TWI574693B - Separation and Purification of Functional Components in Antrodia camphora by Supercritical Fluid Technology - Google Patents

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Description

以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法
本發明係與分離與純化牛樟芝中機能成分之技術有關，更詳而言之是指一種以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法者。
牛樟芝是一種生長在樟科植物(如牛樟樹心材)的寄生真菌，具有抗氧化，降血壓和增強免疫力等功效，不僅可作為食材，並已被廣泛運用於治療藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓和癌症。牛樟芝的活性成分為三萜類化合物(triterpenoids)、多醣體(polysaccharides)、腺苷(adenosine)、維生素、蛋白質、胜肽、核酸等。三萜類中主要麥角甾(ergostane)三萜類(zhankuic acid A,C與antcin C,K)與羊毛甾烷(lanostane)三萜類(dehydroeburicoic acid與dehydrosulphurenic acid)成分。牛樟芝子實體萃取物中的antcin A成分，可抑制老鼠血癌細胞的活性，zhankuic acid A及zhankuic acid C有強的癌細胞毒殺作用。牛樟芝萃取純化的三萜類成分：dehydrosulphurenic acid、dehydroeburicoic acid之實驗結果證明，具有抗腫瘤活性、促使癌細胞凋亡，但不影響人體正常細胞。牛樟芝多醣體成分亦被實驗證明。
習知從牛樟芝中萃取其活性成分：三萜類化合物與多醣體成分的方法，如中國專利CN 102614195 A與美國專利20100210869 A1，係以乙醇溶液、正己烷溶液及乙酸乙酯溶液依次對牛樟芝子實體進行萃取其麥角甾與羊毛甾烷三萜類成分。美國專利7994158 B2首先以水或有機溶劑(如乙酸乙酯、己烷、醇類、氯仿)萃取，得到的水或有機溶劑萃取物，再經矽膠、Sephadex吸收、濃縮和純化。美國專利20100227404 A1以乙酸乙酯、乙醇和水萃取牛樟芝子實體中之多醣體，台灣專利I299665係以乙醇萃取牛樟芝菌絲體中之多醣體。
由上可知，習知萃取牛樟芝中三萜類化合物與多醣體機能成分之技術，不僅耗時，需使用大量的有機溶劑，且過程中有機溶劑可能會與機能成分產生化學反應，完成後溶劑去除與濃縮過程中，加熱蒸發溶劑易造成機能成分部分破壞與溶劑殘留於分離物或純化物中，險有改進之處。
本發明之主要目的即在提供一種以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法，其可直接取得牛樟芝中三萜類化合物與多醣體機能成分，不需經繁複的溶劑去除與濃縮、分離程序，且無溶劑殘留等安全疑慮，成本低，更可保持牛樟芝中生物活性成分的活性，甚為環保、安全，具實用價值者。
緣是，為達成前述之目的，本發明係提供一種以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法，主要係在預定溫度與壓力之操作條件下，將牛樟芝萃取液與超臨界狀態溶劑通入一分餾槽內，用以萃取出牛樟芝之三萜類化合物與多醣體等機能成分，再將萃取出之機能成分與超臨界狀態溶劑，在預定溫度與低於前述壓力之操作條件下，持續通入三個分離槽，用以分別於各分離槽中獲得牛樟芝萃取液中之三萜類化合物與多醣體機能成分。
進一步地，牛樟芝萃取液係以1：5-10(W/V)的比例將牛樟芝粉末與乙醇混合離心而成。
進一步地，牛樟芝粉末可為牛樟芝之子實體、菌絲體、固態培養之粉末。
進一步地，係在壓力2000-4000Psi、溫度40-60℃之操作條件下，將牛樟芝萃取液放置於該分餾槽，以超臨界流體流速3-9L/hr、牛樟芝萃取液流速1-3L/hr流入分餾槽進行萃取，超臨界狀態溶劑係超臨界二氧化碳/乙醇。
進一步地，係將該分餾槽內萃取出之機能成分依序輸送經過連接之三個分離槽逐步降壓，用以可選擇性分離與純化提升三萜類化合物與多醣體機能成分之含量與純度。
進一步地，係在溫度40℃或60℃下，依序分別以3000、2000、1000psi之壓力於三個分離槽快速降壓分離超臨 界狀態溶劑。
進一步地，在壓力為4000Psi、溫度為40℃之操作條件下，最適於將牛樟芝三萜類成分分離於該分餾槽之頂部，而牛樟芝多醣體成分容易被分離於該分餾槽之底部。
進一步地，在溫度為40℃、壓力為4000psi之操作條件下，牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分之選擇性值達220，最適於將牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分純化區分於三個分離槽中。
