肝臟、胃、膀胱或生殖道(子宮頸、卵巢、子宮內膜等)、腦和骨髓的腫瘤、黑色素瘤、或淋巴瘤。
術語“抑制腫瘤細胞生長”在本文中用於意指以下中的一者或一者以上：減緩腫瘤細胞生長、使腫瘤細胞生長停止、引起腫瘤細胞減少或消退、抑制腫瘤侵襲、引起腫瘤細胞死亡以及引起癌轉移的減少或消退。
在一方面，本發明提供了一種組合，其包含抗腫瘤藥物以及樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物，其中樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物的量可減少抗腫瘤藥物的量且對正常細胞提供低細胞毒性。
樟芝乙醇萃取物和從其分離的樟芝酸或其衍生物可透過誘導腫瘤細胞的細胞凋亡而選擇性抑制腫瘤細胞，但對正常細胞呈現低毒性，由此樟芝乙醇萃取物和從其分離的樟芝酸或其衍生物可用作抵抗 腫瘤的藥劑或用於化學療法。
樟芝酸是從樟芝的子實體分離的麥角甾烷型三萜系化合物，其具有下式：
其中R1 為=O或OH；R2 為H或OH；R3 為H、=O、OH或O-乙醯基；R4 為H或OH；R5 為H；R6 為H或OH；且R7 為=O或OH。
樟芝酸的實例包括樟芝酸A(4α-甲基麥角甾-8,24(28)-二烯-3,11-二酮-26-酸)、樟芝酸B(2-甲基-3-亞甲基-6-[(4S)-4,10,13-三甲基-3,7,11-三氧代-1,2,4,5,6,12,14,15,16,17-十氫環戊二烯並[a]菲-17-基]庚酸)、樟芝酸C(4a甲基麥角甾-8,24(28)-二烯-3,11-三酮-7P-26-酸)、樟芝酸D(4,14-羥基-4α-甲基-3,7,11-三氧代-麥角甾-8,24(28)-二烯-26-酸)、樟芝酸E(5,3,11-二氧代-4α-甲基麥角甾-8,14,24(28)-三烯-26-酸)、樟芝酸F(6,3,11-二氧代-7β-羥基-4α-甲基麥角甾-8,14,24(28)-三烯-26-酸)、樟芝酸H(3α,12α-二羥基-4α-甲基麥角甾-8,24(28)-二烯-7,11-二酮-26-酸)和樟芝酸K(4,7-二甲基乙氧基-5-甲基-1,3-苯並間二氧雜環戊烯)。樟芝酸A-K的化學式如下：
樟芝酸A(4α-甲基麥角甾-8,24(28)-二烯-3,11-二酮-26-酸)是本發明的組合中所用的一個較佳實施例且具有如下結構式：
樟芝酸的鹽包括鹼加成鹽。酸性的本發明樟芝酸可與鹼(如鹼金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉和氫氧化鉀；鹼土金屬氫氧化物，例如氫 氧化鈣、氫氧化鋇和氫氧化鎂)、有機鹼(例如N-甲基-D-葡糖胺、膽鹼三(羥甲基)胺基-甲烷、L-精氨酸、L-離氨酸、N-乙基呱啶、二苯甲基胺等)形成鹽(包括醫藥學上可接受的鹽)。與鹼形成的特定鹽包括苄星(benzathine)鹽、鈣鹽、二乙醇胺鹽、葡甲胺鹽、醇胺鹽、鉀鹽、普魯卡因(procaine)鹽、鈉鹽、緩血酸胺(tromethamine)鹽和鋅鹽。在一個實施例中，樟芝酸酯衍生物包括(但不限於)烷基樟芝酸、烯基樟芝酸、炔基樟芝酸。樟芝酸酯較佳為樟芝酸A C1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸B C1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸C C1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸D C1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸E C1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸F C1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯、樟芝酸H C1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯和樟芝酸K C1-8烷基(如甲基、乙基、丙基和丁基等)酯。樟芝酸酯較佳為樟芝酸A甲酯、樟芝酸B甲酯、樟芝酸C甲酯、樟芝酸G甲酯、樟芝酸H甲酯、樟芝酸A乙酯或樟芝酸B乙酯；其化學式如下：
在另一實施例中，樟芝酸的組合物是含有樟芝酸的樟芝的萃取物。樟芝酸或其衍生物包括於樟芝的萃取物中。一個較佳實施例是樟芝乙醇萃取物的低極性沖提物。根據本發明，樟芝乙醇萃取物的低極性沖提物可通過以下方式獲得：用正己烷萃取樟芝，使用呈多種比率的甲醇和乙酸乙酯的混合物作為流動相用矽膠色譜法洗脫所得乙醇萃取物，且收集低極性沖提物。
