TW201625943A - 基因轉殖蛋白的定量分析技術 - Google Patents

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Abstract

本發明有關使用質譜法，定量多元分析從植物而來之複合蛋白樣本之方法。在一些具體例中，揭示內容有關，例如，藉由分析基因轉殖植物品種之世代，選擇性以及靈敏性的定量多元轉基因蛋白，來維持基因轉殖植物品種之方法。

Description

基因轉殖蛋白的定量分析技術 發明領域
本發明有關基因轉殖蛋白的定量分析技術。
發明背景
使用重組DNA技術，來生產商業以及產業用途之基因轉殖植物與日俱增，因此需要發展出可分析基因轉殖植物品系之高通量方法。性狀探索研究、產品開發、種子生產以及商業化，均需要此分析方法，且其可幫助快速的開發具所欲或最適表型之基因轉殖植物。再者，目前針對提供給人類消費者之基因改質(GM)植物之安全性管理之指導原則，要求特徵化親本以及轉形作物間，至DNA以及蛋白之程度。新的植物品種之發展，包含越來越複雜的基因修飾，尤其是包括堆疊基因以及性狀。
目前在此技藝中偏好用於分析基因轉殖植物之方法，包括DNA為主的技術(例如PCR和/或RT-PCR)；使用報告基因；南方墨點法以及免疫化學法。此等所有的方法，遇到各式各樣的缺點。
雖然之前已揭示過質譜分析法，但此既存的方法 受限於無選擇性以及靈敏性的定量。仍存在有，具選擇性以及靈敏性的定量植物中，轉基因表達產物之高通量方法。
發明概要
本發明有關使用質譜法，定量多元分析從植物而來之複合蛋白樣本之方法。在一些具體例中，揭示內容有關，例如，藉由分析基因轉殖植物品種之世代，選擇性以及靈敏性的定量多元轉基因蛋白，來維持基因轉殖植物品種之方法。
在一態樣方面，所提供的是一種定量植物為主的樣本中，一或多種具已知胺基酸序列之標的蛋白之高通量方法。該方法包含：(a)從植物為主的樣本中提取出蛋白；(b)消化從步驟(a)提取的蛋白，獲得胜肽；(c)在單一步驟中分開該胜肽；(d)測定從該具已知胺基酸序列之感興趣蛋白而來之複數個標簽胜肽；(e)使用高解析度精確質譜法(HRAM MS)，測量該複數個標簽胜肽；以及(f)根據該標簽胜肽之測量值，定量該具已知胺基酸序列之蛋白。
在一具體例中，該胜肽係於單一步驟中，經由管柱色層分析法分開。在另外的具體例中，該管柱色層分析法包含液相管柱色層分析法。在另一具體例中，在單一步 驟中，獲得對應於該感興趣蛋白之胜肽的質譜數據。
在一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含二種感興趣蛋白。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含三至二十種感興趣蛋白。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含三至十種感興趣蛋白。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含四種感興趣蛋白。
在一具體例中，該植物為主的樣本，來自基因轉殖植物。在另外的具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含該基因轉殖植物中，預期的轉基因表達產物。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含5'-烯醇丙酮醯-3'-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(2mEPSPS)。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少一種擇自於由序列辨識編號：2-25所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少二種擇自於由序列辨識編號：2-25所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少三種擇自於由序列辨識編號：2-25所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含由序列辨識編號：3、12以及21。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，由序列辨識編號：3、12以及21構成。
在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶(AAD)。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶-12 (AAD-12)。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含至少一種擇自於由序列辨識編號：27-45所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含至少二種擇自於由序列辨識編號：27-45所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含至少三種擇自於由序列辨識編號：27-45所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含序列辨識編號：28、29以及34。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽由序列辨識編號：28、29以及34構成。
在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含雙丙胺膦(bialaphos)抗性(bar)基因產物或草丁膦N-乙醯轉移酶(phosphinothricin N-acetyltransferase)(PAT)酵素。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含草丁膦乙醯轉移酶(PAT)。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少一種擇自於由序列辨識編號：47-60所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少二種擇自於由序列辨識編號：47-60所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少三種擇自於由序列辨識編號：47-60所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含序列辨識編號：49、55以及56。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽由序列辨識編號：49、55以及56構成。
