TWI462918B - 羊毛固醇三萜的新穎用途 - Google Patents

Description

羊毛固醇三萜的新穎用途

本揭示內容是有關於一種自靈芝中分離出來具有氧雜-A,B-升二-類固醇(oxa-A,B-dihomo-steroidal)骨架之羊毛固醇三萜類化合物的新穎用途；特別是這些化合物作為抗癌藥物(如，艾瑞莎或蕾沙瓦)佐劑的用途。

食藥用真菌被廣泛做為保健食品，其中又以靈芝為大宗。在東南亞地區，更常以靈芝子實體入藥。由於靈芝可在生體內啟動諸多正面的反應，相關活性成分的研究很多，其活性成分大致被區分成五大類：靈芝三萜類(triterpenoids)、多醣體(polysaccharides)、核苷(nucleotides)、植物固醇類(phytosterols)及多肽類(polypeptides)。

黃芝(G.colossum )是靈芝科靈芝屬中的一屬，因黃芝較為稀少，因此相關活性成分的研究並不多。本申請案發明人即是在進行黃芝研究過程中，意外發現分離自黃芝的三萜化合物，包括羊毛固醇三萜G及羊毛固醇三萜H，具有可增強已知抗癌藥物抑制癌細胞生長或殺死癌細胞(特別是已對抗癌藥物發展出抗藥性之癌細胞)的功效。因此，未來可開發成已知抗癌藥物(如，艾瑞莎或蕾沙瓦)的佐劑。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

如本揭示內容所廣泛描述與例示，本揭示內容目標為提供一種自黃芝中分離出來的三萜化合物，亦即，具有如下式(I)結構之羊毛固醇三萜化合物的新穎用途： 其中，R₁ 及R₃ 分別為H或OH，R₂ 是H或乙醯氧基(acetoxy)。

據此，本揭示內容第一目的在於提供一種上述式(I)化合物的新穎用途，其係可作為已知抗癌藥物之佐劑。

依據本發明一實施方式，本發明式(I)化合物可與另一種已知可改善癌症治療效果的藥劑合併使用。這類藥劑包括抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、抗生素、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物、細胞激素、顆粒細胞株 刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、抗嘔吐藥物以及其他類似物。

在一特定實例中，上述式(I)化合物之R₁ 與R₃ 分別為OH，且R₂ 為乙醯氧基，亦即該式(I)化合物為羊毛固醇三萜H(Colossolactone H)；且適合與此羊毛固醇三萜H一起使用的藥劑為艾瑞莎。因此，適合組合使用羊毛固醇三萜H及艾瑞莎來治療的癌症為肺癌；特別是對艾瑞莎具有抗性的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。

在另一特定實例中，上述式(I)化合物之R₁ 為OH，R₂ 為乙醯氧基，且R₃ 為H；亦即該式(I)化合物為羊毛固醇三萜G(Colossolactone G)；且適合與此羊毛固醇三萜G化合物一起使用的藥劑為蕾莎瓦。因此，適合組合使用羊毛固醇三萜G及蕾莎瓦來治療的癌症為肝癌。

據此，本揭示內容第二目的在於提供一種可抑制癌細胞增生或轉移之藥學組合物。此藥學組合物包含一有效量之抗癌藥物和一有效量之上述式(I)化合物；及其藥學上可接受的載劑(excipient)。

本揭示內容第三目的在於提供一種可延緩一對象體內之癌細胞生長或轉移之方法。所述方法包含對該對象施用一有效量之本發明式(I)化合物。依據本發明另一實施方式，所述方法更包含在對該對象施用本發明式(I)化合物的同時、之前或之後，對該對象施用另一種可改善癌症治療效果的藥劑。這類藥劑的實例包括抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、抗生素、減輕疼痛藥物、抗 貧血藥物、細胞激素、顆粒細胞株刺激因子、抗嘔吐藥物以及其他類似物。適合以所述方法來治療(亦即，延緩癌細胞生長或遷移)的癌症可為肝癌、肺癌或乳癌；特別是具有轉移能力或對已知抗癌藥物具有抗藥性之癌細胞。適合接受所述方法治療的對象為哺乳動物，例如，人類。

在一特定實施方式中，本發明方法包含先對罹患肺癌之該對象施用一有效量之艾瑞莎；接著，再施用另一有效量之本發明式(I)化合物-羊毛固醇三萜H。在另一特定實施方式中，所述方法包含同時對罹患肺癌之該對象施用一有效量之艾瑞莎，以及另一有效量之羊毛固醇三萜H。在又另一特定實施方式中，所述方法包含先對罹患肝癌之該對象施用一有效量之蕾莎瓦，再施用另一有效量之本發明式(I)化合物-羊毛固醇三萜G。在另一特定實施方式中，所述方法包含同時對罹患肝肺癌之該對象施用一有效量之蕾莎瓦以及另一有效量之羊毛固醇三萜G。

