TWI389699B - 用於誘導細胞凋亡之樟芝子實體乙醇萃取物及其製備方法 - Google Patents

用於誘導細胞凋亡之樟芝子實體乙醇萃取物及其製備方法 Download PDF

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Description

用於誘導細胞凋亡之樟芝子實體乙醇萃取物及其製備方法
本案係關於一種樟芝子實體萃取物及其製備方法，尤其，本案係關於一種樟芝子實體第一乙醇萃取物及其製備方法，該樟芝子實體第一乙醇萃取物可有效誘導癌細胞之細胞凋亡，而以極性不同的有機溶劑萃取樟芝子實體第一乙醇萃取物後所得的樟芝子實體有機溶劑萃取物能有效誘導癌細胞無法增生、進入死亡及進入細胞凋亡程序。
樟芝(Androdia camphorata )又稱樟菇、牛樟菇、牛樟芝等，為台灣特有的真菌菌種，生長於海拔400至2000公尺特有的牛樟樹(Cinnamomum kanehirai )樹幹腐朽的心材內壁，或枯死倒伏的牛樟木材陰暗潮濕的表面。因此，要尋找到野生的樟芝子實體(fruiting body)或確認此多孔菌目(Aphyllophorales)真菌菌株的外觀並不容易，也由於其生物活性成分具潛在的醫藥價值，因此樟芝的價格居高不下。
由於樟芝子實體不易被發現及以人工方式培養，目前市面上多為樟芝菌絲體(mycelia)產品，其宣稱具有抗癌、減少治療引起的症狀及其他副作用。此外，樟芝菌絲體產品也被發現具有抗氧化、抗過敏、免疫刺激效果 (6) 。這些產品宣稱具有與樟芝子實體相似的主要成分，包括具有細胞毒殺效果的三萜類(triterpenes)、類固醇(steroid)及具有免疫刺激性的多醣體等 (1,17) 。
傳統上，樟芝被應用於健康食品，以避免發炎、過敏、皮膚癬、肝癌的發生，因此，樟芝菌絲體及子實體萃取物被認為是具有潛力的化學治療藥物，以對抗肝癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌 細胞等 (2,4,8,11,16) ，但並未鑑定出何種物質具有抑制癌症的能力及探討抑癌機制。
此外，中華民國專利號I299665揭露了樟芝萃取物及其製備方法，其係以乙醇萃取樟芝菌絲體獲得多醣體，用以抑制基質金屬蛋白酶的活性，但並非以樟芝子實體進行萃取，其產物也未能抑制癌細胞的生長；中華民國專利號I279439揭露了以樟芝菌絲體進行培養，藉由調整培養時的酸鹼值獲得到培養物，並未揭露萃取方法；而中華民國專利號591110揭露了由樟芝菌絲體萃取出γ-胺基丁酸，其係先以冷凍乾燥樟芝菌絲體，再以水或有機溶劑萃取。上述這些發明皆未以樟芝子實體進行有機溶劑或水萃取，而且未鑑定出可用於癌症治療或抑制癌細胞之生長的化合物。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「用於誘導細胞凋亡之樟芝子實體乙醇萃取物及其製備方法」，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
為了克服先前技術中以樟芝菌絲體進行萃取而無法找出樟芝有效抗癌成分的缺陷，本發明以乙醇對樟芝子實體進行萃取，獲得到樟芝子實體第一乙醇萃取物，可有效抑制血癌細胞的生長及誘導細胞凋亡。接著，以極性不同的有機溶劑進一步萃取樟芝子實體第一乙醇萃取物，獲得到樟芝子實體有機溶劑萃取物，以核磁共振圖譜確認有效的抗癌成分為樟芝酸A。
本發明係提供一種樟芝子實體第一乙醇萃取物的製備方法，包括下列步驟：(a)提供一樟芝子實體；及(b)以一乙醇溶液萃取該樟芝子實體，過濾並離心，獲得該樟芝子實體第一乙醇萃取物。
根據上述構想，步驟(a)還包括：(a1)研磨該樟芝子實體為一細粉。
根據上述構想，步驟(b)離心後還獲得一樟芝子實體乙醇萃取殘留物，步驟(b)還包括：(b1)煮沸該樟芝子實體乙醇萃取殘留物，獲得一樟芝子實體水萃取物。
根據上述構想，該製備方法，還包括下列步驟：(c)以至少一有機溶劑萃取該樟芝子實體第一乙醇萃取物，獲得至少一樟芝子實體有機溶劑萃取物。
根據上述構想，該至少一有機溶劑具有極性，該至少一有機溶劑係選自由正己烷、乙酸乙酯、乙醇及其組合所組成群組的其中之一。
根據上述構想，步驟(c)還包括下列步驟：(c1)以正己烷萃取該樟芝子實體第一乙醇萃取物，獲得一樟芝子實體正己烷萃取物及一第一樟芝子實體殘留物；(c2)以乙酸乙酯萃取該第一樟芝子實體殘留物，獲得一樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及一第二樟芝子實體殘留物；及(c3)以乙醇萃取該第二樟芝子實體殘留物，獲得一樟芝子實體第二乙醇萃取物及一第三樟芝子實體殘留物。
本發明還提供一種樟芝子實體第一乙醇萃取物，係由一乙醇溶液萃取一樟芝子實體，過濾並離心所獲得。
根據上述構想，該樟芝子實體第一乙醇萃取物用於促進血癌細胞的細胞凋亡。
根據上述構想，該樟芝子實體第一乙醇萃取物調控該血癌細胞組織蛋白、組織蛋白去乙醯酶、組織蛋白乙醯酶、p21、PARP、Bax、Bcl-2、DR4、TRADD、p50及p65及其組合所組成群組之蛋白表現。
根據上述構想，該樟芝子實體第一乙醇萃取物與曲古黴素A 共同作用於該血癌細胞，對該血癌細胞生長具有協同性的抑制作用。
本發明另提供一種萃取自一樟芝子實體第一乙醇萃取物的樟芝子實體乙酸乙酯萃取物，其溶解於CDCl3 溶液時的1 H核磁共振圖譜於δ 0.5-2具有固醇及三萜類化合物其中之一的複數個甲基訊號，於δ 4.8-5.0具有碳-碳末端雙鍵訊號。且其溶解於C5 D5 N溶液時的1 H核磁共振圖譜於δ 5.0-5.4具有碳-碳末端雙鍵訊號。
