CN103792278B - 莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析技术领域，具体涉及莲子生物碱的快速测定方法，步骤包括：样品处理、标准品处理，电喷雾萃取电离质谱EESI‑MS检测，绘制标准曲线，计算样品中生物碱浓度。本发明方法快速、准确、且无需复杂的样品预处理，不仅可用于复杂基体样品中生物碱的快速鉴定，结合化学计量学还可对不同陈化度的莲子样品进行有效区分。
Description
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及莲子活性物质检测。
技术背景
莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）为睡莲科多年生水生草本植物，广泛分布于热带和亚热带地区。莲子是莲的种子，含有丰富的多糖、磷脂、生物碱和类黄酮等营养保健成分，是一种老少皆宜的食疗佳品及著名的药食同源食物。
生物碱为莲的主要生物活性成分，在莲各部位均可检测到。传统的生物碱鉴定方法是根据化学降解法来鉴定生物碱的化学结构，近年来已应用光谱分析、质谱分析和核磁分析等现代分析手段来鉴定生物碱的结构。近年来，对莲心生物碱等方面的研究取得了较大的成就，且已有制剂用于临床。然而，基于直接质谱分析，对莲生物碱进行快速分析及鉴定目前未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测莲子中生物碱的方法，本方法分析速度快，信息提取准确，识别精度高，对莲子样品质谱数据具有较好的识别效果，为生物碱的直接快速分析提供了有效参考。
具体方案如下：
莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）样品处理：取莲子，粉碎，过80目筛，称取莲子粉末各0.01g，加入1.5 mL离心管中，加入1mL 80%乙醇溶液，超声提取10 min，4000 r/min离心5min，将提取上清液作为样品待测；
（2）标准品的制备：分别称取5 mg干燥至恒重的莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、O-去甲基荷叶碱对照品，用80 % 甲醇溶解，分别配制成浓度为1 .00 mg/mL对照品储备溶液。将各对照品储备溶液混合成混标上样，浓度分别为0.03，0.06，0.12，0.24，0.48，1.00mg/mL，现配现用；
（3）对混合标准品和待测样品分别进样检测；
（4）电喷雾萃取电离质谱EESI-MS检测时：LTQ-MS工作在正离子检测模式，质谱扫描范围均为m/z 50~1000；电离电压为3.0 kV；毛细管温度均为250 ℃；ESI溶剂均为甲醇；雾化气为氮气（纯度99.999%），压力为1.2MPa；EESI溶剂无水甲醇和样品溶液流速分别为3μL/min和5 μL/min；两个毛细管喷雾口距离a=1 mm，夹角为60°，到质谱进样口的距离为5mm，角度为150°，在进行串联质谱分析时，母离子的隔离窗口宽度选为1.5 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为17％~25％，其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化；
在测定时，质谱和离子源的条件为：离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250℃，样品进样速率为5 μL/min，其他参数设置为默认值；
（5）选择离子流m/z 611、625、282、314、296分别对应莲心碱、甲基莲心碱、O-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱，与总离子流图的走势一致，离子的丰度随着进样的出现而明显增强，说明样品中存在该质量分数的生物碱；
（6）根据标准品生物碱浓度为横坐标，信号强度为纵坐标绘制标准曲线，根据样品中信号强度计算出样品中相应生物碱的浓度。
本发明有益效果为：
快速、准确、且无需复杂的样品预处理，不仅可用于复杂基体样品中生物碱的快速鉴定，结合化学计量学还可对不同陈化度的莲子样品进行有效区分。
