TWI623749B - 一種樟芝萃取物製備及分析方法 - Google Patents

一種樟芝萃取物製備及分析方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI623749B
TWI623749B TW104113995A TW104113995A TWI623749B TW I623749 B TWI623749 B TW I623749B TW 104113995 A TW104113995 A TW 104113995A TW 104113995 A TW104113995 A TW 104113995A TW I623749 B TWI623749 B TW I623749B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
value
antrodia camphorata
extraction
parameter
total
Prior art date
Application number
TW104113995A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201638584A (zh
Inventor
吳永昌
呂美津
吳東穎
杜英齊
Original Assignee
吳永昌
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 吳永昌 filed Critical 吳永昌
Priority to TW104113995A priority Critical patent/TWI623749B/zh
Priority to JP2016090880A priority patent/JP6325018B2/ja
Priority to CN201610278762.7A priority patent/CN106093260B/zh
Priority to US15/141,916 priority patent/US20160318972A1/en
Publication of TW201638584A publication Critical patent/TW201638584A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI623749B publication Critical patent/TWI623749B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
    • C07J9/005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane containing a carboxylic function directly attached or attached by a chain containing only carbon atoms to the cyclopenta[a]hydrophenanthrene skeleton
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B01D11/0207—Control systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Automation & Control Theory (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本發明係提供一種樟芝萃取物最佳化的製備及分析方法。藉由數學及統計學的實驗設計，分析影響該萃取物的萃取率重要參數，並搭配核磁共振圖譜定量法及高效液相層析串聯質譜法，以量化及鑑定樟芝萃取物及其特定三萜類化合物。藉由前述技術，可以分析/檢測/量化藥品、保健食品或其他商品中是否含有麥角甾烷及/或羊毛甾烷三萜類化合物及其總含量及各別含量。

Description

一種樟芝萃取物製備及分析方法
本案關於一種樟芝萃取物製備及分析方法，尤其，本案關於一種樟芝萃取物製備及分析的最佳化，以及該樟芝萃取物中麥角甾烷三萜類化合物及/或羊毛甾烷三萜類化合物的準確量化之分析方法。
樟芝(Antrodia cinnamomea)又稱樟菇、牛樟菇、牛樟芝等，為台灣特有的真菌菌種，生長於海拔400至2000公尺特有的牛樟樹(Cinnamomum kanehirai)樹幹腐朽的心材內壁，或枯死倒伏的牛樟木材陰暗潮濕的表面。因此，要尋找到野生的樟芝子實體或確認此多孔菌目(Aphyllophorales)真菌菌株的外觀並不容易，也由於其生物活性成分具潛在的醫藥價值，因此樟芝的價格居高不下。
由於樟芝子實體不易被發現及以人工方式培養，目前市面上多為樟芝菌絲體產品，其宣稱具有抗癌、減少治療引起的症狀及其他副作用。此外，樟芝菌絲體產品也被發現具有抗氧化、抗過敏、免疫刺激效果。這些產品宣稱具有與樟芝子實體相似的主要成分，包括具有細胞毒殺效果的三萜類、類固醇及具有免疫刺激性的多醣體等。
傳統上，樟芝被應用於健康食品，以避免發炎、過敏、皮膚癬、肝癌的發生，因此，樟芝菌絲體及子實體萃取物被認為是具有潛力的化學治療藥物，以對抗肝癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌細胞等，但各類有效成分的活性機制與抑制癌症能力並未被完整釐清及探討。
樟芝三萜類成分為其主要的二次代謝物，也是最受注目的活性成分。目前大部分用以評估樟芝三萜類量化標準分為兩種方法，第一種是以重量也就是萃取率為依據，並以乙醇作為萃取溶劑，設定不同萃取時間作為調控參數，以獲得的重量評估萃取率。但並無法分析所得之萃取物中總三萜類含量，以及麥角甾烷與羊毛甾烷三萜類各別含量。第二種則是分光光度測定法，根據樟芝三萜類特有的官能基團(羧基-COOH)與特定試劑在特定條件下反應所成的複合物顏色，以比色法完成樟芝總三萜類含量的測定。