根據上述構想，該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物包括樟芝酸A，該樟芝酸A的一第18號碳及一第19號碳位置為碳-碳單鍵，且該樟芝酸A的一第28號碳位置為一碳-碳末端雙鍵訊號。
經1 H核磁共振圖譜比對後可發現EEAC、FA各與樟芝酸A具有相近的訊號，樟芝子實體正己烷萃取物(FC)與樟芝子實體第二乙醇萃取物(FB)的1 H核磁共振圖譜皆無上述特徵訊號。可確定FA的主要成分確實為樟芝酸A，且本發明的萃取方法的確可將樟芝子實體的主成分-樟芝酸A集中於乙酸乙酯層。
本發明還提供一種方法，用以檢測樟芝子實體中樟芝酸A的含量，該方法包括下列步驟：(a)以乙醇溶液萃取該樟芝子實體，獲得一樟芝子實體第一乙醇萃取物；(b)分別以正己烷、乙酸乙酯萃取該樟芝子實體第一乙醇萃取物，分別獲得樟芝子實體正己烷萃取物及樟芝子實體乙酸乙酯萃取物；及(c)以高效液相層析法檢測該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物中該樟芝酸A的含量。
根據上述構想，步驟(b)還包括：(b1)於經乙酸乙酯萃取後，再以乙醇進行萃取，獲得樟芝子實體第二乙醇萃取物。
根據上述構想，還包括：以核磁共振圖譜分析法檢測樟芝酸A僅存在於樟芝子實體乙酸乙酯萃取物中。
根據上述構想，核磁共振圖譜分析法所使用的解析度至少為 200 MHz，樟芝子實體正己烷、乙酸乙酯以及乙醇再萃取物皆溶解於C5 D5 N溶液。
本案所提出之「用於誘導細胞凋亡之樟芝子實體乙醇萃取物及其製備方法」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
實施例一 生物學實驗 實驗1：自野生樟芝子實體製備乙醇萃取物及水萃取物
將52 g乾燥樟芝子實體磨成細粉，以1：10比例(重量/體積)置於75℃的乙醇溶液迴流2小時。冷卻萃取物，再置於4℃進行隔夜沈澱。進一步以濾紙過濾該萃取物的上清液，以3,000 rpm離心30分鐘以去除沈澱物，將萃取物冷凍乾燥並儲存於-70℃，此即為樟芝子實體第一乙醇萃取物(a first ethanol extract of fruiting body ofAndrodia camphorata ，以下簡稱EEAC)。而前述萃取後的殘留物進一步被煮沸，並以1：10比例(重量/體積)置於水中迴流並萃取6至8小時。過濾該殘留物的上清液，以3,000 rpm離心30分鐘以去除沈澱物，將此產物冷凍乾燥並儲存於-70℃，此即為樟芝子實體水萃取物(water extract of fruiting body ofAndrodia camphorata ，以下簡稱WEAC)。
實驗2：樟芝子實體第一乙醇萃取物之進一步萃取、分餾
為了確定樟芝子實體第一乙醇萃取物的活性成分，將1 g乾燥 之樟芝子實體磨碎，並以實驗1的方法萃取。以MTT試驗法確定樟芝子實體第一乙醇萃取物的50%抑制濃度(IC50 )為104.82 μg/ml；而樟芝子實體水萃取物並不具活性(其IC50 大於200 μg/ml)。將203.1 mg的樟芝子實體第一乙醇萃取物以極性漸增的溶劑(依序為正己烷(n -hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate)及乙醇)萃取，並依序獲得12.8%(26.0 mg)樟芝子實體正己烷萃取物、61.6%(125.1 mg)樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及8.4%(17.0 mg)樟芝子實體第二乙醇萃取物三種不同的萃取物，以及10.0%(20.2 mg)不溶的殘留物。百分比表示佔樟芝子實體第一乙醇萃取物之重量百分比，毫克表示對應的萃取後的乾重。
實驗3：分離及純化樟芝酸A(zhankuic acid A)
以Sephadex LH-20樹脂及三氯甲烷-甲醇(1：3)溶劑層析95.4 mg乙酸乙酯層萃取物，獲得3種分餾產物，其中第二分餾產物(Fraction 2)以薄層色層分析法(thin layer chromatography,TLC)及三氯甲烷-甲醇(25：1)溶劑分離出8種次分餾產物。其中，10.3 mg的第一次分餾產物(Fraction 2-1)以ODS高效液相層析(HPLC)管柱(250×10 mm，Hypersil®，甲醇-水(85：15))純化，獲得4.3 mg樟芝酸A(滯留時間10分鐘，流速2 ml/min)。
樟芝酸A的其他物理化學性質之分析所使用的儀器如下：以核磁共振儀(Varian Unity Plus 400或Varian Gemini 200 NMR spectrometers)紀錄1 H及13 C核磁共振圖譜(NMR spectrum)；化學位移(chemical shift)以ppm(δ)、耦合常數(coupling constant)以赫茲(Hertz)表示；低解析度電噴灑離子化質譜(LRESIMS)以VG Biotech Quattro 5022質譜儀測量；而矽膠60(Merck,230-400 mesh)及Sephedex LH-20用於管柱層析法。薄層色層分析法是在Silica gel GF254 pre-coated plates上分析，浸泡於50%硫酸溶液、再於加熱板 上烘乾呈色而完成。高效液相層析儀由Hitachi L-7100幫浦、D-7000介面、Bischoff RI偵測器及ODS管柱組合而成。
