TW201329040A - 以密環菌乙素來治療癌症之新穎用途 - Google Patents
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Abstract
在此揭示一種自蜜環菌(Armillaria mellea)分離出的一芳香性酯類化合物之新穎用途,特別是密環菌乙素(armillaridin)。所述蜜環菌乙素可用來製造能於一種可於活體內抑制癌細胞生長或者是增強食道癌細胞接受放射線處理之感受性的醫藥品或是藥學組合物。
Description
本揭示內容是有關於自蜜環菌(Armillaria mellea)分離之小分子化合物的新穎用途,特別是蜜環菌乙素(armillaridin)的新穎用途,其可用來製造能增強食道癌細胞對於放射線治療之感受性的醫藥品或是藥學組合物。
放射線經常被用來治療癌症或其他疾病,然而,操作時必須將放射線的有效劑量限制在腫瘤或其他標靶組織,才不會對其他周邊組織及病患健康造成危害。
目前有部分研究致力於如何增強腫瘤細胞對於放射線之感受性,以便能降低所使用之放射線劑量。舉例而言,先前研究顯示,於放射線治療過程中,搭配使用化療藥劑處理腫瘤,可改善治療效果。然而,關於此領域之研究仍相當有限。
有鑒於此,此技術領域中亟需一種藥劑或化合物,能有效增強癌細胞對於放射線治療之感受性,因此上述之藥劑或化合物能進一步作為抗癌藥物的佐劑以治療癌症,特別是食道癌。
本揭示內容至少部分係基於發現,自蜜環菌(Armillaria mellea)分離出來的原伊鲁烷倍半萜酯(protoilludance norsesquilterpenoid ester)化合物,其具有抑制癌細胞增殖的活性,特別是抑制人類食道癌細胞增殖;另一方面,此化合物亦能增強食道癌細胞對於放射線治療之感受性。上述這些發現,暗示此活性化合物可作為能抑制或延緩食道癌細胞生長之治療劑或其他抗癌藥物之佐劑。
有鑒於此,本揭示內容之第一態樣是提供一種蜜環菌乙素之新穎用途,其可用來製造增強食道癌細胞對於放射線處理的感受性的醫藥品或是藥學組合物。此醫藥品或是藥學組合物包含一治療有效量之蜜環菌乙素或是其藥學上可接受的鹽類;以及一藥學上可接受的輔劑。
因此,本揭示內容之第二態樣是提供一種增強食道癌細胞對於放射線治療之感受性的方法。所述方法包括對食道癌細胞施用一有效量之蜜環菌乙素或是其藥學上可接受的鹽類,接著對經蜜環菌乙素處理之癌細胞施以放射線治療。所述放射線治療之步驟包含,以一放射線源照射該經蜜環菌乙素處理之癌細胞,其中該放射線源可發出輻射能量約0.05-150百萬伏特(MV),較佳是約1-10 MV,更佳是約6 MV。於一實施例中,此食道癌細胞為鱗狀上皮癌細胞。在另一實施例中,此食道癌細胞為腺癌細胞。
在某些實施方式中,所述方法更包含在施用本發明之化合物的同時、之前或之後,也施用另一種已知可改善食道癌治療效果的藥劑。這類藥劑的實例包括,但不限於,烷化劑(alkylating agent)、蒽環黴素(anthracycline)、植物鹼(plant alkaloid)、拓撲異構脢(topoisomerase inhibitor)、細胞毒性抗生素(cytotoxic antibiotic)及酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor)及其他類似物。
本揭示內容之第三態樣是提供一種可治療一個體之食道癌的方法。所述方法包含,對該個體施用一有效量之蜜環菌乙素或其藥學上可接受的鹽類。
根據本揭示內容之某些實施方式,於單獨施用蜜環菌乙素時,能夠使食道癌癌細胞停滯於G2/M週期。
在某些實施方式中,相較於控制組,當該個體長期曝露蜜環菌乙素下,其惡性腫瘤之大小可減少至少50%,同時不會影響其體重及白血球數量。於這些實施方式中,可於一段3-30天之期間內對該個體重複施用蜜環菌乙素,其施用劑量為50-120毫克/公斤個體體重,且施用次數至少3-15次。於另一特定實施例中,可於一段20天之期間內,對該個體重複施用80毫克/公斤個體體重之蜜環菌乙素至少12次,且每周至少施用3劑量。
在某些實施方式中,所述方法更包含在對該個體施用本發明之化合物的同時、之前或之後,也對該個體施用另一種已知可改善癌症治療效果的藥劑。這類藥劑的實例包括,但不限於,烷化劑(alkylating agent)、蒽環黴素(anthracycline)、植物鹼(plant alkaloid)、拓撲異構脢(topoisomerase inhibitor)、細胞毒性抗生素(cytotoxic antibiotic)及酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor)及其他類似物。
