TWI487531B - 牛樟芝萃取濃縮物及其製造方法 - Google Patents

Description

牛樟芝萃取濃縮物及其製造方法

本發明係關於一種牛樟芝萃取濃縮方法及其萃取濃縮物，特別係關於一種用以提升有效抑制癌細胞活性成分之牛樟芝萃取濃縮方法及其牛樟芝萃取濃縮物。

牛樟芝(Antrodia cinnamomea )係台灣特有真菌，屬真菌分類學中擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)的多年生菌類，僅生長於台灣特有牛樟樹(Cinnamomum kanehirai )的中空芯材內壁，其子實體為一年生至多年生，呈鮮紅色、橘紅色或淡肉桂色，具有樟樹香氣。

牛樟芝是具有廣泛生理活性的藥用真菌，其具有治療癌症、提高免疫力、抗氧化、消炎及抗菌等功能，牛樟芝包含有三萜類化合物(Triterpenoids)、多醣體(Poly-saccharides)及β-葡聚糖(β-glucan)等，其中，該三萜類化合物為牛樟芝所含有用以抑制癌細胞之主要活性成分，然而，由於牛樟芝中的三萜類化合物含量極低，粗略估計三萜類化合物僅佔牛樟芝子實體中重量百分比不到3%，因此，萃取或分離該牛樟芝中的三萜類化合物並不容易，欲獲取牛樟芝三萜類成分時，僅能將牛樟芝子實體磨粉打錠服用，以直接攝取牛樟芝子實體所含有三萜類化合物，避免三萜類化合物因萃取或分離的操作步驟而流失。

請參照中華民國公告第I352612號「分段式樟芝萃取方法」專利案，如第1圖所示，係提供一種提高牛樟芝萃取物中的特定生理活性成分含量之樟芝萃取方法，係包含：一有機萃取步驟S91，係將樟芝乾燥顆粒浸泡於酒精溶液中，並得到有機萃取溶液及一經有機萃取後之樟芝萃餘物，及一水溶性萃取步驟S92，係將該樟芝萃餘物浸泡於酸性水溶液中，而得到一水溶性萃取溶液，分別將該有機萃取溶液及該水溶性萃取溶液冷凍乾燥後，獲得一有機萃取物及水溶性萃取物，其係包含有較高含量之多醣體或β-葡聚糖。然而，該專利案所揭示之樟芝萃取方法，係提高該兩種萃取物中多醣體或β-葡聚糖含量，該專利案仍無法用以分離其他如三萜類化合物之特定生理活性成分，以提供特定生理活性成分之攝取。

由上述可知，因牛樟芝所含生理活性成分種類繁多且各成分之含量低，故不易以習知萃取方法獲得其特定生理活性成分，亦無法對習知萃取方法所獲得之萃取物加以分離或純化。此外，習用萃取方法或上述專利案所揭示之萃取方法皆係對牛樟芝進行批次式萃取，其所獲得萃取物中的特定生理活性成分含量有限，因此無法應用於工業化連續式量產之作業程序，使得萃取牛樟芝製程成本高，且萃取或分離之效率不佳。

據此，有必要提供一種改良的牛樟芝萃取濃縮方法，係能夠依照使用者需求來提供特定生理活性成份。

本發明之主要目的係提供一種牛樟芝萃取濃縮方法，其係能夠將牛樟芝萃取液中之特定生理活性成分進行分離及濃縮者。

本發明之次一目的係提供一種牛樟芝萃取濃縮方法，其係能夠以連續式進料方式，將牛樟芝萃取液中的特定生理活性成分進行濃縮者。

本發明之又一目的係提供一種牛樟芝萃取濃縮物，其.係包含有效抑制癌細胞之生理活性成分。

為達到前述發明目的，本發明之牛樟芝萃取濃縮方法，係包含：一萃取步驟，將一牛樟芝樣品置於一萃取溶劑中共同形成一牛樟芝萃取液，使牛樟芝中抑制癌細胞之活性成分溶於該牛樟芝萃取液中；及一濃縮步驟，以一模擬移動床，將該牛樟芝萃取液中與碳18固體吸附劑的亨利常數為2.8以上之組份分離並濃縮。

