CN108318594A - 一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法 - Google Patents

一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108318594A
CN108318594A CN201810030524.3A CN201810030524A CN108318594A CN 108318594 A CN108318594 A CN 108318594A CN 201810030524 A CN201810030524 A CN 201810030524A CN 108318594 A CN108318594 A CN 108318594A
Authority
CN
China
Prior art keywords
adenosine
adenosine deaminase
flow velocity
mass spectrometry
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810030524.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王长虹
刘伟
程雪梅
戚胜兰
管辉达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201810030524.3A priority Critical patent/CN108318594A/zh
Publication of CN108318594A publication Critical patent/CN108318594A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法，所述方法是通过将待测样品(全血、血清或血细胞)与底物腺苷进行反应，或者将待测样品(中药或化合物)与腺苷脱氨酶溶液及底物腺苷进行反应，然后通过液相色谱串联质谱法测定反应终止液中肌苷含量，再计算腺苷脱氨酶的活性。本发明的方法具有准确度、精密度、灵敏度高，稳定性好，操作简单，成本低，高通量的优点，为临床检测腺苷脱氨酶活性以诊断白血病、伤寒、系统性红斑狼疮、糖尿病、肝病、肿瘤等提供了一种更为有效的方法，也为筛选腺苷脱氨酶的抑制剂以治疗上述疾病提供了帮助。

Description

一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制 剂的方法
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法。
背景技术
腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase；Adenosine aminohydrolase；ADA；EC3.5.4.4)是一种与机体细胞免疫活性具有重要关系的巯基酶，每分子至少含2个活性巯基。它也是嘌呤核苷酸代谢的关键酶，能特异性催化腺嘌呤核苷或脱氧腺嘌呤核苷脱氨生成次黄嘌呤核苷或次黄嘌呤脱氧核苷，而后经核苷磷酸化酶催化生成次黄嘌呤，最终氧化成尿酸排出体外。
ADA广泛分布于人体的多组织中，尤其在肠系膜、肝、脾、肾及淋巴细胞中水平较高，以盲肠、脾中含量最多，又以淋巴细胞活性最高，在纤维细胞、羊水细胞、肝、肾、肺、骨骼肌中也有发现。血液中ADA主要存在于红、白细胞(淋巴细胞、粒细胞)中，其含量为血清中的40～70倍，T淋巴细胞比B淋巴细胞该酶活性更高。血清中的ADA主要来源于肝脏，90％以上的ADA存在于肝细胞浆水溶性部分，其余位于核内，与核酸代谢有关。
正常水平的ADA对机体胞内和胞外的核苷代谢起了很重要的作用。ADA活性的改变常引起病理学上的改变。一方面，ADA的缺陷可导致免疫功能障碍[1-2]。因遗传的常染色体隐性遗传性状而使ADA缺乏至产生严重的联合免疫缺陷(SCID)，它是一种表现为完全不存在细胞和体液免疫而反复性感染的严重疾病[3]。ADA缺乏症占所有SCID病例的10-15％[4]。另一方面，在许多疾病中也发现了ADA活性的升高，如白血病[5]、伤寒[6]、系统性红斑狼疮[7]、糖尿病[8]、肝病[9]、肿瘤等。特别是在许多癌症患者中，ADA的活性显著升高，如直肠癌[10]、乳腺癌[11]、肾脏腺癌[12]等。因此目前ADA活性检测被用作许多疾病的诊断指标，并且ADA活性抑制剂也被开发用于白血病、系统性红斑狼疮及肿瘤等多种疾病的治疗。
生物组织中直接测定ADA的含量非常困难，因为ADA含量微乎其微，每毫升血液中酶含量在皮克到纳克水平。因此临床测定ADA含量普遍是通过测定ADA所催化的反应速率来反映酶含量。腺苷常作为ADA酶促反应的底物，根据单位时间内腺苷的消耗量、产物肌苷或氨的生成量来评估ADA的活性。目前常用的方法包括：紫外分光光度法、比色法、化学发光法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、同位素分析法。
紫外分光光度法测定ADA含量的原理是：腺苷在265nm处有最大吸收峰，而肌苷在248nm处有最大吸收峰，通过测定ADA催化体系中265nm处吸光度的降低，即腺苷浓度的减少速率，或测定248nm处吸光度的升高，即肌苷浓度的生成速率，来实现ADA活性的测定。董佩杰等[13]基于该方法测量ADA活性，搭建了简单快速的ADA抑制剂筛选平台。该方法操作简单，成本较低，但是存在很大的误差。一方面因为腺苷与肌苷的紫外吸收光谱有部分重叠，可能会存在干扰，另一方面其他有颜色的化合物或提取物会干扰吸光度的测定，容易造成假阳性或假阴性的结果。
