CN105510494B

CN105510494B - 一种定量检测含铬物质中铬元素价态及其含量的方法

Info

Publication number: CN105510494B
Application number: CN201410498516.3A
Authority: CN
Inventors: 郭雪娜; 何秀萍; 张博润
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2034-09-25
Also published as: CN105510494A

Abstract

本发明公开了一种定量检测含铬物质中铬元素价态及含量的方法。该方法包括：将富铬酵母干细胞样品加入碱法消化液处理后离心，调节处理液pH后得到待测液；配置铬标液测试并建立铬标液标准曲线；待测液通过高效液相分离，用感应耦合等离子体质谱分析Cr(VI)含量，酸法消化直接用感应耦合等离子体质谱分析样品总铬含量，通过样品总铬含量与样品Cr(VI)含量的差值计算得出Cr(III)含量。该方法提高了样品测量的准确性，进样量小，检测时间短，节省了样品制备量和测量时间，能准确定量地测量不同铬富集量的富铬酵母。

Description

一种定量检测含铬物质中铬元素价态及其含量的方法

技术领域

本发明属于分析领域，涉及检测样品中铬元素价态及含量的方法，具体涉及一种定量检测含铬物质中铬元素价态及其含量的方法。

背景技术

在自然环境中，铬元素主要以两种价态稳定存在，即Cr(III)和Cr(VI)。这两种铬离子的生理学功能完全相反，Cr(III)是生物体必需的营养元素，影响生物体内葡萄糖，脂类和蛋白质的正常代谢；而Cr(VI)则是公认的致癌剂和突变剂。生物体如果缺乏Cr(III)会导致出现类似糖尿病的症状。目前有多种形式的Cr(III)补充剂，其中富铬酵母被认为是天然存在、有机铬含量较高且生物利用率较高的Cr(III)补充剂。对富铬酵母细胞中铬元素价态的测定，特别是高毒性的Cr(VI)含量的测定，非常必要。分离液态样品中的Cr(III)和Cr(VI)经常利用液相色谱，但在很多色谱分离方法中的流动相为酸性，在分离过程中会诱导样品中一部分的Cr(VI)还原为Cr(III)，影响了样品测量值的准确度。Cr(III)和Cr(VI)的检测方法中，感应耦合等离子体质谱(ICP-MS)方法具有高精度，低检测限，测量范围广和可同时检测多种元素等优点。测量固态样品中的Cr(III)和Cr(VI)含量时，在分离和检测步骤前需要通过碱法消解将样品中结合态的铬离子解离为游离态，碱性消化液中含有的镁离子能够将碱性环境下Cr(III)向Cr(VI)的转化抑制到最小，但当样品中Cr(III)的浓度远高于Cr(VI)时，如富铬酵母，样品中的部分Cr(III)在消化过程中仍会转化为Cr(VI)。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测含铬物质中铬元素价态及其含量的方法。

本发明是为了解决无法准确测量富铬酵母细胞中不同价态铬元素含量的问题。本发明提供一种测定富铬酵母细胞内铬元素价态的测定方法。

本发明提供的测定含铬物质中铬元素价态及其含量的方法，包括如下步骤：

均为1的标准溶液为标准样品，将所述标准样品进行定量测定，得到对应不同总铬含量的色谱图，以总铬含量为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到所述标准样品中总铬含量的标准曲线；

所述总铬含量为Cr(III)含量与Cr(VI)含量之和；

2)将步骤1)所述标准样品用螯合剂螯合后，过柱分离，再进行定量测定，得到对应不同Cr(III)和Cr(VI)的含量的色谱图，以Cr(III)和Cr(VI)的含量为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到所述标准样品中Cr(III)和Cr(VI)含量的标准曲线；

3)将待测样品a进行碱法解离，得到解离后的待测样品b，再将所述解离后的待测样品b过柱分离后进行定量测定，得到Cr(VI)对应的峰面积，结合步骤2)所述Cr(VI)含量的标准曲线，即得到解离后的待测样品b中Cr(VI)的含量，计为I_CrVI；

4)将步骤3)所述待测样品a与酸性消化液加热混匀后，对所得混合液进行定量测定，得到总铬含量对应的峰面积，再结合步骤1)所述总铬含量的标准曲线，即得到所述待测样品中的总铬含量，计为I_总铬；

