TW201300120A - 新穎化合物、其之製備方法及用途 - Google Patents

Abstract

在此揭示一種自黃芝(Ganoderma colossum(Fr.) Baker)中分離出來的新穎三萜化合物、其之製備方法與藥學上的用途。此新穎三萜化合物具有氧雜-A,B-升二-類固醇(oxa-A,B-dihomo-steroidal)骨架，且離體試驗證實其具有可抑制癌細胞生長、轉移或發炎基因表現的功效，因此可做為未來開發抗癌藥物或抗發炎藥物的先導化合物。

Description

新穎化合物、其之製備方法與用途

本揭示內容大致是有關於一種自靈芝中分離出來的新穎化合物，製備此新穎化合物的方法及其用途。詳言之，本揭示內容係有關自黃芝(Ganoderma colossum(Fr.)Baker)中分離出來的一種包含有氧雜-A,B-升二-類固醇(oxa-A,B-dihomo-steroidal)骨架的新穎三萜化合物；此新穎三萜化合物的分離方法；以及以此新穎三萜化合物來製備抗癌或抗發炎藥物的用途。

食藥用真菌被廣泛做為保健食品，其中又以靈芝為大宗。在東南亞地區，更常以靈芝子實體入藥。由於靈芝可在生體內啟動諸多正面的反應，相關活性成分的研究很多，其活性成分大致被區分成五大類：靈芝三萜類(triterpenoids)、多醣體(polysaccharides)、核苷(nucleotides)、植物固醇類(phytosterols)及多肽類(polypeptides)。

黃芝(G. colossum)是靈芝科靈芝屬中的一屬，因黃芝較為稀少，因此相關活性成分的研究並不多。本申請案發明人即是在進行黃芝研究過程中，意外發現一種新穎的靈芝三萜化合物，且於離體試驗中證實此一新發現的靈芝三萜化合物具有可抑制癌細胞生長、轉移以及發炎基因表現的功效，因此可做為未來開發成抗腫瘤生長藥物或抗發炎藥物的先導化合物。

如本揭示內容所廣泛描述與例示，本揭示內容目標為提供一種自黃芝中分離出來的新穎化合物，以及此新穎化合物的用途。

因此，本揭示內容第一目的在於提供一種自黃芝中分離出來之具備有氧雜-A,B-升二-類固醇(oxa-A,B-dihomo-steroidal)骨架的新穎三萜化合物，具有如下式(I)之結構：

依據本發明一實施方式，此新穎之式(I)化合物具有抑制癌細胞生長、轉移或抑制發炎基因表現的功效，故未來可開發成抗癌或抗發炎藥物。

據此，本揭示內容第二目的在於提供一種分離上述新穎式(I)化合物之方法，包含以下步驟：

(a)　以一第一溶液萃取一黃芝(G. colossum)子實體，以獲得一第一萃出物，其中該黃芝子實體與該第一溶液係以重量：體積約為1：10至1:50之比例混合；

(b)　以一由水及有機溶劑組成之第二溶液萃取該第一萃出物，以獲得一水層與一有機層萃出物，其中水及有機溶劑是以體積比約1:1至2:3之比例混合；

(c)　在一矽膠管柱中，以一第三溶液沖提該有機層萃出物，並收集一第一沖提液；

(d)　在一逆相高效液相層析管柱(reverse-phase high performance liquid chromatography)中，以一濃度介於20%至95%(體積%)間的第四溶液沖提該第一沖提液，以獲得一第二沖提液；以及

(e)　濃縮乾燥該第二沖提液以獲得該式(I)化合物。

依據本揭示內容一實施方式，所述步驟(a)中該第一溶液為70%-95%(體積%)之乙醇；所述步驟(b)中該有機溶劑是乙酸乙酯，且該第二溶液是由等體積之水與乙酸乙酯混合而成；所述步驟(c)中該第三溶液是由體積比介於1:0至0:1之己烷與乙酸乙酯所組成；所述步驟(d)中該第四溶液為濃度介於60%-80%(體積%)之甲醇。