實驗4：細胞培養、細胞存活度及細胞毒殺試驗
人類血癌細胞株HL 60購自美國American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,VA)，並培養於添加10%胎牛血清(fetal calf serum)、2 mM麩醯胺酸(glutamine)及抗生素(100 units/ml盤尼西林及100 μg/ml鏈黴素)的RPMI 1640培養液，並於37℃及含5%二氧化碳的培養箱中培養。
以Trypan blue染劑排除法測試細胞存活度，並以MTT試驗法測試細胞毒殺作用。將首先，將1×105 個HL 60細胞培養於96孔培養盤，並以不同濃度(0至150 μg/ml)並溶解於二甲基亞碸(DMSO)的EEAC處理24小時。再以trypan blue染色死細胞，以血球計數器計算存活細胞數。在MTT試驗中，將1.2 mg/ml MTT加入每個培養HL 60細胞的孔洞，並培養2小時用以形成紫色formazan結晶。以二甲基風碸溶解formazan結晶，並以570 nm波長偵測吸光值。
實驗5：流式細胞技術分析
將1×106 個HL 60細胞培養於10公分培養皿，以已知濃度的EEAC處理24小時，再以冰冷的PBS清洗2次，以37℃、200×g離心5分鐘收集細胞。於37℃以70%(v/v)乙醇溶液固定細胞30分鐘。再將細胞懸浮於37℃、1 ml碘化丙錠(propidium iodium)染劑(含0.1% Triton X-100、100 μg/ml RNase A及500 μg/ml碘化丙錠)作用30分鐘。以流式細胞儀偵測細胞，並以FACScan及Cell Quest軟體(Becton Dickinson)分析。
實驗6：DNA斷裂的評估
本實驗是以膠體電泳分析凋亡細胞的DNA斷裂的情形。將1 ×106 個細胞培養於10公分培養皿24小時，再以已知濃度的EEAC(0、50、100、150及200 μg/ml)處理24小時，而對照組為以二甲基風碸處理細胞。之後，以PBS清洗細胞2次，將細胞再懸浮於培養液A(含10 μM EDTA、50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5%(v/v)SDS及1 μg/ml proteinase K)並於56℃作用3小時，再加入最終濃度50 μg/ml的RNase並作用1小時。以酚/氯仿/異丙醇(25：24：1,v/v)萃取細胞DNA，並以膠體電泳分析細胞DNA的斷裂情形，以評估細胞凋亡。
實驗7：以酸萃取分離組織蛋白(histone)
本實驗參照Taplick等人於1998年發表的方法進行 (14) 。首先，以700×g離心收集細胞，並以冰冷的PBS清洗1次並再懸浮於1 ml裂解緩衝液(含10 mM Tris-HCl(pH 6.5)、50 mM Na2 SO4 、10 mM MgCl2 、10 mM sodium butyrate、8.6% sucrose及1% Triton X-100)並以1000×g離心。以裂解緩衝液清洗3次後，將細胞懸浮於含10 mM Tris-HCl(pH 7.4)及13 mM EDTA的混合液中。離心後，再將細胞懸浮於冷無菌水，再加入硫酸至0.4 N。置於冰上1小時再以10,000×g離心5分鐘，以10倍體積的丙酮沈澱上清液中的組織蛋白，隔夜靜置於-20℃。沈澱的組織蛋白以離心、乾燥、懸浮於無菌水方式處理，並以Bio-Rad蛋白試劑組(BioRad Laboratories GmbH,Munchen,Germany)測量蛋白濃度。
實驗8：核蛋白及細胞質蛋白的萃取
本實驗是以Vandergeeten等人於2007年發表的方法進行 (15) 。以冷PBS清洗細胞，並懸浮於裂解緩衝液(含10 mM HEPES-KOH(pH 7.9)、2 mM MgCl2 、0.1 mM EDTA、10 mM KCl、0.5% IGEPAL、1 mM PMSF、1 mM DTT及蛋白酶抑制劑)，並置於冰上30分鐘。以10,000×g離心15分鐘後，收集含有核蛋白的上清 液，測量其蛋白濃度並保存於-80℃。
實驗9：西方點漬法
將收集的細胞以RIPA裂解緩衝液(含1×PBS、1% Nonidet P-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS、1 mM sodium orthovanadate、100 μg/ml PMSF及30 μg/ml aprotinin)處理30分鐘 (7) ，再以20,000×g離心30分鐘，並以BCA蛋白試劑組(Pierce,Rockford,IL)測定蛋白濃度。分別以7.5%、10%或12% SDS-PAGE解析、轉漬至PVDF硝化纖維膜。依序以初級抗體偵測蛋白、再以HRP酵素連結的二級抗體偵測初級抗體、最後以ECL(enhanced chemical luminescence)呈色液呈色，並以X光片感應螢光，沖洗X光片獲得蛋白表現結果。
實驗10：NFκB轉錄因子試驗