5)按照如下公式计算得到步骤3)所述待测样品a中Cr(III)和Cr(VI)的实际含量：

Cr(VI)的实际含量＝Cr(VI)测量值I_CrVI×测量体积×稀释倍数/取样量

Cr(III)的实际含量＝待测样品中的总铬含量I_总铬-Cr(VI)的实际含量。

上述方法还包括在所述步骤2)之后步骤3)之前插入如下步骤：

将不同Cr(III)与Cr(VI)摩尔比值的标准样品进行碱法解离，得到解离后的标准样品，再将所述解离后的标准样品过柱分离后进行定量测定，得到解离后的标准样品中Cr(VI)的含量；

按照如下公式计算Cr(III)转化为Cr(VI)的转化率：

转化率％＝(Cr(VI)测量值-Cr(VI)加入值)*100/Cr(VI)测量值

其中，Cr(VI)测量值为该步骤所得解离后的标准样品中Cr(VI)的含量；

Cr(VI)加入值为该步骤中Cr(VI)的实际加入量。

上述方法的步骤2)中，所述螯合剂为pH值为7.0、浓度为5mM的EDTA·Na₂的水溶液，螯合温度为75℃，螯合时间为3h；

所述碱法解离的方法均包括如下步骤：

向所述标准样品或待测样品a中加入碱性消化液、MgCl₂和磷酸钾缓冲液后加热搅拌后冷却至室温，离心，收集所得上清液，并用水洗涤所得沉淀，将所述上清液和洗液混合并调节pH值至7.0，过滤，收集滤液得到所述解离后的标准样品或解离后的待测样品b；

所述碱性消化液具体为由NaOH、NaCO₃和水组成的混合液；其中，NaOH在所述碱性消化液中的浓度为20g/l，NaCO₃在所述碱性消化液中的浓度为30g/l；

每0.03g标准样品或待测样品a对应的所述碱性消化液的体积用量具体为5～20ml，对应的MgCl₂的体积用量具体为0.04～0.20g，对应的磷酸钾盐缓冲液的体积用量具体为0.05～0.2ml；

所述磷酸钾缓冲液的浓度具体为1.0M，pH值具体为7.0；

所述加热搅拌步骤中，温度具体为90-95℃，时间为60-90min；

所述离心步骤中，相对离心力为3000g-5000g，时间为4min-8min；

所述过滤步骤中，所用滤膜的孔径为0.22μm-0.45μm，具体为0.45μm。

所述步骤2)-3)中，过柱分离所用色谱柱均为高效液相弱阴离子交换柱，具体为安捷伦高效液相1260，色谱柱更具体为Agilent Bio WAX，2.1×50mm，检测器为安捷伦感应耦合等离子体质谱7700；

所述分离步骤中，流动相为pH值为7.0的浓度为40～100mM的NH₄NO₃水溶液，流速为0.1～0.5ml/min，具体为0.2ml/min，进样量为10μl～40μl；Cr(III)的保留时间为1.1-1.3min，具体为1.2min；Cr(VI)的保留时间为1.9-2.3min，具体为2.2min；数据采集时间为5min；

所述步骤1)至4)中，定量测定的方法均为感应耦合等离子体质谱法，所用模式为氦气模式，氦气流速为5ml/min；载气的流速为1.05l/min；采样深度为8mm；同位素检测为52Cr。

所述步骤3)中，固体的待测样品的取样量为0.01g～0.05g。

所述步骤4)中，酸性消化液由体积比为4：1的浓硝酸和高氯酸组成的混合液；浓硝酸的质量百分浓度为70％，高氯酸的质量百分浓度为70-72％；

所述酸性消化液的体积用量为5～20ml，具体为10ml；

所述步骤4)加热步骤中，温度为130-160℃。

所述待测样品为含铬元素的样品，具体为含铬元素的固态样品，更具体为富铬酵母细胞。

本发明优化了样品的分离检测方法，分离、检测过程中保持了环境中的pH始终处于中性环境，避免了样品在分离过程中Cr(III)的氧化和Cr(VI)的还原；分离检测样品的速度快，缩短了样品的测量时间；所需样品进样量小；确定了碱法消化对样品中Cr(VI)浓度的影响，能够准确定量测量富铬酵母样品中Cr(III)和Cr(VI)的含量。

附图说明

图1为本发明中实施例1的不同Cr(III)：Cr(VI)比值混合物色谱图。

图2为本发明中实施例2的仅测样品中Cr(VI)的色谱图。

图3为本发明中实施例2的测量样品中Cr(III)和Cr(VI)的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