此外，大多數三萜類分子結構中含有雙鍵，在光譜的紫外光波長區段有吸收峰，因此，可由紫外分光光度法於特定波長處測定吸收係數相近的總三萜類含量。例如，齊墩果酸(oleanolic acid)為三萜類有機酸，因為齊墩果酸和待測成分的化學結構相似，使用典型的三萜類成分顯色劑(香草醛-冰醋酸-高氯酸(vanillin-glacial acetic acid-perchloric acid)與其反映顯色，再以比色法測定其含量。其具體的顯色原理主要是使羧基脫水，增加雙鍵結構，再經雙鍵位移，雙分子縮合等反應生成共軛雙烯系統，並在酸作用下形成陽離子而顯色，該方法為總三萜類成分的專屬性顯色方法。不過此方法易造成偽陽性，若待測樣品中其他成分結構帶有羧基亦會與特定顯色劑反應而發生誤判。上述兩種方法為常用於檢測樟芝總三萜類的方法，但其準確性不佳，要作為量 化標準仍有改善空間。此外，中華民國專利公開號TW 201416673 A揭露了牛樟芝三萜類成分之定量方法，其係以層析方法取得牛樟芝指紋圖譜，再計算指定區間吸收峰與外部標準品的積分面積比值，進一步計算三萜類含量，但該發明公開案並未揭露樣品萃取方法以及樣品中包含麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類的總含量及各別含量。此外，中華民國專利號I407100揭露了利用高效液相層析分析牛樟芝三萜類之方法，但未揭露樟芝子實體所含有的三萜類之量化方法。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「一種樟芝萃取物製備及分析方法」，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
為了克服先前技術無法有效量化樟芝萃取物之萃取率及其所含特定三萜類化合物，以及建立樟芝萃取最佳製程以更能確保及管控其所含總三萜類的含量，本發明對樟芝源頭的萃取製程進行分析，開發三萜類成分準確的量化標準來確保及管控樟芝來源的品質。本發明藉由數學及統計學的實驗設計，分析影響該萃取物的萃取率重要參數，並搭配核磁共振圖譜定量法及高效液相層析串聯質譜法，以量化及鑑定樟芝萃取物及其特定三萜類化合物。藉由前述技術，可以分析/檢測/量化藥品、保健食品或其他商品中是否含有麥角甾烷及/或羊毛甾烷三萜類化合物及其總含量及各別含量。
本文用語「樟芝萃取物」係指萃取自樟芝子實體、菌絲體或前二者之組合的萃取物，意即樟芝子實體萃取物、樟芝 子實體萃取物或樟芝子實體/菌絲體萃取物。較佳地，本文內容是以醇類萃取樟芝子實體、菌絲體或前二者之組合所獲得的萃取物。本文所揭示的醇類較佳地為甲醇、乙醇或前二者之組合。較佳地，本文所揭示的醇類、甲醇及/或乙醇之濃度為醇類、甲醇及/或乙醇與水調和後之濃度。本文的「樟芝」及「樟芝萃取物」含有麥角甾烷三萜類及/或羊毛甾烷三萜類，其合稱為三萜類。各種麥角甾烷三萜類及各種羊毛甾烷三萜類分別總稱為總麥角甾烷三萜類及總羊毛甾烷三萜類。總麥角甾烷三萜類及總羊毛甾烷三萜類之總稱為總三萜類。此外，實際上含有或者宣稱含有前述麥角甾烷三萜類及羊毛甾烷三萜類的單方藥物、複方藥物、處方藥物、非處方藥物、健康食品、飲品、嗜好品或諸如此類均落入本案「樟芝萃取物」之定義。
本發明提供一種藥物組合物，其包括如後文所揭示之有效劑量的麥角甾烷三萜類(式I~式X)及羊毛甾烷三萜類(式XI~式XIV)的組合物其中之一。
麥角甾烷三萜類組合物包括於後文所揭示的antcin K(式I、式II)、antcin C(式III、式IV)、樟芝酸C(式V、式VI)、樟芝酸B(式VII)、樟芝酸A(式VIII、式IX)及/或antcin A(式X)之組合物(或稱為立體異構純化合物)；而羊毛甾烷三萜類組合物包括去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid，式XI)、硫色多孔菌酸(sulphurenic acid，式XII)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid，式XIII)及/或層孔菌酸(eburicoic acid，式XIV)。
本發明提供一種檢測樟芝中至少一麥角甾烷三萜類組合物的含量的方法，包括下列步驟：以醇類萃取樟芝子實體及/或菌絲體，獲得樟芝萃取物，以1H核磁共振圖譜儀檢測樟芝萃取物，確定樟芝萃取物中是否具有至少一麥角甾烷三萜類組合物。
進一步而言，前述檢測步驟還包括以1H核磁共振圖譜儀檢測該至少一麥角甾烷三萜類組合物之第28位置亞甲基訊號。
再者，該檢測方法還用以同時檢測樟芝中至少一羊毛甾烷三萜類組合物的含量，包括步驟：以1H核磁共振圖譜儀檢測樟芝萃取物，確定樟芝萃取物中是否具有至少一羊毛甾烷三萜類組合物。再以1H核磁共振圖譜儀檢測該至少一羊毛甾烷三萜類組合物之第28位置亞甲基訊號。
本發明另提出一種檢測一待測萃取物中之麥角甾烷三萜類組合物的總含量的方法，包括下列步驟：以特定麥角甾烷三萜類化合物為標準品，配製為不同濃度並製作該標準品的核磁共振圖譜及檢量線；以核磁共振圖譜儀分析待測萃取物中之麥角甾烷三萜類組合物的第28位置亞甲基訊號；以及比對檢量線及第28位置亞甲基訊號，由第28位置亞甲基訊號之積分面積比，計算待測萃取物中之麥角甾烷三萜類組合物的總含量。
參照前述檢測方法，本發明另提出一種檢測待測萃取物中之羊毛甾烷三萜類組合物的總含量的方法，包括下列步驟：以特定羊毛甾烷三萜類化合物為標準品，配製為不同濃度並製作該標準品的核磁共振圖譜及檢量線；以核磁共振圖譜儀分析待測萃取物中之羊毛甾烷三萜類組合物的第28位置亞甲基訊號；以及比對檢量線及第28位置亞甲基訊號，由第28位置亞甲基訊號之積分面積比，計算待測萃取物中之羊毛甾烷三萜類組合物的總含量。
進一步而言，該檢測待測萃取物中之麥角甾烷三萜類組合物及羊毛甾烷三萜類組合物的總含量的方法還包括：以吡嗪(pyrazine)為該1H核磁共振圖譜的內標準品；檢測該待測萃取物 是否具有第28位置亞甲基訊號於δH 4.82(2H,br d)；檢測該待測萃取物是否具有第28位置亞甲基訊號於δH 4.63(1H,s)以及4.70(1H,s)。而出現第28位置亞甲基訊號分別於δH 4.82(2H,br d)、δH 4.63(1H,s)以及4.70(1H,s)表示該待測萃取物具有至少一麥角甾烷三萜類組合物及羊毛甾烷三萜類組合物。
本發明另提供一種萃取樟芝中至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物的方法，包含下列步驟：提供樟芝子實體及/或菌絲體並將其研磨為細粉；使用醇類為萃取溶劑並設計不同萃取參數進行萃取，獲得該樟芝子實體及/或菌絲體醇類萃取物。其中該萃取物包括至少一麥角甾烷三萜類組合物(立體異構純化合物)及至少一羊毛甾烷三萜類組合物。
較佳地，該萃取方法還包括：設定第一參數(溫度)、第二參數(時間)以及第三參數(例如乙醇濃度)為各別獨立的萃取參數；將所得萃取物接續以核磁共振圖譜測定其麥角甾烷三萜類組合物及羊毛甾烷三萜類組合物第28位置亞甲基訊號之積分面積值，該值即為萃取反應值；再設計不同萃取參數進行萃取，依照所得之實驗結果，分析各別獨立的萃取參數或參數與參數間的相互關係及其顯著水平，得到至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物適當之萃取參數，並藉由多元迴歸分析來計算獨立的萃取參數與萃取反應值的變化，如以下式I表示：y=A 0+A 1 x 1+A 2 x 2+A 3 x 3+A 12 x 1 x 2+A 13 x 1 x 3+A 23 x 2 x 3+A 11 x 1 2+A 22 x 2 2+A 33 x 3 2(式I)其中y為萃取反應值，A(0,1,2,3,12,13,23,11,22,33)代表常數，x(1,2,3)為獨立控制參數。