本實驗是以TransAM®轉錄因子試驗法(Active Motif,Tokyo,Japan) (9) 分析EEAC對於活化NFκB的效果。首先，以NFκB consensus binding oligonucleotide(SEQ ID NO：1)塗附96孔盤的每個孔洞，再加入7 mg核萃取物緩慢混合1小時。以清洗液清洗孔洞3次，再加入1,000倍稀釋的p50或p65抗體，置於室溫作用1小時。再次沖洗孔洞後，加入1,000倍稀釋的HRP結合的二次抗體，置於室溫作用1小時，再以呈色液呈色。以405 nm波長偵測吸光值，並以655 nm波長作為背景波長。
實驗11：統計分析
所有數據以「平均±標準差」顯示，實驗組與對照組間的差異以t -test分析，p值小於0.05為具有顯著差異。
實驗結果
請參閱第1圖，為本發明的樟芝子實體第一乙醇萃取物及其 樟芝子實體有機溶劑萃取物的製備方法流程圖。在第1圖的製備方法中，以乙醇溶液萃取磨成細粉的樟芝子實體(步驟101、102)，再過濾、離心，獲得到樟芝子實體第一乙醇萃取物(EEAC)(步驟103)及樟芝子實體乙醇萃取殘留物(步驟110)。為了鑑定樟芝子實體中具有毒殺癌細胞的活性成分，以極性強度不同的有機溶劑對樟芝子實體第一乙醇萃取物進行萃取。本發明選用三種極性由低至高的有機溶劑，依序為正己烷、乙酸乙酯及乙醇。樟芝子實體有機溶劑萃取物的製備方法如下所述：以正己烷萃取樟芝子實體第一乙醇萃取物，獲得到樟芝子實體正己烷萃取物(fraction C,FC)(步驟104)及第一樟芝子實體殘留物(步驟105)。接著，以乙酸乙酯萃取第一樟芝子實體殘留物，獲得樟芝子實體乙酸乙酯萃取物(fraction A,FA)(步驟106)及第二樟芝子實體殘留物(步驟107)。最後，再以乙醇萃取第二樟芝子實體殘留物，獲得樟芝子實體第二乙醇萃取物(fraction B,FB)(步驟108)及第三樟芝子實體殘留物(步驟109)。而樟芝子實體乙醇萃取殘留物(步驟110)再加以水煮、萃取(步驟111)，獲得到樟芝子實體水萃取物(WEAC)(步驟112)。
為了分析這些樟芝子實體有機溶劑萃取物對HL 60細胞的細胞毒殺能力，以MTT試驗法得到EEAC及FA對HL 60細胞的50%抑制濃度分別為104.82及80.53 μg/ml；而FB及FC對HL 60細胞的IC50 皆大於200 μg/ml。由此可知FA對HL 60細胞具有較佳的抑制生長效果。請參閱第2圖(A)，為各種樟芝子實體萃取物對HL 60細胞的生長抑制情形。在第2圖(A)中，隨著各種樟芝子實體萃取物的濃度增加，對HL 60細胞的生長抑制越明顯，尤其是FA可有效抑制HL 60細胞的生長。請參閱第2圖(B)，為100 μg/ml的各種樟芝子實體萃取物誘導HL 60細胞進入細胞凋亡的效果。在第2圖(B)中，與其他樟芝子實體萃取物相較，FA具有顯著的誘 導HL 60細胞凋亡的能力。由上述結果可知，FA存在毒殺HL 60細胞的活性成分。
進一步分析FA的1 H核磁共振圖譜，在FA溶於CDCl3 溶液成為濃度3.0 mg/ml的條件下，於δ 0.5-2的位置出現固醇或三萜類化合物(triterpene)的甲基訊號18、19(第3圖(A))，而由第3圖(A)的圖譜預測FA的主要成分為樟芝酸A。進一步比較FA及樟芝酸A在相同條件下的1 H核磁共振圖譜(第3圖(B))，發現FA與樟芝酸A具有訊號強度相近的圖譜，尤其在樟芝酸A的第18及19號碳位置為碳-碳單鍵，及第28號碳位置為碳-碳末端雙鍵訊號，確定FA具有與樟芝酸A相同的訊號，因此FA的主要成分確實為樟芝酸A，樟芝酸A的結構如式I所示。
乙酸乙酯層萃取物的主要成分-樟芝酸A為淡黃色的非結晶固體，以電噴灑離子化質譜(ESIMS,m/z 469[M+H]+ )及核磁共振圖譜分析後的分子式為C29 H40 O5 ，其1 H核磁共振圖譜的最顯著訊號為5個甲基(3個二級：δ=0.95,1.05,1.30，及2個三級δ=0.70及1.53)及兩個末端烯烴亞甲基質子(terminal olefinic methylene proton)(δ=4.92及4.98)。而13 C核磁共振圖譜顯示出3個羰基(carbonyl group)(δC =200.8、202.6、210.8)、4個烯基碳(olefinic carbon)(δC =111.4、145.5、148.0、151.9)及1個羧酸(carboxylic acid)(δC = 178.8)。比較樟芝酸A及FA的1 H核磁共振訊號特徵後，樟芝酸A確實為FA的主要成分。樟芝酸A對HL60細胞的IC50 為5.45 μg/ml，可做為生物活性指標。
請參閱第4圖，為EEAC對HL60細胞所造成的DNA斷裂情形。由第4圖可知，EEAC的濃度與HL 60細胞的DNA斷裂情形成正比，其表示EEAC對HL 60細胞具有顯著的細胞毒殺作用。
由於組織蛋白的乙醯化(acetylation)及去乙醯化(deacetylation)可調控染色質(chromatin)的結構，此對調節基因表現相當重要，其是藉由組織蛋白乙醯轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)乙醯化組織蛋白上特定的離氨酸(lysine)，而組織蛋白去乙醯酶(histone deacetylase,HDAC)則將離氨酸去乙醯化而完成。經過乙醯化的染色質才可進行轉錄，否則轉錄將被終止。請參閱第5圖(A)，為EEAC對HL 60細胞之組織蛋白乙醯化的西方點漬圖譜。在第5圖(A)中，EEAC對HL 60細胞的組織蛋白H3、H3K18及H3K9的低度乙醯化呈現劑量依賴關係。請參閱第5圖(B)，為EEAC調控HL 60細胞與組織蛋白乙醯化相關的酵素活性之西方點漬圖譜。在第5圖(B)中，EEAC以HAT及HDAC調控組織蛋白H3的去乙醯化，包括抑制GCN5、CBP、SRC-1及PCAF的表現及促進HDAC 1的表現。