據此，本揭示內容第四目的在於提供一種可離體殺死癌細胞之方法，包含對該癌細胞施用一有效量之本發明式(I)化合物。在一特定實例中，該式(I)化合物之R₁ 與R₃ 分別為OH，且R₂ 為乙醯氧基，亦即該式(I)化合物為羊毛固醇三萜H(Colossolactone H)，且所施用的有效量介於約10-40 μM間；且適合以本方法殺死的癌細胞為肺癌細胞，特別是對艾瑞莎具有抗性的肺癌細胞。在另一特定實例中，該式(I)化合物之R₁ 為OH，R₂ 為乙醯氧基且R₃ 為H，亦即該式(I)化合物為羊毛固醇三萜G(Colossolactone G)，且所施用的有效量介於約10-20 μM 間；且適合以本方法殺死的癌細胞為肝癌細胞。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖係依據本發明一實施方式以羊毛固醇三萜H抑制(A)H1650、(B)A549或(C)PC9三種肺癌細胞株之細胞活性的示意圖；第2圖係依據本發明一實施方式合併施用羊毛固醇三萜H與艾瑞莎，其造成(A)H1650、(B)A549或(C)PC9三種肺癌細胞株之細胞死亡率的示意圖；第3圖係依據本發明一實施方式以羊毛固醇三萜H抑制PC-9細胞或抑制對艾瑞莎具有抗藥性之PC9-IR細胞之細胞活性的示意圖；第4圖係依據本發明一實施方式以羊毛固醇三萜H抑制對艾瑞莎具有抗藥性之PC9-IR細胞之細胞活性的示意圖；第5圖係依據本發明一實施方式以羊毛固醇三萜H抑制對艾瑞莎具有抗藥性之PC9-IR細胞之細胞死亡率的示意圖；第6圖係依據本發明一實施方式合併施用羊 毛固醇三萜G與蕾莎瓦，其造成(A)Huh7或(B)PLC-5兩種肝癌細胞株之細胞死亡率的示意圖；第7圖係依據本發明一實施方式，羊毛固醇三萜G造成蕾莎瓦在(A)Huh7或(B)PLC-5肝癌細胞中IC₅₀ 濃度下降的示意圖；以及第8圖係依據本發明一實施方式，合併施用羊毛固醇三萜G與蕾莎瓦後，其抑制Huh7肝癌細胞形成細胞群落的能力分析示意圖。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

以下所提供之發明詳細說明與附隨圖示僅在解釋本發明實施方式之用，並非本發明多種實施方式的唯一代表實施方式。以下文字將說明實施例的功能以及如何建構與操作這些實施例的步驟和順序。但是，本發明請求範圍並不僅限於所揭示的實施態樣。

黃芝(G.colossum )是靈芝科真菌中較為罕見的一個品種，由於黃芝非常稀有，因此有關其活性成分的研究並不多。有鑑於此，本案發明人利用溶劑萃取以及層 析技術，包括矽膠管柱層析與逆相高效液相層析(reverse-phase high performance liquid chromatography)，而自乾燥的黃芝子實體中分離出數種化合物，經過結構鑑定，確認其為含有氧雜-A,B-升二-類固醇(oxa-A,B-dihomo-steroidal)骨架的靈芝三萜類化合物。此等化合物在離體試驗(in vitro study)中被證實可增強已知抗癌藥物殺死癌細胞的功效，故未來可開發成已知抗癌藥物的佐劑。

因此，本發明一方面是提供一種自黃芝子實體中分離出來的靈芝三萜化合物的新穎用途，這些靈芝三萜化合物具有下式(I)之結構： 其中，R₁ 及R₃ 分別為H或OH，R₂ 是H或乙醯氧基。

在一特定實例中，該式(I)化合物之R₁ 與R₃ 分別為OH，且R₂ 為乙醯氧基(acetoxy)，亦即(22S ,23R )-A,B-升二-19-降-15-β-乙醯氧-5,23-二羥-4-氧雜-3-氧代羊毛固醇-1,8,19,24-四烯-26,22-內酯[(22S ,23R )-A,B-dihomo-19-nor-15-β-acetoxy-5,23-dihydroxy-4-o xa-3-oxolanosta-1,8,19,24-tetraen-26,22-olide)]或稱羊毛固醇三萜H(Colossolactone H)。

在另一特定實例中，該式(1)化合物之R₁ 為OH，R₂ 為乙醯氧基且R₃ 為H，亦即(22S ,23R )-A,B-升二-19-降-15-β-乙醯氧-5-羥-4-氧雜-3-氧代羊毛固醇-1,8,19,24-四烯-26,22-內酯[(22S ,23R )-A,B-dihomo-19-nor-15-β-acetoxy-5-hydroxy-4-oxa-3-oxolanosta-1,8,19,24-tetraen-26,22-olide)]或稱羊毛固醇三萜G(Colossolactone G)。