实施例1、液态样品Cr(III)和Cr(VI)分离，检测方法的优化。

1)制作总铬的标准曲线：

以Cr(III)和Cr(VI)浓度分别为0.1，0.5，1，5，10，50和100μg/l，且Cr(III)与Cr(VI)摩尔比值均为1为标准样品，将该标准样品通过ICP-MS进行定量测定，得到对应不同总铬含量的色谱图，以总铬含量为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到标准样品中总铬含量的标准曲线；

2)制作Cr(III)和Cr(VI)标准曲线：

将前述标准样品用浓度为5mM、pH 7.0的EDTA·Na₂水溶液作为螯合剂进行螯合，螯合温度为75℃，螯合时间为3h，然后经高效液相弱阴离子交换柱进行分离，通过ICP-MS进行定量测定，得到对应不同Cr(III)和Cr(VI)的含量的色谱图，以Cr(III)和Cr(VI)的含量为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到标准样品中Cr(III)和Cr(VI)含量的标准曲线；

上述通过ICP-MS进行定量测定步骤中，所用模式均为氦气模式，氦气流速为5ml/min；载气的流速为1.05L/min；采样深度为8mm；同位素检测为52Cr。

所用弱阴离子交换柱均为Agilent Bio WAX column(2.1mm*50mm，5μm)，流动相为pH7.0的75mM的NH₄NO₃水溶液，流动相的流速为0.2ml/min，进样量为10μl。

Cr(III)和Cr(VI)保留时间分别为1.2和2.2min，检测限均为0.1μg/l。样品分析时间为4min。

3)再按照如上方法，将Cr(III)与Cr(VI)摩尔比值替换为10，100和1000，所得Cr(III)与Cr(VI)的分离情况见图1。由图可知，用该方法可有效地分离Cr(III)：Cr(VI)比值在1～1000的样品。

实施例2、固态样品铬元素价态分析方法的建立

由于固态样品需要碱法消解后再进行分离测定，故需要检测碱法消解及螯合处理后对样品分离和检测的影响。

1、碱法消解对样品中Cr(VI)分离测定的影响。

吸取20μg/l Cr(III)标准溶液和1μg/l Cr(VI)标准溶液于一洁净三角瓶中，准确量取5ml消化液，0.04g MgCl₂和0.05ml浓度为1.0M、pH值为7.0的磷酸缓冲液，室温连续搅拌样品5min后加热样品至95℃并维持60min后逐渐冷至室温，过程中持续搅拌样品。4000g离心5min取上清液，用去离子水分三次洗涤沉淀，将上清液和洗液合并至一个干净的容器中，将容器置于搅拌器上，缓慢逐滴向消化杯中加入5M硝酸溶液调节pH至7.0，持续搅拌。将待测液用孔径为0.45μm的膜抽滤并转移至250ml容量瓶中，定容。样品按照实施例1中列出的分离和检测条件进行测量。所得结果见图3。

图2显示了分别将混合标准溶液用碱法消解处理或不处理后，样品Cr(VI)的色谱峰出峰情况，结果表明经碱法消解后Cr(VI)峰的保留时间和峰面积都未改变，检测富铬酵母的色谱峰，其Cr(VI)色谱峰也正常。

当样品中的Cr(III)浓度远高于Cr(VI)浓度时，碱法消解过程中样品中的部分Cr(III)会转化为Cr(VI)。

按上述“碱法消解对样品中Cr(VI)分离测定”中的方法检测样品中Cr(III)：Cr(VI)比值分别为500:1，200:1，100:1，50:1和20:1时Cr(VI)来自Cr(III)的转化率，