曲古黴素A(trichostatin A,TSA)是一種微生物代謝產物，可促進組織蛋白H3的乙醯化。由於H3的乙醯化累積(過乙醯化)，曲古黴素A能有效抑制血癌細胞的生長。請參閱第6圖，為EEAC及TSA對HL 60細胞存活的協同效應。在第6圖中，僅以100 μg/ml EEAC處理與僅以TSA處理相較，EEAC比TSA更具有毒殺HL 60細胞效果。而100 μg/ml的EEAC與不同劑量TSA共同對HL 60細胞的凋亡具有協同性 效果，而且隨著TSA劑量增加，毒殺效果愈好。
請參閱第7圖(A)及(B)，分別為TSA、EEAC及其組合對HL 60細胞的各種蛋白表現西方轉漬圖譜。第7圖(A)是以與細胞生長抑制及誘導細胞凋亡有關的p21、PARP、Bax及Bcl-2蛋白為研究對象，發現TSA及EEAC共同處理HL60細胞可增加p21的表現及抑制Bcl-2及被切斷的PARP(cleaved PARP)的表現。
由於樟芝在耐TRAIL人類癌細胞(TRAIL-resistant human cancer cells)中是一種對FAS(TRAIL)敏感的試劑 (5) ，而DR5及TRADD可與DR4的死亡結構域(death domain)專一性作用，DR4的活化促進TRADD的結合及隨後DR5的表現，以促進細胞凋亡 (12) 。以TSA及EEAC分別或共同處理HL 60細胞，發現與對照組、單獨以TSA或單獨以EEAC處理的組別相較，EEAC和TSA共同作用可增加2至4倍的TRADD及DR5蛋白表現(第7圖(B))。由第7圖(B)可知DR5的結合誘導正調節作用是由EEAC調控，但TRADD的正調節是由EEAC與TSA協同性的共同作用而完成。因此，TSA與EEAC共同調控TRAIL訊息傳導路徑。
某些癌症治療藥劑藉由誘導DR5在癌細胞的表現，擴大TRAIL誘導的細胞凋亡或啟動細胞凋亡，因此TRAIL可做為新的癌症治療方向。此外，CD95及TRAIL death receptor蛋白的直接刺激及FLIP蛋白過度表現可啟動NFκB的活化。而NFκB轉錄因子調節DR5及HDAC 1的表現 (12) 。為了測試NFκB活化對細胞凋亡的影響，發現EEAC與TSA共同作用顯著地增加NFκB p65異位(translocation)(第8圖)，但並不影響細胞總蛋白的表現。很顯然地，EEAC與TSA共同誘導p65 蛋白異位是由EEAC單獨調控。
當以TSA及EEAC共同處理HL 60細胞時，導致細胞核中的basal NFκB p65 DNA結合能力與對照組相較增加78%(p<0.05)。相反地，basal p50 NFκB DNA結合能力並不受其他處理的組合所影響(第8圖)，進一步推測p65的細胞核異位(nuclear translocation)及活化與NFκB p65活化的共同處理有關。
本發明由樟芝子實體以乙醇萃取所獲得的樟芝子實體第一乙醇萃取物(EEAC)可有效抑制血癌細胞株HL 60的細胞生長，並促進細胞進入細胞凋亡，其是透過組織蛋白低度乙醯化、組織蛋白去乙醯轉移酶的正調節及抑制組織蛋白去乙醯轉移酶(包括GCN 5、CBP及PCAF)的活性而誘導HL 60細胞的細胞凋亡。此外，EEAC與TSA共同作用於HL 60細胞，可協同性的抑制細胞生長，並誘導細胞進入細胞凋亡。
以有機溶劑進一步萃取EEAC獲得到各種樟芝子實體有機溶劑萃取物，經過核磁共振分析，確定樟芝酸A為EEAC的主要活性成分，因此，EEAC可成為具有潛力的化學抗癌治療佐劑。
實施例二
本實施例為利用另一野生樟芝子實體，以實施例一實驗1製備方法獲得11 g的冷凍乾燥樟芝子實體第一乙醇萃取物(EEAC)，再以實施例一實驗2方法，依序以正己烷、乙酸乙酯及乙醇萃取，並依序獲得12.7%(1.4 g)樟芝子實體正己烷萃取物(FC)、61.8%(6.8 g)樟芝子實體乙酸乙酯萃取物(FA)及10.0%(1.1 g)樟芝子實體第二乙醇萃取物(FB)三種不同的萃取物，以及5.5%(0.6 g)不溶的殘留物。百分比表示佔樟芝子實體第一乙醇萃取物之重量百分 比，克表示對應的萃取後的乾重。
實驗1：抗血癌活性
為了與對照組的先前技術相較，將各100 mg的實施例二冷凍乾燥樟芝子實體第一乙醇萃取物以三種分配萃取方法進行實驗，並將所得的各萃取物與本實施例二的萃取物進行抗血癌活性比較。其中，對照組1係參考Chen等人 (1) 及Hsu等人 (4) 的研究，將101.9 mg的冷凍乾燥樟芝子實體第一乙醇萃取物以乙酸乙酯和水(各100 ml，體積比為1：1)進行液相-液相分配萃取，獲得78.1%(79.6 mg)樟芝子實體乙酸乙酯萃取物(FEA-EA)、19.6%(20.0 mg)樟芝子實體水萃取物(FW-EA)。
對照組2係參考Cherng等人 (3) 的研究，將100.3 mg的冷凍乾燥樟芝子實體第一乙醇萃取物以三氯甲烷和水(各100 ml，體積比為1：1)進行液相-液相分配萃取，獲得77.4%(77.6 mg)樟芝子實體三氯甲烷萃取物(FCl3-Cl3)、23.5%(23.6 mg)樟芝子實體水萃取物(FW-Cl3)。
對照組3係參考Shen等人 (10) 的研究，將100.9 mg的冷凍乾燥樟芝子實體第一乙醇萃取物，以二氯甲烷和水(各100 ml，體積比為1：1)進行液相-液相分配萃取，獲得76.2%(76.9 mg)樟芝子實體二氯甲烷萃取物(FCl2-Cl2)、23.3%(23.5 mg)樟芝子實體水萃取物(FW-Cl2)。