在一具體例中，測量該複數個標簽胜肽，包含計算對應的波峰高度或波峰面積。在另一具體例中，測量該 複數個標簽胜肽，包含比較從高碎裂模式以及低碎裂模式而來之數據。
在另一態樣方面，所提供的是一種用於定量植物為主之樣本中，一或多種具已知胺基酸序列之感興趣蛋白之高通量系統。該系統包含：(a)一高通量工具，用於從植物為主的樣本中，提取出蛋白；(b)一分開模組，用於在單一步驟中分開胜肽；(c)一選擇模組，用於從具已知胺基酸序列之感興趣蛋白中，選擇出複數個標簽胜肽；以及(d)一高解析度精確質譜法(HRAM MS)，用於測量該複數個標簽胜肽。
在一具體例中，該分開模組包含管柱色層分析法。在另一具體例中，該管柱色層分析法包含液相管柱色層分析法。在另一具體例中，該高解析度精確質譜法(HRAM MS)包含串聯質譜儀。在另一具體例中，該高解析度精確質譜法(HRAM MS)不含串聯質譜儀。
在一具體例中，該植物為主的樣本，來自基因轉殖植物。在另外的具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含該基因轉殖植物中，預期的轉基因表達產物。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含5'-烯醇丙酮醯-3'-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(2mEPSPS)。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至 少一種擇自於由序列辨識編號：2-25所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少二種擇自於由序列辨識編號：2-25所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少三種擇自於由序列辨識編號：2-25所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含序列辨識編號：3、12以及21。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽由序列辨識編號：3、12以及21構成。
在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶(AAD)。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶-12(AAD-12)。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少一種擇自於由序列辨識編號：27-45所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少二種擇自於由序列辨識編號：27-45所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽，包含至少三種擇自於由序列辨識編號：27-45所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含序列辨識編號：28、29以及34。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽由序列辨識編號：28、29以及34構成。
在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含雙丙胺膦抗性(bar)基因產物或草丁膦N-乙醯轉移酶(PAT)酵素。在另一具體例中，該一或多種感興趣蛋白，包含草丁膦乙醯轉移酶(PAT)。在另一具體例中，該複數個標簽 胜肽包含至少一種擇自於由序列辨識編號：47-60所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含至少二種擇自於由序列辨識編號：47-60所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含至少三種擇自於由序列辨識編號：47-60所構成之群組之序列。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽包含序列辨識編號：49、55以及56。在另一具體例中，該複數個標簽胜肽由序列辨識編號：49、55以及56構成。
在另一態樣方面，所提供的是一種定量植物為主的樣本中，一或多種具已知胺基酸序列之感興趣蛋白之高通量方法。該方法包含使用在此所提供之系統。
圖1顯示在此所揭示之方法以及系統之代表性分析法之工作流程。
圖2顯示從HRAM LC-MS之標準色譜圖500ng/mL合成胜肽而來之另一代表性數據：總離子流(上面算起第一排)；合併的提取的離子(上面算起第二排)；提取的離子367.2082m/z-EISGTVK(2+)(上面算起第三排或中間排)；提取的離子367.1850m/z-DVASWR(2+)(下面算起第二排)以及提取的離子484.7798m/z-VNGIGGLPGGK(2+)(下面算起第一排)。所有離子之提取窗為2.0ppm。
圖3顯示從HRAM LC-MS之胰蛋白酶消化的基因轉殖大豆樣本色譜圖而來之代表性數據：總離子流(上面算起第一排)；合併的提取的離子(上面算起第二排)；提取 的離子367.2082m/z-EISGTVK(2+)(上面算起第三排或中間排)；提取的離子367.1850m/z-DVASWR(2+)(下面算起第二排)；以及提取的離子484.7798m/z-VNGIGGLPGGK(2+)(下面算起第一排)。所有離子之提取窗是2.0ppm。
圖4顯示供定量用之堆疊HRAM LC-MS標準品(上排)以及基因轉殖(下排)提取的離子色譜圖之具胜肽注釋的代表性數據。所有離子之提取窗是2.0ppm。
圖5顯示另一從HRAM LC-MS之標準色譜圖500ng/mL合成胜肽而來之代表性數據：總離子流(上面算起第一排)；合併的提取的離子(上面算起第二排)；提取的離子346.6889m/z-FGAIER(2+)(上面算起第三排或中間排)；提取的離子621.8563m/z-IGGGDIVAISNVK(2+)(下面算起第二排)；以及提取的離子598.2831m/z-AAYDALDEATR(2+)(下面算起第一排)。所有離子之提取窗是2.0ppm。