本揭示內容之第四態樣提供一種蜜環菌乙素的新穎用途,其可用來製造一種可治療食道癌的醫藥品或是藥學組合物。此醫藥品或藥學組合物包含一治療有效量之蜜環菌乙素或其藥學上可接受的鹽類;以及一藥學可接受的輔劑。
若以上述藥學組合物總重量為基準,本發明化合物,約占該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其他實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的25%。
透過以下的詳細說明與附隨之申請專利範圍將可更了解本揭示內容的這些及其他特徵。需知以上的概述及以下的詳細說明僅為例示,用來闡述本揭示內容,而非用以限制本揭示內容之範疇。
所述實施方式與專有名詞是為了闡述發明內容之用,並非用以限制本揭示內容範疇。本揭示內容範疇也涵蓋並未特意揭示於此,但習知技藝人士在閱讀過本揭示內容後可輕易推知的其他實施方式。
以下為本說明書中所用特定名詞的說明:
在本文中,「治療(treating或treatment)」一詞意指對癌細胞或一個體施用所述化合物,以使至少45%、50%、55%、60%或65%的癌細胞生長停滯在G2/M週期而防止癌細胞增生(multiplying),因而能縮小腫瘤體積。因此,「治療」一詞在此亦表示殺死癌細胞或誘發癌細胞凋亡。
「一有效量(an effective amount)」一詞意指一用量在經過適當的給藥時期後,能夠達到治療癌症所欲達成的治療效果。
「化合物(compounds)」、「藥劑(agent)」或「醫藥品(medicament)」等詞在此可互相替換,且都是指當施用於一個體(人類或動物)時,能夠透過局部和/或全身性作用而誘發所欲藥學和/或生理反應的一種化合物或組合物。
「施用(administered、administering或、administration)」一詞在此係指直接施用所述的化合物或組合物,或施用活性化合物的前驅藥(prodrug)、衍生物(derivative)、或類似物(analog)等,可於個體體內形成該活性化合物之一相當用量者。
在此處「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞係指可接受所述化合物和/或方法治療的動物,包括人類。「個體」或「患者」在此涵蓋了雄性與雌性兩種性別,除非另有具體說明。因此「個體」或「患者」包含任何哺乳類動物,較佳為人類,其可因利用所述化合物進行治療而獲益。
本揭示內容至少部分係基於發現,自蜜環菌(Armillaria mellea)分離出來的原伊鲁烷倍半萜酯(protoilludance norsesquilterpenoid ester)化合物,其可抑制癌細胞增殖,特別是人類食道癌細胞之增殖;再者,其亦可增強食道癌細胞對於放射線治療之感受性。因此,此活性化合物可作為能抑制食道癌細胞生長之治療劑或其他抗癌藥物之佐劑。
蜜環菌(屬於口磨科(Tricholomataceae))為一種藥用真菌,其與中醫草本植物「天麻(Gastrodia elata Blume)」共同營生。其中,蜜環菌之子實體為傳統中藥成分,可用來治療高血壓(hypertension)、頭痛(headache)、失眠(insomnia)、頭暈(dizziness)和暈眩(vertigo)。此外,在先前對蜜環菌菌絲體之化學成分研究中,已鑑別出數種具有原伊鲁烷(protoilludane)骨架的倍半萜醇芳香酯化合物(sesquiterpenoid aromatic esters)。且先前研究亦證實,某些上述之倍半萜醇(sesquiterpenoids)具有抗微生物活性,尤其是可對抗革蘭氏陽性菌和酵母菌。
本揭示內容之活性化合物,係自蜜環菌中分離出來的蜜環菌乙素或是(2R,2aS,7bR)-3-甲醯-2,2a,4a,5,6,7,7a,7b-八氫-2a-羥基-6,6,7b-三甲基-1H-環丁烷茚-2-基3-氯-6-羥基-4-甲氧基-2-苯甲酸甲酯,於本文中以“CH-205-O”表示。以下為本揭示內容之CH-205-O化學結構:
本發明之CH-205-O之製備步驟揭示於陳等人於2011年4月25號提申之美國專利申請案第13/093,080號,發明名稱為「Protoilludance Norsesquiterpenoid Esters and Uses Thereof」,在此將其整體揭示內容併入作為本說明書之參考資料。