根據本發明的一個實施例，樟芝可呈粉末或溶液形式。根據本發明，低極性沖提物可通過高效液相色譜法(HPLC)、製備型HPLC或半製備型HPLC進一步純化，從而獲得保留時間在23分鐘到35分鐘的沖提物。保留時間優選地在約24分鐘到33分鐘，約27到33分鐘，或約28分鐘到33分鐘，保留時間更優選在約28分鐘到29分鐘。根據本發明的一個更優選實施例，進一步純化所得沖提物以獲得樟芝酸。
根據本發明，抗腫瘤藥物包括(但不限於)：a)具有抗有絲分裂作用的藥物，尤其是靶向細胞骨架元件的藥物，包括微管調節劑，如紫杉醇(taxol)藥物(如紫杉醇、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel))、足葉草毒素(podophylotoxin)或長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新堿(vincristine)或長春堿(vinblastine))；b)抗代謝藥物(如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5FU)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)；嘌呤類似物，如噴司他丁(pentostatin)或甲氨蝶呤methotrexate))；c)烷基化劑或氮芥(nitrogen mustard)(如鉑藥物(順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)或帕拉尼素(paraplidineatin))、亞硝基脲(nitrosourea)、環磷醯胺(cyclophosphamide)或異環磷醯胺(ifosfamide))；d)靶向DNA的藥物， 如蒽環黴素(antracycline)藥物、阿黴素(adriamycin)、小紅莓(doxorubicin)、表阿黴素(pharmorubicin)或表柔比星(epirubicin)；e)靶向拓撲異構酶的藥物，如喜樹鹼(camptothecin)、依託泊苷(etoposide)、米托蒽醌(mitoxantrone)、小紅莓；f)激素或激素激動劑或拮抗劑，如雌激素、抗雌激素(他莫昔芬(tamoxifen)和相關化合物)和雄激素、氟他胺(flutamide)、亮丙瑞林(leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)、環丙孕酮(cyproterone)或奧曲肽(octreotide)；g)靶向腫瘤細胞中信號轉導的藥物，包括抗體衍生物，如賀癌平(herceptin)；h)酪氨酸激酶抑制劑，如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)和埃羅替尼(erlotinib)和舒尼替尼(sunitinib)；i)潛在影響腫瘤的癌轉移的藥物，如基質金屬蛋白酶抑制劑；j)基因療法和反義試劑；和k)抗體治療劑。抗癌藥物較佳為具有抗有絲分裂作用的藥物、抗有絲分裂藥物、抗代謝藥物、烷基化劑或氮芥、靶向DNA的藥物、靶向拓撲異構酶的藥物或激素拮抗劑。更佳地，具有抗有絲分裂作用的藥物是紫杉醇(taxol)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、紫杉德(taxotere)、多烯紫杉醇(docetaxel)、足葉草毒素(podophylotoxin)、長春新鹼(vincristine)或長春鹼(vinblastine)；抗代謝藥物為5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、吉西他濱、噴司他丁或甲氨蝶呤(methotrexate)；烷基化劑或氮芥為順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、帕拉尼素、亞硝基脲、環磷醯胺或異環磷醯胺；靶向DNA的藥物為阿黴素、小紅莓、表阿黴素或表柔比星；靶向拓撲異構酶的藥物為喜樹堿、依託泊苷、米托蒽醌或小紅莓；激素或激素激動劑或拮抗劑為雌激素、他莫昔芬、雄激素、氟他胺(flutamide)、亮丙瑞林、戈舍瑞林、環丙孕酮或奧曲肽；靶向腫瘤細胞中信號轉導的藥物是賀癌平；且酪氨酸激酶抑制劑是伊馬替尼、吉非替尼和埃羅替尼或舒尼替尼。