圖6顯示從HRAM LC-MS之胰蛋白酶消化的基因轉殖大豆樣本之色譜圖而來之代表性數據：總離子流(上面算起第一排)；合併的提取的離子(上面算起第二排)；提取的離子346.6889m/z-FGAIER(2+)(上面算起第三排或中間排)；提取的離子621.8563m/z-IGGGDIVAISNVK(2+)(下面算起第二排)；以及提取的離子598.2831m/z-AAYDALDEATR(2+)(下面算起第一排)。所有離子之提取窗是2.0ppm。
圖7顯示供定量用之堆疊HRAM LC-MS標準品 (上排)以及基因轉殖(下排)提取的離子色譜圖之具胜肽注釋的代表性數據。所有離子之提取窗是2.0ppm。
圖8顯示另一從HRAM LC-MS之標準色譜圖500ng/mL合成胜肽而來之代表性數據：總離子流(上面算起第一排)；合併的提取的離子(上面算起第二排)；提取的離子928.9367m/z-TEPQTPQEWIDDLER(2+)(上面算起第三排或中間排)；提取的離子761.9330m/z-SVVAVIGLPNDPSVR(2+)(下面算起第二排)；以及提取的離子565.8013m/z-LHEALGYTAR(2+)(下面算起第一排)。所有離子之提取窗是2.0ppm。
圖9顯示從HRAM LC-MS之胰蛋白酶消化的基因轉殖大豆樣本之色譜圖而來之代表性數據：總離子流(上面算起第一排)；合併的提取的離子(上面算起第二排)；提取的離子928.9367m/z-TEPQTPQEWIDDLER(2+)(上面算起第三排或中間排)；提取的離子761.9330m/z-SVVAVIGLPNDPSVR(2+)(下面算起第二排)；以及提取的離子565.8013m/z-LHEALGYTAR(2+)(下面算起第一排)。所有離子之提取窗是2.0ppm。
圖10顯示供定量用之堆疊HRAM LC-MS標準品(上排)以及基因轉殖(下排)提取的離子色譜圖之具胜肽注釋的代表性數據。所有離子之提取窗是2.0ppm。
較佳實施例之詳細說明
本發明係根據，從前趨蛋白選擇而來之標簽胜 肽，在用特殊的儀器之多元分析期間，可產生靈敏性的定量之發現。在一具體例中，明確地說明一種液相色層分析法結合高解析度精確質譜(LC-HRAM MS)之方法，用於檢測5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(2mEPSPS)之蛋白表達位準。在此揭示之方法以及系統，能夠分析2mEPSPS本身，或結合植物提取物中之額外的蛋白，用於多元分析法之定量分析。在另一具體例中，明確地述明一種液相色層分析法結合高解析度精確質譜(LC-HRAM MS)之方法，用於檢測芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶-12(AAD-12)之蛋白表達位準。在此揭示之方法以系統，能夠分析AAD-12本身，或結合植物提取物中之額外的蛋白，用於多元分析法之定量分析。在又另一具體例中，明確地述明一種液相色層分析法結合高解析度精確質譜(LC-HRAM MS)之方法，用於檢測草丁膦乙醯轉移酶(PAT)之蛋白表達位準。在此所揭示之方法以及系統，能夠分析PAT本身，或結合植物提取物中之額外的蛋白，用於多元分析法之定量分析。
由於藉由共表達或"堆疊"基因轉殖蛋白，來達到對多種除草劑產生耐受性，或提供多種對昆蟲抗性之作用模式之數量越來越多，所以具有能夠選擇性地檢測多種基因轉殖感興趣蛋白之靈敏的多元分析法，是很重要的。目前，所有與基因轉殖蛋白表達之檢測有關之技術，主要仰賴傳統的免疫化學技術，其面臨適應每個樣本生成所需之數據量的挑戰。
用於定量研究之質譜檢測法，典型地係使用選擇 反應監測(SRM)進行。使用特定類型之儀器，一開始依質量選擇在來源中形成之感興趣離子，接著，在質譜儀(MS)之碰撞區中解離此前趨(蛋白)離子，之後質量選擇，以及計數特定產物(胜肽)離子。在一些具體例中，每單位時間之計數量，可提供可積分的波峰面積，從其中可決定分析物之數量以及濃度。在一些具體例中，使用高解析度精確質量(HRAM)監測，在具HRAM能力之質譜儀上進行定量的可包括，但不限於，混合四極桿-飛行時間、四極桿-軌道阱、離子阱-軌道阱或四極桿-離子阱-軌道阱(混合三種的)質譜儀。使用特殊類型之儀器，胜肽不必經過破碎條件之處理，而是使用全掃描或標靶掃描模式(例如，選擇離子監測模式或SIM)，以完整的胜肽形式測量。可藉由產生各特定分析物之提取的離子的色譜圖，測定可積分的波峰面積，以及計算分析物之數量或濃度。高解析以及精確質量特性數據，使針對感興趣分析物(蛋白和/或胜肽)之高度專一的以及靈敏的離子訊號成為可能。
除非有特別述及，否則在此申請案中，包括說明書以及申請專利範圍，所使用之下列術語，具有以下所給的定義。需注意，在此說明書以及所附之申請專利範圍中所使用之單數形式"一"、"一個"、"一種"以及"該"，包括複數個所指物，除非內容清楚地表示其它形式。
在此使用之術語"生物限制"，意指基因修飾植物或其等之基因物質，遷移至指定位置之限制。該術語包括物理、生化、生物限制，以及其它防止基因修飾植物在自 然環境中或人工生長環境中生存、擴散或重製之限制。
在此使用之術語"複合蛋白樣本"，係用於與純化的蛋白樣本作區別。複合蛋白樣本含有多種蛋白，且可額外地含其它污染物。
在此使用之通用術語"質譜法"或"MS"，意指任一種適合的質譜方法、設備或配置，包括，如電灑離子化(ESI)、基質輔助雷射脫附/離子化(MALDI)MS、MALDI-飛行時間(TOF)MS、大氣壓力(AP)MALDI MS、真空MALDI MS或其等之組合。質譜設備可藉由測量分子通過一組磁電場的飛行路徑，測量分子之分子量(分子之質荷比的函數)。質荷比是一物理量，其廣泛地用於帶電粒子之電動力學。熟悉此技藝之人士，透過推理，可計算出特定胜肽之質荷比。二個具不同質荷比之粒子，當經過相同電磁場之處理時，在真空中不會在相同路徑上移動。
質譜儀由三個模組構成：離子源，其將樣本分子裂解成離子；質量分析器，其藉由施予電磁場，依其等之質量將離子分類；以及檢測器，其測量示量器之值，然後提供用於計算各存在的離子之豐度的數據。該技術具定性以及定量二者之應用。此等包括識別未知的化合物、測定分子中元素之同位素組成、藉由觀察化合物之碎片測定其結構以及定量樣本中化合物之數量。