本發明(I)化合物可依據2011年6月30日提申，申請號100123260，標題為「新穎化合物、其之製備方法及用途」之台灣專利申請案內容所揭示的方法，從黃芝內單離出此式(I)化合物。據此，將上述專利申請案之全部內容併入本文中作為參考；或者，可依據Kleinwächter等人在2001年1月19日透過網路發佈在美國化學學會與美國生藥學學會(American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy)會刊上標題『羊毛固醇三萜化合物-來自越南靈芝之新穎三萜化合物(Colossolactones,New Triterpenoid Metabolites from a Vietnamese Mushroom Ganoderma Colossum)』的文章中所揭示的方法，而從黃芝內單離出此式(I)化合物。據此，將上述文章之全部內容併入本文中作為參考。

依據本發明一實施方式，此式(I)化合物可增強一已知抗癌藥劑殺死癌細胞的效果。因此，本發明式(I)化合物的新穎用途是做為一種目前已知抗癌藥物之佐劑 (adjuvant)。

「佐劑(adjuvant)」一詞在此係指一物質於加入藥學組合物時，可提升另一藥物之吸收動力且因而可提升其生體可用率，但其本身單獨施用時不具有或僅具有輕微的直接醫療效果。在一特定實施方式中，本發明式(I)化合物可作為艾瑞莎的佐劑，與艾瑞莎同時或先後被施用至一罹患肺癌的對象身上。例如，先施用艾瑞莎後，再接續施用上述本發明式(I)化合物。在另一特定實施方式中，本發明式(I)化合物可作為蕾莎瓦的佐劑，與蕾莎瓦同時或先後被施用至一罹患肝癌的對象身上。例如，先施用蕾莎瓦後，再接續施用上述本發明式(I)化合物。

「對象(subject)」一詞在本文中代表可接受本發明藥學組合物之任何一種動物(例如，人類)，包括，但不限於，人類、非人類的靈長類，如哺乳動物、狗、貓、馬、羊、豬、牛等。一般來說，「患者(patient)」一詞及「對象(subject)」一詞在本文中可彼此交替使用。

抗癌藥物的實例包括，但不限於，Gefitnib(商品名：艾瑞莎膜衣錠(Iressa®)、Sorafenib(商品名：蕾莎瓦)、紫杉醇(paclitaxel)、異丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、喜樹鹼(camptothecin,CPT)、抗癌妥(topotecan,TPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)、阿黴素(Doxorubicin)、丹阿黴素(daunorubicin)、艾阿黴素(epirubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、順鉑(cis-platin)、碳鉑(cyclophosphamide)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、尹氟醯胺(ifosfamide)、溶肉瘤素(melphalan)、絲裂黴素 (mitomycin)、氨基甲基葉酸(methotrexate)、絲羥酮(mitoxantrone)、鬼臼毒素(teniposide)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、博萊黴素(bleomycin)、亞葉酸(leucovorin)、星狀素(cytarabine)、放線菌素D(dactinomycin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、考布丁A4磷酸鹽(combretastatin A4-phosphate)、SU5416及其他類似物。在一特定實施方式中，該抗癌藥物為艾瑞莎。在另一特定實施方式中，該抗癌藥物為蕾莎瓦。

據此，本發明另一目的是提供一種可殺死癌細胞或抑制癌細胞增生的藥學組合物，包含一有效量之抗癌藥物和另一有效量之上述式(I)化合物；及其藥學上可接受的載體。

「一有效量(an effective amount)」一詞意指對治療對象施用一具有療效之化合物或組合物的劑量。療效之衡量可為客觀的(亦即，利用一些試驗或標記物(marker)來衡量)或是主觀的(亦即，治療對象對治療效果與感覺之主觀敘述)。本發明藥學組合物的有效劑量範圍可自約1毫克/公斤至約1,000毫克/公斤，或是自10毫克/公斤至約100毫克/公斤。有效劑量亦會隨著施用途徑之不同以及可能並用的其他藥劑之不同而有所改變。熟知此技藝之人會知道有可能會使用比上述多或少之劑量。對特定病人所使用之特定劑量與治療方法將會受許多變因的影響，包含使用藥物之活性、年齡、體重、整體健康狀況、性別、飲食、施用時間、施用途徑、施用頻率、排泄速率、合併用藥、疾病的進程與嚴重度、患者疾病位置、症狀狀況、醫生對 疾病之處理與判斷。

一般來說，本發明式(I)化合物的含量佔整體藥學組合物重量約0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中，本發明式(I)化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少1%(重量%)。在特定實施方式中，本發明式(I)化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少5%(重量%)。在另一些實施方式中，本發明式(I)化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少10%(重量%)。在又另一些實施方式中，本發明式(I)化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少25%(重量%)。

