CN104111302A - 一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法。所述的测定方法包括以下步骤：称取腺苷标准品配制腺甘标准溶液，将其稀释成不同浓度的校准曲线溶液，取样品适量并加溶剂进行超声波提取，制得样品提取液，再将样品提取液进行超声混匀并过滤制得待测样品溶液，最后对不同浓度的校准曲线溶液及待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并计算腺甘含量。本发明对标准品及待测样品统一采用一种溶剂进行配制，且将流动相限定为乙腈-磷酸二氢钾体系，在对待测样品进行腺甘提取时采用15%-20%的甲醇，均可使样品中主成分分离效果好，色谱图可呈现对称峰形，杂质峰影响小，可明显提高检测结果的准确度及灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法。
背景技术
牛樟芝(Taiwanofungus camphorates)，又名牛樟菇或樟芝，是一种原产于我国台湾省的珍稀药用菌。牛樟芝主要存在于我国台湾省的名贵树木牛樟树cinnamomum kanehirae hayata 的树干空洞内。现代研究表明樟芝含有多种生理活性物质，如维生素、固醇类、麦角甾醇、多糖、三萜类、超氧化物歧化酶SOD、 腺苷、小分子蛋白质等
。其中腺甘是一种嘌呤核苷，是核酸的基本结构单位之一，由糖苷键连接腺嘌呤和核糖而成 ，它是机体代谢的 一种中间产物，具有多种生理功能，如扩张血管、降低窦房结的自律性、减慢房室传导、抑制肾素分泌、降低体外循环后肺缺血－再灌注损伤，有效改善右心功能，对再灌注心脏具有保护作等作用。因此，有许多厂商开始投注大量研究资源开发牛樟芝相关医药品或保健品。为了进一步严格控制市售牛樟芝保健品的质量，确保其保健功效，急需寻找一种可以对牛樟芝保健产品中腺甘进行检测的方法，以期为牛樟芝保健产品的质量控制提供保障，也能更好的保障消费者的合法权益。目前，对于保健产品中腺甘的测定主要依据《保健食品检验与评价技术规范》2003年
版中规定的HPLC法，但采用该法测定牛樟芝保健品中的腺甘，灵敏度及准确度较差。为此，本发明对传统的HPLC法进行了改进，可明显提高测定结果的准确度与灵敏度。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种可对牛樟芝保健食品中腺甘含量进行准确测定的方法。
本发明的技术方案如下：
一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，包括以下步骤：
（1）配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品10-30mg加至25ml试管中，向试管中加溶剂，配制成浓度为0.4-1.2mg/ml的腺甘标准溶液；
（2）腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1）中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成不同浓度的校准曲线溶液；
（3）样品提取：取待测样品50-100mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品20-50mg置入25ml试管中，加入溶剂进行超声提取，制得待测样品提取液；
（4）配制待测样品溶液：将步骤（3）中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中，加入溶剂定容至刻度，超声混匀，离心，0.45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液；
（5）HPLC测定：将步骤（2）中配制的不同浓度的校准曲线溶液及步骤（4）中配的待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计算腺甘含量。
步骤（2）中所述的不同浓度的校准曲线溶液其浓度分别为0.4μg/ml,2.0μg/ml,4.0μg/ml,20.0μg/ml,80.0μg/ml。
步骤（1）、（2）、（4）中所加入的溶剂选自50%-100% 的甲醇或去离子水中的一种
步骤（3）中中所述的样品提取时加入的溶剂为15%-20%的甲醇。
步骤（3）中所述的超声提取时间为5-10min，步骤（4）中所述的超声混匀时间为5-10min。
步骤（4）中所述的离心时间为20-30min，离心速度为3000-5000r/min。
步骤（5）中所述的HPLC的参数为：Diamonsil C18色谱柱，4.6×150) mm，5um; 柱温:25℃; 流速: 1.0ml/min; 进样量: 10μl 紫外检测器: 波长254nm; 流动相: 10%乙腈，90%磷酸二氢钾水溶液。
所述的磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.005-0.02 mol/L。
步骤（5）中所述的腺甘含量计算具体公式为：X=(C×V)/m×1000; X:待测样品中腺甘含量（mg/g）；C：从标准工作曲线得到的待测样品溶液中腺甘浓度（ug/ml）；V：待测样品定容体积；m：待测样品的质量。
本发明与现有技术相比，有益效果体现在以下几点：
1.对于保健产品中腺甘的测定主要依据《保健食品检验与评价技术规范》2003年版中规定的HPLC法，但在《保健食品检验与评价技术规范》中，规定标准溶液以纯水配制，样品提取溶剂为60%乙醇，二者进样溶剂不一致，导致检测结果准确度低。研究表明，50%以上的甲醇做为溶剂，对腺甘的提取效果好，且在HPLC测定含量时，其色谱峰为有尖峰的对称波形，因此，可提高方法灵敏度，有利于腺甘与样品中其他成分的分离。
2.本发明中将校准曲线溶液浓度分别配制为0.4μg/ml, 2.0μg/ml, 4.0μg/ml,20.0μg/ml,80.0μg/ml，适合牛樟芝保健品中腺甘的定量检测，多次测定结果线性相关系数达0.999。
3.HPLC法测定腺甘含量多以甲醇-磷酸二氢钾体系为流动相，但分析时间较少，本发明将流动相限定为乙腈-磷酸二氢钾体系，且将磷酸二氢钾浓度限定为0.005-0.02 mol/L，分离效果最好，分析时间也最短。
4.本发明中在定容时选择的溶剂为50%以上的甲醇，这样使得形成的色谱峰有尖峰且对称，而在样品提取时，溶剂选择的为15%-20%的甲醇，样品中腺甘提取效果最好，色谱图中杂质峰影响最小。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，包括以下步骤：
（1）配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品10-30mg加至25ml试管中，向试管中加入50%的甲醇，配制成浓度为0.4mg/ml的腺甘标准溶液；
（2）腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1）中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成0.4μg/ml,2.0μg/ml,4.0μg/ml,20.0μg/ml,80.0μg/ml不同浓度的校准曲线溶液；
（3）样品提取：取待测样品50mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品20mg置入25ml试管中，加入15%的甲醇进行超声提取5min，制得待测样品提取液；
（4）配制待测样品溶液：将步骤（3）中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中，加入50%的甲醇定容至刻度，超声混匀5min，以3000r/min的离心速度离心20min，，0.45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液；
（5）HPLC测定：HPLC的参数为：Diamonsil C18色谱柱，4.6×150) mm，5um; 柱温:25℃; 流速: 1.0ml/min; 进样量: 10μl 紫外检测器: 波长254nm; 流动相: 10%乙腈，90%浓度为0.005mol/L的磷酸二氢钾水溶液；将步骤（2）中配制的不同浓度的校准曲线溶液及步骤（4）中配的待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计算腺甘含量。