本揭示內容第三目的在於提供一種可抑制癌細胞增生、轉移或抑制發炎基因表現之藥學組合物，包含一有效量之式(I)化合物；及其藥學上可接受的載劑(excipient)。

依據本發明一實施方式，適合以所述藥學組合物來抑制其生長或遷移的癌細胞為肝癌或肺癌細胞。

據此，本揭示內容第四目的在於提供一種可延緩一個體體內之癌細胞生長、轉移或抑制該個體之發炎狀況的方法，包含對該個體施用上述之藥學組合物。

依據本發明一實施方式，適合以所述方法來治療(亦即，延緩癌細胞生長或遷移)的癌症可為肝癌、肺癌或乳癌；特別是具有轉移能力的肺癌或乳癌。適合接受所述方法治療的個體為哺乳動物，例如，人類。

以下所提供之發明詳細說明與附隨圖示僅在解釋本發明實施方式之用，並非本發明多種實施方式的唯一代表實施方式。以下文字將說明實施例的功能以及如何建構與操作這些實施例的步驟和順序。但是，本發明請求範圍並不僅限於所揭示的實施態樣。

黃芝(G. colossum)是靈芝科真菌中較為罕見的一個品種，由於黃芝非常稀有，因此有關其活性成分的研究並不多。有鑑於此，本案發明人利用溶劑萃取以及層析技術，包括矽膠管柱層析與逆相高效液相層析(reverse-phase high performance liquid chromatography)，而自乾燥的黃芝子實體中分離出一種新穎化合物，經過結構鑑定，確認其為含有氧雜-A,B-升二-類固醇(oxa-A,B-dihomo-steroidal)骨架的靈芝三萜類化合物。此新穎化合物在體外試驗(in vitro study)中被證實可抑制癌細胞生長及發炎基因表現，故未來可開發成抗癌或抗發炎藥物。

因此，本發明一方面是提供一種自黃芝子實體中分離出來的新穎靈芝三萜化合物，即(22S,23R)-A,B-升二-19-降-15-β-乙醯氧-5,23-二羥-4-氧雜-3-氧代羊毛固醇-1,8,19,24-四烯-26,22-內酯[(22S,23R)-A,B-dihomo-19-nor-15-β-acetoxy-5,23-dihydroxy-4-oxa-3-oxolanosta-1,8,19,24-tetraen-26,22-olide)]或稱羊毛固醇三萜H(Colossolactone H)，其具有以下式(I)之結構：