本方法对莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、O-去甲基荷叶碱的检出限分别为：3.5 × 10－7，1. 2 × 10－6，1.6 × 10－7，6.3 × 10－7，5.6 × 10－7 mg/mL。
附图说明
图1 EESI源装置示意图；
图2 电离电压对m/z 625信号强度的影响；
图3 离子管温度对m/z 625信号强度的影响；
图4 样品进样速率对m/z 625信号强度的影响；
图5 总离子流图和选择离子流（m/z 611、625、282、314和296）图；
图6 莲子醇提物中5种生物碱的的二级质谱图：(A) 莲心碱m/z 611；(B) 甲基莲心碱m/z 625；(C) O-去甲基莲心碱m/z 282；(D) 莲心季铵碱m/z 314；(E) 荷叶碱m/z296；
图7 不同贮藏时间莲子醇提取液中5种生物碱的信号强度变化；
图8 不同贮藏时间莲子醇提液EESI-MS谱图的PCA 3D图。
具体实施方式
本发明所述的实例使用的质谱仪为美国Finnigan公司的LTQ-XL型线性离子阱质谱仪，数据处理系统为美国Finnigan公司的Xcalibur数据处理系统。
中性解吸装置和EESI离子源，由江西省质谱科学与仪器重点实验室自行研制；精密电子天平（METTLER TOLEDO）。甲醇（色谱纯，SK CHEMICALS）；
莲子品种为太空莲3号，由江西省广昌县白莲科学研究科所提供。
实施例1
1 实验部分
1.1 莲子醇溶液的制备:
2012年9月上旬，分别将每个年份收获的莲子（2012，2011，2010，2009）进行粉碎，过80目筛，分别称取莲子粉末各0.01g，加入1.5 mL离心管中，加入1mL 80%乙醇溶液，超声提取10 min，4000 r/min离心5min，将提取上清液作为样品直接进行质谱检测，每种样品平行测试6次。
1.2 EESI-MS实验参数:
LTQ-MS工作在正离子检测模式，质谱扫描范围均为m/z 50~1000；电离电压为3.0kV；毛细管温度均为250 ℃；ESI溶剂均为甲醇；雾化气为氮气（纯度99.999%），压力为1.2MPa；EESI溶剂和样品溶液流速分别为3 μL/min和5 μL/min；两个毛细管喷雾口距离a=1mm，夹角为60°，到质谱进样口的距离为5 mm，角度为150°，在进行串联质谱分析时，母离子的隔离窗口宽度选为1.5 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为17％~25％，其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化。（具体原理见图1）。
1.3 主成分分析:
利用Matlab软件（7.0版，美国Mathworks公司）对2012，2011，2010，2009年样本（每年各60个样本，共240个)进行PCA分析，通过计算特征值、特征向量及累计贡献率，获得少数几个主成分，使它们尽可能完整地保留原始变量的信息，且彼此间不相关，以达到简化数据的目的。
2 结果与讨论
2.1 EESI-MS质谱条件优化:
莲子生物碱具有较为相似的性质，本实验选择甲基莲心碱m/z 625作为目标信号物质，对电离电压、离子传输管和样品进样速率等EESI-MS质谱条件进行优化。
2.1.1 离子源电压的优化:
离子源电压是直接影响分析物电离的重要参数。在本实验所用离子源中，带电的喷雾溶剂与样品溶剂喷雾在离子传输管空间内碰撞，样品中的目标分子被带电喷雾溶剂萃取，进行电荷传递，样品的目标分子形成带电离子在检测器中被检测，因此离子源电压对样品中的目标分子电离的效率有直接影响，对质谱信号的强弱起关键作用。本实验考察了不同离子源电压对m/z 625信号强度的影响，结果如图2所示，电压为3.5 kV时，m/z 625信号强度较高；电压低于3.5 kV时，因为带电初级离子数目较少，难以使生物碱电离；而电压大于3.5 kV时，m/z 625信号有所下降，原因可能是喷雾电压加大了对其他杂质的电离，使目标分析物m/z 625的信号受到干扰，因此本实验选择3.5 kV的作为离子源电压。
2.1.2 离子传输管温度的优化:
离子传输管温度是质谱仪正常工作的一个重要参数。优化实验结果表明（图3），当离子传输管温度小于250 ℃时，m/z 625信号强度随着温度的上升而增加，说明在250 ℃以下，温度升高不仅可去除小液滴中的溶剂，还有利于样品中目标分子加快运动速率，获得更多的电离电荷，因而信号强度升高；在大于250 ℃时，m/z 625信号强度下降，可能是因为温度升高导致生物碱变性，或者是因为反应环境的温度较高，生物碱在溶剂喷雾碰撞过程中挥发并扩散到外界环境中，造成目标信号的下降。故实验采用的离子传输管温度为250 ℃。
2.1.3 样品进样速率的优化:
本实验样品在高压气流（N2）作用下形成喷雾，在一定的喷雾压力以及电离电压下，样品进样速率直接决定进样量，是影响目标质谱信号高低的重要因素。本实验考察了在电喷雾喷雾溶剂流速一定的条件下（5 μL/min），样品进样速率对目标信号的影响（图4）。结果表明，样品的最佳速率为5 μL/min；速率较低时，目标信号物质进入质谱口的量相应减少，使信号强度降低；而进样速率大于5 μL/min时，可能是因为氮气压力一定的情况下，样品溶液不易雾化而影响电离效果，m/z 625信号强度出现了一定的下降。因此样品进样速率为5 μL/min。
经过优化，确定本实验质谱和离子源的条件为：离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250 ℃，样品进样速率为5 μL/min。其他参数设置为默认值。
2.2 莲子醇提物EESI-MS离子流图:
在优化的实验条件下获得莲子醇提物的EESI-MS谱图（图5），TIC为总离子色谱图，m/z 611、625、282、314、296是总离子流中的选择离子。由图5可知，选择的离子流与总离子流图的走势一致，离子的丰度随着进样的出现而明显增强，说明样品中存在该质量分数的物质。通过文献比对，选择的5种离子流的质荷比分别与质子化的莲心碱（异莲心碱）、甲基莲心碱、O-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱质荷比相同，为了确认该系列的离子是否为莲子生物碱，进一步通过串联质谱分析进行验证。
2.3 莲子醇提液的EESI-MS串联质谱分析:
利用串联质谱技术可对莲子生物碱结构进一步确认。选择m/z 611进行碰撞诱导解离（CID）实验，获得二级质谱图（图6 A），其中的m/z 593、579、503、489等离子峰是母体离子分别丢失H2O、CH3OH、CH3-C6H5O、CH3-CH2-C6H5O基团所形成的，与文献报道的莲心碱的二级质谱碎片一致，因而可以确认m/z 611是质子化的莲心碱分子的信号。另外，在二级质谱上还存在有一定丰度的m/z 192的碎片离子峰，而m/z 192是莲心碱的同分异构体异莲心碱二级质谱的特征碎片，因此莲子醇提取液中可能含有一定量的异莲心碱，但其信号强度要小于莲心碱的特征碎片强度。因而，在莲子醇提取液m/z 611的物质中，莲心碱占有较大比例。不同贮藏时间莲子样品的m/z 611二级质谱图十分相似，都含有图6 A所示的各种特征离子峰。
m/z 625离子的二级质谱（图6 B）出现了m/z 607，593，580，489，297和206等离子碎片，其中m/z 607，593，580，489主要由m/z 625分别丢失一个H2O，CH3OH，C2H5O，CH3-CH2-CH2-C6H5O形成，通过与文献比对，可以确认m/z 625为甲基莲心碱。分析谱图可以发现，甲基莲心碱m/z 625的碎片特征与莲心碱m/z 611较为相似，其原因可能是甲基莲心碱只是在莲心碱羟基位点（-OH）替换成了甲基（-CH3），两者结构较为相似，因而离子断裂方式也较为相似。
母体离子m/z 282的二级质谱图（图6 C）表明，特征碎片离子m/z 264、250分别是母体离子丢失H2O、CH3OH基团所形成的，通过与文献比对，可以推断母体离子主要为O-去甲基荷叶碱。
母体离子m/z 314的二级质谱图（图6 D）中最主要的碎片离子峰为m/z 269 (M-45)+，由母离子丢失一个H2O形成的m/z 298含量也较高；通过与文献比对，可以断定m/z 314为莲心季铵碱。
母体离子m/z 296的二级质谱图（图6 E）中有较强离子特征碎片为m/z 265、104，相似的离子断裂方式已经在荷叶中荷叶碱的检测中得到验证，因此推断m/z 296为荷叶碱。