質譜法以及設備之詳細的綜述，可在下列參考文獻中找到，其等在此併入本案以為參考：Can and Annan(1997)Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry.In：Current Protocols in Molecular Biology,edited by Ausubel,et al.New York：Wiley,p.10.21.1-10.21.27；Paterson and Aebersold(1995)Electrophoresis 16：1791-1814；Patterson(1998)Protein identification and characterization by mass spectrometry.In：Current Protocols in Molecular Biology,edited by Ausubel,et al.New York：Wiley,p.10.22.1-10.22.24；以及Domon and Aebersold(2006)Science 312(5771)：212-17。
當在相同樣本中存在二或多種感興趣蛋白/或胜肽時，則在此使用之術語蛋白和/或胜肽是"複合的"。
在此所使用之"植物性狀"，意指植物之任何單獨的特徵或可定量的測量值。
在此使用之詞語"胜肽"，意指以指定的順序連接α-胺基酸所形成之短聚合物。胜肽亦可由蛋白酶消化多肽，例如，蛋白，而產生。
在此使用之詞語"蛋白"，意指由呈直鏈排列，且藉由在羧基與鄰近胺基酸殘基之胺基基團之間，以肽鍵連接之胺基酸，製成之有機化合物。蛋白質中胺基酸之序列，是由基因碼中編碼的基因之序列所界定。一般而言，基因碼確認20種標準胺基酸，然而在某些有機物中，該基因碼可包括硒半光胺酸-以及在某些古生物中-吡咯離胺酸。蛋白中觀察到之殘基，常常是經後轉譯修飾之化學修飾過的，其可發生在於細胞中使用該蛋白之前，或為控制機制之一部分。熟悉此技藝人士，亦可依照其熟悉之技術，設計修 飾蛋白殘基。在此使用之術語"蛋白"，涵蓋直鏈胺基酸，包含天然發生之胺基酸、合成胺基酸、經修飾的胺基酸或以上任一或全部之組合。
在此使用之術語"單一注射"，意指MS或LC-MS設備操作中之起始步驟。當以單一注射之方式，將蛋白樣本引進設備中時，則整個樣本在單一步驟中被引進。
在此使用之詞語"標簽胜肽"，意指特定蛋白之標識(短胜肽)序列。任一種蛋白可含有平均10與100個之間之標簽胜肽。典型地，標簽胜肽具有至少一個下列條件：易於利用質譜法檢測、可預測地以及安定地從液相色層分析(LC)管柱中洗提出、可利用逆相高效液相色層分析法(RP-HPLC)富集、良好的離子化、良好的碎裂，或其等之組合。易於用質譜法定量之胜肽，典型地具有至少一個下列條件：容易合成、能夠高度純化(>97%)、可溶於≦20%之乙腈、低非特專一性鍵結、氧化抗性、後合成修飾抗性以及疏水性或疏水指數≧10以及≦40。疏水指數可依照Krokhin,Molecular and Cellular Proteomics 3(2004)908之方法計算，其在此併入本案以為參考。已知，具有疏水指數低於10或大於40之胜肽，無法用RP-HPLC管柱重複解析或洗提。
在此使用之術語"堆疊"，意指在植物基因組中，併有多種異源多核苷酸。
串聯質譜法：在串聯質譜法方面，使由感興趣分子產生之母離子，在質譜儀器中過濾，之後將該母離子碎 成成一或多個子離子，其等之後在第二質譜法程序中作分析(檢測和/或定量)。在一些具體例中，排除使用串聯質譜法。在此等具體例中，在所提供之方法以及系統中，不使用串聯質譜法。因此，在此等具體例中，沒有母離子，亦沒有子離子產生。
在此使用之術語"基因轉殖植物"，包括在其基因組中包含異源多核苷酸之植物。概略而言，異源多核苷酸是安定地整合於基因組中，如此該多核苷酸可被傳遞至繼代中。異源多核苷酸可單獨，或以重組表達盒之一部分形式，整合至基因組中。在此使用之"基因轉殖"，包括任一種基因型已因存在異源核酸而改變之細胞、細胞株、癒傷組織、組織、植物部分或植物，包括該等一開始即被如此改變之基因轉殖植物，以及該等從起始基因轉殖植物經過有性繁殖或無性繁殖製造之基因轉殖植物。
在本發明之實務中，可處理任何可提供有用的植物部分之植物。例子包括，可提供花、果實、蔬菜以及榖粒之植物。
在此使用之詞語"植物"，包括雙子葉植物以及單子葉植物。雙子葉植物之例子包括煙草、阿拉伯芥、大豆、蕃茄、木瓜、加拿大油菜、向日葵、棉花、苜蓿、馬鈴薯、葡萄樹、樹豆、豌豆、芸苔屬植物、鹰嘴豆、甜菜根、油菜籽、西瓜、香瓜、胡椒、花生、南瓜、白蘿蔔、菠菜、西胡蘆、青花菜、苷藍、紅蘿蔔、白花椰菜、芹菜、大白菜、小黃瓜、茄子以及萵苣。單子葉植物之例子包括玉米、 稻米、小麥、甘蔗、大麥、黑麥、高梁、蘭花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麥、洋葱、小米以及黑小麥。果實之例子包括香蕉、鳳梨、柳橙、葡萄、葡萄柚、西瓜、香瓜、蘋果、桃子、梨子、奇異果、芒果、油桃、芭樂、柿子、鳄梨、檸檬、無花果以及漿果。花之例子包括滿天星、康乃馨、大理花、水仙花、天竺葵、非洲菊、百合、蘭花、牡丹、野胡蘿蔔花、玫瑰、金魚草，或其它切花或觀賞花卉、盆栽以及花卉種球。
容許在質譜法之方法中，辨識從複合樣本而來之單一蛋白之專一性是唯一的，因為為了識別該感興趣蛋白，僅需要該感興趣蛋白之序列。與其它多元格式相比，質譜法獨特之處在於，能夠利用整段蛋白的初級胺基酸序列，標靶蛋白的初級胺基酸序列之唯一識別型部分，無形中排除了非專一性的檢測。在本發明之一些具體例中，使用可唯一地識別感興趣蛋白之蛋白水解片段或蛋白水解片段組，來檢測複合蛋白樣本中之感興趣蛋白。
在一些具體例中，所揭示之方法使能夠利用單一質譜分析法，定量或測定複合蛋白樣本中，多種蛋白之比率，與個別地分次測量每一個感興趣蛋白，然後集結該個別的結果成一個樣本結果之方法截然不同。
在一些具體例中，本揭示內容亦提供可用於發展以及使用基因轉殖植物技術之方法。明確而言，所揭示之方法，可用於維持基因轉殖植物經過連續繼代後的基因型。且，在此揭露之方法中之一些具體例，可用於提供高 通量的分析處於有被從附近的植物而來之轉基因污染之風險下(例如，交叉授粉)之非基因轉植植物。藉由此等具體例，可幫助和/或完成轉基因之生物限制。在其它具體例中，在此揭示之方法，可用於以高通量之方式，篩選植物轉形過程之結果，辨識可展現所欲表達特徵之轉形體。
使用本發明之方法，可分析任一種經由基因轉殖表達技術而被引進植物之蛋白。適合本發明之多元分析法之蛋白，可提供輸出性狀，其使得該基因轉殖植物優於其非基因轉殖的配對物。可提供之所欲的性狀之非限制例子，包括除草劑抗性、對昆蟲之抗性、對疾病之抗性、對環境壓力之抗性、提高產率、改善營養價值、改善貨架時間、改變油含量、改變油組成、改變糖含量、改變澱粉含量、生產植物為主的藥品、生產工業產品(例如，聚羥基鏈烷酸酯：巨分子聚酯，其被視為可用於取代石油衍生的塑膠之理想物)以及潛在的生物藥劑。此外，使用本揭示方法，可分析單一植物物種內，一或多種基因轉殖蛋白之表達。添加或修飾二或多種基因或所欲的性狀於單一的感興趣物種中，稱為基因堆疊。再者，在目前揭示之多元分析法中，可同時分析一或多種基因轉殖蛋白以及一或多種內源性植物蛋白之表達。