本發明另一方面是要提供一種自黃芝子實體中分離出上述式(I)化合物的方法，包含以下步驟：

(a)　以一第一溶液萃取黃芝子實體，以獲得一第一萃出物，其中該黃芝子實體與該第一溶液係以重量：體積約為1：10至1:50之比例混合；

(b)　以一由水及有機溶劑組成之第二溶液萃取該第一萃出物，以獲得一水層與一有機層萃出物，其中水及有機溶劑是以體積比約1:1至2:3之比例混合；

(c)　在一矽膠管柱中，以一第三溶液沖提該有機層萃出物，並收集一第一沖提液；

(d)　在一逆相高效液相層析管柱中，以一濃度介於20%至95%(體積%)間的第四溶液沖提該第一沖提液，以獲得一第二沖提液；以及

(e)　濃縮乾燥該第二沖提液以獲得該式(I)化合物。

依據本揭示內容一實施方式，在上述步驟(a)中，黃芝子實體較佳是先經過乾燥處理使其含水量下降，以避免新鮮的黃芝子實體腐敗而使其中活性化合物改變或含量下降。接著，將乾燥的子實體粉碎成大小均勻的碎屑或粉末，才與第一溶液混合並進行萃取，以獲得第一萃出物。適合的第一溶液為醇類，包括(但不限於)乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇及異丁醇。在一較佳實施方式中，第一溶液為70%-95%(體積%)之乙醇；較佳是95%(體積%)之乙醇。乾燥的黃芝子實體粉末與第一溶液(如，乙醇)較佳是以乾燥粉末重量：第一溶液體積為1：10至1:50之比例混合，更佳是以1:20至1:40的比例混合；最佳是以約1:25至約1:35比例混合。舉例來說，1公斤的黃芝子實體乾燥粉末至少需添加10公升之95%(體積%)乙醇。混合物可以加熱震盪、廻流浸煮或室溫浸泡等方式進行萃取。在一較佳實施方式中，黃芝子實體乾燥粉末與第一溶液是以1：24的比例混合，然後在37℃下浸煮混合物約24小時後，即可得一粗萃液。接著，將此粗萃液過濾、濃縮並乾燥(可以任何習知方式來執行此過濾、濃縮及乾燥的步驟)成粗萃物。

接著，在步驟(b)中，以一種由水與有機溶劑組成的第二溶液來萃取步驟(a)所獲得的第一萃出物。由於第二溶液是由彼此不互溶或極性不同的兩種溶劑以約1:1至約2:3之比例組成，因此萃取後會分成兩層，分別為水層以及有機層。適合用於此步驟中的有機溶劑為低碳數的酯類，包括，但不限於甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯及丙酸丙酯；較佳是乙酸乙酯。在一較佳實施方式中，此第二溶液是由等體積之水與乙酸乙酯混合而成，但需知水與乙酸乙酯亦可以其他適合的比例混合，此領域中習知技藝人士可依據實際操作狀況，透過簡單的試驗找到最適合當時狀況的混合比例。在以第二溶液萃取上述步驟(a)之第一萃出物後，保留有機層之萃出物，用於接續的分離步驟(c)至(e)中。

可重複進行上述步驟(b)數次，例如，1、2或3次，將每一次獲得的有機層萃出物合併，用於接續的分離步驟(c)至(e)中。

在步驟(c)中，將上述步驟(b)之乙酸乙酯層萃出物載入至矽膠管柱中，接著以由體積比介於1:0至0：1之己烷與乙酸乙酯所組成的該第三溶液沖提，並收集所得第一沖提液。適合用來沖提矽膠管柱的第三溶液是由體積比介於1:0至0：1之己烷與乙酸乙酯所組成。

在步驟(d)中，進一步地將步驟(c)所獲得的第一沖提液載入至一逆相高效液相層析管柱中，在約0.5~20毫升/分鐘的流速下(較佳是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14毫升/分鐘，更佳是約2、3、4、5、6、7、8或9毫升/分鐘)，以濃度在20%至95%(體積%)間，例如約20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%；更佳是約50%至90%(體積%)間，例如約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%；最佳是60%至80%(體積%)間，例如約60%、65%、70%、75%或80%之第四溶液進行沖提，並收集所得沖提液。適合用來沖提管柱的第四溶液包括，但不限於水或醇類，包括水、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正-丁醇、異-丁醇等。在一特定實例中，此第四溶液是濃度介於60-80%(體積%)的甲醇溶液。在一特定實例中，此第四溶液是濃度介於60-80%(體積%)的甲醇溶液。

在此一實例中，可將沖提後的沖提液收集在一起，並經減壓濃縮及冷凍乾燥後，獲得欲求的黃芝化合物。在一特定實例中，所沖提出來的新穎化合物經NMR、UV及高解析度電噴霧電離質譜(high resolution electrospray ionization mass spectroscopy,HREIMS)等儀器分析鑑定後，確認其為(22S,23R)-A,B-升二-19-降-15-β-乙醯氧-5,23-二羥-4-氧雜-3-氧代羊毛固醇-1,8,19,24-四烯-26,22-內酯，又稱羊毛固醇三萜H。經由本發明方法分離出來的新穎化合物產率約為0.04%(此百分比係為式(I)化合物重量/子實體乾重)。此外，可以任何習知的方式來將產物濃縮、乾燥。在一實例中，係在一減壓環境下，例如壓力約0.1 torr的環境下，將沖提液濃縮，待沖提液中的固形物含量達20%時，即停止此濃縮處理。接著，將濃縮物乾燥，例如，在-30℃~-50℃下冷凍乾燥。