本發明之牛樟芝萃取濃縮方法中，該亨利常數為2.8以上之組份，包含具有抑制癌細胞特性之活性成分。

本發明之牛樟芝萃取濃縮方法中，該濃縮步驟後，得到一牛樟芝萃取濃縮液，該亨利常數為2.8以上之組份較佳係佔該牛樟芝萃取濃縮液之重量百分比50%以上。

本發明之牛樟芝萃取濃縮方法中，該碳18固體吸附劑較佳係SUPELCO Ascentis^TM C18管柱。

本發明之牛樟芝萃取濃縮方法中，該移動相較佳係含0.05%醋酸之去離子水與甲醇所組成之水溶液。

本發明之牛樟芝萃取濃縮方法中，該牛樟芝樣品較佳係牛樟芝之子實體或菌絲體。

本發明之牛樟芝萃取濃縮方法中，該牛樟芝樣品較佳係小於5毫米見方之顆粒。

一種牛樟芝萃取濃縮物，係以如上所述之方法獲得，其係包含與碳18固體吸附劑的亨利常數為2.8以上之組份。

本發明之牛樟芝萃取濃縮物中，該亨利常數2.8以上之組份係包含抑制癌細胞特性之活性成分。

本發明之牛樟芝萃取濃縮物中，該癌細胞為肺癌細胞或肝癌細胞。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之牛樟芝萃取濃縮方法，係能夠萃取及濃縮牛樟芝中不同生理活性成分，獲得至少一牛樟芝萃取濃縮物，該牛樟芝萃取濃縮物中包含有效抑制癌細胞的活性成分。舉例而言，該牛樟芝萃取濃縮物可以係含有亨利常數為2.8以上之組份A，其係具有抑制癌細胞之活性成分。

本發明所指「牛樟芝」係不限定野生採集或人工培育方式獲得之子實體或菌絲體，其中，人工培育方式可以選擇將牛樟芝菌絲體以固態醱酵或液態醱酵方式培養，以獲得菌絲體。

本發明所指「萃取」，係將牛樟芝子實體或菌絲體、中的活性成分溶於一萃取溶劑之程序。

本發明所指「濃縮」，係將含有牛樟芝活性成分之萃取液，經由一模擬移動床(Simulated Moving Bed，簡稱SMB)，並根據該牛樟芝活性成分之極性特性(亨利常數H)，將該牛樟芝之活性成分分離並濃縮之程序，例如分離牛樟芝中具有抑制癌細胞特性之活性成分。

本發明所指「組份」，係指以特定固定相及移動相之層析管柱或模擬移動床，將牛樟芝萃取物中不同極性特性之成分進行層析，該極性特性係以亨利常數作為判斷依據，根據不同滯留時間的層析區段所得到的一群特定極性之成分，統稱為一組份。

請參照第2圖所示，本發明牛樟芝萃取濃縮方法，係包含一萃取步驟S1及一濃縮步驟S2。

本發明之萃取步驟S1 ，係將一牛樟芝樣品置於一萃取溶劑中共同形成一牛樟芝萃取液，使該牛樟芝中抑制癌細胞之活性成分溶於該牛樟芝萃取液中。該牛樟芝可以選擇為子實體或菌絲體，較佳係將牛樟芝之子實體或菌絲體乾燥至含水量低於10%以下，更佳係將該牛樟芝子實體或菌絲體破碎成較小顆粒，例如小於5毫米見方之顆粒，以增進該萃取步驟S1之萃取效率；本實施例之牛樟芝係由喬本生醫股份有限公司所提供之牛樟芝子實體。

該萃取步驟S1之萃取溶劑，係根據所欲萃取成分之極性特性來選擇，該萃取溶劑可以為水、有機溶劑或超臨界流體，其中該有機溶劑及超臨界流體係有利於萃取極性特性較低之活性成分，水則係有利於萃取極性特性較高之活性成分；本實施例係選擇親有機性(或低極性)之超臨界流體，特別係指超臨界態二氧化碳流體做為該萃取溶劑。