可在基因轉殖植物中表達之特別適合的蛋白，是該等可提供對除草劑具耐受性者，例如下列之基因：可提供對草甘膦(glyphosate)除草劑產生耐受性之5'-烯醇丙酮醯-3'-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)或其變異體、可提供對2,4-D 除草劑產生耐受性之芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶(AAD)、可提供對草銨膦(glufosinate)除草劑產生耐受性之草丁膦乙醯轉移酶(PAT)，或其等之組合。
質荷比可使用四極桿分析器測定。例如，在"四極桿"或"四極桿離子阱"儀器方面，在振盪射頻場中之離子，經歷一與在電極之間所施予之直流電位、該射頻訊號之振幅以及m/z成比例之力量。可選定電壓以及振幅，使僅具有特別的m/z之離子，可運行四極桿的全長，而所有其它的離子會偏移。因此，四極桿儀器可作為射入該儀器之離子的"質量過濾器"以及"質量檢測器"。
碰撞誘導解離("CID")常用於產生供進一步檢測之子離子。在CID方面，母離子透過與諸如氬之惰性氣體之碰撞獲得能量，之後經由稱作"單分子分解"之過程產生碎裂。在母離子上必須放足夠的能量，如此離子內之某些鏈才可因增加的能量而斷裂。
質譜儀典型地可提供使用者離子掃描；即，在給定範圍內(例如，10至1200amu)各m/z之相對豐度。可將分析物分析之結果，即，質譜，與用許多業界已知之方法測定原始樣本中之分析物所得之數量產生關連。例如，假設小心地控制採樣以及分析參數，則可將給定離子之相對豐度，與將相對豐度轉換成原始分子之絕對數量之表作比較。選擇性地，可使分子標準品(如，內標準以及外標準)與樣本一起進行，然後依照從該等標準品產生之離子，建構標準曲線。使用此一標準曲線，可將給定離子之相對豐 度，轉換成原始分子之絕對數量。許多其它用於將離子之出現或數量，與原始分子之出現或數量產生關連之方法，係熟悉此技藝之人士熟知的。
離子化方法之選擇，可根據欲進行測量之分析物、樣本類型、檢測器類型、正與負模式之選擇等等作決定。離子可使用各式各樣的方法產生，包括，但不限於，電子離子化、化學離子化、快速原子撞擊、場致脫附，以及基質輔助雷射脫附離子化(MALDI)、表面增強雷射脫射離子化(SELDI)、脫附電灑離子化(DESI)、光子離子化、電灑離子化以及感應耦合式電漿。電灑離子化，意指一種其中溶液沿著毛細管之短的長度，通到被施與高正或負電位之終端的方法。到達管子終端之溶液，於溶劑蒸氣中被蒸發(噴灑)成非常小的溶液液滴之噴射或噴霧。此液滴霧流過加熱至防止冷凝以及使溶劑蒸發之蒸氣室。隨著液滴變得更小，電表面電荷密度增加，直到相同的電荷之間自然的排斥，導致離子以及中性分子被釋出。
可將LC之流出物，直接以及自動(即，"聯機")注射進入電灑裝置中。在一些具體例中，LC之流出物中所含之蛋白，先被電灑離子化成母離子。
各種不同的質量分析器，可用於液相色層分析-質譜法之結合(LC-MS)。例示性質量分析器包括，但不限於，單一四極桿、三級式四極桿、離子阱、TOF(飛行時間)以及四極桿-飛行時間(Q-TOF)。
四極桿質量分析器由4個環形桿構成，彼此平行 安裝。在四極桿質譜儀(QMS)中，該四極桿是負責依照離子之質荷比(m/z)，過濾樣本離子之儀器的組件。離子在四極桿中，依照其等於施與該桿之振盪電場中之軌跡的安定性而被分開。
離子阱是電與磁場之組合，其會捕捉在真空系統或管之區域中之離子。離子阱可用在質譜法中，同時操控離子之量子態。
飛行時間質譜法(TOFMS)是一種質譜法之方法，其中離子的質荷比，係經由時間測量值決定。用已知強度之電場，加速離子。此加速產生具有與任一其它具有相同電荷之離子相同的動能之離子。該離子之速度，取決於質荷比。測量粒子之後到達已知距離之檢測器所需的時間。此時間將取決於粒子之質荷比(較重的粒子到達之速度較慢)。從此時間以及已知的實驗參數，吾人可找出離子之質荷比。
在一些具體例中，所提供之方法和/或系統使用之特殊的儀器，可包含高碎裂模式以及低碎裂模式(或選擇性地非碎裂模式)。此等不同的模式，可包括改變掃描高以及低能擷取方法，產生高解析度質量數據。在一些具體例中，高解析度質量數據可包含一產物數據組(例如，在高碎裂模式下，從產物離子(碎片離子)衍生而得之數據)，以及前趨數據組(例如，在低碎裂或無碎裂模式下，從前趨物離子(未碎裂離子)衍生而得之數據)。
在一些具體例中，所提供之方法和/或系統使用 一質譜儀，其包含一可用於選擇步驟之過濾裝置、一可用於碎裂驟之碎裂裝置和/或一或多種質量分析器，其可用於擷取和/或質譜製造步驟。
該過濾裝置和/或質量分析器，可包含四極桿。該選擇步驟和/或擷取步驟和/或質譜製造步驟，可涉及使用分辨四極桿(resolving quadrupole)。額外或選擇性地，該過濾裝置可包含二維或三維離子阱或飛行時間(ToF)質量分析器。該(等)質量分析器，可包含或另外包含一或多種飛行時間質量分析器和/或離子回旋振盪質量分析器和/或軌道阱質量分析器和/或二維或三維離子阱。
用根據質荷比(m/z)進行選擇之方法進行之過濾，可使用可依照m/z選擇離子之質量分析器達到，例如，四極桿；或傳送廣範圍m/z，根據其等之m/z分開離子，然後利用其等之m/z值，選擇感興趣離子。後者的例子可為飛行時間質量分析器結合定時離子選擇器。所提供之方法和/或系統，可包含使用色層分析技術，例如液相色層分析法(LV)，從，例如，二或多種複數個蛋白中，分離和/或分開一或多種感興趣蛋白。該方法可另外包含，測量感興趣蛋白之洗提時間和/或比較所測量之洗提時間與預期的洗提時間。
額外或選擇性地，可使用離子遷移技術(其可使用離子遷移電池進行)來分開感興趣蛋白。額外地，可利用離子遷移之順序或時間，選擇感興趣蛋白。該方法可另外包含測量感興趣蛋白之飄移時間和/或比較所測得的飄移 時間與預期的飄移時間。
在一些具體例中，所提供之方法和/或系統是非標定法(label-free)，在此可藉由比較注射以及送過樣本(across sample)s之間，感興趣前趨物或產物之m/z值之波峰強度或質譜波峰下之面積，達到定量。在一些具體例中，內標準正規化可用於計算任何已知相關的分析誤差。另一非標定的定量方法，譜圖計數，涉及加總碎片離子光譜之數目，或以非冗餘模式或冗餘模式掃描各給定胜肽。之後總合各蛋白之相關的胜肽質譜，提供各蛋白之掃描數的測量值，此與其豐度成比例。之後進行樣本/注射之間之比較。