更佳地，具有抗有絲分裂作用的藥物是太平洋紫杉醇、紫杉德或多烯紫杉醇；抗代謝藥物為5FU；烷基化劑或氮芥為順 鉑、卡鉑或環磷醯胺；靶向DNA的藥物為小紅莓；靶向拓撲異構酶的藥物為喜樹堿、米托蒽醌或小紅莓；抗雌激素為他莫昔芬；且酪氨酸激酶抑制劑是舒尼替尼。最佳地，具有抗有絲分裂作用的藥物是太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇；抗代謝藥物為5FU；烷基化劑或氮芥為順鉑或卡鉑；靶向DNA的藥物為小紅莓；靶向拓撲異構酶的藥物為米托蒽醌；抗雌激素為他莫昔芬；且酪氨酸激酶抑制劑是舒尼替尼。
在一個實施例中，本發明提供一種組合，其包含抗有絲分裂藥物、抗代謝藥物、烷基化劑、氮芥、靶向DNA的藥物、拓撲異構酶抑制劑、激素拮抗劑或酪氨酸激酶抑制劑以及樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物。所述組合較佳地包含太平洋紫杉醇、紫杉德、多烯紫杉醇、5FU、順鉑、卡鉑、環磷醯胺、小紅莓、喜樹鹼、米托蒽醌、他莫昔芬或舒尼替尼以及樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物。在另一實施例中，本發明提供一種組合，其包含5-FU、他莫昔芬、米托蒽醌或舒尼替尼以及樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物。
在一些實施例中，樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物的量可減少抗腫瘤藥物的量且對正常細胞提供低細胞毒性。樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物以及抗腫瘤藥物的量較佳在以下範圍內：分別為約0.5%(w/w)到約95%(w/w)和約99.5%(w/w)到約5%(w/w)，分別為約2%(w/w)到約90%(w/w)和約98%(w/w)到約10%(w/w)，分別為約4%(w/w)到約90%(w/w)和約96%(w/w)到約10%(w/w)，分別為約2%(w/w)到約85%(w/w)和約98%(w/w)到約15%(w/w)，分別為約2%(w/w)到約25%(w/w)和約98%(w/w)到約75%(w/w)，分別為約55%(w/w)到約90%(w/w)和約45%(w/w)到約10%(w/w)，分別為約10%(w/w)到約80%(w/w)和約90%(w/w)到約20%(w/w)，分別為約15%(w/w)到約70%(w/w)和約85%(w/w)到約30%(w/w)，分別為約20%(w/w)到約80%(w/w)和約80%(w/w)到約20%(w/w)，分別為約 20%(w/w)到約70%(w/w)和約80%(w/w)到約30%(w/w)，分別為約20%(w/w)到約60%(w/w)和約80%(w/w)到約40%(w/w)，分別為約20%(w/w)到約50%(w/w)和約80%(w/w)到約50%(w/w)，分別為約30%(w/w)到約80%(w/w)和約70%(w/w)到約20%(w/w)，分別為約30%(w/w)到約70%(w/w)和約70%(w/w)到約30%(w/w)，分別為約30%(w/w)到約60%(w/w)和約70%(w/w)到約40%(w/w)，分別為約40%(w/w)到約80%(w/w)和約60%(w/w)到約20%(w/w)，分別為約40%(w/w)到約70%(w/w)和約60%(w/w)到約30%(w/w)以及分別為約50%(w/w)到約80%(w/w)和約50%(w/w)到約20%(w/w)。
包含本發明的組合的醫藥調配物通常將包含一種或一種以上載劑或賦形劑和任選地其他治療成分。在與調配物的其他成分相容以及對其接受者生理學上無害的意義上，載劑一般將為“可接受的”。所述載劑或賦形劑為已知的，例如填充劑、潤滑劑、黏合劑和用於液體調配物的多種液體賦形劑。適合的載劑包括本文中引用的參考文獻中所公開的載劑。