因此,本揭示內容提供一種可增強食道癌細胞對於放射線治療之感受性的方法。所述方法包含,施用一有效量之CH-205-O或其藥學上可接受的鹽類至食道癌細胞;接著以放射線治療前述經CH-205-O處理之食道癌細胞。其中該放射線治療之步驟包含,於一段時間內,以足以殺死目標組織之癌細胞條件下,以一放射線源,其輻射發射能量在約0.05-15百萬伏特(MV)間,即0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14或15 MV照射經CH-205-O處理之癌細胞。較佳為,放射線源之輻射發射能量約1-10 MV,即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 MV;更佳為約6 MV。於一實施例中,所述食道癌細胞為鱗狀上皮癌細胞;而於另一實施例中,所述食道癌細胞為腺癌細胞。
此方法更進一步包含在施用CH-205-O的同時、之前或之後,也施用另一種已知可改善食道癌治療效果的藥劑。此藥劑之實例包含,但不限於,烷化劑(alkylating agent)、蒽環黴素(anthracycline)、植物鹼(plant alkaloid)、拓撲異構脢(topoisomerase inhibitor)、細胞毒性抗生素(cytotoxic antibiotic)及酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor)及其他類似物。
烷化劑之實例包含,但不限於,順鉑(cisplatin)、卡鉑定(carboplatin)、草酸鉑(oxaliplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)或尹氟醯胺(ifosfamide)及其他類似物。蒽環黴素(Anthracycline)之實例包含,但不限於,艾黴素(doxorubicin)、道紅鏈絲菌素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicin)或艾達黴素(idarubicin)及其類似物。植物鹼之實例包含,但不限於,長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、紫杉醇(taxol)或代苯紫杉醇(docetaxel)及其他類似物。拓撲異構脢抑制劑之實例包含,但不限於,喜樹鹼(camptothecin,CPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)或抗癌妥(topotecan,TPT)及其他類似物。細胞毒殺抗生素之實例包含,但不限於,放線菌素(antinomycin)、博來黴素(bleomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、或普卡黴素(plicamycin)及其他類似物。酪胺酸激酶抑制劑包含,但不限於尼祿替尼(nilotinib)、伊馬替尼(imatinib)、艾瑞莎(gefitinib)、得舒緩(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、納魯單抗(zalutumumab)、尼莫單抗(nimotuzumab)、麻妥單抗(matuzumab)及其他類似物。
除了上述增強癌細胞對於放射線治療之感受性的方法,本揭示內容亦提供一種可用來治療一個體之癌症的方法。此方法包含對於該個體施用一有效量上述之CH-205-O或是其藥學上可接受的鹽類。該個體在施用過本揭示內容之CH-205-O之後,能有效的抑制癌細胞生長。於一較佳的實施例中,以CH-205-O所處理之癌症為食道癌,其目前治療方式仍然以外科手術切除為主。於一特定實施例中,CH-205-O可有效的使至少50%之食道癌細胞停滯於G2/M週期,以防止癌細胞繼續增生。
在某些實施方式中,可經由口服、肌肉注射或靜脈注射而施用至個體身上之本發明化合物的有效用量約為1-150毫克/公斤個體體重。每天可施用至個體身上之本發明化合物的有效用量為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150毫克/公斤個體體重;較佳為約30-120毫克/公斤個體體重,即,約30、40、50、60、70、80、90、100、110或120毫克/公斤個體體重;更佳為約50-100毫克/公斤個體體重,例如約50、60、70、80、90或100毫克/公斤個體體重;最佳是約80毫克/公斤個體體重。這些劑量可以單次施用或是分成多次在一天內施用。