除本發明式(I)化合物外，上述藥學組合物內尚包含一種已知可改善癌症治療效果的抗癌藥劑。此抗癌藥劑的實例包括，但不限於，Gefitnib(商品名：艾瑞莎膜衣錠(lressa^® )、Sorafenib(商品名：蕾莎瓦膜衣錠(Nexavar^® ))、紫杉醇(paclitaxel)、異丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、喜樹鹼(camptothecin,CPT)、抗癌妥(topotecan,TPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)、阿黴素(Doxorubicin)、丹阿黴素(daunorubicin)、艾阿黴素(epirubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、順鉑(cis-platin)、碳鉑(cyclophosphamide)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、尹氟醯胺(ifosfamide)、溶肉瘤素(melphalan)、絲裂黴素(mitomycin)、氨基甲基葉酸(methotrexate)、絲羥酮(mitoxantrone)、鬼臼毒素(teniposide)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、博萊黴素(bleomycin)、亞葉酸(leucovorin)、星狀素(cytarabine)、放線菌素D(dactinomycin)、鏈尿佐 菌素(streptozocin)、考布丁A4磷酸鹽(combretastatin A4-phosphate)、SU5416及其他類似物。在一特定實施方式中，此抗癌藥劑為艾瑞莎；且合併施用艾瑞莎與上述式(I)化合物(例如，羊毛固醇三萜H)可協同性地提高肺癌細胞死亡率超過2倍以上。在另一特定實施方式中，此抗癌藥劑為蕾莎瓦；且合併施用蕾莎瓦與上述式(I)化合物(例如，羊毛固醇三萜G)可有效提高肝癌細胞死亡率約2倍以上。

這類醫藥品或藥學組合物較佳是透過可有效傳送所述組合物中式(I)化合物及抗癌藥劑的途徑施用至一哺乳類(較佳是人類)身上適當或可產生欲求效果的位置。適當的施用途經可以是例如主動或被動地經口、經鼻、經肺或經皮膜等方式；或是以經腸胃外的方式，如直腸栓劑、皮下注射、靜脈內注射、肌肉內注射、鼻腔內、眼用溶液或軟膏。

舉例來說，本發明藥學組合物可經由口服(如，口服用膠囊、懸浮液或藥錠)、或腸胃外(parenterally)等適當方法施用。腸胃外(parenterally)施用方式包括例如肌肉內注射、靜脈注射、皮下注射或腹膜內注射等系統性方式施用。或是，也可透過穿皮膜方式施用，如局部皮膚塗抹或是吸入性(如支氣管內、鼻腔內、口腔內或鼻滴劑等)；或是直腸內方式施用。施用時可以單獨給藥或併同習知藥學可接受輔劑一起給藥。在較佳實施方式中，可經由口服方式(如，透過食物)將本發明藥學組合物投予治療對象。

若以口服方式施用，可將本發明藥學組合物配方成為內含各種輔劑(如微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸二鈣及甘胺酸)；各種崩解劑(如澱粉、藻酸及特定矽酸鹽)；以及顆粒黏合劑(如，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠及相思樹膠(acacia))的藥錠。除此外，還可包含諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石等的潤滑劑。此固態配方也可當作填充劑用於明膠膠囊內，與此相關的較佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。當使用方式是口服用懸浮液和/或特效藥液(elixirs)時，可組合活性成分與各種甜味劑或風味劑、著色劑或染料一起配方，需要時還可加入乳化劑和/或懸浮劑，以及諸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀釋劑。

若以腸胃外(parenterally)方式施用，可將本發明藥學組合物配方成為液態的藥學組合物，其可為能以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的無菌溶液或懸浮液。可用來製造上述無菌注射溶液或懸浮液的稀釋劑包括，但不限於，1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等張性氯化鈉溶液。也可使用脂肪酸(如，油酸)及其之甘油酯衍生物，或是藥學可接受的油(如，橄欖油或菜籽油)來製造可供注射用的溶液或懸浮液。這類油性溶液或懸浮液中也可包含用來稀釋的醇類或羧甲基纖維素或類似的分散劑。也可使用其他常用的界面活性劑(如，Tweens或Spans系列)或乳化劑，或藥學領域製造配方時常用來增強生物可利用性的藥劑。

也可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物調 製成多種可供局部表面給藥(topical application)的劑型。可使用此領域中習知的各種皮膚可接受的惰性輔劑在這類劑型中。適合皮膚表面施用之配方包括液體、乳霜、乳液、乳膏、凝膠、噴劑、氣霧噴劑、皮膚貼片等類似物。常用的惰性輔劑如水、乙醇、聚乙烯吡咯啶、丙二醇、礦物油、硬脂醇及其他可形成膠狀物的材料。所有上述劑型與輔劑皆為藥學領域所熟知。對於本文所述的組合物之效果而言，劑型的選擇並非關鍵。

亦可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物製成多種適用於黏膜給藥(mucosal application)的劑型，如經頰(buccal)和/或舌下(sublingual)藥物劑型單元，以遞送藥物穿過口腔黏膜。可使用多種生物可降解且藥學可接受的高分子輔劑，此種輔劑可使得藥學組合物具有可接受的吸附效果以及所欲的藥物釋放模式，且可和經頰和/或舌下藥物劑型單元中所含的欲施用活性成分或其他成分相容。一般來說，上述的高分子輔劑包含親水性聚合物，其可黏附至口腔黏膜的濕潤表面。高分子輔劑的實施例包括但不限於丙烯酸聚合物與共聚物(acrylic acid polymers and copolymers)；水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol)；聚乙烯氧化物(polyethylene oxides)；聚丙烯酸酯(polyacrylates)；乙烯聚合物與共聚物(vinyl polymers and copolymers)；聚乙烯吡咯啶；葡萄糖(dextran)；瓜膠(guar gum)；果膠(pectins)；澱粉；及纖維素聚合物(cellulosic polymers)