比色法主要包括波氏比色法和酶联比色法。波氏比色法测定ADA含量的原理是：腺苷在ADA催化下水解产生的NH3，在碱性条件下可与次氯酸钠、苯酚反应生成靛酚兰，其在628nm处有特定吸收，通过比色法检测靛酚兰含量可评估ADA活性。该方法应用广泛，赵明[14]采用该方法分析了ADA对结核性胸膜炎的鉴别诊断价值。Pinnelli等[15]采用该方法分析了2型糖尿病患者血清中ADA活性与血糖状态之间的关系。该法所需试剂和仪器简单，无需事先去除蛋白质，国内应用较多，但该法易受外源性NH3影响，与显色剂反应耗时，手工操作时间长，干扰因素多，不适宜全自动分析，且不能直接测定红细胞活性。酶联比色法也被用于测定ADA活性，何忠发等[16]利用腺苷经ADA反应后生成的NH3可在α-酮戊二酸和还原型辅酶Ⅰ存在下，经谷氨酸脱氢酶催化发生氨化还原反应，生成谷氨酸和氧化型辅酶Ⅰ，通过在340nm处监测还原型辅酶Ⅰ的消耗率来评估ADA活性。该法可实现自动化分析，但易受外源性NH3的影响。另外，另一产物肌苷的酶联比色法也被广泛用于ADA活性分析。胡卫红等[17]报道了一种测定ADA活性的酶联比色法，其原理为：底物腺苷经ADA、PNP、黄嘌呤氧化酶(XOD)作用后，生成尿酸和H2O2，H2O2再经过氧化物酶(POD)催化生成有色醌类化合物，通过测定其最大吸收波长处吸光度的上升速率(ΔA/min)，即有色醌类化合物的生成速率来测定ADA活性。酶联法可实现自动分析，但需多步酶偶联反应，操作复杂，检测成本较高。
化学发光法分析ADA活性的原理为：底物腺苷经ADA和PNP催化后可生成次黄嘌呤，再经XOD氧化生成尿酸和H2O2，H2O2与鲁米诺发生化学发光反应，其发光强度与次黄嘌呤含量成正比，由此可测定ADA活性。徐顺清等[18]基于上述原理报道了检测ADA活性的化学发光法，该法对癌性胸水及结核性胸膜炎的诊断鉴别有较好的实用价值。
高效液相色谱技术能够将ADA酶促反应的底物与产物完全分离并准确定量而测定ADA活性。Uberti等[19]首次以强阳离子交换色谱柱分析人淋巴细胞与血红细胞中的ADA活性，由于人淋巴细胞中PNP的存在，因此肌苷会进一步转化为次黄嘌呤，基于分离的产物与底物，定量分析产物的生成速率进而评估ADA活性。该法也有很多不足，其样品前处理过程(如蛋白的完全沉淀，过滤与pH值的调节)复杂，而过酸过碱或是含有一定量蛋白的样品均会损坏色谱柱，且冲洗和平衡过程较耗时。
毛细管电泳法也是基于分离ADA酶促反应体系中的底物与产物而达到准确定量，从而评价ADA活性。Carlucci F[20]等利用毛细管电泳法诊断和检测了腺苷脱氨酶缺乏症。Qi Y[21]等利用毛细管电泳法检测了腺苷脱氨酶活性并在中药中筛选出ADA抑制剂。该方法灵敏度不高，操作中间步骤多、费时。
同位素分析ADA活性的原理为：利用同位素标记的腺苷作为底物，经催化分解后测定系统中标记的腺苷或次黄苷或氨的含量变化都能够计算酶的活性。Niedzwicki等[22]用同位素法测定了人血浆中ADA的活性。此法灵敏度高，但需放射性核素，易导致环境污染，不适合常规应用。
综上，ADA是体内重要的核苷酸代谢酶，与很多疾病相关，对其活性分析具有重要的临床意义。测定ADA活性的常用方法有紫外法、比色法、高效液相色谱法等，但是这些方法都存在一些不足之处，还需要开发新的检测ADA活性的方法。近年来，UPLC-MS证实具备灵敏度高、选择性好的优势，可以建立UPLC-MS检测ADA活性的方法，为ADA的进一步研究提供工具。然而，平衡稳定的UPLC-MS的建立受到众多因素的影响，如扫描模式、流动相、流量、色谱柱、温度等。以上条件都需要结合检测物质的特性及对于UPLC-MS的经验进行摸索。
专利文献CN106153773A，公开日2016.11.23，公开了一种利用超高效液相色谱串联质谱快速定量测定婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的方法，采用CORTECS HILIC色谱柱进行分离，以甲醇-0.1％甲酸溶液为流动相，柱温25℃，进样量2μL，流速0.3ml/min，质谱离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式，扫描方式为多反应监测，定量离子为m/z 162.2→103.1。该方法操作简便、灵敏度高、重复性好。专利文献CN106290661A，公开日2017.01.04，公开了一种高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内CYP2C9酶活力的方法，该方法具体包括如下步骤：(1)制备蚯蚓微粒体蛋白悬浮液；(2)将步骤(1)中制得的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液加入含有探针底物的孵育体系中，升温启动酶促反应，待酶促反应终止后，利用高效液相色谱串联质谱联用仪检测经酶促反应终止后所产生的代谢产物，计算CYP2C9酶活力。该检测方法准确度、精确度及灵敏度高，稳定性强，可用于不同污染环境下蚯蚓体内CYP2C9活力的分析检测。
但目前还未见精密度好、准确度高、稳定性强，可满足临床要求的测定腺苷脱氨酶活性及筛选腺苷脱氨酶抑制剂的液相色谱串联质谱法。
参考文献：
[1]Somech R,Lev A,Grisaru-Soen G,et al.Purine nucleosidephosphorylase deficiency presenting as severe combined immune deficiency[J].Immunologic research,2013,56(1):150-154.