本發明另提出一種檢測一待測萃取物中至少一麥角 甾烷三萜類組合物各別含量的方法，包括下列步驟：以醇類萃取樟芝子實體、菌絲體或子實體及菌絲體的混合物，獲得醇類萃取物，以1H核磁共振圖譜儀檢測醇類萃取物，確定醇類萃取物中是否具有至少一麥角甾烷三萜類組合物。當出現該至少一麥角甾烷三萜類組合物時，以高效液相層析儀檢測醇類萃取物中該至少一麥角甾烷三萜類組合物(立體異構純化合物)的含量。
再者，該檢測方法還用以同時檢測該待測萃取物中至少一羊毛甾烷三萜類組合物的各別含量，包括步驟：以1H核磁共振圖譜儀檢測醇類萃取物，確定醇類萃取物中是否具有至少一羊毛甾烷三萜類組合物。當出現該至少一羊毛甾烷三萜類組合物時，以高效液相層析儀檢測醇類萃取物中該至少一羊毛甾烷三萜類組合物的含量。而高效液相層析技術使用了全波長偵測器及/或串聯式質譜儀所組合的偵測器。
進一步而言，該檢測方法還包括：計算至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物之pKa值；調整分離溶媒的pH值；於同一層析圖譜分析至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物。
進一步而言，該檢測方法還包括：層析醇類萃取物及對應至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物之標準品；比較醇類萃取物及標準品之高效液相層析圖譜；當醇類萃取物的高效液相層析圖譜出現至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物，進一步使用串聯式質譜儀進行分析、建立至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物標準品之母離子(假性離子峰)、第一強度子離子及第二強度子離子，作為判斷待測之醇類萃取物中是否具有至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物之依據；配 製各別標準品不同濃度並製作檢量線，以串聯式質譜儀分析待測醇類萃取物中至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物之標準品訊號；及比對各別標準品檢量線得到積分面積比，計算待測醇類萃取物中之至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物的各別含量。
根據上述構想，本發明可用以檢測含有至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物之複方藥物中其總含量及各別含量、含有至少一麥角甾烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷三萜類組合物之單方藥物中其總含量及各別含量，或其他中草藥樣品中是否存在至少一種前述兩類化合物或是存在至少一種前述兩類化合物中特定化合物的總含量及各別含量。進一步地，再檢測這兩類化合物或兩類化合物中特定化合物在複方藥物、單方藥物或中草藥樣品中之比例。
第1圖為本發明中以加熱迴流萃取法萃取樟芝乙醇萃取物總三萜類的1H NMR圖譜(DMSO-d6，400MHz)。
第2圖為本發明中以超音波震盪萃取法萃取樟芝乙醇萃取物總三萜類的1H NMR圖譜(DMSO-d6，400MHz)。
第3圖為總麥角甾烷三萜類化合物與總羊毛甾烷三萜類化合物的最佳萃取條件預期值的示意圖。
第4圖為本發明中樟芝子實體乙醇萃取物的最佳化高效能液相層析圖。
第5圖為本發明中高效能液相層析串聯質譜儀內部標準品靈芝酸A(ganoderic acid A)的化學結構式。
本案所提出之「一種樟芝萃取物製備及分析方法」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。實施例
本發明萃取的麥角甾烷三萜類組合物E1~E12的結構式(式I至式X)詳列如下。
本發明萃取的羊毛甾烷三萜類組合物L1~L4的結構式(式XI至式XIV)詳列如下。
實驗1、核磁共振圖譜分析
三萜類化合物為樟芝的主要二次代謝物，分為麥角甾烷以及羊毛甾烷兩類。本發明利用核磁共振圖譜分析法進行樟芝萃取物(以樟芝子實體乙醇萃取物為例，但不以此為限)中總麥角甾烷三萜類化合物與總羊毛甾烷三萜類化合物的絕對含量分析。
檢測實驗流程如下。首先選擇適當的氘代溶劑，接續選擇此兩類化合物之標準品，分別以不同濃度製作檢量線，並添加一定量的內部標準品於欲分析的標準品中，計算各標準品特徵訊號與內部標準品標的訊號的積分面積比值，並利用線性迴歸將此積分值與濃度作圖，即可得到兩類化合物標準品之檢量線。再配置一定濃度之樟芝子實體乙醇萃取物，加入等量之氘代溶劑以及內部標準品進行核磁共振圖譜分析，在積分兩類化合物之標準品的特徵訊號與內部標準品的標的訊號後計算積分比值，再藉由檢量線求得兩類化合物於樟芝子實體乙醇萃取物中的絕對總含量。
本發明利用核磁共振圖譜分析法進行樟芝子實體乙醇萃取物中總麥角甾烷三萜類化合物與總羊毛甾烷三萜類化合物之絕對含量分析。實驗條件如下，配置不同濃度的兩類化合物之標準品，分別為麥角甾烷三萜類的樟芝酸A以及羊毛甾烷三萜類 的去氫齒孔酸，並加入0.132mg的內部標準品吡嗪(pyrazine)，同時溶於0.6mL的DMSO-d6溶液作為進行核磁共振圖譜分析之測試溶劑，核磁共振儀為Varian UNITY plus 400MHz圖譜儀，掃描次數為10次(7分鐘)，圖譜寬度為6002.4Hz，強度脈衝寬度為6.3μs。前述測試溶劑可為但不限於DMSO-d6溶液、CDCl3以及C5D5N等。請參閱表1與表2，再使用手動選擇兩類化合物標準品第28位置亞甲基特徵訊號的起點及終點，計算其波峰積分面積以及與內部標準品吡嗪標的訊號(δH 8.66)的積分面積比值，麥角甾烷三萜類標準品樟芝酸A的特徵質子(第28號位置亞甲基)吸收訊號在δH4.82(2H,br d)，羊毛甾烷三萜類標準品去氫齒孔酸的特徵質子(第28號位置亞甲基)吸收訊號在δH 4.63(1H,s)以及4.70(1H,s)。前述試驗進行三重複並計算相對標準偏差之數值(RSD%)。
請參閱表3，其利用線性迴歸將此積分比值與濃度作圖，得到兩類化合物標準品之檢量線(標準曲線、迴歸分析的決定係數)，作為此定量分析方法之依據。
實驗2、樟芝子實體中麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類組合物之萃取方式設計
將乾燥樟芝子實體磨成細粉或剪成碎片，以1：10~1：20比例(重量/體積)置於75℃的95%乙醇溶液，迴流及/或超音波震盪2小時。萃取物冷卻後再置於4℃隔夜沈澱。再以濾紙過濾萃取物的上清液，以3,000rpm離心30分鐘以去除沈澱物，將萃取物冷凍乾燥並儲存於-70℃，即為樟芝子實體乙醇萃取物。