在一些具體例中，離子源是擇自於由下列所構成之群組：(1)電灑離子化("ESI")離子源；(2)大氣壓光離子化("APPI")離子源；(3)大氣壓化學離子化("APCI")離子源；(4)基質輔助雷射脫附離子化("MALDI")離子源；(5)雷射脫附離子化("LDI")離子源；(6)大氣壓離子化("API")離子源；(7)矽晶片上的脫附離子化("DIOS")離子源；(8)電衝擊("El")離子源；(9)化學離子化("CI")離子源；(10)場致離子化("Fl")離子源；(11)場致脫附("FD")離子源；(12)感應耦合電漿("ICP")離子源；(13)快速原子撞擊("FAB")離子源；(14)液相二次離子質譜法("LSIMS")離子源；(15)脫附電灑離子化("DESI")離子源；(16)鎳-63放射性的離子源；(17)大氣壓基質輔助雷射脫附離子化離子源；以及(18)熱灑離子源。
在一些具體例中，所提供之方法和/或系統，包含一裝置和/或控制系統，其配置成可執行電腦程式元件， 該元件包含電腦可讀取的程式碼工具，用於使處理器執行程式，以便實行該方法。
在一些具體例中，所提供之方法和/或系統，使用交替低與高能掃描功能，結合液相色層分析法，分開植物之提取物。可提供之感興趣蛋白的資訊之列表，包含，但不限於，前趨離子之m/z、產物離子之m/z、停留時間、離子遷移飄移時間以及遷移改變之速率。在LC之分開過程以及標的離子洗提進入質譜儀期間(不是檢測低能前趨離子，就是檢測高能產物離子，或開啟停留時間窗)，所提供之方法和/或系統之質量分析器，可選擇窄m/z範圍(寬度可多樣易變)使離子通至氣體室(gas cell)。據此，可顯著地提高用於定量感興趣蛋白之訊號雜訊比。
在一些具體例中，在當標定的感興趣蛋白將要被洗提進入質譜儀之離子源時之色譜停留時間處，所提供之方法和/或系統之質量分析器，可根據標靶的前趨離子，選擇窄的m/z範圍(寬度可多樣易變)。此等選定的離子，之後轉移至能夠藉由交替以及重覆在高碎裂模式(樣本前趨離子實質上被碎裂成產物離子)以及低碎裂模式(或非碎裂模式；樣本前趨離子實質上沒有被碎裂)之間轉換之手段，使離子解離之儀器階段。典型地，在二個模式下均需要高解析度精確的質譜，且在實驗最後，藉由色譜洗提時間以及任擇地其它物化特性擬合緊密的程度，辨識相關的前趨以及產物離子。與標定感興趣蛋白相關之前趨離子或產物離子之訊號強度，可用於測定植物提取物中蛋白的數量。
該等熟悉此技藝之人士應了解，根據所提供之揭示內容，存在某些變化。因此，下列範例係提供用於例示說明本發明之目的，而不應被解釋成本發明或申請專利範圍之範疇之限制。
範例 範例1
用分析緩衝液PBST結合二硫蘇糖醇(DTT)，提取的植物樣本(例如，榖粒、葉、根、飼料、花粉)。序列辨識編號：1，提供5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(2mEPSPS)之蛋白序列：
使提取的蛋白變性，之後加入胰蛋白酶，在37℃下15-20個小時，使蛋白分解消化。之後，用蟻酸(pH=1-2)酸化該消化反應，然後使用LC-MS分析。在電腦中分析以及消化2mEPSPS之蛋白序列，產生欲利用LC-MS檢測以及測量之理論胜肽片段。胰蛋白酶消化後之5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(2mEPSPS)之候選標簽胜肽，列在表1中。
令人驚訝地，相較於從酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)或其它定量方法得到之結果，使用LC-MS定量之三個候選標簽胜肽提供良好的相關性。此等三個標簽胜肽是EISGTVK(序列辨識編號：3)、DVASWR(序列辨識編號： 21)以及VNGIGGLPGGK(序列辨識編號：12)。此等序列之市售合成的胜肽以及微生物衍生而得之2mEPSPS蛋白二者，均作為分析參考標準品，其等經歷與以上所述相同的消化過程，在此合成胜肽可直接作為蛋白定量之分析參考標準。
從HRAM LC-MS之標準色譜圖500ng/mL合成胜肽而來之代表性數據，示於圖2中，在此比較總離子流(上面算來第一排)；合併的提取的離子(上面算來第二排)；提取的離子367.2082m/z-EISGTVK(2+)(上面算來第三排或中間排)；提取的離子367.1850m/z-DVASWR(2+)(下面算來第二排)；以及提取的離子484.7798m/z-VNGIGGLPGGK(2+)(下面算來第一排)，可辨識各標簽胜肽之標簽波峰。所有離子之提取窗為2.0ppm。
從HRAM LC-MS之胰蛋白酶消化的基因轉殖大豆樣本色譜圖而來之另一代表性數據，示於圖3中，在此比較總離子流(上面算來第一排)；合併的提取的離子(上面算來第二排)；提取的離子367.2082m/z-EISGTVK(2+)(上面算來第三排或中間排)；提取的離子367.1850m/z-DVASWR(2+)(下面算來第二排)；以及提取的離子484.7798m/z-VNGIGGLPGGK(2+)(下面算來第一排)，亦可辨識各標簽胜肽之標簽波峰。所有離子之提取窗為2.0ppm。
計算各標簽胜肽之標簽波峰之波峰面積，以及將供定量用之堆疊HRAM LC-MS標準品(上排)以及基因轉殖 (下排)提取的離子色譜圖之具胜肽注釋的代表性數據，示於表4中。所有離子之提取窗為2.0ppm。
範例2
用分析緩衝液PBST結合二硫蘇糖醇(DTT)，提取的植物樣本(例如，榖粒、葉、根、飼料、花粉)。使提取的蛋白變性，之後加入胰蛋白酶，在37℃下15-20個小時，使蛋白分解消化。之後，用蟻酸(pH=1-2)酸化該消化反應，然後使用LC-MS分析。序列辨識編號：26提供AAD-12蛋白序列：
在電腦中，分析以及消化AAD-12之蛋白序列，產生欲利用LC-MS檢測以及測量之理論胜肽片段。胰蛋白酶消化後之AAD-12的候選標簽胜肽，列在表2中。
令人驚訝地，相較於從酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)或其定量方法獲得之結果，使用LC-MS定量之三個候選標簽胜肽提供良好的相關性。此等三個標簽胜肽是FGAIER(序列辨識編號：28)、IGGGDIVAISNVK(序列辨識編號：29)以及AAYDALDEATR(序列辨識編號：34)。此等序列之市售合成的胜肽以及微生物衍生而得的AAD-12蛋白二者，均用作為分析參考標準品，其等經歷與以上所述相同的消化過程序，在此合成的胜肽可直接作為蛋白定量之分析參考標準。
從HRAM LC-MS之標準色譜圖500ng/mL合成胜肽而來之代表性數據，顯示圖5中，在此比較總離子流(上面算起第一排)；合併的提取的離子(上面排起第二排)；提取的離子346.6889m/z-FGAIER(2+)(上面算起第三排或中間排)；提取的離子621.8563m/z-IGGGDIVAISNVK(2+)(下面算起第二排)；以及提取的離子598.2831m/z- AAYDALDEATR(2+)(下面算起第一排)。所有離子之提取窗是2.0ppm。