據此，本發明另一發明目的是提供一種可抑制癌細胞增生或抑制發炎的藥學組合物，包含一有效量之式(I)化合物；及其藥學上可接受的載體。

「一有效量(an effective amount)」一詞意指對治療對象施用一具有療效之化合物或組合物的劑量。療效之衡量可為客觀的(利用一些試驗或標誌來衡量)或是主觀的(治療對象給予其對效果與感覺之敘述)。本發明藥學組合物的有效劑量範圍可自約1毫克/公斤至約1000毫克/公斤，或是自10毫克/公斤至約100毫克/公斤。有效劑量亦會隨著施用途徑之不同以及可能並用的其他藥劑之不同而有所改變。熟知此技藝之人會知道有可能會使用比上述多或少之劑量。對特定病人所使用之特定劑量與治療方法將會受許多變因的影響，包含使用藥物之活性、年齡、體重、整體健康狀況、性別、飲食、施用時間、施用途徑、施用頻率、排泄速率、合併用藥、疾病的進程與嚴重度、患者疾病位置、症狀狀況、醫生對疾病之處理與判斷。

因此，本發明一態樣為提供一種延緩或抑制一個體身上多數癌細胞生長或轉移的方法，其至少包含對該個體施用一有效量之所述藥學組合物，使得該個體身上約90%的該些癌細胞的生長停滯或是不會轉移，因而能達到延緩腫瘤或癌生長或擴散的目的。適合以本發明方法或藥學組合物來治療(亦即，延緩癌細胞生長或轉移)的癌症為肝癌、肺癌或乳癌；特別是具有轉移能力的肺癌或乳癌。

本發明另一態樣則是提供一種可抑制或減緩一個體之發炎狀況的方法，其至少包含對該個體施用一有效量之所述藥學組合物，使得該個體之發炎基因表現受到抑制，因而能達成減緩發炎的效果。

「個體(subject)」一詞在本文中代表可接受本發明藥學組合物之任何一種動物(例如，人類)，包括，但不限於，人類、非人類的靈長類，如哺乳動物、狗、貓、馬、羊、豬、牛等。一般來說，「患者(patient)」一詞及「個體(subject)」一詞在本文中可彼此交替使用。

除非另行定義，文中所使用之所有專業與科學用語與習知技藝者所熟悉之意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等之方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述之較佳實施方法與材料僅做示範之用。於本申請書中所提到之所有參考文獻均全體納入參考，以揭露並敘述該文獻所記載之相關方法及/或材料。此外，文中所討論之文獻僅揭露本發明申請日前之習知技術。並且無任何文獻顯示本發明內容曾為習知技術所揭露。本發明內容所得到之實際數據會因個別的實施條件而與本發明揭露於說明書內容中之數據有所不同。

除非另外指明，否則在本文及附隨之請求項範圍中所述及之單數型式詞，「一(“a“,“an”)或該(“the”)」均涵蓋其複數形式。

以下，將透過實施例來闡述本發明的較佳實施方式。

實施例 實施例1　自黃芝子實體中分離式(I)化合物

羊毛固醇三萜H(Colossolactone H)

(22S,23R)-A,B-升二-19-降-15-β-乙醯氧-5,23-二羥-4-氧雜-3-氧代羊毛固醇-1,8,19,24-四烯-26,22-內酯

(22S,23R)-A,B-dihomo-19-nor-15-β-acetoxy-5,23-dihydroxy-4-oxa-3-oxolanosta-1,8,19,24-tetraen-26,22-olide