从鉴定出的生物碱来看，莲子中生物碱种类丰富，不仅含有莲子芯中存在的莲心碱、甲基莲心碱及莲心季铵碱，还有在荷叶中较常见的荷叶碱、O-去甲基生物碱等。丰富的生物碱组成是莲子作为药用食物的一个重要的因素。
2.4 不同贮藏时间莲子生物碱组成的差异:
通过对不同贮藏时间莲子醇提取液进行EESI-MS分析发现，莲子醇提液中5种生物碱含量依次为：O-去甲基荷叶碱<莲心碱<甲基莲心碱<莲心季铵碱<荷叶碱。各种生物碱的质谱信号在不同年份样品中存在差异，表明不同陈化度莲子的生物碱含量也不同。图7分别为2009、2010、2011、2012年莲子中m/z 611、625、282、314和m/z 296 5种离子峰的信号强度趋势图，从2.3可知，这5种离子的信号强度在一定程度上表示莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、O-去甲基荷叶碱和荷叶碱的含量。从图7可知，莲心碱和甲基莲心碱在储藏过程中信号强度变化较小，可能是由于莲心碱与甲基莲心碱分子量较大，在结构上容易形成环状的疏水区域，具有较强的抗氧化活性，在储藏过程变化较小。莲心季铵碱的信号强度随储藏时间延长而呈下降趋势，可能是由于储藏中发生了氧化水解等作用。各个年份莲子样品中荷叶碱信号强度差异较大，且呈现不规则变化。O -去甲基荷叶碱的信号强度变化很小。
2.5 不同贮藏时间莲子醇提物EESI-MS谱图的PCA分析:
将2012、2011、2010和2009年4个年份的莲子共40个样本（每个年份10个样品）在正离子模式下所获得的EESI-MS指纹谱图信息，导入Matlab中进行PCA数据处理与分析，分别得到三维的PCA得分结果，获得区分不同贮藏时间莲子。主成分1（PC1）占总方差贡献率的95.1%，主成分2（PC2）占1.86%，主成分3（PC3）占1.06%，其累计方差贡献率是98%（图8）。其中，PC1贡献率的95.1%描述了数据集合中最大变量的方向，沿着PC1的方向，不同贮藏时间的莲子之间具有很好的区分效果。因此，不同贮藏时间莲子的醇提物中物质差异显著，能够被明显区分在PCA三维空间的不同区域。
3 总结
本文在优化条件下对莲子醇提液进行了EESI-MS分析。研究结果表明，采用EESI-MSn可在未经样品预处理的前提下，直接对莲子醇提液进行分析。分析结果表明，通芯莲子中含有莲心碱、甲基莲心碱、O-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱等生物碱；不同贮藏时间的莲子生物碱信号强度变化趋势表明，莲心碱、甲基莲心碱含量较为稳定，而荷叶碱的含量变化较大；PCA分析不同贮藏时间莲子醇提液的EESI-MS谱图表明，莲子在贮藏过程中醇提液部分物质发生显著变化，不同年份的莲子能够被明显区分在PCA三维空间的不同的区域。本文首次采用EESI-MSn对通芯莲子样品中的生物碱进行多级串联质谱鉴定，快速、准确、且无需复杂的样品预处理，不仅可用于复杂基体样品中生物碱的快速鉴定，结合化学计量学还可对不同陈化度的莲子样品进行有效区分。
实施例2
莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法，包括如下步骤：
（1）样品处理：取莲子，粉碎，过80目筛，称取莲子粉末各0.01g，加入1.5 mL离心管中，加入1mL 80%乙醇溶液，超声提取10 min，4000 r/min离心5min，将提取上清液作为样品待测；
（2）标准品的制备：分别称取5 mg干燥至恒重的莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、O-去甲基荷叶碱对照品，用80 % 甲醇溶解，分别配制成浓度为1.00 mg/mL对照品储备溶液。将各对照品储备溶液混合成混标上样，浓度分别为0.03，0.06，0.12，0.24，0.48，1.00 mg/mL，现配现用；
（3）对标准品和待测样品分别进样检测；
（4）电喷雾萃取电离质谱EESI-MS检测时：LTQ-MS工作在正离子检测模式，质谱扫描范围均为m/z 50~1000；电离电压为3.0 kV；毛细管温度均为250 ℃；ESI溶剂均为甲醇；雾化气为氮气（纯度99.999%），压力为1.2MPa；EESI溶剂无水甲醇和样品溶液流速分别为3μL/min和5 μL/min；两个毛细管喷雾口距离a=1 mm，夹角为60°，到质谱进样口的距离为5mm，角度为150°，在进行串联质谱分析时，母离子的隔离窗口宽度选为1.5 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为17％~25％，其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化；