由實驗1之核磁共振圖譜分析已知濃度之乙醇萃取物中總麥角甾烷及總羊毛甾烷三萜類組合物之積分比值，進而計算出總麥角甾烷及總羊毛甾烷三萜類組合物之濃度。
請參閱第1圖及第2圖，其分別為本發明中以加熱 迴流萃取法及超音波震盪萃取法萃取樟芝乙醇萃取物總三萜類的1H NMR圖譜。本發明以此兩種不同萃取方法進行預試驗，由核磁共振圖譜分析得知這兩種萃取方法的總麥角甾烷與總羊毛甾烷三萜類化合物特徵訊號的積分面積值無太大的差異性，證明以核磁共振圖譜分析樟芝子實體中總麥角甾烷及總羊毛甾烷三萜類組合物的濃度的適切性。
實驗3、樟芝子實體中麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類組合物濃度之萃取參數設計
本發明以數學及統計學設計實驗，分析影響樟芝子實體中麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類組合物濃度的萃取參數，作為控制或改良的參考依據。根據預試驗實際數據，建立參數與參數間相互關係的數學模式，並藉由該模式尋找出極值點的位置，包含極大值及極小值。
本發明實驗設計的模式建立了每種萃取參數的三個域值(-1、0、+1)，進而找尋最佳萃取條件，意即該範圍須包括極大值及極小值。本發明實驗中三種獨立的萃取參數分別為第一參數(溫度)、第二參數(時間)以及第三參數(乙醇濃度)，作為評估最佳萃取製程的控制參數。萃取條件相對反應值即以核磁共振圖譜分析測定樟芝子實體乙醇萃取物中總麥角甾烷及總羊毛甾烷三萜類特徵訊號的積分面積值為依據。在預試驗中得知三種控制參數各自的極大值與極小值，再藉由數學及統計學的模式設計，設計出16種不同的萃取條件(域值-1、0、+1之組合)，其中通過中心點6次(0)代表評估模式設計的缺適性及提供誤差的資訊(參閱表4、5)。
值得注意的是，本發明以3種參數及其極大值、極小值以及介於極大值與極小值之間的中間值作為樟芝最佳萃取製 程的控制參數，但本領域的技術人員均可充分理解，以複數種參數，例如2種、3種、4種或更多參數，作為控制參數亦是可行的。而且，複數種參數也不限於溫度、時間及乙醇濃度，凡涉及樟芝萃取的參數均可作為控制參數，例如壓力、樟芝碎裂研磨程度程度、樟芝與溶液的重量體積比例等。除了參數的極大值、極小值以及介於其間的中間值可作為樟芝最佳萃取製程的控制參數之外，參數的極大值、極小值以及介於其間的任一數值亦可作為樟芝最佳萃取製程的控制參數。
實驗4、樟芝子實體中麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類組合物其濃度之最佳萃取參數
分別秤取重量為70mg乾燥樟芝子實體細粉，配置上述16種不同的萃取條件並使用超音波震盪萃取法進行萃取。將所得之16種條件之萃取物使用迴旋濃縮機抽乾，再取6mg之各別萃取物加入等量之氘代溶劑以及內部標準品(0.132mg的內部標準品吡嗪，溶於0.6mL的DMSO-d6)進行核磁共振圖譜分析，以核磁共振圖譜分析評估不同條件所得樟芝乙醇萃取物中總麥角甾烷與總羊毛甾烷三萜類的特徵訊號其積分面積值。
請參閱表6，其為以核磁共振圖譜測定16種不同萃取條件所得之反應值。由表6可知溫度、時間以及乙醇濃度分別於50℃、60分鐘以及95%乙醇溶液的萃取條件下，可得到總麥角甾烷與總羊毛甾烷三萜類化合物最佳的積分面積值，分別為40.33及13.59。
將上述之結果藉由多元迴歸分析來計算獨立的萃取參數與萃取反應值的變化，如以下式I表示：y=A 0+ A 1 x 1+A 2 x 2+A 3 x 3+A 12 x 1 x 2+A 13 x 1 x 3+A 23 x 2 x 3+A 11 x 1 2+A 22 x 2 2+A 33 x 3 2 (式I)，其中y為萃取反應值，A(0,1,2,3,12,13,23,11,22,33)代表常數，x(1,2,3)為獨立控制參數。多元迴歸分析的線性、二次和交叉乘積項和P值(顯著水平)請參閱表7。變異性分析顯示出決定(判定)係數R 2 皆大於0.90，分別是0.97以及0.94。此數據證明所建立的模式可充分解釋約95%由獨立控制參數或參數與參數間所產生的反應值(變異性)。而模式的缺適性是反應實驗設計的缺乏度，結果顯示P值大於0.05，分別是0.09以及0.61，表示本發明的設計模式是足夠準確的預測反應的變異性。此外，由迴歸分析可得知此模式所設計的條件於總麥角甾烷與總羊毛甾烷三萜類的P值皆小於0.001(參閱表8)。因此，本發明的設計模式顯示出一個非常適合且合理的代表數據。在本發明的實驗設計中，16種條件所得之反應值皆可使用多元迴歸方程充分解釋，進一步確定以所建立的迴歸模式進行預測不同的萃取參數針對樟芝總麥角甾烷與總羊毛甾烷三萜類的含量變化是可行的。
前述式(I)為以3種萃取參數進行多元迴歸分析的方程式。本領域的技術人員均理解，當以2種、4種或更多萃取參數進行多元迴歸分析時，式(I)方程式及其分析統計方法均可適當改寫及修飾，而前述改寫及修飾均落於本發明申請專利範圍之內。
除了評估由建立模式所得數據之合理性及缺適性外，也分析了獨立的控制參數及各別參數間的相互影響關係(參閱表8)。在麥角甾烷三萜類的獨立參數中，第三參數(乙醇濃度)的P值小於0.01；其餘獨立參數中一次項的交叉乘積(溫度、時間及乙醇濃度)和獨立參數的一次項的平方(溫度、時間及乙醇濃度)之P值大於0.05，因此表示乙醇的濃度於萃取樟芝麥角甾烷三萜類成分為主要的控制參數。相同的情況也發現於羊毛甾烷三萜類的獨 立參數中，第三參數(乙醇濃度)的P值小於0.01。此外於第一參數(溫度)的平方(X1 2)之P值小於0.05，表示除了乙醇濃度的比例於萃取樟芝羊毛甾烷三萜類成分為主要的控制參數，溫度也是另一個顯著的控制參數。
本發明以樟芝子實體三萜類萃取製程為驗證模式，搭配數學及統計學的方式模式設計，進而得到樟芝三萜類化合物最佳萃取製程的三個獨立參數(溫度、時間及乙醇濃度)預期值，分別為54.6度、58.9分鐘以及95%(參閱第3圖)。而萃取製程主要的控制參數為乙醇濃度，於麥角甾烷與羊毛甾烷三萜類其P值皆小於0.05。由表8得知，羊毛甾烷三萜類另一個顯著的控制參數出現在第一參數(溫度)的平方，其P值為0.014。本發明以所設計的模式分析出在最佳製程54.6℃、58.9分鐘以及95%乙醇濃度的條件下可得到最大預期值。意即，當溫度在接近55度時，羊毛甾烷三萜類可達到最高萃取率，但若溫度繼續上升或不足55度時，其萃取率則會下降。而時間參數對於兩類化合物是最無統計差異的因素，因為超音波萃取方式可以提升萃取效率。本發明發現以超音波萃取超過60分鐘即已達飽和。
因此，本領域的技術人員可以依照實驗3及實驗4的內容先由萃取參數的設計來萃取小量樟芝，藉由小量樟芝萃取物的核磁共振圖譜分析及多元迴歸分析，尋求最佳萃取製程參數或使用者所需的萃取製程參數，再以該最佳萃取製程參數或使用者所需的樟芝萃取製程參數來大量萃取樟芝。因此，所獲得的樟芝萃取物將含有最佳化比例或最大量的總麥角甾烷三萜類化合物與總羊毛甾烷三萜類化合物，或者使用者所欲的總麥角甾烷三萜類化合物與總羊毛甾烷三萜類化合物的含量或比例。