本發明的組合較佳呈單位劑型形式，如錠劑、丸劑、膠囊、粉末、顆粒、無菌胃腸外溶液或懸浮液、計量式氣霧劑或液體噴霧劑、滴劑、安瓿、自動噴射裝置或栓劑；用於口服、胃腸外、鼻內、舌下或直腸投與，或用於通過吸入或吹入的投予。或者，組合可以適於每週一次或每月一次投予的形式存在。可考慮含有活性成分的易蝕聚合物。對於製備固體組合(如錠劑)來說，將主要活性成分與醫藥載劑(例如常規錠劑成分，如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠)和其他稀釋劑(例如水)混合，從而形成含有本發明的化合物或其鹽、衍生物或組合物的均勻混合物的固體預調配組合。當提及這些預調配組合為均勻時，意指成分遍及組合均勻分散，以使組合可易於再分為等效的單位劑型(如錠劑、丸劑和膠 囊)。新穎組合的錠劑或丸劑可經包衣或以其他方式混配以提供具有延長作用的優勢的劑型。舉例來說，錠劑或丸劑可包含內部劑量和外部劑量組分，後者呈前者上的包膜的形式。兩種組分可由腸衣層分隔，所述腸衣層用於防止在胃中崩解且容許內部組分完整傳遞到十二指腸內或延遲釋放。各種材料可用於所述腸衣層或包衣，所述材料包括多種聚合酸和聚合酸與如蟲膠、十六烷醇和乙酸纖維素的材料的混合物。
適合的調配物包括本發明的組合的水性或油性溶液。適於活性成分胃腸外傳遞的調配物包括水性和非水性組合物，其中活性成分溶解或懸浮於溶液中。適於胃腸外投與的調配物包括水性和非水性無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑細菌劑或使得調配物與預定接受者的血液等滲的溶質。其他胃腸外調配物可包含水性和非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑和增稠劑。
適於口服投與的本發明的調配物被製備為：如膠囊、扁囊劑、膠狀物或錠劑的個別單元，其各自含有預定量的樟芝乙醇萃取物的低極性沖提物或樟芝酸A或其醫藥學上鹽；粉末或顆粒；呈水性液體或非水性液體形式的溶液或懸浮液；或水包油液體乳液或油包水液體乳液。
用於直腸投與的調配物可以具有適合基質的栓劑形式存在。
適於肺內或經鼻投與的調配物將具有例如在0.01微米到200微米範圍內的粒徑(包括在以0.1微米的增量介於0.01微米與500微米之間的範圍內的粒徑，如0.1微米、0.2微米、0.3微米、0.4微米、0.5微米、1微米、2微米、5微米、30微米、35微米等)，其通過經鼻部通道吸入或通過經口腔吸入來投與，以便到達多個支氣管或肺泡囊。適於氣霧劑或乾粉投與的調配物可根據常規方法製備且可與其他治療劑一起傳遞。
適於陰道投與的調配物可以除活性成分外含有所述如此項技術中已知為適當的載劑的子宮托、棉塞、乳膏劑、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧劑調配物形式存在。
適於經皮投與的調配物可以經皮貼片的形式存在。經皮貼片向患者提供基線或穩態樟芝酸或其鹽或酯水準。由貼錠劑在使用期間釋放的樟芝乙醇萃取物的低極性沖提物或樟芝酸A或其醫藥學上鹽的總量將視使用者的體型大小以及對治療的反應而變化。貼片的尺寸將根據待傳遞的樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物的量而變化。
包含本發明的組合的調配物以單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿和小瓶)形式存在，且可儲存在冷凍乾燥(凍幹)條件中，在即將使用之前，僅需加入無菌液體載劑(例如注射用水)即可。可自先前描述的種類的無菌粉末、顆粒和錠劑製備臨時注射溶液和懸浮液。如本文所述，優選的單位劑量調配物為含有日劑量或單位日亞劑量的單位劑量調配物。
應理解，除本發明的組合以外，以上特別提及的本發明的調配物可包括此項技術中常規的與所討論的調配物類型有關的其他藥劑，例如適於口服投與的藥劑可包括調味劑或著色劑。
本發明的組合可用於提供控制釋放醫藥調配物，其中控制和調節本發明的組合的釋放，從而允許較不頻繁的給藥或改進本發明的組合的藥物動力學或毒性概況。
調配物包括適於前述投藥途徑中的任一者的調配物。調配物可便利地存在於單位劑型中且可通過藥劑學技術中熟知的任何方法製備。所述方法包括使活性成分與構成一種或一種以上輔助成分或賦形劑的載劑結合的步驟。一般來說，透過使活性成分與液態載劑或細粉狀固體載劑或兩者均勻且緊密結合且接著(如果必要)使產物成形來製備調配物。舉例來說，透過任選地與一種或一種以上輔助成分一起壓 製或模製來製造錠劑。壓製錠劑可通過在適當機器中壓製呈如粉末或顆粒的自由流動形式，任選地與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性或分散劑混合的本發明的組合來製備。模製錠劑可通過在適當機器中模製用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末狀活性成分的混合物來製備。錠劑可任選地經包衣或刻劃且任選地經調配以便由其提供減緩或控制釋放的活性成分。