在测定时，质谱和离子源的条件为：离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250℃，样品进样速率为5 μL/min，其他参数设置为默认值；
（5）选择离子流m/z 611、625、282、314、296分别对应莲心碱、甲基莲心碱、O-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱，与总离子流图的走势一致，离子的丰度随着进样的出现而明显增强，说明样品中存在该质量分数的生物碱；
（6）根据标准品生物碱浓度为横坐标，信号强度为纵坐标绘制标准曲线。根据样品中信号强度计算出样品中相应生物碱的浓度。本方法对莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、O-去甲基荷叶碱的检出限分别为：3.5 × 10－7，1. 2 × 10－6，1.6 × 10－7，6.3× 10－7，5.6 × 10－7 mg/mL。
Claims (2)
1.莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）样品处理：取莲子，粉碎，过80目筛，称取莲子粉末各0.01g，加入1.5 mL离心管中，加入1mL 80%乙醇溶液，超声提取10 min，4000 r/min离心5min，将提取上清液作为样品待测；
（2）标准品的制备：分别称取5 mg干燥至恒重的莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、O-去甲基荷叶碱对照品，用80 % 甲醇溶解，分别配制成浓度为1.00 mg/mL对照品储备溶液；将各对照品储备溶液混合成混标上样，浓度分别为0.03，0.06，0.12，0.24，0.48，1.00mg/mL，现配现用；
（3）对标准品和待测样品分别进样检测；
（4）电喷雾萃取电离质谱EESI-MS检测时：LTQ-MS工作在正离子检测模式，质谱扫描范围均为m/z 50~1000；电离电压为3.0 kV；毛细管温度均为250 ℃；ESI溶剂均为甲醇；雾化气为纯度99.999%氮气，压力为1.2MPa；EESI溶剂无水甲醇和样品溶液流速分别为3 μL/min和5 μL/min；两个毛细管喷雾口距离a=1 mm，夹角为60°，到质谱进样口的距离为5 mm，角度为150°，在进行串联质谱分析时，母离子的隔离窗口宽度选为1.5 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为17％~25％，其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化；
在测定时，质谱和离子源的条件为：离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250 ℃，样品进样速率为5 μL/min，其他参数设置为默认值；
（5）选择离子流m/z 611、625、282、314、296分别对应莲心碱、甲基莲心碱、O-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱，与总离子流图的走势一致，离子的丰度随着进样的出现而明显增强，说明样品中存在该生物碱；
（6）根据标准品生物碱浓度为横坐标，信号强度为纵坐标绘制标准曲线，根据样品中信号强度计算出样品中相应生物碱的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在电喷雾萃取电离质谱EESI-MS测定时，质谱和离子源的条件为：离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250 ℃，样品进样速率为5 μL/min。
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