因此，本發明另一態樣為提供一種延緩或抑制 一對象身上多數癌細胞生長或轉移的方法，其至少包含對該對象施用一有效量之所述藥學組合物，使得該對象身上約90%的該些癌細胞的生長停滯或是不會轉移，因而能達到延緩腫瘤或癌生長或擴散的目的。適合以本發明方法或藥學組合物來治療(亦即，延緩癌細胞生長或轉移)的癌症為肝癌、肺癌或乳癌；特別是具有轉移能力或是具有抗藥性的肺癌或肝癌。在一特定實施方式中，適以本發明方法或藥學組合物來治療的癌症是對非小細胞肺癌之第二線用藥-艾瑞莎具有抗性的肺癌。在此特定實施方式中，係對一罹患肺癌的對象合併施用一有效量之艾瑞莎與另一有效量之所述藥學組合物(其包含有效量之本發明式(I)化合物)。相較於單獨施用所述藥學組合物的治療效果而言，合併施用艾瑞莎與本發明式(I)化合物(如，羊毛固醇三萜H)，可提高對艾瑞莎具有抗性的肺癌細胞(如，PC9-IR細胞)之死亡率約2倍以上。在另一特定實施方式中，適以本發明方法或藥學組合物來治療的癌症是對第三期肝癌藥物-蕾莎瓦具有抗性的肝癌。在此特定實施方式中，係對一罹患肝癌的對象合併施用一有效量之蕾莎瓦與另一有效量之所述藥學組合物(其包含有效量之本發明式(I)化合物-羊毛固醇三萜G)。相較於單獨施用所述藥學組合物的治療效果而言，合併施用蕾莎瓦與本發明式(I)化合物，可提高對蕾莎瓦殺死肝癌細胞之死亡率2倍以上。

除非另行定義，文中所使用之所有專業與科學用語與習知技藝者所熟悉之意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等之方法及材料皆可應用於本發明方法 中。文中所述之較佳實施方法與材料僅做示範之用。於本申請書中所提到之所有參考文獻均全體納入參考，以揭露並敘述該文獻所記載之相關方法及/或材料。此外，文中所討論之文獻僅揭露本發明申請日前之習知技術。並且無任何文獻顯示本發明內容曾為習知技術所揭露。本發明內容所得到之實際數據會因個別的實施條件而與本發明揭露於說明書內容中之數據有所不同。

除非另外指明，否則在本文及附隨之請求項範圍中所述及之單數型式詞，「一(“a“,“an”)或該(“the”)」均涵蓋其複數形式。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料與方法

細胞培育 在本研究中所使用的細胞株包括以下：肺癌細胞株PC9，以及對艾瑞莎敏感的PC9肺癌細胞株(在本文中稱為PC9-IR)；人類肺腺癌細胞株(human lung adenocarcinoma)，包括CL1-5、A549及H1650細胞株；人類肝癌細胞株(human hepatocarcinoma)，包括Huh7及PLC5細胞株；人類直腸癌細胞株(human colon carcinoma cells，簡稱HCT116)；人類乳腺癌細胞株(human carcinoma cells，簡稱MDA-MB-231)。將每一細胞株的細胞分別培育在經Dulbecco氏改良過之Eagle氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中，並添加10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、100單位/ml之盤尼西林、100 ng/ml之鏈黴素硫酸鹽(Invitrogen,Carlsbad,CA)、2mM L- 穀氨酸、非必要胺基酸及丙酮酸鈉(1%)於該基礎培養液中，並維持在37℃的潮溼環境下(5% CO₂ 及95%空氣)。平時將細胞培養於10公分培養盤內，當細胞長到八分滿時進行繼代培養。繼代培養方式係先吸去舊的培養液後，以3毫升的磷酸緩衝液(PBS)清洗培養細胞一次，接著，在37℃下以1毫升之胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.025%)溶液處理細胞5分鐘，使細胞脫離培養盤成懸浮狀態；接著，在懸浮細胞中加入2毫升新鮮的培養液，以中和胰蛋白酶的活性。然後，將細胞打散使平均分布於細胞懸浮液中，留下適當比例的細胞數後，加入新培養液補至適當體積並混勻後，放入37℃培養箱內培養。

細胞活性分析 取約3,000個細胞，將之接種在平底96孔盤中，以培養液補充每一培養孔內的培養液，使體積達180 μL，接著將培養盤放入37℃之培養箱培養過夜。次日加入含不同濃度的式(I)化合物及艾瑞莎之上述培養液。各培養孔內最終體積為200 μL，每個濃度進行三重覆，放入37℃培養箱培養，於48小時後測定細胞活性。