[2]Shovlin C L,Hughes J M B,Simmonds H A,et al.Adult presentation ofadenosine deaminase deficiency[J].The Lancet,1993,341(8858):1471.
[3]Ochs H D,Smith C I E,Puck J M.Primary immunodeficiency diseases:amolecular&cellular approach[M].Oxford University Press,2006.
[4]Aiuti A,Cattaneo F,Galimberti S,et al.Gene therapy forimmunodeficiency due to adenosine deaminase deficiency[J].New England Journalof Medicine,2009,360(5):447-458.
[5]余莲,张兆嶙.白血病患者血清腺苷脱氨酶测定及临床意义[J].白血病,1999,8(5):292-293.
[6]施前锋,徐辉.血清腺苷脱氨酶在伤寒诊断中的意义[J].江西医学检验,2001,19(1):57.
[7]Nalini G,Hariprasad C,Chandrasekaran AN,et al.A comparative studyof serum deaminases in systemic rheumatic diseases[J].Rheumatology,1993,32(12):1118-1119.
[8]管茶英,周美霞,陈光.糖尿病患者血清腺苷脱氨酶测定的临床意义[J].临床检验杂志,2006,24(5):331.
[9]张军,常丽.肝病患者血清腺苷脱氨酶的检测分析[J].航空航天医药,2006,17(2):76.
[10] A,Canbolat O,Demirci S,et al.Activities of adenosinedeaminase and 5′-nucleotidase in cancerous and noncancerous human colorectaltissues[J].Medical Oncology,2000,17(4):319-324.
[11]Aghaei M,Karami-Tehrani F,Salami S,et al.Adenosine deaminaseactivity in the serum and malignant tumors of breast cancer:the assessment ofisoenzyme ADA1and ADA2activities[J].Clinical biochemistry,2005,38(10):887-891.
[12]Sufrin G,Tritsch G L,Mittelman A,et al.Adenosine deaminaseactivity in patients with renal adenocarcinoma[J].Cancer,1977,40(2):796-802.
[13]董佩杰,张新国,刘英娟,等.腺苷脱氨酶抑制剂快速筛选模型的建立[J].中国现代应用药学,2015,32(11):1301-1305.
[14]赵明.腺苷脱氨酶和溶菌酶测定在胸腔积液鉴别诊断中的价值[J].中国社区医师:医学专业,2010(6):110-110.
[15]Pinnelli V B,Jayashankar C A,Mohanty S,et al.Elevated levels ofserum adenosine deaminase in type 2diabetes mellitus patients[J].International Journal of Research in Medical Sciences,2016,4(1):131-134.
[16]何忠发,陈敬捷,罗雪林,等.腺苷脱氨酶双试剂测定的全自动分析方法[J].检验医学与临床,2010,7(17):1859-1861.
[17]胡卫红,魏小文,王超要,等.酶法测定血清腺苷脱氨酶的应用评价[J].中国误诊学杂志,2006,6(2):266-267.
[18]徐顺清,陈志飞.发光分析测定体液中腺苷脱氨酶[J].同济医科大学学报,1997,26(6):438-441.
[19]Uberti J,Lightbody J J,Johnson R M.Determination of adenosinedeaminase activity using high-pressure liquid chromatography[J].Analyticalbiochemistry,1977,80(1):1-8.
[20]Carlucci F,Tabucchi A,Aiuti A,et al.Capillary electrophoresis indiagnosis and monitoring of adenosine deaminase deficiency[J].ClinicalChemistry,2003,49(11):1830-1838.
[21]Qi Y,Li Y,Bao J J.Development of a capillary electrophoresismethod for analyzing adenosine deaminase and purine nucleoside phosphorylaseand its application in inhibitor screening[J].Analytical biochemistry,2016,506:31-44.
[22]Niedzwicki J G,Mayer K H,Abushanab E,et al.Plasma adenosinedeaminase2,is a marker for human immunodeficiency virus‐1seroconversion[J].American journal of hematology,1991,37(3):152-155.