圖一係本發明一較佳實施例之壓力-牛樟芝總三萜類成分分離效率分析圖。
圖二係本發明一較佳實施例之壓力-牛樟芝三萜類成分分離效率分析圖。
圖三係本發明一較佳實施例之壓力-牛樟芝總多醣體成分分離效率分析圖。
圖四係本發明一較佳實施例之壓力-牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分之選擇性值分析圖。
圖五係本發明一較佳實施例之三萜類化合物與多醣體成分、分餾槽底部殘餘物(R)與三分離槽F1、F2、F3之濃度分佈圖。
圖六係本發明一較佳實施例之HPLC圖譜圖。
以下，茲舉本發明一較佳實施例，並配合圖式做進一步之詳細說明如後：本發明一較佳實施例以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法，主要係先備取1-2Kg之牛樟芝粉末(可為牛樟芝之子實體、菌絲體、皿式培養或固態培養、粉末)，以1：5-10(W/V)的比例用乙醇混合離心，產生牛樟芝萃取液(Feed)，接著在壓力2000-4000Psi、溫度40-60℃、超臨界流體(二氧化碳SC-CO2/乙醇溶劑)流速3-9L/hr與牛樟芝萃取液流速1-3L/hr之操作條件下，通入一分餾槽內進行分離之處理，用以可於該分餾槽之頂端獲取牛樟芝三萜類含量y(triterpenoids)與多醣體含量y(polysaccharides)，該分餾槽底端獲取牛樟芝三萜類含量x(triterpenoids)與多醣體含量x(polysaccharides)。該分餾槽係內徑36mm、高度1000mm的不鏽鋼槽體，其內充填有不鏽鋼單體片。
接著，在溫度40℃或60℃下，將超臨界流體與萃取出牛樟芝之三萜類化合物與多醣體等機能成分，持續地依序輸送經過連接之三個分離槽，分別以3000、2000、1000psi之壓力逐步降壓，亦即，第一分離槽係3000psi之壓力，第二分離槽係2000psi之壓力，而最後之第三分離槽係1000psi之壓力，可於該分餾槽底部得到殘餘物，即牛樟芝萃取液中之 三萜類與多醣體等機能成分，三個分離槽分別得到區分物1(F1)，區分物2(F2)和區分物3(F3)。三個分離槽皆係內徑36mm、高度500mm的不鏽鋼槽體。
以下，茲利用不同之操作條件(改變壓力與溫度)實施前揭方法，係取牛樟芝萃取液(Feed)、分餾槽頂部得到之萃取物(Extract)、分餾槽底部得到之殘餘物(Raffinate)，三個分離槽分別得到之區分物1(F1)，區分物2(F2)和區分物3(F3)，分析定量以下性質：(1)牛樟芝總三萜類含量、(2)牛樟芝總多醣體含量、(3)牛樟芝中三萜類化合物成分與含量。
總三萜類含量之測量，以熊果酸當為標準品，於波長548nm吸光度換算標準品含量，定量單位以mg/ml表示。總多醣體含量之測量，以苯酚硫酸法測定試劑，於波長490nm吸光度換算葡萄糖之含量，定量單位以mg/ml表示。三萜類化合物之個別成分與含量之測量，以C18管柱之HPLC定量分析，單位以mg/ml表示。實驗結果分為二部分：(1)牛樟芝中的機能成分最適分離與純化條件，(2)總三萜類含量、總多醣體含量與三萜類之個別化合物成分的分離與純化量產製程，數據分析如圖一至圖六所示。
首先，將牛樟芝萃取液分離後，收集該分餾槽頂部與底部之樣品，分析二者含量並計算出牛樟芝三萜類之分離效率(Ktriterpenoids)、牛樟芝多醣體之分離效率 (Kpolysaccharides)與二者含量之選擇性值(selectivity)。定義如下：Ktriterpenoids=分餾槽頂部牛樟芝三萜類含量(V*y(triterpenoids))÷分餾槽底部牛樟芝三萜類含量(L*x(triterpenoids))。
Kpolysaccharides=分餾槽頂部牛樟芝多醣體含量(V*y(polysaccharides))÷分餾槽底部牛樟芝多醣體含量(L*x(polysaccharides))。
選擇性值定義：=Ktriterpenoids÷Kpolysaccharides。
當Kpolysaccharides=1時，表示該分餾槽頂部之牛樟芝多醣體含量等於分餾槽底部牛樟芝多醣體含量。當Ktriterpenoids=1時，表示該分餾槽頂部之牛樟芝三萜類含量等於分餾槽底部牛樟芝三萜類含量。因此，Ktriterpenoids>>1時，表示牛樟芝三萜類含量容易被分離於分餾槽之頂部；Kpolysaccharides<<1時，表示牛樟芝多醣體含量容易被分離於該分餾槽底部。操作壓力與溫度會改變牛樟芝中之三萜類化合物與多醣體成分之分離效率。