從HRAM LC-MS之胰蛋白酶消化的基因轉殖大豆樣本色譜圖而來之另一代表性數據，示於圖6中，在此比較總離子流(從上面算起第一排)；合併的提取的離子(從上面算起第二排)；提取的離子346.6889m/z-FGAIER(2+)(從上面算起第三排或中間排)；提取的離子621.8563m/z-IGGGDIVAISNVK(2+)(從下面算起第二排)；以及提取的離子598.2831m/z-AAYDALDEATR(2+)(從下面算起第一排)，亦可辨識各標簽胜肽之標簽波峰。所有離子之提取窗為2.0ppm。
計算各標簽胜肽之標簽波峰之波峰面積，且將供定量用之堆疊HRAM LC-MS標準品(上排)以及基因轉殖(下排)提取的離子色譜圖之具胜肽注釋的代表性數據，示於圖7中。所有離子之提取窗為2.0ppm。
範例3
用分析緩衝液PBST結合二硫蘇糖醇(DTT)，提取的植物樣本(例如，榖粒、葉、根、飼料、花粉)。使提取的蛋白變性，之後加入胰蛋白酶，在37℃下15-20個小時，使蛋白分解消化。之後，用蟻酸(pH=1-2)酸化該消化反應，然後使用LC-MS分析。序列辨識編號：46提供草丁膦乙醯轉移酶(PAT)之蛋白序列：
在電腦中分析以及消化PAT之蛋白序列，產生欲利用LC-MS檢測以及測量之理論胜肽片段。胰蛋白酶消化後之草丁膦乙醯轉移酶(PAT)之候選標簽胜肽，列在表3中。
令人驚訝地，相較於從酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)或其它定量方法得到之結果，使用LC-MS定量之三個候選標簽胜肽提供良好的相關性。此等三個標簽胜肽是TEPQTPQEWIDDLER(序列辨識編號：49)、SVVAVIGLPNDPSVR(序列辨識編號：55)以及LHEALGYTAR(序列辨識編號：56)。此等序列之市售合成的胜肽以及微生物衍生而得之PAT蛋白二者，均作為分析參考標準品，其等經歷與以上所述相同的消化過程，在此合成胜肽可直接作為蛋白定量之分析參考標準。
從HRAM LC-MS之標準色譜圖500ng/mL合成胜肽而來之代表性數據，示於圖8中，在此比較總離子流(上面算來第一排)；合併的提取的離子(上面算來第二排)；提取的離子928.9367m/z-TEPQTPQEWIDDLER(2+)(上面 算來第三排或中間排)；提取的離子761.9330m/z-SVVAVIGLPNDPSVR(2+)(下面算來第二排)；以及提取的離子565.8013m/z-LHEALGYTAR(2+)(下面算來第一排)，可辨識各標簽胜肽之標簽波峰。所有離子之提取窗為2.0ppm。
從HRAM LC-MS之胰蛋白酶消化的基因轉殖大豆樣本色譜圖而來之另一代表性數據，示於圖9中，在此比較總離子流(上面算來第一排)；合併的提取的離子(上面算來第二排)；提取的離子928.9367m/z-TEPQTPQEWIDDLER(2+)(上面算來第三排或中間排)；提取的離子761.9330m/z-SVVAVIGLPNDPSVR(2+)(下面算來第二排)；以及提取的離子565.8013m/z-LHEALGYTAR(2+)(下面算來第一排)，亦可辨識各標簽胜肽之標簽波峰。所有離子之提取窗為2.0ppm。
計算各標簽胜肽之標簽波峰之波峰面積，且將供定量用之堆疊HRAM LC-MS標準品(上排)以及基因轉殖(下排)提取的離子色譜圖之具胜肽注釋的代表性數據，示於圖10中。所有離子之提取窗為2.0ppm。
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<130> 75620
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 445
<212> PRT
<213> 阿拉伯芥
<400> 1
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 2
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 3
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 4
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 6
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 7
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 8
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<220>
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<220>
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<213> 人工合成序列
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<223> 候選標簽胜肽
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<213> 人工合成序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 代爾夫特食酸菌(Delftia acidovorans)
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<212> PRT
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<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<220>
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<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<213> 人工合成序列
<220>
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<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 42