在另一方面中，本發明提供一種在低毒性情況下抑制和/或治療腫瘤細胞的方法，其包含投與個體有效量的本發明的組合，所述本發明的組合包含樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物以及有效量的抗腫瘤藥物。根據本發明的一個實施例，樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物和抗腫瘤藥物可單獨、同時或依序投與。
根據本發明，樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物以及抗腫瘤藥物適用於在低毒性和選擇性情況下抑制腫瘤細胞。具體地說，本發明的組合對腫瘤細胞而非正常細胞具細胞毒性。在組合地使用樟芝酸或其鹽或酯衍生物或組合物時，抗腫瘤藥物的量可減少。根據本發明，腫瘤為骨髓淋巴瘤、肝細胞癌、肝母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食道癌、甲狀腺癌、惡性神經節瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's tumor)、膀胱平滑肌肉瘤、橫紋肌內皮肉瘤(rhabdotheliosarcoma)、結腸癌、胰臟癌、肝癌、乳房癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、韋爾姆斯氏瘤(Wilms'tumor)、子宮頸癌、睾丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管母細胞瘤、顱咽管 瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、視網膜母細胞瘤、白血病(例如急性淋巴細胞性白血病)、急性髓細胞性白血病(成髓細胞性、前髓細胞性、骨髓單核細胞性、單核細胞性和紅白血病)、慢性白血病(慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病和慢性淋巴細胞性白血病)、真性紅細胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin's disease)和非霍奇金氏病)、多發性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、直腸癌、頭頸部癌症、腦癌、原發位不明癌、外周神經系統癌、中樞神經系統癌、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、重鏈病、癌轉移以及特徵在於細胞生長不受控制或異常的任何疾病或病症。腫瘤較佳地為肝臟腫瘤或乳房腫瘤。
在一個實施例中，腫瘤為肝癌。肝癌包括肝細胞癌(HCC)、血管內皮瘤、肉瘤、肝母細胞瘤或膽管癌(bile duct cancer/cholangiocarcinoma)。本發明的組合可任選地用於組合療法以治療這些疾病或病狀中的任一者。組合療法包括本發明的組合與手術、放射療法、化學療法、細胞毒性劑或細胞生長抑制劑的組合，包括本文中所公開或在本文中所引用的任何參考文獻中的任何療法或治療。本發明的組合優選地可與化學療法組合使用。或者，本發明的組合可用作化學治療劑或輔助化學治療劑。
用於治療性應用的本發明組合的有效劑量將在一定程度上至少視以下因素而定：如所治療的病狀的狀態、是否是防治性地(較低劑量)使用本發明的組合、或惡性疾病的嚴重度和傳遞的方法。這些因素將由臨床醫師使用常規劑量遞增研究確定。
任何適合的投藥途徑均可用于提供患者有效劑量的本發明的組合。舉例來說，視情況可使用口服、直腸、胃腸外、經皮、經粘膜、皮下、肌肉內、鞘內、肺內、經鼻或陰道等。
本發明的組合可有效抑制腫瘤細胞而非正常細胞。因此，本發 明的組合可在低毒性情況下選擇性抑制腫瘤細胞。此外，通過組合地使用樟芝酸或其酯衍生物、鹽或組合物，可減少抗腫瘤藥物的量，因此減少由抗腫瘤引起的副作用。
實例1樟芝酸A與5-氟尿嘧啶(5FU)的組合的細胞生存力分析(MTT分析)