舉例而言，本發明該萃取步驟S1之第一實施例係選擇超臨界流體萃取法，提供一如第3圖所示之超臨界二氧化碳萃取裝置(超臨界二氧化碳萃取設備，NATEX)，其包括二氧化碳儲槽1及一輔溶劑儲槽2，分別與一萃取槽3連通，以一背壓閥4調節該萃取槽3之內部壓力，另以數個溫度調節器5調控該超臨界二氧化碳萃取裝置之內部溫度，使通入該萃取槽3之二氧化碳能夠在達到臨界壓力及臨界溫度時轉變為超臨界流體以進行萃取，該萃取槽3與一氣液分離槽6連通，以供減壓時回復成氣態的二氧化碳流入，並且回收至該二氧化碳儲槽1，其中，該超臨界二氧化碳萃取裝置中設有數個液泵7及數個閥門8，以調控該二氧化碳或輔溶劑於該超臨界二氧化碳萃取裝置之流動，該二氧化碳儲槽1及該氣液分離槽6之間較佳係包含一吸附管柱9，以去除該二氧化碳氣體內之雜質。更詳言之，該二氧化碳氣體以大於臨界壓力72巴(Bar)，及大於臨界溫度31.1℃以上之條件，即可形成超臨界二氧化碳流體，較佳係壓力為300~400 bar，溫度為32~50℃之條件下所形成之超臨界二氧化碳流體進行萃取；該超臨界流體萃取法亦可混合一輔溶劑，幫助改變該超臨界流體之物化特性，增進該萃取效率。

更詳言之，本發明該萃取步驟S1之第一實施例係取105公克之牛樟芝子實體，破碎成顆粒大小約為5毫米見方之顆粒，置於該萃取槽3中，設定該萃取槽3之內部壓力為350 bar，內部溫度為50℃，該輔溶劑係95%乙醇，並以每分鐘3毫升之速率進料，自該輔溶劑進料之時起算第30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330及360分鐘，分別收取各該時點之牛樟芝萃取液(依序為第A1至A12組)，由於該牛樟芝萃取液呈膏狀，其中仍包含有95%乙醇，本實施例係另以溫度設定為30~35℃烘箱將該膏狀牛樟芝萃取液中的乙醇去除，以便進行後續之濃縮步驟S2。

藉由超臨界二氧化碳流體萃取，不僅能夠簡化有機溶劑萃取法的溶劑成本及操作步驟，以超臨界二氧化碳流體完成萃取後，以減壓方式就能夠將牛樟芝萃取液中的活性成分與萃取溶劑完全分離而不會殘留萃取溶劑，故可減低後續濃縮處理的成本；此外，當二氧化碳形成超臨界流體型態，係具親有機性(或低極性)，故對於萃取低極性成分而言，具有較佳萃取效率。

將本發明該萃取步驟S1之第一實施例於不同萃取時間所獲得之牛樟芝萃取液乾燥後，獲得一牛樟芝萃取物秤重，以計算其牛樟芝萃取物之產率。請參照第4圖所示，係本發明該萃取步驟S1之第一實施例的牛樟芝萃取物產率折線圖，隨著萃取時間的增加，該牛樟芝萃取物之產率亦隨之增加，待萃取至第210分鐘時，其萃取物之產率達到28%並趨於穩定。

請參照第5圖所示，係本發明該萃取步驟S1之第一實施例於不同萃取時間(0~360分鐘，分別為第A1至A12組)所獲得之牛樟芝萃取物，分別以一HPLC層析管柱(SUPELCO Ascentis^TM C18管柱，其內徑4.6 mm，長度為15 cm)結合一分光光度計(L-2455 Diode Array Detector)，偵測該牛樟芝萃取物經層析後於波長240~260 nm之吸光強度，並以該吸光強度所繪製之折線圖，對特定滯留時間內的面積積分，以推估該牛樟芝萃取物中亨利常數為2.8以上之組份A百分率，其中，該組份A係屬於滯留時間超過8分鐘者，其包含有抑制癌細胞之活性成分。

請參照第6圖所示，係分析第A1至A12組所獲得之萃取物中，其所佔亨利常數為2.8以上之組份A百分率，在萃取時間為0~120分鐘時，可以獲得較多含量的組份A，且該組份A係佔該牛樟芝萃取物重量百分比40%以上。