1.1　製備黃芝子實體之醇溶粗萃物

將乾重為50克的黃芝子實體以粉粹機碎裂成粉末後，置於震盪萃取裝置內。接著以黃芝子實體粉末乾重量：溶劑體積=1：24之比例，加入1,200毫升的酒精溶劑，在37℃下浸煮一天後，將浸煮液濃縮。重複此萃取、濃縮步驟數次，合併所得的萃取液並經過濾與減壓濃縮抽乾後，可得13克(產率：26%)的黃芝子實體醇溶粗萃物。接著，在40℃恆溫真空乾燥系統內隔夜抽濾去除所得黃芝子實體醇溶粗萃物中的殘餘溶劑。

1.2　製備黃芝子實體之乙酸乙酯萃出物(GCAE)

於上述實施例1.1所得之乾重為13.0克的黃芝子實體醇溶粗萃物中，加入以等體積比例混合之水與乙酸乙酯(H₂O: ethyl acetate=1：1)的混合溶液，以進行萃取，可得一水層溶液以及乙酸乙酯萃取層溶液，將此乙酸乙酯萃取層溶液濃縮乾燥後，以40℃恆溫真空乾燥系統隔夜抽濾去除殘餘溶劑，可得乾重為9.5克的黃芝子實體乙酸乙酯萃取物(GCAE)，相對於總黃芝子實體醇溶粗萃物而言，此GCAE產率約為19%。

1.3　以矽膠管柱層析分離出式(I)化合物

將上述實施例1.2所得乾燥的黃芝子實體乙酸乙酯萃取物(GCAE)，以開放式矽膠管柱(silica gel 60,25×3.5 cm)進行層析，利用己烷：乙酸乙酯=1:1之溶劑系統進行梯度沖提後，將其劃分為12個區分層，分別稱為第1至12區分層。進一步地，利用逆向高壓液相層析系統(HPLC/Diode array)以60%-80%甲醇溶液系統對第11個區分層(247.7毫克)進行分離純化，可得18毫克之式(I)化合物的白色粉末狀固體，相對於總黃芝子實體醇溶粗萃物而言，此式(I)化合物的產率為0.04%。

進一步以IR、UV、¹HNMR、¹³CNMR、HREIMS及CD對此式(I)化合物進行鑑定，相關數據如下示：mp 149-156℃;+48.5(c 0.40,MeOH);IR(KBr)ν_max 3418,2930,1705,1576,1446,1372,1248,1142,1021 cm^-1;UV(MeOH)λ _max 250(sh),340 nm;CD Δε₂₅₁-5.446,Δε₃₅₃,+0.936(c 1.44×10^-4 mM,MeOH);¹H NMR(CD₃OD,500 MHz)δ7.08(1H,d,J=10.0 Hz,H-1),6.62(1H,m,H-24),6.38(1H,s,H-19),5.80(1H,d,J=10.0 Hz,H-2),4.91(1H,d,brs,J=7.0 Hz,H-15),4.41(1H,dd,J=10.5,2.0 Hz,H-23),2.67(1H,m,H-16a),2.34(1H,m,H-6a),2.33(2H,m,H-11),2.24(1H,m,H-6b),2.12(1H,m,H-17),2.08(1H,m,H-20),2.05(3H,s,H-2'),1.88(3H,s,H-27),1.83(2H,m,H-12),1.51(1H,m,H-16b),1.24(3H,s,H-29),1.17(3H,s,H-18),1.14(3H,s,H-28),1.06(3H,d,J=5.5 Hz,H-21),1.03(3H,s,H-30);¹³C NMR(CD₃OD,125 MHz)δ172.0(s,C-1'),167.5(s,C-3),167.4(s,C-26),150.6(d,C-1),150.2(s,C-8),147.5(d,C-24),141.2(d,C-19),134.8(s,C-10),129.7(s,C-25),127.7(s,C-9),117.0(d,C-2),94.9(s,C-5),85.8(d,C-22),79.9(s,C-15),77.9(s,C-4),64.1(d,C-23),56.6(s,C-14),47.2(d,C-17),45.9(t,C-6),45.7(s,C-13),39.2(t,C-16),36.9(d,C-20),32.6(t,C-12),28.9(t,C-11),27.6(t,C-7),25.1(q,C-28),24.7(q,C-29),24.7(q,C-30),21.6(q,C-2'),17.7(q,C-18),16.9(q,C-27),13.3(q,C-21);HRESIMS m/z 577.2767[M+Na]⁺(Calc. for C₃₂H₄₂O₈Na,577.2772).

