TW201416673A - 牛樟芝三萜類成分之定量方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於一種定量牛樟芝三萜類成分的方法，本法包含以下步驟：(1)利用層析法取得牛樟芝指紋圖譜(2)積分指定區間的吸收峰面積(3)計算與外標準品之面積比值(4)以外部標準品計算三萜類含量。
Description
本發明係關於一種牛樟芝三萜類成分之定量方法，其特徵在於：本方法使用層析法，但不必使用樟芝三萜類成分標準品即可完成定量。本方法可以符合健康食品法規對於牛樟芝成分安定性實驗的要求。
牛樟芝簡稱“樟芝”，學名為Antrodia Camphorata，俗名牛樟菇、紅樟芝、樟內菇、樟菇等，因其療效特殊神奇、活人無數，在民間甚至有“陰陽對口菇”之稱。為台灣特有的藥用野生菌，牛樟芝外型呈板狀或鐘狀，表面呈鮭紅色，用於養生保健，類似靈芝，只生長在高海拔的常綠闊葉大喬木的牛樟樹(Cinnamomum kanehirae)上。台灣原住民早期喜食用牛樟芝解宿醉。牛樟芝富含類三萜類化合物、超氧歧化脢、腺苷、多醣體、β-D-葡聚醣、維生素，常用於抗癌、抗癢、抗過敏及抗疲勞。在傳統療法，牛樟芝被喻為是一種「補肝良藥」。
目前牛樟芝可以人工培植，有液體發酵法、固體培養法和椴木栽培法，當中以椴木栽培法最好。透過在椴木栽培法的樟芝子實體，具有抗氧化及抗癌的特性。
牛樟芝的三萜類含量很高，各種保健功效的研究陸續被發表，因樟芝具有解毒保肝、抗癌、強化免疫、抗過敏、
降血脂等神奇功效，素有“藥芝之王”、“臺灣森林中之紅寶石”的美譽，近年來有許多廠商投入研究以及生產。
不過，與其它藥用植物或真菌不同的是，樟芝在不同培育條件下所產生的三萜類種類差異極大。經比較市售多家廠商所培育出的樟芝成品，發現各家樟芝的三萜類成分完全不同。雖然食品或藥品中以HPLC定量指標成分含量來品管產品的方法早為業界所習用，但用在樟芝產品上卻很困難，主要的原因在於樟芝三萜類成分多且複雜、各產品不同，也無法確實知道其中活性成分為何？而現實上還有更大的困難則是，標準品無法取得的問題。
因此，雖然知道三萜類為樟芝的主要功效成分，但業界卻僅能用籠統的紫外光比色法來作定量(中國食用菌中三萜類化合物含量的檢測方法，《中国食用菌》2006年第1期3页30-32页：本方法以齊墩果酸作為標準品，進行呈色反應後測其吸光度)，本法雖然簡易，但缺乏專一性，如發酵基質中含三萜化合物，或額外添加非樟芝三萜類，本法完全無法予以分辨。
若利用HPLC以標準品定量的方式，雖然可以取得樟芝HPLC指紋圖譜，但卻因為樟芝標準品不易購得，而難以執行。即使少數標準品可以購得，但均極為昂貴，如用以作為品管之用，成本過鉅。若以自行分離的方式，除了困難度高之外，又因為三萜成分過多，不易確認活性成分而難以執行。
國內生產樟芝的廠商眾多，多希望發展為健康食品，但卻遭遇到三萜類成分定量的困難(目前衛生暑已不接受中國食用菌中三萜類化合物含量的檢測方法作為安定性試驗定量標準)，因此發展一具有專一性且易執行的層析法定量方式，為業界所期盼。
目前牛樟芝申請健康食品認證時，最大問題在於三萜類安定性實驗，也就是需要以分析來保證產品在有效期限內，成分保持穩定。中國食用菌中三萜類化合物含量的檢測方法雖為習用方式，但缺乏專一性，尤其三萜類成分間如有轉化現象，也無法反映在檢測數據上。因此，國內健康食品認證已不能接受這種籠統定量的方法。
而以特定三萜類作為指標成分的方式，則有標準品不易取得的困難。還有，如該特定三萜在整體比例中並不高，很難主張單一成分可以代表整體三萜類的效果，其定量值不具有整體意義。
綜合以上方法缺失，本發明提出一種以外部標準品(非樟芝內在成分)作為定量基準的方式。將HPLC指紋圖譜中，相當於樟芝三萜的成分，積分其面積，如有需要，可再將面積標準化。將此面積與外標準品作比較，即可計算出含量(以該標準品計)，雖此含量並非實際數值，但作為健康食品申請之安定性實驗要求，已可達到兩個目的：
1.主要成分之安定性，如比面積值固定，可合理假設成分安定
2.總成分含量不變，可取代中國食用菌中三萜類化合物含量的檢測方法，且利用HPLC滯留時間的篩選，排除其它可能的呈色干擾物，結果會比呈色法要精確。
本方法在牛樟芝產品的三萜類定量上為首次使用，具備新穎性；此外，此法有效解決了業界申請健康食品時，對於安定性實驗的要求，具備進步性，依法應予專利。
經以本所牛樟芝逆相層析法的分析條件(BR-M120)方法分析市售不同牛樟芝產品，確實發現不同樟芝樣品之三萜類成分有很大的差異(如圖1)，且多數成分未經鑑定，即使是少數已知的成分，市面上亦無法購得標準品。這也是目前牛樟芝產品在品管上遭遇到最大的難題。
由於牛樟芝三萜類成分差異很大，為確認層析圖譜中的三萜類成分位置區間，我們使用先前文獻的條件來執行分析(TW 201042045)，由於本條件為台灣農委會所發表，在目前唯有該單位能夠合法取得野生牛樟芝，故其所發表
的資料較其他來源更具可信度(以下稱此分析條件為BR-M200)。