另，本發明該萃取步驟S1之第二實施例係選擇以乙醇進行萃取，取乾燥的牛樟芝子實體破碎至2毫米見方左右，取0.2公克之破碎子實體置於10毫升乙醇中，於溫度40℃下進行超音波震盪90分鐘後，將牛樟芝萃餘物以抽氣過濾方式去除，獲得該牛樟芝萃取液，再將該牛樟芝萃取液進行真空乾燥，獲得該牛樟芝萃取物，並以該牛樟芝萃取物進行後續之濃縮步驟S2。

分別將該萃取步驟S1之第一實施例(萃取時間為90分鐘者)及第二實施例所獲得之牛樟芝萃取物以甲醇溶解後，以HPLC分析一HPLC層析管柱(SUPELCO Ascentis^TM C18管柱，其內徑4.6 mm，長度為15 cm)結合一分光光度計(L-2455 Diode Array Detector)，偵測該牛樟芝萃取物經HPLC層析後於波長240~260 nm之吸光強度，並與本發明該萃取步驟S1之第一實施例之牛樟芝萃取物比較其圖譜。

請參照第7圖，第B1組為乙醇萃取之牛樟芝萃取物HPLC層析圖譜，而第B2組為超臨界二氧化碳流體萃取之牛樟芝萃取物HPLC層析圖，由此可知，以乙醇輔以超音波震盪萃取而得之牛樟芝萃取物，或以超臨界二氧化碳流體萃取之牛樟芝萃取物之組成大致相同，部分組份之萃取量略有不同，特別係指以超臨界二氧化碳流體所獲得低極性物質(滯留時間大於8分鐘以上者)之含量較高。

本發明之萃取步驟S1不限於以有機溶劑或超臨界流體萃取該牛樟芝的生理活性成分，而較佳係選擇以超臨界二氧化碳流體萃取亨利常數為2.8以上之組份，係能夠達到提高該活性成分萃取量之功效，又避免在完成萃取後不會有溶劑殘留的問題。

本發明之濃缩步驟S2 ，以一模擬移動床將該牛樟芝萃取液中與碳18固體吸附劑的亨利常數為2.8以上之組份A分離並濃縮。更詳言之，該亨利常數為2.8以上之組份A係具有低極性特性之成分，相對而言，該牛樟芝萃取物中另包含亨利常數為2.8以下之組份B，其係具有高極性特性之成分。本發明之濃縮步驟S2係不限於由水、有機溶劑或超臨界流體萃取所獲得之牛樟芝萃取液，並能夠依照所欲萃取組份之不同極性從該牛樟芝萃取液中分離並濃縮之，特別係藉由一模擬移動床進行分離及濃縮，達到節省習知用以分離牛樟芝活性成分之方法的成本，更能夠以工業化量產的連續式操作方法，達到更高的分離效率。

本發明該濃縮步驟S2之較佳實施例，係提供如第8圖所示之模擬移動床作為一種連續進料式的純化平台，對該牛樟芝萃取液中不同亨利常數之成份進行群組分離；本實施例較佳係將該萃取步驟S1之牛樟芝萃取液先進行乾燥，獲得一牛樟芝萃取物後，再以適當之移動相溶液將該牛樟芝萃取物溶解，以進行該濃縮步驟S2。

本實施例模擬移動床之固定相(Stationary phase，簡稱SP)係選擇為與低極性物質具有吸附性之碳18管柱，本實施例之移動相(Mobile phase，簡稱MP)係用以溶解該牛樟芝萃取物，本實施例之移動相選擇為水及甲醇之混合液，該水含有0.05%之醋酸，以該移動相溶解該牛樟芝萃取物，該水及甲醇之重量比例較佳為20：80至40：60，該水及甲醇更佳之重量比例為22：78，使該移動相之選擇因子(Selective factor)為大於1.3，能夠更有效地分離出不同極性特性的組份A及組份B。

本實施例之模擬移動床較佳係包含至少三分離區域，其依序為α、β及γ區域，其中該α區域之後端設有一第一出料口O_α (稱作Extract outlet)，該γ區域之後端設有一第二出料口O_γ (稱作Raffinate outlet)，該進料口I(稱作Feed inlet)則設於該β及γ區域之間。