根據本揭示內容之一特定實施方式,相較於控制組,當該個體被長期曝露在CH-205-O下,其惡性腫瘤之體積大小可減少至少50%,且不會對個體體重及白血球數量造成不良影響。較佳為,在一段3-30天的期間內,即3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天內,重複施用約50-150毫克/公斤個體體重之CH-205-O至該個體,即50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150毫克/公斤個體體重,至少3-15次,即3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次。更佳為在一段7-25天的期間內,即7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天內,重複施用約70-100毫克/公斤個體體重之CH-205-O至該個體,即70、80、90或100毫克/公斤個體體重,至少5-10次,即5、6、7、8、9或10次。所施用劑量可為每天一次或是每周3-5次。所施用之CH-205-O劑量與次數會隨著年齡、性別、體重、病史和/或患者接受治療之狀況而有所差異,習知技藝人士可在不需過度實驗的情況下推知應使用的劑量與次數。於一特定實施例中,於一20天之期間內,對該個體施用CH-205-O,至少12次,且每周至少施用3劑量。
在某些實施方式中,所述方法更包含施用本發明之化合物的同時、之前或之後,也施用另一種已知可改善癌症治療效果的藥劑。這類藥劑的實例包括,但不限於,烷化劑(alkylating agent)、蒽環黴素(anthracycline)、植物鹼(plant alkaloid)、拓撲異構脢(topoisomerase inhibitor)、細胞毒性抗生素(cytotoxic antibiotic)及酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor),及其他類似物。
烷化劑之實例包含,但不限於,順鉑(cisplatin)、卡鉑定(carboplatin)、草酸鉑(oxaliplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)或尹氟醯胺(ifosfamide)及其他類似物。蒽環黴素(Anthracycline)之實例包含,但不限於,艾黴素(doxorubicin)、道紅鏈絲菌素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicin)或艾達黴素(idarubicin)及其他類似物。植物鹼之實例包含,但不限於,長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、紫杉醇(taxol)或代苯紫杉醇(docetaxel)及其他類似物。拓撲異構脢抑制劑之實例包含,但不限於,是喜樹鹼(camptothecin,CPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)或抗癌妥(topotecan,TPT)及其他類似物。細胞毒性抗生素之實例包含,但不限於,放線菌素(antinomycin)、博來黴素(bleomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、或普卡黴素(plicamycin)及其他類似物。酪胺酸激酶抑制劑包含,但不限於尼祿替尼(nilotinib)、伊馬替尼(imatinib)、艾瑞莎(gefitinib)、得舒緩(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、納魯單抗(zalutumumab)、尼莫單抗(nimotuzumab)、麻妥單抗(matuzumab)及其他類似物。
本揭示內容亦提供一用來治療癌症之藥學組合物;此組合物包含一治療有效量之本發明化合物或其藥學上可接受的鹽類;以及一藥學上可接受的輔劑。
一般而言,若以上述藥學組合物總重量為基準,本發明化合物,約占該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其他實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的25%。