請參考圖2及圖3。依據TW201042045的條件及說明，牛樟芝大部分三萜類出現於滯留時間20~170 min，故樣品1在210nm的層析圖譜中，20~170 min區間的各吸收峰可視為之牛樟芝的三萜類。而其單獨的積分面積與其含量為正相關，總和的積分面積則與總體三萜含量呈正相關。因此，在無法取得牛樟芝特定三萜標準品的前提下，本發明首次提出，可以利用層析圖譜中各吸收峰與外部標準品齊墩果酸(Oleanolic acid)的面積比值來估算牛樟芝內的成分含量。此法可以直接觀測到單一吸收峰的面積值，應用在健康食品安定性實驗中，可直接知道該成分是不是含量產生變化，遠較習用之中國食用菌中三萜類化合物含量測定法的紫外光比色法要來得精確。
以下就樣品的實際積分計算之，為校正各種秤量及實驗的誤差，本發明亦首次提出『標準化面積』的概念，讓本方法的精確性更能提高，且可適用在不同分析儀器及分析條件。
◆Peak標準化面積=Area x (X/Y)x(X/Y)
◆外標標準化面積=Area x(X/Y)
◆比值=(Peak標準化面積)/(外標標準化面積)
◆定量值=比值x 1/10(mg/ml)x 20/0.5(ml/g)
◆Peak標準化面積=5477683 x (20/20)x(0.5029/0.5)=5509453
◆外標標準化面積=1079461x(1/1.04)=1037943
◆比值=5509453/1037943=5.31
◆定量值=21.23(mg/g)(以齊墩果酸計)=2.12%
樣品1之實際積分例
請參考圖4至圖9。為確認本法可適用於其他樟芝樣品，經搜集多項樣品，套用實施例2的計算法，可通用於樣品2~7三萜類之定量，本實施例證實本法可通用於所有牛樟芝產品之三萜類定量。
為驗證本方法可適用在不同儀器及流洗梯度，本實施例將樣品1使用不同HPLC之方法測定之。
請參考圖9。經比較兩次實驗數值，發現差距很小，顯示本方法在不同機台，不同流洗梯度下，具備有相當穩定性及泛用性。
請參考圖11及圖12。本實施例為使用本發明方法來定量特定三萜類成分(非總三萜)的例證。針對在254nm波長具備有UV吸收波長的成分，選擇254nm可以較有選擇性地偵測此特定成分含量。在此情況下，選定也是三萜類成分的甘草酸作為外部標準品較合適。經實際定量樣品2(圖11)中Peak 1成分，以甘草酸計為2.22%。在健康食品的安定性實驗中，如peak 1已知為活性成分，即可以此法觀察此成分的安定性。
特定三萜類定量值
圖1係不同樟芝之三萜類指紋圖譜(BR-M120)。
圖2係樣品牛樟芝之三萜類指紋圖譜區間(BR-M200)。
圖3係外標準品齊墩果酸圖譜(BR-M200)。
圖4係樣品2之三萜類指紋圖譜(BR-M200)。
圖5係樣品3之三萜類指紋圖譜(BR-M200)。
圖6係樣品4之三萜類指紋圖譜(BR-M200)。
圖7係樣品5之三萜類指紋圖譜(BR-M200)。
圖8係樣品6之三萜類指紋圖譜(BR-M200)。
圖9係樣品7之三萜類指紋圖譜(BR-M200)。
圖10係樣品1之三萜類指紋圖譜比較(BR-M200) vs.(BR-UPLCM100)。
圖11係樣品2之三萜類指紋圖譜(BR-M200) -254nm。
圖12係甘草酸指紋圖譜(BR-M200) -254nm。
Claims (10)
- 一種定量牛樟芝三萜類成分的方法，本法包含以下步驟：(1)利用層析法取得牛樟芝指紋圖譜(2)積分指定區間的吸收峰面積(3)計算與外標準品之面積比值(4)以外部標準品計算三萜類含量。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中(2)的指定區間可以視需要限定在特定三萜，或總三萜。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中(2)的吸收峰面積，可視需要選定其偵測波長。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中(2)的吸收峰面積其偵測波長為210nm或254nm。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中(3)的面積比值比對基準為非屬牛樟芝成分的外部標準品。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中(3)的面積比值係使用標準化面積計算。
- 如申請專利範圍第3項的方法，其中外部標準品係為任意之三萜類成分。
- 如申請專利範圍第7項的方法，其中外部標準品係為齊墩果酸。
- 如申請專利範圍第7項的方法，其中外部標準品係為甘草酸。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其可作為申請健康食品之三萜類成分定量使用。
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