該三分離區域α、β及γ係分別由二管柱c組成，該三分離區域之管柱c相互連通，該管柱c內係填充該固定相，特別係該固定相的顆粒間具有孔隙供該移動相通過，並使該移動相朝同一方向依序流經該α、β及γ區域之管柱c內，該固定相則係以一進料口切換裝置於一進料口切換時間T_sw 後改變該進料口I於該三分離區域之相對位置，使 該固定相相對該移動相朝另一方向模擬移動。

根據模擬移動床之三角理論，所欲分離組份包括：該亨利常數為2.8以上之組份A及該亨利常數為2.8以下之組份B，各三分離區域α、β及γ中，該組份A之淨質量通量F_A 及該組份B之淨質量通量F_B 符合第1表之條件，使該組份A往該區域α移動，該組份B往該區域γ移動，且各該三分離區域α、β及γ之流速比值n(各分離區域α、β及γ之流速比值分別為n_α 、n_β 及n_γ )係與所欲分離組份之極性(即組份A之亨利常數為H_A ，組份B之亨利常數為H_B )相關，各流速比值n_α 、n_β 及n_γ 應符合如第1表及第9圖中斜線區域之條件，其中，各組份之亨利常數H係根據公式I計算而得，T0為不被固定相吸附之物質流經管柱之滯留時間(T0=1.71)，Tr為欲分離組份之滯留時間，ε為本實施例所使用管柱之孔隙度(0.412)。

本發明濃縮步驟S2之較佳實施例中，係取本發明萃取步驟S1之第一實施例萃取時間為90分鐘所獲得之牛樟 芝萃取物進行分離及濃縮，故本發明之牛樟萃取物之萃取步驟S1之操作不再贅述。

本實施例濃縮步驟S2之固定相係選擇為碳18固體吸附劑，該碳18固體吸附劑係以矽膠(silica gel)為主碳鏈，該主碳鏈上可以與不同官能基鍵結，該官能基可以係由十八烷基(Octadecyl)等所組成之群組；本實施例之碳18固體吸附劑係選擇為SUPELCO Ascentis^TM C18管柱(管柱內徑4.6mm，長度為15cm，其官能基為十八烷基矽烷(octadecylsilane)，移動相係由含0.05%醋酸之去離子水與甲醇所組成之水溶液，移動相流速為每分鐘1毫升。本實施例之模擬移動床係由一液泵(HITACHI L-2130)進行加壓，使移動相於各區域之管柱內朝向同一方向流動，設定本實施例SMB之進料口切換時間T_sw ，以模擬該固定相朝向與該移動相流向相反之條件，並以第2表所示之條件分離該牛樟芝萃取物，並於該第一出料口O_α 獲得該亨利常數為2.8以上之組份A，該第二出料口O_γ 獲得該亨利常數為2.8以下之組份B。

本實施例將SFE萃取牛樟芝子實體90分鐘所得之牛樟芝萃取物，以第B1組之條件連續式的進料至少1500分鐘以上，分離並濃縮該牛樟芝萃取物中的組份A或組份B，並將該第一出料口O_α 及第二出料口O_γ 所獲得之濃縮物進行HPLC層析。

請參照第10圖所示，係分別對第B1組之第一出料口O_α 及第二出料口O_γ 濃縮物進行HPLC分析之層析圖，X軸為滯留時間(min)，Y軸為吸光強度(AU)，其中，該第一出料口O_α 之濃縮物主要係滯留時間為8分鐘以上者，屬於亨利常數為2.8以上之組份A，其包含有抑制癌細胞之活性成分，該第二出料口O_γ 之濃縮物主要係滯留時間小於8分鐘者，為亨利常數為2.8以下之組份B，由第10圖之積分面積計算，該第一出料口O_α 之濃縮物中係至少含有重量百分比為80%以上之組份A。