將上述各萃取物進行抗血癌活性比較，如表1所示，可發現本實施例二的乙酸乙酯萃取物(FA)具有最強活性，與先前技術的乙酸乙酯和水的液相-液相分配萃取有所區別；含氯有機溶媒的分配萃取方式雖然具有一定的活性，但由於這些有機溶媒已多被管制、禁用，因此先前技術並非理想製程。
實驗2：核磁共振圖譜分析
實驗2的1 H核磁共振圖譜實驗條件為：解析度400 MHz的儀器、濃度為10.0 mg/0.75 ml，並將第一乙醇萃取物(EEAC)、正己烷萃取物(FC)、乙酸乙酯萃取物(FA)、第二乙醇萃取物(FB)及樟芝酸A皆溶於C5 D5 N溶液，以利比較。
請參閱第9圖(A)至(E)，分別為(A)樟芝子實體第一乙醇萃取物、(B)樟芝子實體正己烷萃取物、(C)樟芝子實體乙酸乙酯萃取物、(D)樟芝子實體第二乙醇萃取物及(E)樟芝酸A於400 MHz及C5 D5 N中的1 H核磁共振圖譜。若將第9圖(A)至(E)的1 H核磁共振圖譜部分重疊並相互比較，發現第9圖(A)的樟芝子實體第一乙醇萃取物(EEAC)在δ 5.0-5.4出現碳-碳末端雙鍵訊號，此與第3圖(A)及第3圖(B)一致，而樟芝子實體乙酸乙酯萃取物(FA)也在δ 5.0-5.4出現碳-碳末端雙鍵訊號。圖譜比對後可發現EEAC、FA各與樟芝酸A具有相近的訊號，樟芝子實體正己烷萃取物(FC)與樟芝子實體第二乙醇萃取物(FB)的1 H核磁共振圖譜皆無上述特徵訊號。確定本發明的萃取方法的確可將樟芝子實體的主成分-樟 芝酸A集中於乙酸乙酯層。
由6.8 g樟芝子實體乙酸乙酯萃取物(FA)分離得標準品，除了樟芝酸A外，利用核磁共振儀和電噴灑離子化質譜的解析，可確定另獲得三個主成分：Antcin C(式II)、樟芝酸C(Zhankuic acid C)(式III)和Dehydroeburicoic acid(式IV)。以下為此三種主成分的化學結構式、分離及純化。
(1)分離及純化Dehydroeburicoic acid：以Silica gel 60(Merck,230-400 mesh)及正己烷-乙酸乙酯-甲醇(依序為10：1：0,5：1：0,1：1：0,0：1：0,0：40：1,0：30：1,0：20：1,0：10：1)梯度層析6.8 g乙酸乙酯萃取物，獲得17種分餾產物，其中，588.4 mg的第四分餾產物(Fraction 4)以Sephadex LH-20樹脂及乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇 (1：1：6)溶劑層析，分離出3種次分餾產物。568.6 mg的第一次分餾產物(Fraction 4-1)以Silica gel 60及三氯甲烷-甲醇(35：1)溶劑層析，分離出3種次分餾產物。由240.3 mg的第二次分餾產物(Fraction 4-1-2)中取50 mg以ODS高效液相層析管柱(250×10 mm，Hypersil®，甲醇-水(90：10))純化，獲得10.3 mg Dehydroeburicoic acid(滯留時間27分鐘，流速2 ml/min)。
(2)分離及純化樟芝酸A：970.9 mg的第六分餾產物(Fraction 6)以Sephadex LH-20樹脂及乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇(1：1：6)溶劑層析，分離出3種次分餾產物。由901.0 mg的第二次分餾產物(Fraction 6-2)中取100 mg以ODS高效液相層析管柱(250×10 mm，Hypersil®，乙腈-水(75：25))純化，獲得77.5 mg樟芝酸A(滯留時間12分鐘，流速2 ml/min)。
(3)分離及純化Antcin C：132.6 mg的第十分餾產物(Fraction 10)以薄層色層分析法及二氯甲烷-甲醇(15：1)溶劑分離出5種次分餾產物。85.0 mg的第二次分餾產物(Fraction 10-2)以ODS高效液相層析管柱(250×10 mm，Hypersil®，乙腈-水(70：30))純化，獲得40.9 mg Antcin C(滯留時間10分鐘，流速2 ml/min)。
(4)分離及純化樟芝酸C：1.4 g的第十三分餾產物(Fraction 13)以Silica gel 60及二氯甲烷-甲醇(15：1)溶劑層析，分離出7種次分餾產物。107.5 mg的第五次分餾產物(Fraction 13-5)以ODS高效液相層析管柱(250×10 mm，Hypersil®，乙腈-水(70：30))純化，獲得26.0 mg樟芝酸C(滯留時間10分鐘，流速2 ml/min)。
實驗3：高效液相層析
將所獲得的四個主成分與乙酸乙酯萃取物(FA)進行高效液相層析圖的比對，高效液相層析的條件如下：高效液相層析儀為Shimadzu LC-10AT；偵測器為Shimadzu SPD-M10A photodiode array detector；自動取樣器為Shimadzu SIL-20A prominence auto sampler；高效液相層析管柱為Cosmosil 5C-18-MS 250 x 4.6 mm；動相中的溶劑A為acetonitrile(0.1% trifluoroacetic acid)、溶劑B為H2 O(0.1% trifluoroacetic acid)；流速為1 ml/min；管柱溫度為室溫、偵測波長為UV 254 nm及UV 270 nm。