實施例2　式(I)化合物之體外抗癌活性分析

在本試驗中，係以人類肝癌細胞株HepG2以及人類肺癌細胞株A549進行活體外抗癌分析；將細胞以不同濃度的式(I)化合物處理後，測量細胞內酸性磷酸酵素(Acid phosphatase,ACP)的活性，作為細胞活性的指標。

2.1　細胞培養

以DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養液當作HepG2或A549細胞株的基礎培養液，並在其中添加盤尼西林G(100 units/ml)、鏈黴素硫酸鹽(100 ng/ml)、L-麩醯胺、非必要胺基酸、胎牛血清(10%)及丙酮酸鈉(1%)。平時將細胞培養於10公分培養盤內，當細胞長到八分滿時進行繼代培養。繼代培養方式係先吸去舊的培養液後，以3毫升的磷酸緩衝液(PBS)清洗培養細胞一次，接著，在37℃下以1毫升之胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.025%)溶液處理細胞5分鐘，使細胞脫離培養盤成懸浮狀態；接著，在懸浮細胞中加入2毫升新鮮的培養液，以中和胰蛋白酶的活性。然後，將細胞打散使平均分布於細胞懸浮液中，留下適當比例的細胞數後，加入新培養液補至適當體積並混勻後，放入37℃培養箱內培養。

2.2　抗癌活性分析

取約3,000個HepG2細胞，將之接種在平底96孔盤中，以培養液補充每一培養孔內的培養液，使體積達180 μL，接著將培養盤放入37℃之培養箱培養過夜。次日加入以不含胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的上述基礎培養液稀釋成不同濃度的式(I)化合物，各培養孔內最終體積為200 μL，式(I)化合物濃度分別為0、5、10、20及40 μg/ml，每個濃度進行三重覆，放入37℃培養箱培養，於72小時測定細胞活性。

細胞活性測定：活細胞中有大量酸性磷酸酶(ACP)可將其受質磷酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)轉換成對-硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)，p-NP在405 nm波長下有最大吸光值，故可藉測定吸光值可定量出細胞中ACP活性，進而推算出細胞的活性。

測定細胞活性時，先吸去培養液，以200 μL PBS清洗一次，加入100 μl的分析用緩衝液(內含10 mM p-NPP、0.1 M醋酸鈉、0.1% Triton X-100，且pH約為5.5)，於37℃反應30分鐘後加入10 μl的氫氧化鈉(0.1 N)終止反應，以MRX II ELISA Reader(DYN-EX Tech.,USA)於波長410 nm測定吸光值，進而換算出不同條件處理下的細胞活性。結果示於第1及2圖。

如第1圖所示，當細胞以式(I)化合物處理後，活性下降，且隨著式(I)化合物的濃度上升以及處理時間增加，細胞活性下降越明顯，式(I)化合物對於HepG2的IC₅₀(抑制50%細胞活性之濃度)約為25 μM。類似的趨勢也可在A549細胞株中觀察到，參見第2圖，處理72小時後，式(I)化合物對於A549細胞的IC₅₀約為38 μM。