在某些實施方式中,上述本發明之醫藥品或是藥學組合物中更包括另一種已知可改善癌症治療效果的藥劑。這類藥劑的實例包括,但不限於,烷化劑(alkylating agent)、蒽環黴素(anthracycline)、植物鹼(plant alkaloid)、拓撲異構脢(topoisomerase inhibitor)、細胞毒性抗生素(cytotoxic antibiotic)及酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor)及其他類似物。
可根據眾所接受的藥學製程來製備上述藥劑或藥學組合物,如Remington’s Pharmaceutical Sciences(17th edition,ed. Alfonoso R. Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa(1985))中所述的製程。藥學上可接受的輔劑係指可和製劑中其他成分相容且與生物體相容之物質。
本發明化合物(即,CH-205-O)可經由口服(如,口服用膠囊、懸浮液或藥錠)、或腸胃外(parenterally)等適當方法施用。腸胃外(parenterally)施用方式包括例如肌肉內注射、靜脈注射、皮下注射或腹膜內注射等系統性方式施用。或是,也可透過穿皮膜方式施用,如局部皮膚塗抹或是吸入性(如支氣管內、鼻腔內、口腔內或鼻滴劑等);或是直腸內方式施用。施用時可單獨給藥或併同習知藥學可接受輔劑一起給藥。在較佳實施方式中,可經由口服方式(如,透過食物)將本發明化合物投予個體。
若以口服方式施用,可將本發明化合物配方成為內含各種輔劑(如微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸二鈣及甘胺酸);各種崩解劑(如澱粉、藻酸及特定矽酸鹽);以及顆粒黏合劑(如,聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠及相思樹膠(acacia))的藥錠。除此之外,還可包含諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石等的潤滑劑。此固態配方也可當作填充劑用於明膠膠囊內,與此相關的較佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。當使用方式是口服用懸浮液和/或特效藥液(elixirs)時,可組合活性成分與各種甜味劑或風味劑、著色劑或染料一起配方,需要時還可加入乳化劑和/或懸浮劑,以及諸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀釋劑。
若以腸胃外(parenterally)方式施用,可將本發明化合物配方成為液態的藥學組合物,其可為能以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的無菌溶液或懸浮液。可用來製造上述無菌注射溶液或懸浮液的稀釋劑包括,但不限於,1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等張性氯化鈉溶液。也可使用脂肪酸(如,油酸)及其之甘油酯衍生物,或是天然藥學可接受的油(如,橄欖油或菜籽油)來製造可供注射用的溶液或懸浮液。這類油性溶液或懸浮液中也可包含用來稀釋的醇類或羧甲基纖維素或類似的分散劑。也可使用其他常用的界面活性劑(如,Tweens或Spans系列)或乳化劑,或藥學領域製造配方時常用來增強生物可利用性的藥劑。
可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物調製成多種可供局部表面給藥(topical application)的劑型。可使用此領域中習知的各種皮膚可接受的惰性輔劑在這類劑型中。適合皮膚表面施用之配方包括液體、乳霜、乳液、乳膏、凝膠、噴劑、氣霧噴劑、皮膚貼片等類似物。常用的惰性輔劑如水、乙醇、聚乙烯吡咯啶、丙二醇、礦物油、硬脂醇及其他可形成膠狀物的材料。所有上述劑型與輔劑皆為藥學領域所熟知。對於本文所述的組合物之效果而言,劑型的選擇並非關鍵。