溶媒系統條件如下：動相包括溶劑A及B、線性梯度為0~30分鐘(45% A~50% A)、30~35分鐘(50% A~55% A)、35~45分鐘(55% A~60% A)、45~55分鐘(60% A~70% A)、55~60分鐘(70% A~85% A)及60~100分鐘(85% A~100% A)。流速及管柱溫度如上所述。
根據過去文獻 (1,3,4,10) ，樟芝酸A、Antcin C以及樟芝酸C皆為結構上25位置具不對稱中心的立體異構混合物，分離時無法將兩者純化；但於上述高效液相層析的條件下，能觀察到兩立體異構物被分開，即層析圖譜上出現兩波峰。
請參閱第10圖(A)及表2，為樟芝乙酸乙酯萃取物於254 nm波長進行高效液相層析後之各種成分的面積及高度比較。在表2中，在254 nm、延遲時間為47.261及48.007分鐘的條件下，樟芝酸A出現兩個波峰，總計的面積佔整個活性層約26.82%，高度為27.3%，為四種主要成分中最高者。
請參閱第10圖(B)及表3，為樟芝乙酸乙酯萃取物於270 nm波長進行高效液相層析後之各種成分的面積及高度比較。在表3中，在270 nm、延遲時間為47.261及48.007分鐘的條件下，樟芝酸A出現兩個波峰，總計的面積佔整個活性層約45.51%，高度為44.86%，亦為四種主要成分中最高者。
由上述核磁共振分析及高效液相分析的結果可知，樟芝酸A為樟芝子實體乙酸乙酯萃取物中的主要成分，Anticin C、樟芝酸C及Dehydroeburicoic acid為其餘三種主成分。因此前述的實驗方法可做為產業上檢測樟芝酸A成分的利器。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附權利要求所要保護的範圍。
第1圖
101‧‧‧樟芝子實體
102‧‧‧以水萃取
103‧‧‧樟芝子實體第一萃取物(EEAC)
104‧‧‧樟芝子實體正己烷萃取物(FC)
105‧‧‧第一樟芝子實體殘留物
106‧‧‧樟芝子實體乙酸乙酯萃取物(FA)
107‧‧‧第二樟芝子實體殘留物
108‧‧‧樟芝子實體第二乙醇萃取物(FB)
109‧‧‧第三樟芝子實體殘留物
110‧‧‧樟芝子實體乙醇萃取殘留物
111‧‧‧樟芝子實體
112‧‧‧樟芝子實體水萃取物(WEAC)
第1圖為本發明的樟芝子實體第一乙醇萃取物及其樟芝子實 體有機溶劑萃取物的製備方法流程圖。
第2圖(A)為各種樟芝子實體萃取物對HL 60細胞的生長抑制情形。
第2圖(B)為100 μg/ml的各種樟芝子實體萃取物誘導HL 60細胞進入細胞凋亡的效果。
第3圖(A)為樟芝子實體乙酸乙酯萃取物溶於CD3 OD溶液所測得的1 H核磁共振圖譜。
第3圖(B)為樟芝酸A溶於CD3 OD溶液所測得的1 H核磁共振圖譜。
第4圖為EEAC對HL 60細胞所造成的DNA斷裂情形。
第5圖(A)為EEAC對HL 60細胞之組織蛋白乙醯化的西方點漬圖譜。
第5圖(B)為EEAC調控HL 60細胞與組織蛋白乙醯化相關的酵素活性之西方點漬圖譜。
第6圖為EEAC及TSA對HL 60細胞存活的加成效應。
第7圖(A)及(B)分別為TSA、EEAC及其組合對HL 60細胞的各種蛋白表現西方轉漬圖譜，其中第7圖(A)為p21、PARP、Bcl-2及Bax的蛋白表現，第7圖(B)為p50、p65、TRADD及DR5的蛋白表現Actin為內對照組。
第8圖為TSA、EEAC及其組合對HL 60細胞的NFκB p65活性影響。
第9圖(A)至(E)分別為(A)樟芝子實體第一乙醇萃取物、(B)樟芝子實體正己烷萃取物、(C)樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及(D)樟芝子實體第二乙醇萃取物及(E)樟芝酸A於400 MHz及C5 D5 N中的1 H核磁共振圖譜。
第10圖(A)及(B)分別為樟芝乙酸乙酯萃取物於(A)254 nm及 (B)270 nm波長之高效液相層析圖譜。
 縮寫表：
DMSO dimethylsulfoxide
DTT dithiothreitol
EDTA 2-[2-(Bis(carboxymethyl)amino)ethy1-(carboxymethyl)a mino]acetic acid
ESIMS electrospray ionization mass spectra
HDAC 1 histone deacetyltransferase 1
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)
HRP horseradish peroxidase
LRESIMS low-resolution electrospray ionization mass spectra
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
NFκB nuclear factor kappa B
PBS phosphate buffered saline
PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
SDS sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand
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<213> Artificial sequence