實施例3　式(I)化合物之體外抗發炎活性分析

當細胞受到外來刺激時，會活化環氧合酶(cyclooxygenase,COX)，使花生四烯酸(arachidonic acid)轉變成前列腺素(prostaglandin G2,PG)，再轉變成不同的代謝物，如前列腺素E2(PGE2)、前列腺素D2(PGD2)等等，進而引起血管擴張與紅、腫、熱、痛等發炎反應。在細胞中有兩種COX酵素存在，分別為COX-1與COX-2，COX-1平時即存在於細胞中，於各組織中表現並合成前列腺素以調節正常的生理功能，如調控腎血管阻力與維持胃腸道微血管的完整性。COX-2在正常細胞中的表現量非常低，只有在受到發炎性刺激或細胞素(cytokine)刺激時，才會被誘導生成，進而大量合成前列腺素。COX-2能夠被選擇性的抑制，因其與COX-1的活化位置不同，若一待測物能抑制COX-2的表現量，即表示此待測物具有抑制發炎反應的活性。

在本實驗例中，以老鼠巨噬細胞RAW264.7為細胞模式，施以脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)處理促使細胞內COX-2的表現量上升，再觀察式(I)化合物是否可抑制COX-2的表現，以評估式(I)化合物是否可做為抗發炎藥物。

3.1抗發炎反應分析

將老鼠巨噬細胞株RAW264.7培養在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中，並大致依實施例2.1之操作方式進行培育。

測定細胞內mRNA表現量　在直徑6公分的細胞培養盤中，放入3×10⁵個細胞，待其貼附至培養盤底部後，分別加入1、5、10、20μg/ml之式(I)化合物(相當於1.8、9、18、36μM之式(I)化合物)，於37℃下培養1小時後，再以脂多醣(1μg/ml)處理7小時，接著萃取細胞內的RNA。

取2μg RNA進行反轉錄反應(此反轉錄反應溶液中含有0.5 mM dNTPs、10 mM DTT、50 mM Tris-HCl(pH 8.3)、75 mM KCl,3 mM MgCl₂以及200 unit SuperScript^TM III RNase H-反轉錄酶)，於50℃下反應2小時，使mRNA完全反轉錄成cDNA。接著，進行即時聚合酶連鎖反應，取200 ng cDNA，與最終濃度為400 nM的一對引子，即5’-CCT CTG CGA TGC TCT TCC GA-3’(序列編號：1)及5’-CAC TTA TAC TGG TCA AAT CC-3’(序列編號：2)，混合均勻後，加入10 μl的反應緩衝液(含有dNTP混合物、緩衝液、Mg²⁺、Tag聚合酶以及SYBR綠I與參考顏料)，加水至終體積為20μL。以GADPH基因表現量為校正基準，並以未加藥處理之細胞組別為控制組，以應用生物系統7500快速即時PCR分析儀(Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR)，測定PCR產物之螢光變化，並據此回推出各基因的表現量。依據製造商所提供的軟體計算出各表現基因的變化量。結果示於第3圖中。

如第3圖所示，相較於控制組(即，只施以LPS處理的細胞)，隨著式(I)化合物濃度增加，其抑制COX-2基因表現的能力也隨之上升。根據本實驗結果初步顯示，式(I)化合物具有抑制發炎反應的活性，因此未來可開發成為抗發炎藥物。

實施例4　式(I)化合物之體外抑制癌轉移活性分析

惡性腫瘤轉移是癌症難以痊癒的原因之一，因此化合物能抑制癌轉移的能力極有醫藥價值。我們利用三株具有高轉移能力的癌細胞株，包括肺癌細胞株PC9和CL1-5，以及乳癌細胞株MDA-MB231,在體外以傷口癒合試驗(wound-healing assay)來分析癌細胞轉移的能力。

4.1　傷口癒合試驗

在24孔培養皿中置入細胞培養間隔物(Culture-Insert，購自ibidi,Gmbh,Germany)，在每個有插入細胞培養間隔物的培養孔中加入70 μl細胞懸浮液(含3x10⁴個細胞)，搖晃使細胞分布均勻，將培養皿置入37℃的二氧化碳培養箱中培養，待細胞貼附後移除細胞培養間隔物，可以看到細胞被培養間隔物造成的分隔(稱為『傷口』)，將培養基置換成含1% FBS的DMEM培養基，並加入式(I)化合物，分別於0小時、12小時、24小時及48小時以顯微鏡(10X物鏡)觀察『傷口』被細胞覆蓋的的狀況並拍照，再以Image-J軟體定量分析『傷口』的癒合。結果顯示於第4及5圖中。