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法。
第一方面，本发明提供了一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)酶促反应：向待测样品中加入底物腺苷进行反应，反应终止后制备反应终止液上清液；
(2)液相色谱串联质谱法测定反应终止液上清液中肌苷含量；
(3)计算腺苷脱氨酶的活性；
步骤(2)中，液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：38-42℃；流速：0.28-0.32mL/min；进样体积：4.5-5.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气N2流速：34-36arb；辅助气N2的流量流速：9-11arb；喷雾电压：1.9-2.1kV；毛细管温度：310-330℃；s-lens射频水平：48-52；辅助气加热器温度：290-310℃。
较优地，所述的液相条件如下：柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：5μL。
较优地，所述的质谱条件如下：鞘气N2流速：35arb；辅助气N2的流量流速：10arb；喷雾电压：2.00kV；毛细管温度：320℃；s-lens射频水平：50；辅助气加热器温度：300℃。
作为本发明的一个具体实施例，所述的待测样品是经预处理的血清、全血或血细胞。
较优地，所述的步骤(1)具体如下：
(1-1)取血清、全血或血细胞，使用pH7.5-7.7的9-11mM PBS缓冲液进行稀释并测定蛋白浓度，得到18-22mg/mL蛋白浓度的待测样品；
(1-2)向所述的待测样品中加入底物腺苷，腺苷终浓度为3.740-3.750μM，30-40℃反应18-22min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液，加3.5-4.5倍体积的水稀释混匀，离心，得到反应终止液上清液。
第二方面，本发明提供了一种液相色谱串联质谱法筛选腺苷脱氨酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
(1)酶促反应：向待测样品中加入腺苷脱氨酶溶液和底物腺苷进行反应，终止反应；
(2)液相色谱串联质谱法测定反应终止液中肌苷含量；
(3)计算腺苷脱氨酶的活性；
步骤(2)中，液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：38-42℃；流速：0.28-0.32mL/min；进样体积：4.5-5.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气N2流速：34-36arb；辅助气N2的流量流速：9-11arb；喷雾电压：1.9-2.1kV；毛细管温度：310-330℃；s-lens射频水平：48-52；辅助气加热器温度：290-310℃。
较优地，所述的液相条件如下：柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：5μL。
较优地，所述的质谱条件如下：鞘气N2流速：35arb；辅助气N2的流量流速：10arb；喷雾电压：2.00kV；毛细管温度：320℃；s-lens射频水平：50；辅助气加热器温度：300℃。
较优地，所述的步骤(1)具体如下：
(1-1)制备中药提取物溶液或化合物溶液；
(1-2)加入腺苷脱氨酶溶液混合，腺苷脱氨酶终浓度为0.00732-0.00738unit/mL，放置5-15min，加入底物腺苷，腺苷的终浓度为3.740-3.750μM，30-40℃反应18-22min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液用水稀释。
作为本发明的一个具体实施例，所述的中药提取物溶液的制备方法为：取药材，用甲醇超声提取，收集上清液，干燥得到浸膏，用0.8％-1.2％DMSO溶解，即得。
本发明优点在于：
1、建立了测定腺苷脱氨酶活性的液相色谱串联质谱方法；
2、建立了筛选腺苷脱氨酶抑制剂的液相色谱串联质谱方法；
3、本发明的液相色谱串联质谱条件是基于发明人对检测物和液相色谱串联质谱丰富的研究经验基础上，选择得到合适的参数条件，结合实验摸索得到的，取得了显著的效果，能用于检测全血、血清及血细胞这些复杂样品中的腺苷脱氨酶活性，或用于检测中药或化合物作用后的复杂样品中的腺苷脱氨酶活性，具有准确度、精密度、灵敏度高，稳定性好，操作简单，成本低，高通量的优点。
综上，本发明为临床检测腺苷脱氨酶活性以诊断白血病、伤寒、系统性红斑狼疮、糖尿病、肝病、肿瘤等提供了一种更为有效的方法，也为筛选腺苷脱氨酶抑制剂以治疗上述疾病提供了帮助。
附图说明
附图1.产物肌苷和内标的色谱图。
附图2.酶浓度对肌苷生成量的影响。
附图3.底物腺苷对肌苷生成量的影响。
附图4.反应时间对肌苷生成量的影响。
附图5.反应温度对肌苷生成量的影响。
附图6.ADA酶促动力学曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、实验方法
1仪器与试剂
1.1仪器
涡旋仪(Votex-Genie 2，USA)，BT-25S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。KQ-250DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。微量移液器(Eppendorf，USA)。Milli-Q纯水仪(Milli-Q，Millipore Co.，Billerica，MA，USA)。微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司)。
1.2试剂
腺苷脱氨酶(ADA)购于上海源叶生物科技有限公司。腺苷(AD)，肌苷(Hypoxanthine ribonucleoside)，矮壮素(内标，IS)，购买于Sigma-Aldrich(MO,USA)。EHNA和2’-脱氧助间霉素(2’-dC F)购于大连美仑生物技术有限公司。色谱级甲醇购于Fisher Co.(NJ,USA)。色谱级甲酸购于Tedia Inc.(OH,USA)。超纯水通过Milli-QAcademic System(Millipore,Billerica,MA)获得。其他试剂均为分析级。
山豆根、茵陈蒿、女贞子、掌叶大黄、板蓝根、大青叶、猪苓、土鳖虫、虫草菌丝(CS-4)、五味子、丹参、甘草、黄芪、川芎、当归、白芍、柴胡、栀子、黄连、姜黄、防己、苦参、绞股蓝、白术、桃仁、升麻、松花粉、虎杖和垂盆草等购于上海养和堂药业连锁经营有限公司。
1.3实验动物与样品收集
10只雄性SD大鼠(180～220g)购自北京维通利华实验动物有限公司(生产许可：SCXK(京)2016-0011)，饲养于上海中医药大学实验动物中心(使用许可：SYXK(沪)2014-0008)。从眼眶静脉丛取血肝素抗凝获得全血、非抗凝离心获得血清及血细胞。
2标准溶液及质控样品配制
取适量的肌苷，加超纯水溶解配制获得7.456mM的储存液；取适量的IS，加甲醇溶解配制获得6.326mM的储存液。使用初始流动相通过一系列稀释肌苷，获得8个系列浓度(0.020、0.049、0.122、0.305、0.764、1.909、4.772、11.930μM)标准工作液及低(0.020μM)、中(0.764μM)、高(11.930μM)质控(Quality control，QC)样品，使用甲醇稀释获得3.290μM的IS工作液，所有的溶液都储存于4℃，放置室温后使用。