分離後之數值結果顯示：如圖一所示，溫度於40℃範圍下，壓力越高時(即壓力達4000psi時)，牛樟芝總三萜類成分之分離效率(Ktriterpenoids)達50左右。以最適溫度40℃分析不同壓力範圍下(2000-4000psi)之牛樟芝三萜類 每個成分之分離效率，圖二顯示牛樟芝三萜類成分於壓力4000psi時，如zhankuic acid A與dehydrosulphurenic acid之分離效率達150以上，antcin C與dehydroeburicoic acid之分離效率達30以上，而antcin K與zhankuic acid A之分離效率至少達10以上。如圖三所示，溫度於60℃範圍下，壓力越高時(即壓力達4000psi時)，牛樟芝總多醣體成分之分離效率(Kpolysaccharides)達3.6；相對地，溫度於40℃與壓力4000psi時，牛樟芝總多醣體成分之分離效率只有0.23。因此，由圖一與圖三可知，採用溫度40℃與壓力4000psi時，最適於將牛樟芝三萜類成分分離於分餾槽之頂部，而，牛樟芝多醣體成分則容易被分離於該分餾槽底部。
如圖四所示，當溫度於40℃範圍下與壓力達4000psi時，牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分之選擇性值達220，顯示於此操作條件下，最適於將牛樟芝中之三萜類化合物與多醣體成分純化區分於三個分離槽中(F1、F2、F3)。舉例而言，選擇溫度40℃與壓力4000psi之操作條件下，將牛樟芝中之三萜類化合物，分離於分餾槽之頂端，再利用降壓(即降低壓力至3000、2000、1000psi於F1、F2、F3)，可以選擇性地分離、區分與純化牛樟芝中之三萜類化合物與多醣體成分含量與純度。因此，如圖五所示，利用最適合之選擇性值實驗數值，以牛樟芝萃取液(Feed)於溫度40℃與壓力4000psi之操作條件下，分離出分餾槽底部得到殘餘物(R) 與分餾槽頂部得到萃取物(Extract)，再將Extract區分至三個分離槽F1、F2、F3中。如圖五分析R、F1、F2、F3之三萜類化合物與多醣體成分濃度分佈，顯示牛樟芝萃取液中之多醣體成分被分配至分餾槽之底部R；同時，牛樟芝萃取液中之三萜類成分被分配至分離槽F1與F2中，牛樟芝三萜類中之antcin C、dehydrosulphurenic acid與zhankuic acid A成分大部分被區分於分離槽F1中。比較牛樟芝萃取液、第一分離槽-區分物1(F1)與分餾槽之底部R中之牛樟芝三萜類成分，圖六的HPLC圖譜顯示與證明：牛樟芝萃取液中之三萜類化合物可以經過分餾槽分離後，95%以上之三萜類化合物可以分離與純化至第一分離槽-區分物1(F1)中。
由上可知，本發明所提供以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法，其可將牛樟芝萃取液分離出活性成分--三萜類與多醣體，相較於習知萃取與分離牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分之方法，本發明僅藉由控制操作溫度與壓力，即可分離出牛樟芝三萜類與多醣體，且，分離與純化過程中沒有溶劑殘留與毒性等疑慮，以簡明之牛樟芝三萜類與多醣體分離效率及選擇性計算求得，易於操作、量產並可連續式運作，甚具實用價值。

Claims (4)

  1. 一種以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法，主要係在溫度40-60℃與壓力2000-4000Psi之操作條件下，將牛樟芝萃取液與超臨界狀態溶劑通入一分餾槽內進行萃取，牛樟芝萃取液係以1：5-10(W/V)的比例將牛樟芝粉末與乙醇混合離心而成，超臨界流體流速3-9L/hr、牛樟芝萃取液流速1-3L/hr，超臨界狀態溶劑係超臨界二氧化碳/乙醇，用以萃取出牛樟芝之三萜類化合物與多醣體等機能成分，再將萃取出之機能成分與超臨界狀態溶劑，在溫度40℃或60℃與低於前述壓力之操作條件下，持續地通入連接的三個分離槽並依序以壓力3000、2000、1000psi逐步降壓，用以可選擇性分離與純化提升三萜類化合物與多醣體機能成分之含量與純度，而分別於各分離槽中獲得牛樟芝萃取液中之三萜類化合物與多醣體機能成分。
  2. 如申請專利範圍第1項所述以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法，其中，牛樟芝粉末可為牛樟芝之子實體、菌絲體、皿式培養或固態培養之粉末。
  3. 如申請專利範圍第1項所述以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法，其中，在壓力為4000Psi、溫度為40℃之操作條件下，最適於將牛樟芝三萜類成分分離於該分餾槽之頂部，而牛樟芝多醣體成分容易被分離於該分餾槽之底部。
  4. 如申請專利範圍第1項所述以超臨界流體技術分離與純化牛樟芝中機能成分之方法，其中，在溫度為40℃、壓力為 4000psi之操作條件下，牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分之選擇性值達220，最適於將牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分純化區分於三個分離槽中。
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