亦可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物製成多種適用於黏膜給藥(mucosal application)的劑型,如經頰(buccal)和/或舌下(sublingual)藥物劑型單元,以遞送藥物穿過口腔黏膜。可使用多種生物可降解且藥學可接受的高分子輔劑,此種輔劑可使得藥學組合物具有可接受的吸附效果以及所欲的藥物釋放模式,且可和經頰和/或舌下藥物劑型單元中所含的欲施用活性成分或其他成分相容。一般來說,上述的高分子輔劑包含親水性聚合物,其可黏附至口腔黏膜的濕潤表面。高分子輔劑的實施例包括但不限於丙烯酸聚合物與共聚物(acrylic acid polymers and copolymers);水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol);聚乙烯氧化物(polyethylene oxides);聚丙烯酸酯(polyacrylates);乙烯聚合物與共聚物(vinyl polymers and copolymers);聚乙烯吡咯啶;葡萄糖(dextran);瓜膠(guar gum);果膠(pectins);澱粉;及纖維素聚合物(cellulosic polymers)。
因此,本發明也提供用來治療哺乳類(特別是人類)之癌症的方法,包括對該個體施用所述內含本發明活性化合物之醫藥品或藥學組合物。這類醫藥品或藥學組合物較佳是以可有效傳送所述組合物中活性化合物的途徑施用至一哺乳類(較佳是人類)身上適當或可產生欲求效果的位置。適當的施用途經可以是例如主動或被動地經口、經鼻、經肺或經皮膜等方式;或是以經腸胃外的方式,如直腸栓劑、皮下注射、靜脈內注射、肌肉內注射、鼻腔內、眼用溶液或軟膏。此外,也可將本發明化合物與其他活性藥劑一同施用。
當可理解,本發明之化合物的劑量會因患者而異,這不僅是因為所用的特定化合物或組合物、給藥途徑、化合物(單獨或連同一或多種藥物)於患者體內所引發之所欲反應等因素之不同,還可能受到其他因素影響,例如:欲治療症狀的疾病狀態或嚴重程度;患者的年齡、性別或體重、患者的健康狀況;以及欲治療的病理狀態的嚴重程度、患者於同時進行的其他醫療或特殊飲食內容;以及本領域通常知識者可想到的其他因素;而負責照料的醫療人員最終可基於這些因素而判斷出適當的劑量。可調整給藥劑量與形式以提供較佳的治療反應。治療有效量同時也是指化合物或組合物所致的毒性或有害的效果不及於其所帶來的治療利益。在較佳的情形中,本發明之化合物或組合物於投藥時,應採用適當的劑量並持續一段時間,以使得症狀的數目和/或嚴重性得以降低。
以下實施例是用來闡明本揭示內容特定態樣並幫助習知技藝者了解並實施本揭示內容。但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。
細胞培育 在本揭示內容中係使用人類鱗狀上皮癌細胞株(human squamous carcinoma cell lines)CE81T/VGH及TE-2,以及人類腺癌細胞株(human adenocarcinoma cell lines)BE-3及SKGT-4。將每一細胞株的細胞分別培養在經Dulbecco氏改良過之Eagle氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中,並添加10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、100單位/ml之盤尼西林、100 μg/ml之鏈黴素和2mML-穀氨酸,並維持在37℃的潮溼環境下(5% CO2及95%空氣)。
剛果藍排除試驗 以染劑排除試驗法測定細胞懸浮液中存活的細胞數目。此試驗原理係基於,活細胞具有完整的細胞膜,因此會排斥染料使其無法滲入,相對地,死細胞則無法排除染料分子進入細胞內;上述所稱之特定染料,可以是剛果藍(trypan blue)、伊紅(eosin)或丙啶(propidium)等。於此試驗中,首先以一試驗化合物(即,CH-205-O)處理細胞,經一特定時間(即,72小時)之後,再以適當的緩衝溶液收集細胞並且使之再次懸浮。將細胞懸浮液與剛果藍染劑混合,接著以肉眼觀察該細胞是否排斥或吸入染料。關於細胞染色之結果,活細胞之細胞質為透明的,相對地,死細胞之細胞質則為藍色的。於72小時之後,藉由不同濃度之試驗化合物所產生之劑量反應曲線,以二次多項式迴歸模式及以SigmaPlot軟體分析(Systat Software Inc.,San Jose,California),即可得知本試驗細胞存活率減少50%(即,IC50)的濃度。
細胞週期分析 自培養基中取得經培養之細胞(不論是否經過本發明之化合物預先處理,即以10或20 μM密環菌乙素處理48或72小時),接著,在4℃下以75%冰冷的酒精處理該些細胞並至少經過一夜,使細胞固定。之後,在室溫下以A型RNA酶(RNAase A)處理細胞約30分鐘,離心後將細胞沉澱物重新懸浮在適量的碘化丙啶(propidium iodide,PI)(20 μg/ml)中,然後以流式細胞儀測定出不同週期的細胞並計數其數目。