實驗5、總麥角甾烷三萜類化合物與總羊毛甾烷三萜 類化合物之絕對含量分析
將最佳製程之萃取物所得知兩類化合物積分比值帶入檢量線換算後，在1mg樟芝子實體乙醇萃取物中，總麥角甾烷三萜類化合物的絕對含量為513±0.18μg/mg，總羊毛甾烷三萜類化合物的絕對含量為187±0.25μg/mg。本發明以統計方式建立一快速、節能且有效益的萃取製程，以提高樟芝角甾烷與羊毛甾烷三萜類的萃取率。
實驗6、麥角甾烷三萜類化合物與羊毛甾烷三萜類化合物之高效能液相層析分析
樟芝子實體特有的麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類成分其結構皆具有羧基，於酸性的移動相會得到較好的層析效果，先前技術也由樟芝子實體乙醇萃取物之高效能液相層析圖確立樟芝麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類成分於乙腈-水(0.1%有機酸)或甲醇-水(0.1%有機酸)能得到較佳的層析圖譜。在此條件下，雖然可同時偵測麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類化合物的滯留時間，但並未能夠完全分離麥角甾烷三萜類立體異構混合物。為了得到更佳的分離及解析度，本發明進一步分析三萜類化合物之解離常數，再使用線上「Sparc化學自動推理軟體」(SPARC，全稱Sparc Performs Automated Reasoning in Chemistry)化學演算軟體計算樟芝子實體各個麥角甾烷以及羊毛甾烷三萜類化合物(包含12種麥角甾烷化合物E1-E12及4種羊毛甾烷三萜類化合物L1-L4)的酸度係數(參閱表9)。此兩類三萜類化合物的酸度係數範圍約在4.40~4.60。接續，配置五種不同pH值之移動相，分別為3.75、4.00、4.25、4.50以及5.00，進行高效能液相層析的圖譜分析比較。針對層析最佳化條件進行探討，分析結果之評估係以各層析圖譜中各三萜類化合物(E1-E12,L1-L4)之解析度(Resolution,Rs)作為判定依據。
高效液相層析的條件如下：高效液相層析儀為安捷倫1200 HPLC系統(Agilent Technologies)；偵測器為API 4000三段四極質譜儀(Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)；高效液相層析管柱為安捷倫EC-C18(150×4.6mm)；動相中的溶劑A為乙腈、溶劑B為純水並添加0.1%醋酸混合10mM醋酸銨並調整pH值分別為3.75、4.00、4.25、4.50以及5.00；流速為1.3ml/min；管柱溫度為室溫、偵測波長為UV 254nm。溶媒系統條件如下：動相包括溶劑A及B、線性梯度為0~15分鐘(39% A~44% A)、15~17.5分鐘(44% A~45% A)、17.5~22.5分鐘(45% A~47% A)、22.5~27.5分鐘(47% A~50% A)、27.5~30分鐘(50% A~53% A)、30~35分鐘(53% A~55% A)、35~45分鐘(55% A~65% A)、45~55分鐘(65% A~98% A)及55~60分鐘(98% A~100% A)。流速及管柱溫度如上所述。
結果顯示當移動相pH值為4.25時，各麥角甾烷以及羊毛甾烷三萜類化合物會得到較佳的解析度(參閱第4圖)。本發明建立之最佳化高效能液相層析圖譜中，兩兩一對的麥角甾烷三萜類化合物具有較佳的解析度及分離效果，可應用於高效能液相層析串聯質譜儀定量分析(如：三段四極質譜儀)。再者，待測分析化合物包含12種麥角甾烷以及4種羊毛甾烷三萜類化合物，雖然層析圖只顯示出兩個羊毛甾烷三萜類化合物的訊號，分別為去氫硫色多孔菌酸(L1)及去氫齒孔酸(L3)，但化合物L1與L2(硫色多孔菌酸)結構相似，化合物L3與L4(層孔菌酸)結構相似，結構上皆僅有兩組雙鍵(於C7-C8以及C9-C11)與一組雙鍵(於C8-C9)的差異。雖然於所建立之層析條件下，化合物L1與L2的波鋒重疊，L3與L4的波鋒重疊，但其分子量並不相同，可根據其分子量不相同的特性，利用高效能液相層析串聯質譜儀於上述最佳化高效 能液相層析條件下進行羊毛甾烷三萜類化合物的定性、定量測定。
實驗7、麥角甾烷三萜類化合物與羊毛甾烷三萜類化合物之各別含量分析
進一步建立樟芝子實體乙醇萃取物中16個三萜類化合物(E1-E12,L1-L4)於高效能液相層析串聯質譜儀的定量分析，偵測器亦選用定量準確性高的三段式四級棒質譜儀並以MRM為離子掃描模式進行。本實驗中選擇了分子量516的靈芝酸A(參閱第5圖)作為內部標準品，其理化及質譜性質皆與待測的16個三萜類化合物相似。所使用液相層析串聯質譜儀為安捷倫1200 HPLC系統及API 4000三段四極質譜儀，游離源為電噴灑游離(ESI)並搭配負離子模式進行偵測。
由16種三萜類化合物(E1-E12,L1-L4)及內部標準品靈芝酸A分別取兩組子離子對，第一強度離子對作為定量離子(Quantitation transitions)，第二強度離子對則用來作為定性離子。其最佳化質譜參數與萃取離子層析圖(Extracted Ion Chromatogram,XIC)與16個三萜類化合物子離子質譜圖請參閱表10。為了同時偵測16個三萜類化合物，進一步配製各標準品五種不同濃度(10-1000ng/ml)，計算每個濃度下各化合物與內部標準品定量離子的積分比值並繪製檢量線。表10的結果顯示16種三萜類化合物之線性迴歸相關係數的平方值(R 2 )皆大於0.99。由高效能液相層析串聯質譜儀定量方法檢測樟芝乙醇萃取物中的16種三萜類化合物的各別含量如表11所示。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

Claims (12)

  1. 一種樟芝的萃取方法，包括步驟：(a)選擇一第一參數、一第二參數及一第三參數，其中該第一、該第二及該第三參數各具有一極大值、一極小值以及介於該極大值與該極小值之間的一數值，並將各該極小值、該數值及該極大值分別給定一域值-1、一域值0及一域值1，該第一參數、該第二參數及該第三參數分別為一溫度、一時間及一醇類濃度；(b)以該域值-1、該域值0及該域值1組合出複數萃取條件來萃取一少量的樟芝，獲得複數樟芝萃取物；(c)使用式I方程式評估各該複數樟芝萃取物的一萃取反應值：
    Figure TWI623749B_C0001