如第4圖所示，相較於控制組(即，未經式(I)化合物處理的細胞)，隨著式(I)化合物濃度增加，其抑制PC9肺癌細胞爬行的能力也隨之上升。根據本實驗結果顯示，如第5圖所示，式(I)化合物具有抑制PC9和CL1-5兩種肺癌細胞以及MDA-MB231乳癌細胞爬行的活性，因此未來可開發成為抗癌轉移的藥物。

雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。舉例來說，上述的說明書、實施例與數據已提供了與本發明相關之結構與實施例之完整說明，任何習知技藝人士將可在不背離本發明精神與範疇下，參照上述一或多個特定實施方式進行各種改良或變化，這些改良或變化應該被視為本發明下附請求範圍之範疇。

以下提供本揭示內溶附隨圖式之簡要說明，其中：

第1圖係依據本發明一實施方式以式(I)化合物來抑制HepG2肝癌細胞生長的示意圖；

第2圖係依據本發明一實施方式以式(I)化合物來抑制A549肺癌細胞生長的示意圖；

第3圖係依據本發明一實施方式以式(I)化合物來抑制發炎指標COX-2基因表現量的示意圖；

第4圖係依據本發明一實施方式以式(I)化合物來抑制PC9肺癌細胞體外癌轉移的示意圖；以及

第5圖係依據本發明一實施方式以式(I)化合物抑制PC9和CL1-5兩種肺癌細胞以及MDA-MB231乳癌細胞之體外癌轉移活性量化的示意圖。

Claims (9)

1. 一種具有下式(I)結構之化合物：
2. 一種製備如請求項1所述之化合物的方法，包含：(a)　以一第一溶液萃取一黃芝(G. colossum)子實體，以獲得一第一萃出物，其中該黃芝子實體與該第一溶液係以重量：體積約為1：10至1:50之比例混合；(b)　以一由水及有機溶劑組成之第二溶液萃取該第一萃出物，以獲得一水層及一有機層萃出物，其中水及有機溶劑是以體積比約1:1至2:3之比例混合；(c)　將該有機層萃出物載入至一矽膠管柱中，以一第三溶液進行沖提，並收集一第一沖提液；(d)　將該第一沖提液載入至一逆相高效液相層析管柱中，以一濃度介於20%至95%(體積%)間的第四溶液進行沖提，以獲得一第二沖提液；以及(e)　濃縮乾燥該第二沖提液以獲得該請求項1所述之化合物。
3. 如請求項2所述之方法，其中步驟(a)中該第一溶液為70%-95%(體積%)之乙醇；且該黃芝子實體與該第一溶液係以重量：體積約為1：20至1:40之比例混合。
4. 如請求項2所述之方法，其中步驟(b)中該有機溶劑是乙酸乙酯，且該第二溶液是由等體積之水與乙酸乙酯混合而成。
5. 如請求項2所述之方法，其中步驟(c)中該第三溶液是由體積比介於1:0至0：1之己烷與乙酸乙酯所組成。
6. 如請求項2所述之方法，其中步驟(d)中該第四溶液為濃度介於60%-80%(體積%)之甲醇，並接續進行步驟(c)至(e)。
7. 如請求項2所述之方法，其中步驟(e)中該請求項1所述之化合物的產率約為0.04%。
8. 一種可抑制細胞增生、細胞轉移或抑制發炎之藥學組合物，包含一有效量之如請求項1所述之化合物；及其藥學上可接受的載劑(excipient)。
9. 一種可延緩一個體體內之癌細胞生長、轉移或抑制該個體之發炎狀況的方法，包含對該個體施用如請求項8所述之藥學組合物。