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 45
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<211> 183
<212> PRT
<213> 綠色產色鏈黴菌
<400> 46
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 51
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 52
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
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<223> 候選標簽胜肽
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 59
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 候選標簽胜肽
<400> 60

Claims (30)

  1. 一種定量在一以植物為主之樣本中之一或多種具已知胺基酸序列之感興趣蛋白之高通量方法，該方法包含：(a)從一以植物為主的樣本中提取出蛋白；(b)消化從步驟(a)中提取之蛋白，以獲得胜肽；(c)在單一步驟中分開該等胜肽；(d)測定來自該具已知胺基酸序列之感興趣蛋白之複數個標簽胜肽；(e)使用高解析度精確質譜儀(HRAM MS)來測量該複數個標簽胜肽；以及(f)根據該等標簽胜肽之測量值來定量該具已知胺基酸序列之感興趣蛋白。
  2. 如請求項1之方法，其中該等胜肽係於單一步驟中，經由管柱色層分析儀分開。
  3. 如請求項2之方法，其中該管柱色層分析儀包含液相管柱色層分析儀。
  4. 如請求項1之方法，其中在單一步驟中，獲得有關對應於該感興趣蛋白之胜肽的質譜數據。
  5. 如請求項1之方法，其中該一或多種感興趣蛋白，包含二種感興趣蛋白。
  6. 如請求項1之方法，其中該一或多種感興趣蛋白，包含四種感興趣蛋白。
  7. 如請求項1之方法，其中該以植物為主的樣本係來自一 基因轉殖植物。
  8. 如請求項7之方法，其中該一或多種感興趣蛋白包含該基因轉殖植物中預期的轉基因表達產物。
  9. 如請求項1之方法，其中該一或多種感興趣蛋白包含5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(2mEPSPS)、芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶-12(AAD-12)和/或草丁膦乙醯轉移酶(phosphinothricin acetyltransferase,PAT)。
  10. 如請求項1之方法，其中該複數個標簽胜肽包含至少一個擇自於由序列辨識編號：2-25、27-45以及47-60所構成之群組之序列。
  11. 如請求項1之方法，其中該複數個標簽胜肽包含至少二個擇自於由序列辨識編號：2-25、27-45以及47-60所構成之群組之序列。
  12. 如請求項1之方法，其中該複數個標簽胜肽包含至少三個擇自於由序列辨識編號：2-25、27-45以及47-60所構成之群組之序列。
  13. 如請求項1之方法，其中該複數個標簽胜肽包含(1)序列辨識編號：3、12以及21；(2)序列辨識編號：28、29以及34；和/或(3)序列辨識編號：49、55以及56。
  14. 如請求項1之方法，其中該複數個標簽胜肽由(1)序列辨識編號：3、12以及21；(2)序列辨識編號：28、29以及34；和/或(3)序列辨識編號：49、55以及56所構成。
  15. 如請求項1之方法，其中測量該複數個標簽胜肽包含計算對應的波峰高度或波峰面積。
  16. 如請求項1之方法，該中測量該複數個標簽胜肽包含比較來自高碎裂模式以及低碎裂模式之數據。
  17. 一種用於定量在一以植物為主的樣本中之一或多種具已知胺基酸序列之感興趣蛋白之高通量系統，該系統包含：(a)一高通量工具，用於從一以植物為主的樣本中提取出蛋白；(b)一分開模組，用於在單一步驟中分開胜肽；(c)一選擇模組，用於從該具已知胺基酸序列之感興趣蛋白中選擇出複數個標簽胜肽；以及(d)一高解析度精確質譜儀(HRAM MS)，用於測量該複數個標簽胜肽。
  18. 如請求項17之系統，其中該分開模組包含管柱色層分析儀。
  19. 如請求項18之系統，其中該管柱色層分析儀包含液相管柱色層分析儀。
  20. 如請求項17之系統，其中該高解析度精確質譜儀(HRAM MS)包含串聯質譜儀。
  21. 如請求項17之系統，其中該高解析度精確質譜儀(HRAM MS)不含串聯質譜儀。
  22. 如請求項17之系統，其中該以植物為主的樣本係來自一基因轉殖植物。
  23. 如請求項22之系統，其中該一或多種感興趣蛋白包含該基因轉殖植物中預期的轉基因表達產物。
  24. 如請求項17之系統，其中該一或多種感興趣蛋白包含5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(2mEPSPS)、芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶-12(AAD-12)和/或草丁膦乙醯轉移酶(PAT)。
  25. 如請求項17之系統，其中該複數個標簽胜肽包含至少一個擇自於由序列辨識編號：2-25、27-45以及47-60所構成之群組之序列。
  26. 如請求項17之系統，其中該複數個標簽胜肽包含至少二個擇自於由序列辨識編號：2-25、27-45以及47-60所構成之群組之序列。
  27. 如請求項17之系統，其中該複數個標簽胜肽包含至少三個擇自於由序列辨識編號：2-25、27-45以及47-60所構成之群組之序列。
  28. 如請求項17之系統，其中該複數個標簽胜肽包含(1)序列辨識編號：3、12以及21；(2)序列辨識編號：28、29以及34；和/或(3)序列辨識編號：49、55以及56。
  29. 如請求項17之系統，其中該複數個標簽胜肽由(1)序列辨識編號：3、12以及21；(2)序列辨識編號：28、29以及34；和/或(3)序列辨識編號：49、55以及56所構成。
  30. 一種定量在一以植物為主的樣本中之一或多種具已知胺基酸序列之感興趣蛋白之高通量方法，其包含使用如請求項17之系統。
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