本實施例以第B1組之條件連續式進料0~8000分鐘，收集並分析第500、1800及3000分鐘之濃縮物中各組份之所佔重量百分比，請參照第11圖所示，係該第一出料口Oα之濃縮物中各組份之所佔重量百分率分析圖，該組份A中，至少重量百分比70%以上為三萜類化合物(滯留時間為7~12min者)，其餘部份係其他未知結構的低極性物質(滯留時間為12min以上者)，而關於組份B如多醣體或β-葡聚糖成份(滯留時間為6min以下者)則幾乎不存在；請參照第12圖所示，係同樣條件下於第二出料口O_γ 之濃 縮物，其中該組份B佔該濃縮物重量百分比至少80%以上，其餘三萜類化合物及低極性物質則佔不到20%。

請參照第13圖所示，係分別對第B2組之第一出料口O_α 及第二出料口O_γ 濃縮物進行HPLC分析之層析圖，X軸為滯留時間(min)，Y軸為吸光強度(AU)，以積分面積計算，該第一出料口O_α 之濃縮物中含有至少重量百分比為74%以上之組份A，表示本實施例SMB之條件設計亦能夠達到很好的分離濃縮效果。

本實施例再以第B2組之條件連續式進料0~8000分鐘，收集並分析第500、1800及3000分鐘之濃縮物中各組份之所佔重量百分比，請參照第14圖所示，該第一出料口Oα之濃縮物中，至少重量百分比60%以上為三萜類化合物(滯留時間為7~12min者)，其餘部份係其他未知結構的低極性物質(滯留時間為12min以上者)，而關於組份B如多醣體或β-葡聚糖(滯留時間為6min以下者)則幾乎不存在；請參照第15圖所示，係同樣條件下於第二出料口O_γ 之濃縮物，其該組份B佔該濃縮物重量百分比幾乎為100%，三萜類化合物及低極性物質則幾乎不存在。

此外，以該第B1及B2組之條件連續式進料長達8000分鐘時，該第一出料口O_α 之濃縮物中不會含有該組份B，而污染該第一出料口O_α 濃縮物的情況發生，表示本發明之濃縮步驟S2亦可以進行長時間操作，並且維持其分離及濃縮的穩定性。

由本發明較佳實施例可知，本發明之濃縮步驟S2確實能夠有效分離不同極性特性之組份A及組份B，其中， 該組份A係由第一出料口分離而得，該組份B係由第二出料口分離而得；且以工業操作系統下連續式進料方式0~8000分鐘，係能夠提高該牛樟芝萃取濃縮物中所含組份A之產量，並且長時間操作下亦不會有汙染的情況發生，係能夠以工業量產方式獲得較高純度的組份A。

為證實本發明牛樟芝萃取濃縮方法確實能有效分離出亨利常數為2.8以上之組份A，且該組份A確實包含有有效抑制癌細胞之活性成分，以下係本發明牛樟芝萃取濃縮方法所獲得牛樟芝萃取濃縮物進行癌細胞之存活率試驗。

本實施例係以二氧化碳超臨界流體萃取90分鐘，並以如第B1組之模擬移動床參數條件進行分離及濃縮，所獲得之第一出料口O_α 濃縮物，分別施用於不同癌細胞，再以MTT細胞活性染色法(MTT assay)測量各癌細胞之存活率。

更詳言之，MTT細胞活性染色法係利用活細胞粒線體中所含有之琥珀酸去氫酶(Dehydrogenase)可代謝溶於細胞培養液中的黃色MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)化合物，將MTT化合物中的tetrazolium轉為一藍色產物formazan，該formazan會堆積在細胞中，另以DMSO將formazan溶解，測量於波長570nm處之吸光值，代表各組細胞之存活率，當活細胞數越多，則570nm之吸光值越高。

本實施例係選用人類肺纖維正常細胞株MRC-5、肺癌細胞株A549及肝癌細胞株HepG2等細胞株測試該牛樟芝 萃取濃縮物(包括經SFE獲得之牛樟芝萃取物、經SFE及SMB獲得第一出料口O_α 及第二出料口O_γ 之牛樟芝萃取濃縮物)之抑制細胞增生效果，各該細胞株係購自台灣新竹食品工業科學研究所，各編號依序為BCRC 60023、BCRC 60074及BCRC 60025。本實施例將該等細胞株培養於一適當培養基中進行繼代培養，待該等細胞數量增殖至培養容器之7~8分滿，取一緩衝液，將增殖培養之細胞由該培養容器之器壁沖刷至該緩衝液中，以方便進行該細胞株之細胞計數，以及後續細胞存活率之分析。