放射線處理及形成細胞群落能力分析 在直徑約35毫米的6孔培養盤內植入數目約為100之癌細胞,並加入DMEM培養基(其中添加了10% FCS,以及濃度分別0、1.25、為2.5或5μM的測試藥物(即,CH-205-O)),然後繼續培養約24小時。洗掉藥物,並對細胞施以放射線處理。透過線性加速器(Clinac 1800,Varian Associates,Inc.,Palo Alto,CA,USA)來傳送約6 MeV的電子束能量,並以單次、每分鐘約2.4Gy的速率施加約0、0.5、1、2或4Gy(Gray)的劑量。每次照射時,以另一同時也被照射的RP-60C游離室(CAPINTEL,Inc.,Ramsey,NY,USA)作為對照組,以確保電子能量達到平衡。輻射照射後,將細胞放回培育室,繼續培育10-14天,然後,以3%的結晶紫進行染色,並計算所形成的細胞群落數目(50細胞為1個細胞群落)。
異種移植食道癌小鼠模型 於小鼠食道癌模型中,將總數共9隻之6周齡Balb/c裸鼠,隨機分配至3個群組中,每一組3隻小鼠。為了使小鼠生成食道癌,於第0天,以皮下注射方式將濃度約5 x 105之CE81T/VGH細胞,注入至每一隻小鼠背部,接著繼續培育21天使其癌化。為了評估本發明化合物的功效,在試驗進行的第22天,對試驗組小鼠施用本試驗化合物(CH-205-O之劑量為為80毫克/公斤/劑量)或順鉑(cisplatin)(劑量為2.5毫克/公斤/劑量),於20天之期間內,每週施用3劑量,共施用12劑量。此外,以卡尺測量腫瘤大小。並且於本試驗進行過程中,持續每天記錄每隻小鼠的體重和白血球計量。腫瘤之體積藉由下列公式計算:體積=寬度2×長度×0.52。
以上述「材料與方法」部分所述的步驟,培養人類食道癌細胞株,包含鱗狀細胞癌細胞株CE81T/VGH和TE-2,以及腺癌細胞株BE-3和SKGT-4培養。以細胞存活率及細胞週期分析評估CH-205抑制各細胞株增殖之活性。
表1顯示以剛果藍排除試驗評估之CH-205-O對人類食道癌細胞株細胞存活率之影響。試驗結果顯示CH-205-O能有效減少各細胞株之細胞數目;CH-205-O抑制50%鱗狀上皮細胞株CE81T/VGH和TE-2生長之濃度(IC50)分別約為7μM和3μM;抑制腺癌細胞株BE-3和SKGT-4之IC50濃度則約為5μM。
細胞週期分析結果更進一步顯示,以濃度10或20μM之CH-205-O處理48小時,能夠使CE81T/VGH細胞停滯於G2/M週期,且此細胞停滯的效果與CH-205-O劑量多寡相關;經CH-205-O處理72小時後,能夠進一步誘導G1週期之次細胞群(sub-G1週期)細胞數量增加(第1圖)。
本實施例中主要探究CH-205-O對人類癌細胞株CE81T/VGH接受放射線處理之感受性的影響。
為此,以CH-205-O預先處理(濃度分別為1.25、2.5或5μM)癌細胞,接著依據先前本文「材料與方法」段落中所揭示的步驟,以不同劑量之放射線照射上述經CH-205-O處理過之癌細胞,然後再繼續培養殘存的癌細胞,並以細胞群落分析(clonogenic assay)來觀察這些細胞後續形成細胞群落的能力。細胞群落分析乃是癌症研究領域中,慣用來測試藥物或放射線處理,對癌細胞本身後續繼續無限制地進行分裂之能力的試驗,其是透過計算這些癌細胞形成群落的數目來估算。每一細胞群落至少必須包含50個細胞。試驗結果示於第2圖中。以濃度為2.5或5μM之CH-205-O處理癌細胞,可有效增強CE81T/VGH細胞對放射線處理之感受性;因此本發明之密環菌乙素化合物,具有後續開發成抗癌藥物佐劑的潛力。
透過測量移植有CE81T/VGH細胞之小鼠身上,所移植腫瘤的體積大小,來評估CH-205-O對CE81T/VGH細胞的影響;並依據本文「材料與方法」段落中所揭示的步驟,測量小鼠體重和白血球數量。結果顯示於第3圖。
依據第3A圖所示,相較於控制組(即,僅接受佐劑注射之小鼠),持續施用濃度80毫克/公斤/劑量之CH-205-O,至少12劑量,可有效使異種移植之食道腫瘤的體積大小縮減至少50%。同時,結果亦顯示小鼠長期暴露在CH-205-O下,並不會對其體重和白血球數量造成任何不良影響(第3B和3C圖)。有此可見,CH-205-O為具有後續潛力發展成為長期使用之抗癌醫藥品。