3药材提取与样品制备
取药材粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液。取上清液重量的15％放入到10mL EP管中，氮吹干，再称重，获得浸膏的重量。称取适量浸膏加入1％DMSO溶解制备获得100mg/mL待测药材的母液。
4色谱条件
液相条件：色谱柱使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm，i.d.1.8μm，Waters，USA)，柱温：40℃。流速：0.3mL/min，等度洗脱，流动相为0.1％甲酸水-甲醇(85％-15％)，进样体积为5μL。
质谱条件：使用Thermo Fisher Q-Exactive LC Orbitrap LC-MS/MS四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)配备HESI源作为分析检测的仪器。在正离子模式下采用全扫描(分辨率为70 000)，设定质荷比范围为m/z 50至750。质谱参数设置如下：鞘气(N2)流速：35arb；辅助气(N2)的流量流速：10arb；喷雾电压：2.00kV；毛细管温度：320℃；s-lens射频水平：50；辅助气加热器温度：300℃。
5方法学验证
5.1线性:通过测定0.020至11.930μM的8个不同浓度的肌苷，平行五份样品，标准曲线是通过产物与内标峰面积的比值与浓度作图获得的，产物肌苷峰面积与内标峰面积的比值作为y值，肌苷浓度作为x值进行线性回归。最低检测限与定量限分别为检测信噪比为3与10时标品的浓度。
5.2精密度:精密度是通过测定浓度分别为0.020,0.764,11.930μM的三个质控样品(n＝6)获得的，其中日内精密度是一天之内测定三次质控样品(QC)，日间精密度是连续三天测定三次质控样品，RSD通过等式：％RSD＝[standard deviation(SD)/Cobs]×100计算。所测得的高、中浓度QC样品的精密度RSD＜15％，低浓度QC样品的精密度RSD＜20％。
5.3准确度：准确性通过测定三个不同浓度的QC样品(0.020,0.764,11.930μM；n＝6)，通过标准曲线计算出测定的浓度。通过方程回收率(％)＝[Cobs/Cthe]×100计算回收率，Cobs为计算浓度，Cthe为理论浓度。准确度要求在85％-115％范围内。
5.4稳定性：室温稳定性即通过测定室温(25±2℃)放置4h的三个不同浓度的QC样品(n＝6)，测定稳定性通过测定于进样室或冰箱(4℃)放置24h的三个不同浓度的QC样品(n＝6)。
5.5基质效应：基质效应是通过比较含基质的(预处理甲醇沉淀蛋白)的溶剂配制的样品(B,n＝6)与初始流动相配制的样品(A,n＝6)，并通过mean value(B)/mean value(A)×100％计算获得，基质效应要求在85％至115％之间。
6腺苷脱氨酶活性测定
使用AD作为ADA活性实验的底物，测定大鼠血清、全血和血细胞中ADA活性。大鼠血清、全血和血细胞使用10mM PBS缓冲液(pH7.6)进行稀释并采用BCA法测定蛋白浓度。首先加入30μL的待测样品(20mg/mL蛋白浓度)，然后加入30μL底物(AD为3.742μM)，30℃反应，在反应5min及10min时立即用180μL含有3.290μM IS的冰甲醇(0℃)终止反应，平行3份，取反应终止液50μL，加入200μL水稀释混匀，至15000×g离心10min，取上清液进样检测。
7体外筛选ADA抑制剂实验
使用AD作为ADA活性实验的底物。采用优化好的条件，首先加入包括6μL的待测样品，然后加入34μL酶溶液(ADA为0.00736unit/mL)混合，放置10min，加入20μL底物(AD为3.742μM)，30℃反应20min，立即用180μL含有3.290μM IS的冰甲醇(0℃)终止反应，取出50μL，加入200μL水稀释混匀，用于分析。IC50值通过Prism 5软件计算。
使用UPLC-MS法对ADA酶动力学特征进行分析评价。使用6μL缓冲液替代待测样品，使用的底物浓度AD为(1.871-374.195μM)，平行三份。动力学参数：最大反应速率(Vmax)及米氏常数(Km)通过Eadie-Hofstee V versus V/S作图拟合获得。
二、实验结果
1色谱条件
在先前提到的UPLC条件下，使用HSS T3柱肌苷和内标能够达到基线分离，其保留时间分别为0.95和1.53min(见图1)。在本试验，为了改善各成分的色谱行为，如良好的峰对称性，高的检测灵敏性和适当的离子化，结合自身丰富的研究经验，我们考察了大量因素，包括不同的流动相(水，乙腈，甲醇)及流动相添加剂(乙酸铵，乙酸，甲酸)等因素，最终选择0.1％甲酸与甲醇作为流动相，流速为0.3mL/min，柱温40℃，检测时间仅为2min可用作准确的高通量筛选，并且在实验中AD和ADA用量也较低。
2方法学验证
对该方法的线性、选择性、精密度、准确度、基质效应及稳定性进行了评价。
肌苷的线性方程为y＝0.312x+0.00603，R2＝0.9951，肌苷的LOD(S/N＝3)为0.013μM，LOQ(S/N＝10)为0.02μM。日内和日间精密度、准确性、基质效应及稳定性的结果见表1，其中日内精密度在2.14％至7.17％内，日间精密度2.55％至8.99％间；三个水平质控样品的准确度分别为89.17±2.04、111.3±0.85、85.69±1.13，准确度都在85％-115％范围内，基质效应在101.64％至107.12％范围内，室温稳定性及储存稳定性都符合测定要求。
表1 UPLC-MS法测定肌苷的方法学验证结果(mean±sd)
注：RT：室温。
3优化酶反应的酶浓度底物、酶浓度
酶反应的底物浓度、酶浓度及反应时间的优化，根据稳定状态动力学原理应选择产物生成呈线性变化的区域。发现在抗ADA实验中(见图2-4)，ADA的用量是0.00736unit/mL，底物腺苷的用量是3.742μM，反应时间是20min，产物肌苷的生成呈线性变化，因此选择反应中，ADA的用量是0.00736unit/mL，底物腺苷的用量是3.742μM。
4优化酶反应的温度
在反应温度30℃至40℃间对ADA没有影响(见图5)，故为了实验方便选择了30℃作为酶反应的实验温度。
5ADA反应的米氏常数
为计算获得酶动学参数，采用未加抑制剂组的反应，结果见图6，从图可以知道，ADA催化的反应符合米氏动力学。ADA的Km和Vmax分别为81.70±13.82μM和779.2±43.99μM/min/unit。
6大鼠血清、全血和血细胞中ADA活性
采用建立好的方法测得大鼠全血、血清及血细胞ADA活性分别为1.765±0.434unit/mg protein、0.450±0.101unit/mg protein和2.150±0.412unit/mgprotein。
7体外ADA抑制及筛选
采用建立好的方法测得各中药体外抑制ADA活性结果见表1，其中柴胡、川芎、当归、苦参、茵陈蒿、白术、大青叶、女贞子、五味子、栀子、掌叶大黄、虫草菌丝(CS-4)、升麻、松花粉、虎杖和垂盆草表现出不同程度抑制ADA活性。
表1.中药和化合物抑制腺苷脱氨酶活性
实施例2