細胞活性測定 活細胞中有大量酸性磷酸酶(ACP)可將其受質磷酸對硝基苯酯(p -nitrophenyl phosphate,p -NPP)轉換成對-硝基苯酚(p -nitrophenol,p -NP)，p -NP在405 nm波長下有最大吸光值，故可藉測定吸光值可定量出細胞中ACP活性，進而推算出細胞的活性。測定細胞活性時，先吸去培養液，以200 μL PBS清洗一次，加入100 μl的分析用緩衝液(內含10 mMp -NPP、0.1 M醋酸鈉、0.1% Triton X-100，且pH約為5.5)，於37℃反應30-40分鐘後加入10 μl的氫氧化鈉(0.1 N)終止反應，以SpectraMax M5 Microplate Reader(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)於波長405 nm測定吸光值代表其細胞活性，以未處理藥物組的細胞活性為1，計算出不同條件藥物處理下的細胞活性比。

死亡細胞分析 利用活細胞對於碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染劑的拒染性來評估細胞是否死亡。將2×10⁵ 顆細胞接種在平底的6孔培養皿中，於培養箱中培養過夜，加入藥物處理48小時後，以5 μg/mL的PI溶液染色30分鐘，接著以PBS清洗。再利用胰蛋白脢分解使細胞脫離培養盤後，加入2毫升的PBS將細胞打散，放入流式細胞儀(Epics XL-MCL Flow Cytometer)中進行分析，並以EXPO32分析軟體分析所得結果。死亡細胞會呈現比較高的螢光強度。

細胞群落形成能力分析 將1.4%的低熔點洋菜膠以1：1的方式與10% FBS-RPMI混合(最終濃度為5% FBS)，在6孔盤的每個孔洞加入2毫升。接著將Huh7細胞用10% FBS-RPMI配成含不同條件藥物(蕾沙瓦：濃度分別為0或5μM，本發明式(I)化合物濃度分別為0、10或20μM)的細胞液，以1：1的方式和稀釋於PBS的0.7%的低熔點洋菜膠混合均勻後，在6孔盤的每個孔洞分別加入2毫升(2,500顆細胞，5% FBS)，待凝固後於上層加入2毫升含藥物之20% FBS-RPMI，並將其培養在37℃且含有5% CO₂ 之培養箱內。7天後以3%的結晶紫進行染色，並以 Olympus IX71倒立式螢光顯微鏡計數每個孔洞內直徑大於100 μm的細胞群落數目。

實施例1

1.1羊毛固醇三萜H作為艾瑞莎佐劑以抑制非抗藥性肺癌細胞株活性及生長的效果

在本試驗中，係以人類肺癌細胞株PC9、人類肺泡腺癌細胞株A549以及人類支氣管肺泡癌細胞株H1650進行活體外抗癌分析；將上述各種癌細胞以不同濃度的羊毛固醇三萜H處理後，測量細胞內酸性磷酸酵素(Acid phosphatase,ACP)的活性，作為細胞活性的指標，結果示於第1-2圖。

如第1A圖所示，當合併使用艾瑞莎與羊毛固醇三萜H來處理H1650細胞後，隨著羊毛固醇三萜H(濃度分別為10、20、40μM)以及艾瑞莎(濃度分別為0.5、1、5、10 μM)的濃度上升，H1650細胞活性下降也越趨明顯。類似的趨勢也可在A549細胞株中觀察到，參見第1B圖。

另一株人類肺癌細胞株PC9對艾瑞莎的處理相當敏感，單獨施以濃度約0.001 μM之艾瑞莎時，可造成約10%的癌細胞活性下降；若合併施以約40μM的羊毛固醇三萜H，則可使癌細胞活性下降超過50%。當提高艾瑞莎濃度至0.005 μM時，可造成癌細胞活性下降達70%；若合併施用艾瑞莎與羊毛固醇三萜H，則癌細胞活性下降可達約85%(第1C圖)。

此外，如第2A及2B圖之死亡細胞分析結果所示，對H1650和A549細胞來說，單獨施用艾瑞莎(10 μM) 或式(I)化合物(40 μM)所能殺死的癌細胞比例有限(<5%)；但合併施用艾瑞莎(10 μM)及羊毛固醇三萜H(40 μM)後，則可協同性地提高癌細胞死亡率至少4倍，達20-25%。

類似的，如第2C圖所示，對於對艾瑞莎較為敏感的PC9細胞來說，單獨施用艾瑞莎(濃度0.001 μM)或羊毛固醇三萜H(40 μM)所能殺死的癌細胞比例不超過10%；然而合併施用艾瑞莎(0.001 μM)及羊毛固醇三萜H(40 μM)後，同樣也可協同性地提高癌細胞死亡率約3倍，達25%左右。

1.2羊毛固醇三萜H作為艾瑞莎佐劑以抑制抗藥性肺癌細胞株(PC9-IR)活性及生長的效果

在癌症臨床治療上，最常遇到的困境是癌細胞對所施加的抗癌藥物發展出抗藥性。因此，本實施例進一步測試羊毛固醇三萜H對具有抗藥性之癌細胞的功效，特別是其作為目前臨床抗癌藥物佐劑的功效。