將2×104 個HepG2細胞接種到96孔板的每個孔中，並且用含有10% FBS和1%抗生素-抗黴菌溶液的DMEM培養基培育。去除培養基，並且然後將6.25μg/ml 5-氟尿嘧啶(5FU)作為對照物、200μg/ml 5FU+25μg/ml樟芝酸A、200μg/ml 5FU+20μg/ml樟芝酸A、200μg/ml 5FU+15μg/ml樟芝酸A、200μg/ml 5FU+10μg/ml樟芝酸A、200μg/ml 5FU+5μg/ml樟芝酸A、100μg/ml 5FU+25μg/ml樟芝酸A、100μg/ml 5FU+20μg/ml樟芝酸A、100μg/ml 5FU+15μg/ml樟芝酸A、100μg/ml 5FU+10μg/ml樟芝酸A、100μg/ml 5FU+5μg/ml樟芝酸A加入到孔中。24小時之後，去除試劑，並且將100μl 0.5% mg/ml溴化3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑(MTT)加入到每個孔中用於MTT分析。在37℃下在暗處孵育2小時之後，去除溶液，並且將100μl DMSO加入到每個孔中，並且將其在暗處放置10分鐘。從每個孔取用溶液，並且然後使其經歷ELISA讀取器以檢測570nm波長下的吸光度。通過使用對照物的吸光度作為100%來計算細胞存活率百分比。
如圖1中所示，用5FU處理的HepG2細胞的IC50是200μg/ml，並且即使高濃度5FU情況下的細胞也不能完全被殺死。然而，分別用200μg/ml 5FU以及5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml的樟芝酸A處理的細胞可以幾乎完全被殺死(圖2)。在將5FU濃度降低到100μg/ml並且分別用100μg/ml 5FU以及5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml的樟芝酸A處理HepG2細胞之後，細胞可 以幾乎完全被殺死(圖3)。
此外，分別用培養基作為對照物、200μg/ml 5FU、100μg/ml 5FU和100μg/ml 5FU以及25μg/ml樟芝酸A處理正常細胞株CCD-966SK，以測試本發明的組合對正常細胞的作用。如圖4中所示，加入樟芝酸A可增強用5FU處理的細胞的細胞存活率。
另外，當分別用樟芝酸A 10μg/ml以及12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的5FU處理HepG2細胞和CCD-966SK細胞時，可以有效抑制癌細胞(HepG2細胞)，同時正常細胞(CCD-966SK細胞)具有高存活率(參見圖5)。結果顯示，樟芝酸A可以增強5FU在殺死癌細胞中的作用(即減少5FU的量)，同時使正常細胞保持在高存活率(即減少對正常細胞的細胞毒性)。
實例2樟芝酸A與他莫昔芬的組合的細胞存活率分析(MTT分析)
除3.13μg/ml他莫昔芬+25μg/ml樟芝酸A、3.13μg/ml 5FU+20μg/ml樟芝酸A、3.13μg/ml他莫昔芬+15μg/ml樟芝酸A、3.13μg/ml他莫昔芬+10μg/ml樟芝酸A、3.13μg/ml他莫昔芬+5μg/ml樟芝酸A作為測試樣品以外，對照物、測試條件、材料和方法與實例1相同。如圖6中所示，用他莫昔芬處理的HepG2細胞的IC50是8.02μg/ml，並且用12.5μg/ml他莫昔芬處理的細胞不能完全被殺死。通過分別使用低濃度的他莫昔芬以及5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml的樟芝酸A，細胞存活率可以顯著減弱。如圖7中所示，在分別用3.13μg/ml他莫昔芬(“TAM”)以及5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml的樟芝酸A處理HepG2細胞之後，細胞存活率分別是49.92%、41.52%、30.82%、26.21%和23.18%。
此外，分別用培養基作為對照物、3.13μg/ml他莫昔芬(“TAM”)和3.13μg/ml TAM以及15μg/ml樟芝酸A處理正常細胞株CCD-966SK，以測試本發明的組合對正常細胞的作用。如圖8中所示，加 入樟芝酸A可增強用TAM處理的細胞的細胞存活率。
另外，當分別用10μg/ml樟芝酸A以及0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的TAM處理HepG2細胞和CCD-966SK細胞時，可以有效抑制癌細胞(HepG2細胞)，同時正常細胞(CCD-966SK細胞)具有高生存力(參見圖9)。結果顯示，樟芝酸A可以增強TAM在殺死癌細胞中的作用(即減少5FU的量)，同時使正常細胞保持在高存活率(即減少對正常細胞的細胞毒性)。