(1)从SD大鼠眼眶静脉丛取血肝素抗凝获得全血、非抗凝离心获得血清及血细胞，使用pH7.5的11mM PBS缓冲液进行稀释并测定蛋白浓度，得到18mg/mL蛋白浓度的待测样品；向所述的待测样品中加入底物腺苷，腺苷终浓度为3.740μM，30℃反应22min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液，加3.5倍体积的水稀释混匀，离心，得到反应终止液上清液。
(2)按照实施例1的方法，通过液相色谱串联质谱法测定反应终止液上清液中肌苷含量：
液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：42℃；流速：0.28mL/min；进样体积：4.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气(N2)流速：34arb；辅助气N2的流量流速：11arb；喷雾电压：1.9kV；毛细管温度：330℃；s-lens射频水平：52；辅助气加热器温度：290℃。
(3)计算腺苷脱氨酶的活性，测得大鼠全血、血清及血细胞ADA活性分别为1.658±0.339unit/mg protein、0.429±0.095unit/mg protein和2.251±0.347unit/mgprotein。
实施例3
(1)从SD大鼠眼眶静脉丛取血肝素抗凝获得全血、非抗凝离心获得血清及血细胞，使用pH7.7的9mM PBS缓冲液进行稀释并测定蛋白浓度，得到22mg/mL蛋白浓度的待测样品；向所述的待测样品中加入底物腺苷，腺苷终浓度为3.750μM，40℃反应18min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液，加4.5倍体积的水稀释混匀，离心，得到反应终止液上清液。
(2)按照实施例1的方法，通过液相色谱串联质谱法测定反应终止液上清液中肌苷含量：
液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：38℃；流速：0.32mL/min；进样体积：5.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气(N2)流速：36arb；辅助气N2的流量流速：9arb；喷雾电压：2.1kV；毛细管温度：310℃；s-lens射频水平：48；辅助气加热器温度：310℃。
(3)计算腺苷脱氨酶的活性，测得大鼠全血、血清及血细胞ADA活性分别为1.598±0.417unit/mg protein、0.472±0.102unit/mg protein和2.271±0.258unit/mgprotein。
实施例4
(1)取药材(柴胡)粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液。取上清液重量的15％放入到10mL EP管中，氮吹干，再称重，获得浸膏的重量。称取适量浸膏加入1％DMSO溶解制备获得100mg/mL待测药材的母液。加入腺苷脱氨酶溶液混合，腺苷脱氨酶终浓度为0.00732unit/mL，放置15min，加入底物腺苷，腺苷的终浓度为3.740μM，40℃反应18min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液用水稀释。
(2)按照实施例1的方法，液相色谱串联质谱法测定反应终止液中肌苷含量：
液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：38℃；流速：0.32mL/min；进样体积：4.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气(N2)流速：34arb；辅助气N2的流量流速：9arb；喷雾电压：2.1kV；毛细管温度：330℃；s-lens射频水平：48；辅助气加热器温度：310℃。
(3)计算腺苷脱氨酶的活性，进一步计算对腺苷脱氨酶的IC50。结果测得柴胡提取物对腺苷脱氨酶的IC50为2.24±0.05mg·mL-1。
实施例5
(1)取药材(五味子)粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液。取上清液重量的15％放入到10mL EP管中，氮吹干，再称重，获得浸膏的重量。称取适量浸膏加入1％DMSO溶解制备获得100mg/mL待测药材的母液。加入腺苷脱氨酶溶液混合，腺苷脱氨酶终浓度为0.00738unit/mL，放置5min，加入底物腺苷，腺苷的终浓度为3.750μM，35℃反应22min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液用水稀释。
(2)按照实施例1的方法，液相色谱串联质谱法测定反应终止液中肌苷含量：
液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：42℃；流速：0.28mL/min；进样体积：5.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气(N2)流速：36arb；辅助气N2的流量流速：11arb；喷雾电压：1.9kV；毛细管温度：310℃；s-lens射频水平：52；辅助气加热器温度：290℃。
(3)计算腺苷脱氨酶的活性，进一步计算对腺苷脱氨酶的IC50。结果测得五味子提取物对腺苷脱氨酶的IC50为0.051±0.002mg·mL-1。
实施例6
条件优化过程中，设置了大量的实验组。例如当流动相采用0.1％甲酸水-乙腈(70:30)，流速为0.3mL/min时，目标物质出峰时间延长，2min内无法完成检测，且峰型宽。当流动相采用0.1％甲酸水-乙腈(85:15)，流速为0.4mL/min时，目标物质出峰与内标物出峰时间重叠，质谱响应相互有一定影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)酶促反应：向待测样品中加入底物腺苷进行反应，反应终止后制备反应终止液上清液；
(2)液相色谱串联质谱法测定反应终止液上清液中肌苷含量；
(3)计算腺苷脱氨酶的活性；
步骤(2)中，液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：38-42℃；流速：0.28-0.32mL/min；进样体积：4.5-5.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气N2流速：34-36arb；辅助气N2的流量流速：9-11arb；喷雾电压：1.9-2.1kV；毛细管温度：310-330℃；s-lens射频水平：48-52；辅助气加热器温度：290-310℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液相条件如下：柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：5μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的质谱条件如下：鞘气N2流速：35arb；辅助气N2的流量流速：10arb；喷雾电压：2.00kV；毛细管温度：320℃；s-lens射频水平：50；辅助气加热器温度：300℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是经预处理的血清、全血或血细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)具体如下：