实施例1
一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，包括以下步骤：
（1）配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品30mg加至25ml试管中，向试管中加入100%的甲醇，配制成浓度为1.2mg/ml的腺甘标准溶液；
（2）腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1）中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成0.4μg/ml,2.0μg/ml,4.0μg/ml,20.0μg/ml,80.0μg/ml不同浓度的校准曲线溶液；
（3）样品提取：取待测样品100mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品50mg置入25ml试管中，加入20%的甲醇进行超声提取10min，制得待测样品提取液；
（4）配制待测样品溶液：将步骤（3）中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中，加入100%的甲醇定容至刻度，超声混匀10min，以3000-5000r/min的离心速度离心30min，0.45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液；
（5）HPLC测定：HPLC的参数为：Diamonsil C18色谱柱，4.6×150) mm，5um; 柱温:25℃; 流速: 1.0ml/min; 进样量: 10μl 紫外检测器: 波长254nm; 流动相: 10%乙腈，90%浓度为0.02 mol/L的磷酸二氢钾水溶液；将步骤（2）中配制的不同浓度的校准曲线溶液及步骤（4）中配的待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计算腺甘含量。
实施例3
一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，包括以下步骤：
（1）配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品20mg加至25ml试管中，向试管中加入去离子水，配制成浓度为0.8mg/ml的腺甘标准溶液；
（2）腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1）中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成0.4μg/ml,2.0μg/ml,4.0μg/ml,20.0μg/ml,80.0μg/ml不同浓度的校准曲线溶液；
（3）样品提取：取待测样品80mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品40mg置入25ml试管中，加入18%的甲醇进行超声提取8min，制得待测样品提取液；
（4）配制待测样品溶液：将步骤（3）中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中，加入去离子水定容至刻度，超声混匀5-10min，以4000r/min的离心速度离心25min，，0.45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液；
（5）HPLC测定：HPLC的参数为：Diamonsil C18色谱柱，4.6×150) mm，5um; 柱温:25℃; 流速: 1.0ml/min; 进样量: 10μl 紫外检测器: 波长254nm; 流动相: 10%乙腈，90%浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾水溶液；将步骤（2）中配制的不同浓度的校准曲线溶液及步骤（4）中配的待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计算腺甘含量。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1. 一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品10-30mg加至25ml试管中，向试管中加溶剂，配制成浓度为0.4-1.2mg/ml的腺甘标准溶液；
（2）腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1）中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成不同浓度的校准曲线溶液；
（3）样品提取：取待测样品50-100mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品20-50mg置入25ml试管中，加入溶剂进行超声提取，制得待测样品提取液；
（4）配制待测样品溶液：将步骤（3）中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中，加入溶剂定容至刻度，超声混匀，离心，0.45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液；
（5）HPLC测定：将步骤（2）中配制的不同浓度的校准曲线溶液及步骤（4）中配的待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计算腺甘含量。
2.根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的不同浓度的校准曲线溶液其浓度分别为0.4μg/ml,2.0μg/ml,4.0μg/ml,20.0μg/ml,80.0μg/ml。
3.根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，步骤（1）、（2）、（4）中所加入的溶剂选自50%-100% 的甲醇或去离子水中的一种。
4.根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤（3）中中所述的样品提取时加入的溶剂为15%-20%的甲醇。
5.根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的超声提取时间为5-10min，步骤（4）中所述的超声混匀时间为5-10min。
6.根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的离心时间为20-30min，离心速度为3000-5000r/min。
7.根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的HPLC的参数为：Diamonsil C18色谱柱，4.6×150) mm，5um; 柱温:25℃; 流速: 1.0ml/min; 进样量: 10μl 紫外检测器: 波长254nm; 流动相:10%乙腈，90%磷酸二氢钾水溶液。
8.根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，所述的磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.005-0.02 mol/L。
9.根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的腺甘含量计算具体公式为：X=(C×V)/m×1000; X:待测样品中腺甘含量（mg/g）；C：从标准工作曲线得到的待测样品溶液中腺甘浓度（ug/ml）；V：待测样品定容体积；m：待测样品的质量。
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