    其中y為該萃取反應值，A(0,1,2...)A(0,1,2,3,12,13,23,11,22,33)為常數，x(1,2,3)為該第一、該第二及該第三參數；(d)對該複數樟芝萃取物進行核磁共振圖譜分析，獲得各該複數樟芝萃取物中總麥角甾烷三萜類與總羊毛甾烷三萜類的特徵訊號的積分面積值；以及(e)依據該萃取反應值、該積分面積值及一使用者的需要，使用該第一、該第二及該第三參數的該極大值、該極小值、介於該極大值與該極小值之間的該數值以及介於該極大值與該極小值之間的任一數值其中之一對一大量的樟芝進行加熱迴流萃取或超音波震盪萃取，以獲得樟芝萃取物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的萃取方法，其中該樟芝為樟芝子實體、樟芝菌絲體或其組合。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的萃取方法，其中該溫度的一極大值、一極小值以及介於該極大值與該極小值之間的一數值分別為75℃、25℃及50℃。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的萃取方法，其中該時間的一極大值、一極小值以及介於該極大值與該極小值之間的一數值分別為90分鐘、30分鐘及60分鐘。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的萃取方法，其中該醇類濃度為一醇類與水調製的一濃度，且該醇類為一甲醇及一乙醇其中之一。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的萃取方法，其中當該醇類為該乙醇時，該乙醇與水調製為一乙醇濃度，該乙醇濃度的一極大值、一極小值以及介於該極大值與該極小值之間的一數值分別為95%、35%及65%。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的萃取方法，其中在54.6℃的該溫度、58.9分鐘的該時間及95%的該乙醇濃度為條件下，該樟芝的該總麥角甾烷三萜類與總羊毛甾烷三萜類的萃取量最高。
  8. 一種分析方法，用於最佳化樟芝的萃取製程參數，包括步驟：(a)選擇一第一參數、一第二參數及一第三參數，其中該第一、該第二及該第三參數各具有一極大值、一極小值以及介於該極大值與該極小值之間的一數值，並將該極小值、該數值及該極大值分別給定一域值-1、一域值0及一域值1，該第一參數、該第二參數及該第三參數分別為一溫度、一時間及一醇類濃度；(b)以該域值-1、該域值0及該域值1組合出複數萃取條件來萃取樟芝，以獲得複數樟芝萃取物；(c)使用式I方程式評估各該複數樟芝萃取物的一萃取反應值：
    Figure TWI623749B_C0002
    其中y為該萃取反應值，A(0,1,2,3,12,13,23,11,22,33)為常數，x(1,2,3)為該第一、該第二及該第三參數；(d)對該複數樟芝萃取物進行核磁共振圖譜分析，以獲得各該複數樟芝萃取物中總麥角甾烷三萜類與總羊毛甾烷三萜類的特徵訊號的積分面積值，並由該積分面積值及該萃取反應值決定該樟芝的最佳萃取製程參數。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的分析方法，更包括：步驟(e)以一高效能液相層析串聯質譜儀分析該總麥角甾烷三萜類中各麥角甾烷三萜類以及該總羊毛甾烷三萜類中各羊毛甾烷三萜類之一母離子、一第一強度子離子及一第二強度子離子，以計算各麥角甾烷三萜類及各羊毛甾烷三萜類的含量。
  10. 一種分析方法，用於最佳化樟芝的萃取製程參數，包括：(a)選擇複數個參數，其中各該參數具有一極大值、一極小值以及介於該極大值與該極小值之間的一數值，並將該極小值、該數值及該極大值分別給定一域值-1、一域值0及一域值1；(b)以該域值-1、該域值0及該域值1組合出複數萃取條件來萃取樟芝，以獲得複數樟芝萃取物；以及(c)使用多元迴歸計算各該複數樟芝萃取物的一萃取反應值，並據以決定該樟芝的最佳萃取製程參數。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的分析方法，其中步驟(c)更包括：(c1)對該複數樟芝萃取物進行核磁共振圖譜分析，以獲得各該複數樟芝萃取物中總三萜類的特徵訊號的積分面積值；以及(c2)以該積分面積值以及萃取反應值決定該樟芝的該最佳萃取製程參數。
  12. 一種用於最佳化一樟芝的總麥角甾烷三萜類與總羊毛甾烷三萜類的含量的方法，包括步驟：確定如申請專利範圍第1項所述之第一參數、第二參數及第三參數之各自反應值，各該反應值係選自由一極大值、一極小值以及介於該極大值與該極小值之間的一數值所組成的群組其中之一；以及分析該第一、該第二及該第三參數之間的相互影響關係，以獲得最佳化該總麥角甾烷三萜類與該總羊毛甾烷三萜類的含量。
TW104113995A 2015-04-30 2015-04-30 一種樟芝萃取物製備及分析方法 TWI623749B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104113995A TWI623749B (zh) 2015-04-30 2015-04-30 一種樟芝萃取物製備及分析方法
JP2016090880A JP6325018B2 (ja) 2015-04-30 2016-04-28 牛樟芝の抽出物の調製方法及びその分析方法
CN201610278762.7A CN106093260B (zh) 2015-04-30 2016-04-28 一种樟芝萃取物制备及分析方法
US15/141,916 US20160318972A1 (en) 2015-04-30 2016-04-29 Preparation method and analytic method for the extract of antrodia cinnamomea

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104113995A TWI623749B (zh) 2015-04-30 2015-04-30 一種樟芝萃取物製備及分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201638584A TW201638584A (zh) 2016-11-01
TWI623749B true TWI623749B (zh) 2018-05-11

Family

ID=57205681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104113995A TWI623749B (zh) 2015-04-30 2015-04-30 一種樟芝萃取物製備及分析方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160318972A1 (zh)
JP (1) JP6325018B2 (zh)