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<223> NF kappaB consensus binding oligonucleotide
<400> 1
101‧‧‧樟芝子實體
102‧‧‧以乙醇溶液萃取
103‧‧‧樟芝子實體第一乙醇萃取物(EEAC)
104‧‧‧樟芝子實體正己烷萃取物(FC)
105‧‧‧第一樟芝子實體殘留物
106‧‧‧樟芝子實體乙酸乙酯萃取物(FA)
107‧‧‧第二樟芝子實體殘留物
108‧‧‧樟芝子實體第二乙醇萃取物(FB)
109‧‧‧第三樟芝子實體殘留物
110‧‧‧樟芝子實體乙醇萃取殘留物
111‧‧‧以水萃取
112‧‧‧樟芝子實體水萃取物(WEAC)

Claims (7)

  1. 一種由一樟芝子實體製備一樟芝子實體乙酸乙酯萃取物的方法，該樟芝子實體包含至少一三萜類，該至少一三萜類係選自樟芝酸A、antcin C、樟芝酸C及去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)所組成的群組至少其中之一，該方法包括下列步驟：(a)提供該樟芝子實體；(b)以一第一乙醇溶液萃取該樟芝子實體，過濾並離心，獲得一樟芝子實體第一乙醇萃取物；(c)以正己烷萃取該樟芝子實體第一乙醇萃取物，獲得一樟芝子實體正己烷萃取物及一第一樟芝子實體殘留物；(d)以乙酸乙酯萃取該第一樟芝子實體殘留物，獲得一樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及一第二樟芝子實體殘留物；及(e)以一第二乙醇溶液萃取該第二樟芝子實體殘留物，獲得一樟芝子實體第二乙醇萃取物及一第三樟芝子實體殘留物；其中該至少一三萜類僅存在於該樟芝子實體正己烷萃取物、該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及該樟芝子實體第二乙醇萃取物中的該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中步驟(a)還包括：(a1)研磨該樟芝子實體為一細粉。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中步驟(b)離心後還獲得一樟芝子實體乙醇萃取殘留物，步驟(b)還包括：(b1)煮沸該樟芝子實體乙醇萃取殘留物，獲得一樟芝子實體水萃取物。
  4. 一種根據申請專利範圍第1項所述之方法所獲得的樟芝子實體乙酸乙酯萃取物，其中該樟芝子實體所包含的至少一三萜類僅存在於該樟芝子實體正己烷萃取物、該樟芝子實體乙酸乙酯萃 取物及該樟芝子實體第二乙醇萃取物的該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物中。
  5. 一種將根據申請專利範圍第1項所述的方法所獲得的樟芝子實體乙酸乙酯萃取物用於製備促進血癌細胞的細胞凋亡之藥物之用途。
  6. 一種方法，用以檢測至少一三萜類是否僅存在於一樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及該至少一三萜類在該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物中的含量，該至少一三萜類係選自樟芝酸A、antcin C、樟芝酸C及去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)所組成的群組至少其中之一，該方法包括下列步驟：(a)以一第一乙醇溶液萃取該樟芝子實體，獲得一樟芝子實體第一乙醇萃取物；(b)以一正己烷萃取該樟芝子實體第一乙醇萃取物，獲得一樟芝子實體正己烷萃取物及一第一樟芝子實體殘留物；(c)以乙酸乙酯萃取該第一樟芝子實體殘留物，獲得一樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及一第二樟芝子實體殘留物；(d)以一第二乙醇溶液萃取該第二樟芝子實體殘留物，獲得一樟芝子實體第二乙醇萃取物及一第三樟芝子實體殘留物；(e)以一核磁共振圖譜分析法檢測該樟芝子實體正己烷萃取物、該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及該樟芝子實體第二乙醇萃取物，以確定該至少一三萜類是否僅存在於該樟芝子實體正己烷萃取物、該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物及該樟芝子實體第二乙醇萃取物中的該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物；以及(f)當確定該至少一三萜類僅存在於該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物時，以一高效液相層析法檢測該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物中該至少一三萜類的含量。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該核磁共振圖譜分析法所使用的解析度至少為200 MHz，且該樟芝子實體正己烷萃取物、該樟芝子實體乙酸乙酯萃取物以及該樟芝子實體第二乙醇萃取物皆溶解於C5 D5 N溶液。
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