(1-1)取血清、全血或血细胞，使用pH7.5-7.7的9-11mM PBS缓冲液进行稀释并测定蛋白浓度，得到18-22mg/mL蛋白浓度的待测样品；
(1-2)向所述的待测样品中加入底物腺苷，腺苷终浓度为3.740-3.750μM，30-40℃反应18-22min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液，加3.5-4.5倍体积的水稀释混匀，离心，得到反应终止液上清液。
6.一种液相色谱串联质谱法筛选腺苷脱氨酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)酶促反应：向待测样品中加入腺苷脱氨酶溶液和底物腺苷进行反应，终止反应；
(2)液相色谱串联质谱法测定反应终止液中肌苷含量；
(3)计算腺苷脱氨酶的活性；
步骤(2)中，液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：38-42℃；流速：0.28-0.32mL/min；进样体积：4.5-5.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气N2流速：34-36arb；辅助气N2的流量流速：9-11arb；喷雾电压：1.9-2.1kV；毛细管温度：310-330℃；s-lens射频水平：48-52；辅助气加热器温度：290-310℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的液相条件如下：柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：5μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的质谱条件如下：鞘气N2流速：35arb；辅助气N2的流量流速：10arb；喷雾电压：2.00kV；毛细管温度：320℃；s-lens射频水平：50；辅助气加热器温度：300℃。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)具体如下：
(1-1)制备中药提取物溶液或化合物溶液；
(1-2)加入腺苷脱氨酶溶液混合，腺苷脱氨酶终浓度为0.00732-0.00738unit/mL，放置5-15min，加入底物腺苷，腺苷的终浓度为3.740-3.750μM，30-40℃反应18-22min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液用水稀释。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的中药提取物溶液的制备方法为：取药材，用甲醇超声提取，收集上清液，干燥得到浸膏，用0.8％-1.2％DMSO溶解，即得。
CN201810030524.3A 2018-01-12 2018-01-12 一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法 Pending CN108318594A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810030524.3A CN108318594A (zh) 2018-01-12 2018-01-12 一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810030524.3A CN108318594A (zh) 2018-01-12 2018-01-12 一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108318594A true CN108318594A (zh) 2018-07-24

Family

ID=62893570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810030524.3A Pending CN108318594A (zh) 2018-01-12 2018-01-12 一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108318594A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109270179A (zh) * 2018-10-22 2019-01-25 中国药科大学 一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂
CN111650314A (zh) * 2020-06-05 2020-09-11 深圳华大临床检验中心 非衍生法串联质谱检测遗传代谢疾病相关物质的试剂盒和方法
CN114686560A (zh) * 2022-04-08 2022-07-01 通辽梅花生物科技有限公司 一种腺苷水解酶酶活性的检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1319095A (zh) * 1998-07-23 2001-10-24 藤泽药品工业株式会社 咪唑化合物及其作为腺苷脱氨酶抑制剂的用途
BR0205204A (pt) * 2002-12-30 2004-09-21 Comissao Nac Energia Nuclear Processo para obtenção de altos nìveis de expressão do hormÈnio estimulador de tireóide (tireotrofina humana ou htsh) em células de ovário de hamster chinês, mediante a utilização de vetores de expressão dicistrÈnicos, aplicação de uma estratégia de amplificação com duplo marcador gênico detecção e controle de qualidade do mesmo htsh ao longo do processo de produção mediante cromatografia lìquida de alta eficiência em fase reversa
CN103439442A (zh) * 2013-08-21 2013-12-11 上海交通大学医学院附属仁济医院 血浆中肌苷含量的测定方法
CN106018572A (zh) * 2016-01-27 2016-10-12 中国药科大学 一种同时测定10种核苷类物质的hplc-tof-ms/ms方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1319095A (zh) * 1998-07-23 2001-10-24 藤泽药品工业株式会社 咪唑化合物及其作为腺苷脱氨酶抑制剂的用途