Cr(VI)来自Cr(III)的转化率(％)＝(Cr(VI)测量值-Cr(VI)加入量)×100/Cr(VI)的测量值。

所得结果见表1。

表1、碱法消化过程中Cr(VI)来自Cr(III)的转化率

Cr(III):Cr(VI)	Cr(VI)来自Cr(III)的转化率(％)
		500	71
200	24
		100	6.2
50	0.9
		20	0

由表1可知，Cr(III)：Cr(VI)比值越小，Cr(VI)来自Cr(III)的转化率越低；

当Cr(III)：Cr(VI)为20时，检测不到Cr(III)转化为Cr(VI)。

2、碱法消解对样品中Cr(III)和Cr(VI)分离测定的影响。

吸取20μg/l Cr(III)标准溶液和1μg/l Cr(VI)标准溶液于一洁净三角瓶中，准确量取5ml消化液，0.04g MgCl₂和0.05ml 1.0M磷酸缓冲液，室温连续搅拌样品5min后加热样品至95℃并维持60min后逐渐冷至室温，过程中持续搅拌样品。将容器置于搅拌器上，缓慢逐滴向消化杯中加入5M硝酸溶液调节pH至7.0，持续搅拌。将处理液与终浓度为5mM EDTA·Na₂(pH 7.0)混合，75℃水浴3h，冷却至室温后将待测液用孔径为0.45μm的膜抽滤并转移至250ml容量瓶中，定容。样品按照实施例1中列出的分离和检测条件进行测量。

图3显示经碱法处理再经EDTA·Na₂螯合后，在正常的Cr(III)峰前出现一些未知峰，这些未知峰降低了Cr(III)的峰面积，而且还改变了正常的Cr(VI)的出峰时间和峰面积。

综上所述，由于碱法消解对样品中Cr(VI)分离测定没有影响，故在测定铬元素含量时只测定碱法消解后所得Cr(VI)的含量。

实施例3、富铬酵母细胞中铬元素价态的测定

1)将一株酿酒酵母菌株分别在含有0μg/ml，200μg/ml，400μg/ml和600μg/ml Cr³⁺(醋酸铬)的YEPD培养基(葡萄糖20g/l，酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l)中200rpm，30℃培养24hr。3000g离心10min收集酵母细胞，用去离子水洗涤细胞直至在洗出液中检测不到铬离子，将细胞在60℃烘箱中干燥至恒重。称取0.03g酵母干细胞，准确量取5ml碱性消化液，0.04g MgCl₂和0.05ml浓度为1.0M、pH值为7.0的磷酸缓冲液，室温连续搅拌样品5min后加热样品至95℃并维持60min后逐渐冷至室温，过程中持续搅拌样品，以4000g离心5min取上清液，用去离子水分三次洗涤沉淀，将上清液和洗液合并至一个干净的容器中，将容器置于搅拌器上，缓慢逐滴向消化杯中加入硝酸溶液调节pH值至7.0，持续搅拌，再将待测液用孔径为0.45μm的膜抽滤并转移至250ml容量瓶中，定容，得到解离后的待测样品。

将所得解离后的待测样品经高效液相弱阴离子交换柱进行过柱分离，通过ICP-MS进行定量测定并结合实施例1所得Cr(VI)含量的标准曲线，得到解离后的待测样品中Cr(VI)的含量，计为I_CrVI；

其中，过柱分离步骤所用弱阴离子交换柱为Agilent Bio WAX column(2.1mm*50mm，5μm)，流动相为pH7.0的75mM的NH₄NO₃水溶液，流动相的流速为0.2ml/min，进样量为10μl。

通过ICP-MS进行定量测定步骤中，所用模式为氦气模式，氦气流速为5ml/min；载气的流速为1.05l/min；采样深度为8mm；同位素检测为52Cr。

同时将30μg/l Cr(VI)标液加入到酵母样品中，按上述试验进行前处理和样品分离、检测，计算样品加标回收率，所得结果见表2。

2)称取0.02g酵母干细胞至圆底烧瓶中，加入10ml酸性消化液(酸性消化液由体积比为4：1的浓硝酸和高氯酸组成的混合液，其中，浓硝酸的质量百分浓度为70％，高氯酸的质量百分浓度为70％-72％)，于160℃加热至瓶中溶液澄清透明。取下后冷却，转移至容量瓶中，定容至1l，用孔径为0.45μm的膜过滤后直接用与步骤1)相同的ICP-MS法并结合实施例1所得总铬含量的标准曲线，测定得到该解离后的待测样品中的总铬含量，计为I_总铬，结果见表2。