當可理解上述實施方式與實施例僅為例示,且熟習此技藝者可對齊進行各種修飾。上文提出之說明書、實施例與資料的目的在於使本說明書的結構完備,並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上,然其並非用以限定本揭示內容,任何熟習此技藝者,在不脫離本揭示內容之精神和範圍內,當可作各種之更動與潤飾,因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
為讓本揭示內容之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:
第1圖繪示出依據本發明一實施方式,CH-205-O對於CE81T/VGH細胞之細胞週期分布的影響;本圖上排為CE81T/VGH細胞經CH-205-O處理48小時的結果,其中CH-205-O作用濃度分別為0(A圖)、10 μM(B圖)或20 μM(C圖),下排為經為CE81T/VGH細胞經CH-205-O處理72小時的結果,其中CH-205-O作用濃度分別為0(D圖)、10 μM(E圖)或20 μM(F圖);
第2圖繪示出依據本發明一實施方式,CH-205-O對於CE81T/VGH細胞接受放射線處理之感受性的影響;以及
第3圖繪示出依據本發明一實施方式,CE81T/VGH細胞異種移植小鼠長時間暴露於CH-205-O之影響。
Claims (13)
- 一種密環菌乙素(armillaridin)的用途,其可用來製造能增強食道癌細胞對放射線處理感受性之醫藥品。
- 如請求項1所述之用途,其中該食道癌細胞是鱗狀上皮癌細胞(squamous carcinoma cells)或腺癌細胞(adenocarcinoma cells)。
- 如請求項1所述之用途,其中該放射線處理包含以一放射線源照射該食道癌細胞,該放射線源可發出約1-10百萬伏特(mega volts)之能量。
- 一種可增強一個體之食道癌對一放射線處理之感受性的組合物,包含一有效量之密環菌乙素或其藥學上可接受的鹽類;以及一藥學上可接受的輔劑。
- 如請求項4所述之組合物,其中該密環菌乙素或其藥學上可接受的鹽類是以80毫克/公斤體重施用至該個體上。
- 如請求項4所述之組合物,更包含一有效量的一化學治療藥劑。
- 如請求項6所述之組合物,其中該化學治療藥劑係選自由烷化劑(alkylating agent)、蒽環黴素(anthracycline)、植物鹼(plant alkaloid)、拓撲異構脢(topoisomerase inhibitor)、細胞毒性抗生素(cytotoxic antibiotic)及酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor)所組成之物質群組中。
- 如請求項7所述之組合物,其中該烷化劑是順鉑(cisplatin)、卡鉑定(carboplatin)、草酸鉑(oxaliplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)或尹氟醯胺(ifosfamide)。
- 如請求項7所述之組合物,其中該蒽環黴素(anthracycline)是艾黴素(doxorubicin)、道紅鏈絲菌素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicin)或艾達黴素(idarubicin)。
- 如請求項7所述之組合物,其中該植物鹼是長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、紫杉醇(taxol)或代苯紫杉醇(docetaxel)。
- 如請求項7所述之組合物,其中該拓撲異構脢抑制劑是喜樹鹼(camptothecin,CPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)或抗癌妥(topotecan,TPT)。
- 如請求項7所述之組合物,其中該細胞毒性抗生素是放線菌素(antinomycin)、博來黴素(bleomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、或普卡黴素(plicamycin)。
- 如請求項7所述之組合物,其中該酪胺酸激酶抑制劑是伊馬替尼(imatinib)、艾瑞莎(gefitinib)、得舒緩(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、納魯單抗(zalutumumab)、尼莫單抗(nimotuzumab)、麻妥單抗(matuzumab)或其他類似物。
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