更詳言之，本實施例係選擇但不限定將該等細胞株於含有10%非活化之胎牛血清(Fetal bovine serum，簡稱FBS，10437,Gibco,Grand Island,NY,USA)之DMEM培養基(Dulcbecco’s modified Eagle medium,12800-017,Gibco,Grand Island,NY,USA)中增殖培養，其培養條件為含有5%二氧化碳之空氣、溫度為37℃，待該等細胞長至培養容器之七或八成滿，以一商用EDTA緩衝液(Ethylene diamine tetra-acetic acid；MERCK)重複沖洗該培養容器，以便將貼壁生長的細胞沖刷至該EDTA緩衝液，並進行細胞計數；本實施例含有10%FBS之DMEM培養基配方如第3表所示。

本實施例取三種不同共培養物：(1)經SFE獲得之牛樟芝萃取物、(2)經SFE及SMB獲得第一出料口O_α 之牛樟芝萃取濃縮物，及(3)經SFE及SMB獲得第二出料口O_γ 之牛樟芝萃取濃縮物，各三細胞株準備10組5×10³ cell/ml之三細胞株於96孔培養盤中培養24小時後，分別添加不同濃度(0、1、1.5、2、2.5、3、5、7、10及100μg/ml)之共培養物72小時，以MTT細胞活性染色法測量各組細胞株之細胞存活率，其中，以未添加任何共培養物之細胞株組別所測得之吸光值作為基準(即該組細胞株細胞存活率設為100%)，與其他添加不同濃度共培養物之組別相較，計算各組不同濃度共培養物之細胞存活率，並且換算該三種共培養物對於該三細胞株之半抑制濃度(IC₅₀ ，單位：μg/ml)。

請參照第4表所示，該三種共培養物無論係與肺癌細胞、肝癌細胞或肺纖維正常細胞共培養，以(2)經SFE及SMB獲得第一出料口O_α 之牛樟芝萃取濃縮物共培養，其半抑制濃度皆小於(3)經SFE及SMB獲得第二出料口O_γ 之牛樟芝萃取濃縮物及(1)經SFE獲得之牛樟芝萃取物之半抑制濃度。

由本實施例可證實，牛樟芝子實體經SFE及SMB萃取濃縮後，於第一出料口O_α 所獲得之牛樟芝萃取濃縮物，確實能夠有效提高抑制癌細胞之功效，特別係能夠抑制肺癌細胞或肝癌細胞。

綜上所述，本發明牛樟芝萃取濃縮方法，係藉由該萃取步驟S1將該牛樟芝子實體或菌絲體中所含之生理活性成分，萃取至牛樟芝萃取液中，並將該牛樟芝萃取液以該 濃縮步驟S2將牛樟芝萃取液中不同極性特性之生理活性成分進行分離及濃縮，特別係亨利常數為2.8以上之組份A係具有抑制癌細胞之效果，藉由本發明之牛樟芝萃取濃縮方法，不僅能夠將特定生理活性之成份分離及濃縮，並可以符合工業化量產方式產製各該組份之濃縮物，不僅能夠達到改善習用批次式萃取方法所不能達到的量產化功效，又能達到降低用以濃縮牛樟芝所含不同生理活性成分所需成本之功效。

據此，本發明之牛樟芝萃取濃縮方法，係能夠藉由該萃取及濃縮步驟，將牛樟芝萃取液中之特定生理活性成分分離，係能夠達到有效分離不同生理活性之功效。

本發明之牛樟芝萃取濃縮方法，其係能夠藉由模擬移動床以連續式進料方式，自牛樟芝萃取液中獲得較高含量的生理活性成分，以達到工業化量產之功效。

本發明之牛樟芝萃取濃縮物，係包含有效抑制癌細胞之生理活性成分，其含量能夠達到50%以上，係具有提高抑制癌細胞存活率之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

[本發明]