在本實例中，所使用的臨床標靶藥物為肺癌第二線用藥-艾瑞莎，用來測試的癌細胞為對艾瑞莎具有抗性的肺癌細胞株PC9(以下簡稱PC9-IR細胞株)。大致依照前述方式培養PC9-IR細胞株，並分別測定合併施用羊毛固醇三萜H與艾瑞莎後，PC9-IR細胞的細胞活性與死亡細胞比例。結果示於第3、4及5圖。

第3圖繪示出分別對PC-9細胞與對艾瑞莎具有抗性之PC9-IR細胞，合併施用羊毛固醇三萜H與艾瑞莎兩種藥物後，其細胞活性下降的結果。數據顯示，相較於一般PC-9細胞，PC9-IR細胞確實對艾瑞莎不敏感。對沒 有抗藥性的PC-9細胞來說，僅需約0.005 μM的艾瑞莎，即足以令其細胞活性減少約70%；但對具有抗藥性的PC9-IR細胞來說，即使提高艾瑞莎濃度兩百倍至約1μM，細胞活性僅下降不到20%。但，合併施加羊毛固醇三萜H至經艾瑞莎處理的PC9-IR細胞，則可降低細胞活性至60%；提高艾瑞莎濃度兩千倍至約10μM，細胞活性也僅下降約40%。但，合併施加羊毛固醇三萜H至經艾瑞莎處理的PC9-IR細胞，則可協同性地提高細胞活性降低超過80%。類似的結果也繪示在第4圖中。

第5圖則繪示出合併施用羊毛固醇三萜H(40 μM)與艾瑞莎(10 μM)至PC9-IR細胞後所造成的細胞死亡率。對於對艾瑞莎具有抗藥性的PC9-IR細胞來說，單獨施用艾瑞莎(濃度10 μM)或羊毛固醇三萜H(40 μM)所能殺死的癌細胞比例約8%；然而合併施用艾瑞莎(10 μM)及羊毛固醇三萜H(40 μM)後，可協同性地提高癌細胞死亡率約3倍，達25%左右。

實施例2

2.1羊毛固醇三萜G抑制各種癌細胞株生長的效果

在本試驗中，係以人類肺癌細胞株PC9、CL1-5、對艾瑞莎具有抗性之PC9-IR細胞；人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231；人類大腸癌細胞株HCT-116以及人類肝癌細胞株Hnh7和HCT116進行活體外癌細胞生長抑制分析。將上述各種癌細胞以不同濃度的羊毛固醇三萜G處理後，再測量其死亡率，並據以計算出羊毛固醇三萜G達 成50%致死率的有效濃度。結果示於表I中。

由表I結果可知，羊毛固醇三萜G本身即具有抑制癌細胞生長的效果，惟其需較高濃度，約40-60 μM方可達成50%致死率。

2.2低濃度羊毛固醇三萜G作為蕾莎瓦佐劑以抑制肝癌細胞株活性及生長的效果

依據前述材料方法中的實驗步驟及實施例1之方式，來評估羊毛固醇三萜G與已知抗癌藥物-蕾沙瓦協同抑制肝癌細胞活性的效果，結果示於第6、7圖。

如第6A-6B圖所示，當合併使用蕾沙瓦與羊毛固醇三萜G來處理各種肝癌細胞株後，隨著羊毛固醇三萜G(濃度分別為0、10、20μM)以及蕾沙瓦(濃度分別為0、2.5、5、10 μM)的濃度上升，各肝癌細胞株(包括Huh7、及PLC-5細胞株)之細胞活性下降也越趨明顯。與表I結果最大的不同在於，在此合併使用抗癌藥劑-蕾沙瓦的實例中，所使用的羊毛固醇三萜G濃度相當低，僅為10-20μM，約為其單獨使用時對各肝癌細胞株(包括Huh7及PLC-5及細胞株)之IC₅₀ 濃度的1/4-1/2濃度。

如第6A圖所示，在Huh7細胞經72小時培養，以濃度2.5 μM之蕾沙瓦單獨處理時，僅可造成約5%的癌 細胞活性下降；但若合併施以20 μM的羊毛固醇三萜G，則可加成性地使癌細胞活性下降約25%。當提高蕾沙瓦濃度至5 μM時，可造成癌細胞活性下降約10%；但若合併施用蕾沙瓦與羊毛固醇三萜G，則可使癌細胞活性下降達約42%(第6A圖)。類似的效果也可在PLC-5人類肝癌細胞株中觀察到(第6B圖)。

2.3羊毛固醇三萜G可有效降低蕾莎瓦50%致死率濃度

第7圖繪示出合併使用蕾沙瓦(濃度分別為0、5、10、15、20 μM)與羊毛固醇三萜G(濃度分別為0、10、20 μM))來分別處理Huh7肝癌細胞或PLC-5細胞後，羊毛固醇三萜G對蕾沙瓦之IC₅₀ 濃度的影響。結果顯示在Huh7細胞，當合併施用蕾沙瓦與羊毛固醇三萜G(濃度20 μM)48小時，可有效降低蕾沙瓦之IC₅₀ 濃度約52%；在PLC-5細胞，當合併施用蕾沙瓦與羊毛固醇三萜G(濃度20 μM)72小時，可有效降低蕾沙瓦之IC₅₀ 濃度約51%。