3)按照如下公式计算得到待测样品中Cr(III)和Cr(VI)的实际含量：

Cr(VI)的实际含量＝Cr(VI)测量值I_CrVI×测量体积×稀释倍数/取样量。

Cr(III)的实际含量＝总铬含量I_总铬-Cr(VI)的实际含量；

所得待测样品中Cr(III)和Cr(VI)的实际含量的结果见表2所示。

表2、酵母细胞中Cr(III)和Cr(VI)的浓度

培养基中铬含量(μg/ml)	Cr(VI)浓度(μg/g)	Cr(VI)回收率(％)	总铬浓度(μg/g)	Cr(III)浓度(μg/g)
					0	0.05±0.007	95	11.68±0.98	11.63
200	6.61±0.31	95	247±11.2	240.39
					400	45.39±2.12	102	1517±64	1471.61
600	84.20±3.67	108	3364±129	3279.8

根据表2所得Cr(III)和Cr(VI)的实际含量，可计算得到待测酵母样品中Cr(III)：Cr(VI)含量的比值均在32-39之间，根据表1所得数据可知，可知经碱性消解后，待测酵母样品中Cr(VI)来自Cr(III)的转化率为0-0.9％，碱法消化过程中Cr(VI)来自Cr(III)的转化率可忽略不计。

Claims

1.一种测定含铬物质中铬元素价态及其含量的方法，包括如下步骤：

1)以一系列已知Cr(III)与Cr(VI)摩尔浓度且Cr(III)与Cr(VI)摩尔比值均为1的标准溶液为标准样品，将所述标准样品进行定量测定，得到对应不同总铬含量的色谱图，以总铬含量为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到所述标准样品中总铬含量的标准曲线；

所述总铬含量为Cr(III)含量与Cr(VI)含量之和；

所述碱法解离的方法包括如下步骤：

所述碱性消化液为由NaOH、NaCO₃和水组成的混合液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在所述步骤2)之后步骤3)之前插入如下步骤：

按照如下公式计算Cr(III)转化为Cr(VI)的转化率：

转化率％＝(Cr(VI)测量值-Cr(VI)加入值)*100/Cr(VI)测量值

Cr(VI)加入值为该步骤中Cr(VI)的实际加入量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述螯合剂为pH值为7.0、浓度为5mM的EDTA·Na₂的水溶液，螯合温度为75℃，螯合时间为3h；

所述碱法解离的方法中，NaOH在所述碱性消化液中的浓度为20g/l，NaCO₃在所述碱性消化液中的浓度为30g/l；

每0.03g标准样品或待测样品a对应的所述碱性消化液的体积用量为5～20ml，对应的MgCl₂的体积用量为0.04～0.20g，对应的磷酸钾盐缓冲液的体积用量为0.05～0.2ml；

所述磷酸钾缓冲液的浓度为1.0M，pH值为7.0；

所述加热搅拌步骤中，温度为90-95℃，时间为60-90min；

所述离心步骤中，相对离心力为3000g-5000g，时间为4min-8min；

所述过滤步骤中，所用滤膜的孔径为0.22-0.45μm。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述碱法解离的方法包括如下步骤：

所述碱性消化液为由NaOH、NaCO₃和水组成的混合液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述碱法解离的方法中，NaOH在所述碱性消化液中的浓度为20g/l，NaCO₃在所述碱性消化液中的浓度为30g/l；

所述磷酸钾缓冲液的浓度为1.0M，pH值为7.0；

所述加热搅拌步骤中，温度为90-95℃，时间为60-90min；

所述离心步骤中，相对离心力为3000g-5000g，时间为4min-8min；

所述过滤步骤中，所用滤膜的孔径为0.22-0.45μm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)-3)中，过柱分离所用色谱柱均为高效液相弱阴离子交换柱；

所述分离步骤中，流动相为pH值为7.0的浓度为40～100mM的NH₄NO₃水溶液，流速为0.1～0.5ml/min，进样量为10μl～40μl；Cr(III)的保留时间为1.1-1.3min；Cr(VI)的保留时间为1.9-2.3min；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)-3)中所述分离步骤中，流动相的流速为0.2ml/min；Cr(III)的保留时间为1.2min；Cr(VI)的保留时间为2.2min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，固体的待测样品的取样量为0.01g～0.05g。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，酸性消化液由体积比为4：1的浓硝酸和高氯酸组成的混合液；浓硝酸的质量百分浓度为70％，高氯酸的质量百分浓度为70-72％；

所述酸性消化液的体积用量为5～20ml；

所述步骤4)加热步骤中，温度为130-160℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述酸性消化液的体积用量为10ml。

11.根据权利要求1-10任一所述的方法，其特征在于：所述待测样品为含铬元素的样品。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述待测样品为含铬元素的固态样品。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述待测样品为富铬酵母细胞。