S1‧‧‧萃取步驟

S2‧‧‧濃縮步驟

1‧‧‧二氧化碳儲槽

2‧‧‧輔溶劑儲槽

3‧‧‧萃取槽

4‧‧‧背壓閥

5‧‧‧溫度調節器

6‧‧‧氣液分離槽

7‧‧‧液泵

8‧‧‧閥門

9‧‧‧吸附管柱

α‧‧‧α區域

β‧‧‧β區域

γ‧‧‧γ區域

c‧‧‧管柱

O_α ‧‧‧第一出料口

I‧‧‧進料口

O_γ ‧‧‧第二出料口

[習用]

S91‧‧‧有機萃取步驟

S92‧‧‧水溶性萃取步驟

第1圖：習用牛樟芝萃取方法之步驟方塊圖。

第2圖：本發明牛樟芝萃取濃縮方法之步驟方塊圖(一)。

第3圖：本實施例超臨界二氧化碳萃取裝置示意圖。

第4圖：本實施例第A1-1至A1-12組之牛樟芝萃取物產率折線圖。

第5圖：本實施例第A1-1至A1-12組之HPLC層析圖。

第6圖：本實施例第A1-1至A1-12組中亨利常數為2.8以上之組份A百分率。

第7圖：本實施例第B1及B2組之HPLC層析圖。

第8圖：本實施例三區域模擬移動床之管柱配置示意圖。

第9圖：三角理論之純化條件示意圖。

第10圖：本實施例第B1組之第一出料口O_α 及第二出料口O_γ 濃縮物HPLC層析圖。

第11圖：本實施例第B1組之第一出料口O_α 濃縮物之各成分所佔重量百分比之XY散佈圖。

第12圖：本實施例第B1組之第二出料口O_γ 濃縮物之各成分所佔重量百分比之XY散佈圖。

第13圖：本實施例第B2組之第一出料口O_α 及第二出料口O_γ 濃縮物HPLC層析圖。

第14圖：本實施例第B2組之第一出料口O_α 濃縮物之各成分所佔重量百分比之XY散佈圖。

第15圖：本實施例第B2組之第二出料口O_γ 濃縮物之各成分所佔重量百分比之XY散佈圖。

S1．．．萃取步驟

S2．．．濃縮步驟

Claims (11)

1. 一種牛樟芝萃取濃縮方法，係包含：一萃取步驟，將一牛樟芝樣品置於一萃取溶劑中共同形成一牛樟芝萃取液，使牛樟芝三萜類化合物溶於該牛樟芝萃取液中；及一濃縮步驟，以一模擬移動床，將該牛樟芝萃取液中與碳18固體吸附劑的亨利常數為2.8以上之組份連續性分離並濃縮，以獲得牛樟芝包含三萜類化合物之組份。
2. 如申請專利範圍第1項所述之牛樟芝萃取濃縮方法，其中該亨利常數為2.8以上之組份，包含具有抑制癌細胞特性之活性成分。
3. 如申請專利範圍第1項所述之牛樟芝萃取濃縮方法，其中該碳18固體吸附劑係SUPELCO Ascentis^TM C18管柱。
4. 如申請專利範圍第1項所述之牛樟芝萃取濃縮方法，其中，該模擬移動床之移動相為含0.05%醋酸之去離子水與甲醇所組成之水溶液。
5. 如申請專利範圍第4項所述之牛樟芝萃取濃縮方法，其中，該含0.05%醋酸之去離子水及甲醇之重量比例為20：80至40：60。
6. 如申請專利範圍第1項所述之牛樟芝萃取濃縮方法，其中該牛樟芝樣品係牛樟芝之子實體或菌絲體。
7. 如申請專利範圍第1項所述之牛樟芝萃取濃縮方法，其中該牛樟芝樣品係小於5毫米見方之顆粒。
8. 如申請專利範圍第1至7項任何一項所述之牛樟芝萃取濃縮方法，其中，該萃取溶劑係為乙醇或超臨界態二氧化碳流體。
9. 一種牛樟芝萃取濃縮物，係以如申請專利範圍第1至8項任何一項所述之方法獲得，其係包含與碳18固體吸附劑的亨利常數為2.8以上之組份。
10. 一種如申請專利範圍第9項所述之牛樟芝萃取濃縮物之用途，其係用以製備抑制癌細胞特性之藥物。
11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該癌細胞為肺癌細胞或肝癌細胞。