CN (1) CN106093260B (zh)
TW (1) TWI623749B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108061720A (zh) * 2017-12-26 2018-05-22 广州广电计量检测股份有限公司 一种紫外吸收系数法测定灵芝三萜含量的方法
CN110122180A (zh) * 2018-02-08 2019-08-16 广东东阳光药业有限公司 牛樟芝培养基质、培养牛樟芝的方法以及牛樟芝产品
CN110749661B (zh) * 2018-07-24 2020-08-25 厦门大学 一种皿培式培养牛樟芝的质量控制方法
TW202038981A (zh) * 2018-11-28 2020-11-01 薩摩亞商吉亞生技控股股份有限公司 治療失智症的組合物及方法
IT201900020630A1 (it) * 2019-11-08 2021-05-08 Univ Degli Studi Genova Processo e sistema per l’estrazione di molecole da matrici solide particellari
KR20220119367A (ko) * 2019-11-20 2022-08-29 예일 유니버시티 파네소이드 x 수용체(fxr)-매개 전사 반응의 유도 또는 증대 방법
TWI783217B (zh) 2020-03-18 2022-11-11 綠茵生技股份有限公司 牛樟芝用於解酒及/或增加酒精代謝之用途
CN112345575B (zh) * 2020-11-10 2024-05-31 淮阴师范学院 一种通过1h nmr定量测定左旋肉碱富马酸盐的方法
CN117347357B (zh) * 2023-12-05 2024-02-13 江门天锦泰生物工程有限公司 一种含有藤茶提取物的饲料添加剂含量检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201231474A (en) * 2011-01-26 2012-08-01 Univ Kaohsiung Medical Triterpenoid composition of Antrodia cinnamomea, preparation and analysis method thereof
TW201332558A (zh) * 2012-02-13 2013-08-16 Joben Bio Medical Co Ltd 牛樟芝萃取濃縮物及其製造方法
CN104523877A (zh) * 2015-02-02 2015-04-22 杭州绿本生物科技有限公司 一种抗癌药物及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI486164B (zh) * 2009-02-13 2015-06-01 Univ Kaohsiung Medical 用於誘導細胞凋亡之樟芝子實體乙醇萃取物及其製備方法
TWI522112B (zh) * 2012-12-11 2016-02-21 財團法人工業技術研究院 疫苗佐劑、疫苗組合物與牛樟芝子實體之多醣體用於製備一疫苗佐劑的用途
CN104107208B (zh) * 2014-07-09 2018-04-27 陕西师范大学 响应面法优化超声-微波协同提取的山茱萸总皂苷及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201231474A (en) * 2011-01-26 2012-08-01 Univ Kaohsiung Medical Triterpenoid composition of Antrodia cinnamomea, preparation and analysis method thereof
TW201332558A (zh) * 2012-02-13 2013-08-16 Joben Bio Medical Co Ltd 牛樟芝萃取濃縮物及其製造方法
CN104523877A (zh) * 2015-02-02 2015-04-22 杭州绿本生物科技有限公司 一种抗癌药物及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王光磊等人，幾種提取技術在樟芝三萜提取中的應用和比較，Strait Pharmaceutical Journal Vol 26 No. 8 2014. *
王宮等人，牛樟芝總三萜提取工藝研究，現代中藥研究與實踐2011年第25卷第6期第67-68頁。
陸震嗚等人，乙醇提取樟芝菌粉三萜類化合物的動力學研究，食品科學，2009,Vol. 30, No. 03, p21-24.
陸震嗚等人，乙醇提取樟芝菌粉三萜類化合物的動力學研究，食品科學，2009,Vol. 30, No. 03, p21-24. 王宮等人，牛樟芝總三萜提取工藝研究，現代中藥研究與實踐2011年第25卷第6期第67-68頁 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6325018B2 (ja) 2018-05-16
JP2016210770A (ja) 2016-12-15
CN106093260B (zh) 2019-05-31
CN106093260A (zh) 2016-11-09
US20160318972A1 (en) 2016-11-03
TW201638584A (zh) 2016-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI623749B (zh) 一種樟芝萃取物製備及分析方法
Chisté et al. Simultaneous extraction and analysis by high performance liquid chromatography coupled to diode array and mass spectrometric detectors of bixin and phenolic compounds from annatto seeds
Kotra et al. A critical review of analytical methods for determination of curcuminoids in turmeric
Zhu et al. Fingerprint analysis of Radix Aconiti using ultra-performance liquid chromatography–electrospray ionization/tandem mass spectrometry (UPLC–ESI/MSn) combined with stoichiometry