實例3樟芝酸A與舒尼替尼和樟芝酸A與米托蒽醌的組合的細胞生存力分析(MTT分析)
對照物、測試條件、材料和方法與實例1相同。如圖10中所示，用舒尼替尼處理的HepG2細胞的IC50是約25μg/ml，並且正常細胞(CCD-966SK細胞)也在此濃度下被殺死。當分別用10μg/ml的樟芝酸A以及5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml的舒尼替尼處理HepG2細胞和CCD-966SK細胞時，可以有效抑制癌細胞(HepG2細胞)，同時正常細胞(CCD-966SK細胞)具有高生存力(參見圖11)。結果顯示，樟芝酸A可以增強舒尼替尼在殺死癌細胞中的作用(即減少5FU的量)，同時使正常細胞保持在更高存活率(即減少對正常細胞的細胞毒性)。
關於米托蒽醌，如圖12中所示，用米托蒽醌處理的HepG2細胞的IC50是約25μg/ml，並且正常細胞(CCD-966SK細胞)的存活率也在此濃度下減弱。當分別用10μg/ml的樟芝酸A以及2.5μg/ml、5μg/ml、6.25μg/ml、10μg/ml和12.5μg/ml的米托蒽醌處理HepG2細胞和CCD-966SK細胞時，可以有效抑制癌細胞(HepG2細胞)，同時正常細胞(CCD-966SK細胞)具有更高存活率(參見圖13)。結果顯示，樟芝酸A可以增強舒尼替尼在殺死癌細胞中的作用(即減少5FU的量)，同時使正常細胞保持在更高存活率(即減少對正常細胞的細胞毒性)。
實例4本發明的組合樟芝酸A與5FU、樟芝酸A與他莫昔芬、樟芝酸A與舒尼替尼和樟芝酸A與米托蒽醌的動物模型測試
將2×106 個HepG2人類肝癌細胞注入到NOD-SCID小鼠的背中以形成腫瘤。在腫瘤生長到10×10mm3 之後，每天分別將本發明的組合，即分別1mg/kg量的樟芝酸A與20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1.25mg/kg量的5FU，分別1mg/kg量的樟芝酸A與1mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg、0.125mg/kg、0.0625mg/kg量的他莫昔芬，分別1mg/kg量的樟芝酸A與2.5mg/kg、2mg/kg、1.5mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg量的舒尼替尼，和分別1mg/kg量的樟芝酸A與1.25mg/kg、1mg/kg、0.625mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg量的米托蒽醌注入到小鼠的腹腔中。將乙醇注入到小鼠中作為對照物。在每天一次注入持續14天之後，將小鼠殺死，並且測量腫瘤的尺寸。結果顯示，本發明的組合顯著減小腫瘤的尺寸(約20%到70%減小)。

Claims (8)

  1. 一種抗腫瘤藥物以及樟芝酸A(antcin A)或其鹽或甲基酯或乙基酯之組合，其中該抗腫瘤藥物為酪胺酸激酶抑制劑，其選自伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)或舒尼替尼(sunitinib)所組成之群；及其中該樟芝酸A或其鹽或甲基酯或乙基酯的量可減少所述抗腫瘤藥物的量並且對正常細胞提供低細胞毒性。
  2. 如請求項1之組合，其中該抗腫瘤藥物係與樟芝酸A組合。
  3. 如請求項1之組合，其中該抗腫瘤藥物係與樟芝酸A甲酯組合，其中該酪氨酸激酶抑制劑是舒尼替尼。
  4. 如請求項1之組合，其中該酪氨酸激酚抑制劑是舒尼替尼。
  5. 如請求項1之組合，其中該樟芝酸A或其鹽或甲基酯或乙基酯組合抗腫瘤藥物的量分別介於20%(w/w)到80%(w/w)及80%(w/w)到20(w/w)的範圍內。
  6. 一種如請求項1之組合之用途，其係用於製備對個體的腫瘤具選擇性的情況下抑制和/或治療腫瘤之藥物。
  7. 如請求項6之用途，其中該腫瘤選自由以下組成的群組：結腸癌、胰臟癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、直腸癌、頭頸癌或腦癌。
  8. 如請求項7之用途，其中該肝癌為肝細胞癌或肝胚細胞瘤；該肺癌為小細胞肺癌。
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