2.4羊毛固醇三萜G抑制Huh7肝癌細胞形成群落

細胞群落形成能力分析(clonogenic assay)乃是癌症研究領域中，慣用來測試藥物處理，對癌細胞本身後續繼續無限制地進行分裂之能力的試驗，其是透過計算這些癌細胞形成群落的數目或群落的大小來估算。每一細胞群落至少必須包含50個細胞。

先依據本文「材料與方法」段落中所揭示的步驟，對上述肝癌細胞施以藥物(蕾沙瓦：濃度分別為0或5 μM)；羊毛固醇三萜G：濃度分別為0、10或20 μM)處理，然後再繼續培育殘存的癌細胞，並以細胞群落分析來觀察這些肝癌細胞後續形成細胞群落的能力。結果繪示於第8圖。

如第8圖所示，單獨使用羊毛固醇三萜G，對Huh7肝癌細胞形成群落能力的影響不大；濃度20 μM的羊毛固醇三萜G，可減少24%之癌細胞群落數目。單獨使用5 μM蕾沙瓦，可減少約32%之癌細胞群落數目，若合併使用5 μM蕾沙瓦及20 μM的羊毛固醇三萜G，則可進一步減少約70%之癌細胞群落數目。此結果顯示，本發明之羊毛固醇三萜G確實具有當作抗癌藥物之佐劑的功能。

雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。舉例來說，上述的說明書、實施例與數據已提供了與本發明相關之結構與實施例之完整說明，任何習知技藝人士將可在不背離本發明精神與範疇下，參照上述一或多個特定實施方式進行各種改良或變化，這些改良或變化應該被視為本發明下附請求範圍之範疇。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

Claims (18)

1. 一種具有下式(I)結構之化合物的用途，其係可作為一抗癌藥物之佐劑： 其中，R₁ 及R₃ 分別為H或OH；且R₂ 是H或乙醯氧基(acetoxy)；其中，該抗癌藥物是艾瑞莎或蕾莎瓦。
2. 如請求項1所述之用途，其中該式(I)化合物之R₁ 及R₃ 均為OH，R₂ 為乙醯氧基；且該抗癌藥物是艾瑞莎。
3. 如請求項1所述之用途，其中該式(I)化合物之R₁ 為OH，R₂ 為乙醯氧基，R₃ 為H；且該抗癌藥物是蕾莎瓦。
4. 一種可殺死癌細胞之藥學組合物，包含：一有效量之式(I)化合物； 一有效量之艾瑞莎或蕾莎瓦抗癌藥物；以及其藥學上可接受的載劑；其中，R₁ 及R₃ 分別為H或OH；且R₂ 是H或乙醯氧基。
5. 如請求項4所述之藥學組合物，其中該式(I)化合物之R₁ 及R₃ 均為OH，R₂ 為乙醯氧基；且該抗癌藥物是艾瑞莎。
6. 如請求項5所述之藥學組合物，其中該癌細胞為肺癌細胞。
7. 如請求項6所述之藥學組合物，其中該癌細胞為對艾瑞莎具有抗性的肺癌細胞。
8. 如請求項4所述之藥學組合物，其中該式(I)化合物之R₁ 為OH，R₂ 為乙醯氧基，R₃ 為H；該抗癌藥物是蕾莎瓦。
9. 如請求項8所述之藥學組合物，其中該癌細胞為肝癌細胞。
10. 如請求項9所述之藥學組合物，其中該癌細胞為對蕾莎瓦具有抗性的肝癌細胞。
11. 一種離體殺死癌細胞的方法，包含對該癌細胞施用一有效量之艾瑞莎或蕾莎瓦抗癌藥物，以及一有效量之式(I)化合物； 其中，R₁ 及R₃ 分別為H或OH；且R₂ 是H或乙醯氧基。
12. 如請求項11所述之方法，其中該抗癌藥物及式(I)化合物係同時或先後施用至該癌細胞上。
13. 如請求項11所述之方法，其中該式(I)化合物之R₁ 及R₃ 均為OH，且R₂ 為乙醯氧基；且所施用的有效量介於約10-40μM間。
14. 如請求項13所述之方法，其中該癌細胞為肺癌細胞。
15. 如請求項14所述之方法，其中該癌細胞為對艾瑞莎具有抗性的肺癌細胞。
16. 如請求項11所述之方法，其中該式(I)化合物之R₁ 為OH，R₂ 為乙醯氧基且R₃ 為H；且所施用的有效量介於約10-20μM間。
17. 如請求項16所述之方法，其中該癌細胞為肝癌細胞。
18. 如請求項17所述之方法，其中該癌細胞為對蕾莎 瓦具有抗性的肝癌細胞。