BR0205204A (pt) * 2002-12-30 2004-09-21 Comissao Nac Energia Nuclear Processo para obtenção de altos nìveis de expressão do hormÈnio estimulador de tireóide (tireotrofina humana ou htsh) em células de ovário de hamster chinês, mediante a utilização de vetores de expressão dicistrÈnicos, aplicação de uma estratégia de amplificação com duplo marcador gênico detecção e controle de qualidade do mesmo htsh ao longo do processo de produção mediante cromatografia lìquida de alta eficiência em fase reversa
CN103439442A (zh) * 2013-08-21 2013-12-11 上海交通大学医学院附属仁济医院 血浆中肌苷含量的测定方法
CN106018572A (zh) * 2016-01-27 2016-10-12 中国药科大学 一种同时测定10种核苷类物质的hplc-tof-ms/ms方法及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUL MIN PARK 等: "Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based multiplex enzyme assay for six enzymes associated with hereditary hemolytic anemia", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 *
KUN HU 等: "A carbon nanotubes based fluorescent aptasensor for highly sensitive detection of adenosine deaminase activity and inhibitor screening in natural extracts", 《JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS》 *
周芬霞: "孢子粉灵芝粉剂活性成分分析及增强免疫力功能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
董佩杰 等: "腺苷脱氨酶抑制剂快速筛选模型的建立", 《中国现代应用药学》 *
齐艳菲 等: "毛细管电泳分析血红细胞中腺苷脱氨酶活性", 《分析实验室》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109270179A (zh) * 2018-10-22 2019-01-25 中国药科大学 一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂
CN109270179B (zh) * 2018-10-22 2020-08-28 中国药科大学 一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂
CN111650314A (zh) * 2020-06-05 2020-09-11 深圳华大临床检验中心 非衍生法串联质谱检测遗传代谢疾病相关物质的试剂盒和方法
CN114686560A (zh) * 2022-04-08 2022-07-01 通辽梅花生物科技有限公司 一种腺苷水解酶酶活性的检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102072846B (zh) 复方氨基酸（8）维生素（11）胶囊的质量检测方法
CN108318594A (zh) 一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法
CN111562322B (zh) 一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法及应用
WO2023005687A1 (zh) 一种代谢谱检测试剂盒及使用方法与应用
CN105954453A (zh) 一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒
Świądro et al. Development of a new method for drug detection based on a combination of the dried blood spot method and capillary electrophoresis
CN104198619A (zh) 一种小儿止咳糖浆的质量检测方法
CN111781290A (zh) 用于准确测定人血清中多种抗癫痫药物血药浓度的试剂盒及检测方法
CN114487242B (zh) 鸡内金和/或醋鸡内金及制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法
CN106908532B (zh) 测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法
CN114689771A (zh) 一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒
CN112730674B (zh) 一种罗汉茶的质量检测方法
CN103033623A (zh) 人m2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒及制备方法
CN101181339B (zh) 艾迪注射制剂的检测方法
CN106483210A (zh) 一种赤灵芝药材的质量控制方法
CN110361485A (zh) 一种血液中奥卡西平药物浓度监测试剂盒及其检测方法
CN111579684B (zh) 一种胶囊剂的囊材中辣椒总碱的含量测定方法
CN104345108A (zh) 一种清肝片的定性定量检测方法
CN109828040B (zh) 墨旱莲药材uplc特征图谱的构建方法和检测方法
CN106546690B (zh) 一种20(R)-人参皂苷Rg3的质量标准检测方法
EP3660502A1 (en) A method for determination of 5-fluorouracil in serum and a kit for thereof
CN110146615A (zh) 一种同时测血清中尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量的方法
CN205263036U (zh) 一种快速检测血样中氟尿嘧啶的系统
CN109187816A (zh) 一种鉴定胰腺炎生物标记物的方法及其检测试剂盒
CN109406671A (zh) 一种鉴定类风湿性关节炎生物标记物的方法及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180724

RJ01 Rejection of invention patent application after publication