Sun et al. Profiling and identification of the absorbed constituents and metabolites of schisandra lignans by ultra‐performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry
TW201231474A (en) Triterpenoid composition of Antrodia cinnamomea, preparation and analysis method thereof
CN105651899B (zh) 一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用
CN103792278B (zh) 莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法
Manwar et al. Gas chromatography method for the determination of non-ethanol volatile compounds in herbal formulation
Bongiorno et al. Bio‐phenols determination in olive oils: Recent mass spectrometry approaches
Avula et al. Characterization of steroidal saponins from Dioscorea villosa and D. cayenensis using ultrahigh performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry
Zhao et al. Characterization and classification of three common Bambusoideae species in Korea by an HPLC-based analytical platform coupled with multivariate statistical analysis
Lee et al. Discrimination of Scrophulariae Radix according to geographical origin and determination of active constituents by near infrared spectroscopy (NIRS)
Zhu et al. Comparative quality of the forms of decoction pieces evaluated by multidimensional chemical analysis and chemometrics: Poria cocos, a pilot study
Zhai et al. Discrimination of toxic ingredient between raw and processed Pinellia ternata by UPLC/Q-TOF-MS/MS with principal component analysis and T-test
Xu et al. Optimization of flash extraction, separation of ginsenosides, identification by HPLC-FT-ICR-MS and determination of rare ginsenosides in mountain cultivated ginseng
Li et al. Chemical Differentiation and Quantitative Analysis of Different Types of Panax Genus Stem‐Leaf Based on a UPLC‐Q‐Exactive Orbitrap/MS Combined with Multivariate Statistical Analysis Approach
Zhang et al. Comparative and chemometric analysis of correlations between the chemical fingerprints and anti‐proliferative activities of ganoderic acids from three Ganoderma species
Faberi et al. Determination of type B fumonisin mycotoxins in maize and maize‐based products by liquid chromatography/tandem mass spectrometry using a QqQlinear ion trap mass spectrometer
Shin et al. Metabolomic approach for discrimination of four-and six-year-old red ginseng (Panax ginseng) using UPLC-QToF-MS
KR101629570B1 (ko) 사중극자 비행시간 질량 분석법에 결합시킨 고속 분리능 액체 크로마토그래피를 이용한 고려인삼의 재배지 판별 방법
CN112114079B (zh) 一种同时检测使君子中9种化学成分的方法
Liu et al. Quantitation of thioprolines in grape wine by isotope dilution–liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Hao et al. Metabolic profiling analysis of three processed rhizomes of Curcuma wenyujin YH Chen et C. Ling by ultra-performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry
Huang et al. The quantification of monacolin K in some red yeast rice from Fujian province and the comparison of the other product