KR20170010381A

KR20170010381A - 트랜스제닉 단백질의 정량적 분석

Info

Publication number: KR20170010381A
Application number: KR1020167034997A
Authority: KR
Inventors: 트렌트 제임스 오만; 베리 더블유 섀퍼; 라이언 크리스토퍼 힐; 제프리 알 길버트; 구오민 샨
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2017-01-31
Also published as: US20150355189A1; RU2016148876A; EP3155432A1; JP2017519206A; CN106461610A; IL249395A0; MX2016016054A; WO2015191270A1; AU2015275086A1; TW201625943A; AU2015275086B2; CA2951250A1; CL2016003146A1; BR112016028496A2; US20170115305A1

Abstract

본 발명은 질량 분광학을 사용한, 식물로부터 복합 단백질 샘플의 정량적 다중 분석을 위한 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 개시내용은 예를 들어 트랜스제닉 식물 품종 세대를 다중화 트랜스제닉 단백질의 선택적인 및 민감한 정량에 대해 분석함으로써 트랜스제닉 식물 품종을 유지하는 방법에 관한 것이다.

Description

트랜스제닉 단백질의 정량적 분석{QUANTITATIVE ANALYSIS OF TRANSGENIC PROTEINS}

상업적인 및 산업적인 용도를 위해 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용 증가는 트랜스제닉 식물주의 고속 (high-throughput) 분석 방법의 개발을 필요로 한다. 상기 분석 방법은 형질 발견 연구, 생성물 개발, 종자 생산, 및 상업화를 위해 및 바람직한 또는 최적 표현형을 갖는 트랜스제닉 식물의 신속한 개발을 돕기 위해 필요하다. 또한, 인간 소비를 위해 제안된 GM 식물의 안전성 평가를 위한 현재의 지침은 모 작물과 형질전환된 작물 사이의 DNA 및 단백질 수준에서의 특성화를 필요로 한다. 개발되는 새로운 식물 품종은 특히 중첩된 (stacked) 유전자, 및 형질을 포함하는 점차 복잡해지는 유전적 변형으로 이루어진다.

관련 기술 분야에서 바람직한 트랜스제닉 식물의 분석을 위한 현재의 방법은 DNA-기반 기술 (예를 들어 PCR 및/또는 RT-PCR); 리포터 유전자의 사용; 서던 블로팅 (Southern blotting); 및 면역화학을 포함한다. 모든 상기 방법은 다양한 단점을 안고 있다.

질량 분광 분석이 이전에 논의된 바 있지만, 기존의 방식은 선택된 민감한 정량을 제시하지 못하여 제한된다. 따라서, 식물에서 트랜스제닉 발현 생성물의 선택된 및 민감한 고속 정량 방법에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 질량 분광학을 사용한, 식물로부터 복합 단백질 샘플의 정량적 다중 분석을 위한 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 개시내용은 예를 들어 트랜스제닉 식물 품종 세대를 다중화 (multiplexed) 트랜스제닉 단백질의 선택적이고 민감한 정량에 대해 분석함으로써 트랜스제닉 식물 품종을 유지하는 방법에 관한 것이다.

한 측면에서, 식물-기반 샘플 내의 알려진 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 관심 단백질의 고속 정량 방법이 제공된다. 이 방법은

(a) 식물-기반 샘플로부터 단백질을 추출하고;

(b) 단계 (a)로부터 추출된 단백질을 소화시켜 펩티드를 얻고;

(c) 펩티드를 단일 단계로 분리하고;

(d) 알려진 아미노산 서열을 갖는 관심 단백질로부터 복수의 시그너쳐 (signature) 펩티드를 결정하고;

(e) 고분해능 정밀 질량 분광 분석 (HRAM MS)을 사용하여 복수의 시그너쳐 펩티드를 측정하고;

(f) 시그너쳐 펩티드의 측정을 기초로 하여 알려진 아미노산 서열을 갖는 관심 단백질을 정량하는 것

을 포함한다.

한 실시양태에서, 펩티드는 컬럼 크로마토그래피에 의해 단일 단계로 분리된다. 추가의 실시양태에서, 컬럼 크로마토그래피는 액체 컬럼 크로마토그래피를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 관심 단백질에 대응하는 펩티드에 대한 질량 스펙트럼 데이타는 단일 단계로 얻는다.

한 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 2개의 관심 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 3 내지 20개의 관심 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 3 내지 10개의 관심 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 4개의 관심 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, 식물-기반 샘플은 트랜스제닉 식물로부터 유래된다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 트랜스제닉 식물에서 예상된 트랜스진 발현 생성물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 5'-에놀피루빌-3'-포스포쉬키메이트 합성효소 (EPSPS)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (2mEPSPS)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호 (SEQ ID NO): 2-25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 2-25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 2-25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 3, 12, 및 21을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 3, 12, 및 21로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제-12 (AAD-12)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 27-45로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 27-45로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 27-45로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 28, 29, 및 34를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 28, 29, 및 34로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 비알라포스 내성 (bar) 유전자 산물 또는 포스피노트리신 N-아세틸트랜스퍼라제 (PAT) 효소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 49, 55, 및 56을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 49, 55, 및 56으로 이루어진다.

한 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드의 측정은 대응하는 피크 높이 또는 피크 면적을 계산하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드의 측정은 고 단편화 방식 및 저 단편화 방식으로부터의 데이타를 비교하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 식물-기반 샘플 내의 알려진 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 관심 단백질을 정량하기 위한 고속 시스템이 제공된다. 이 시스템은 다음을 포함한다:

(a) 식물-기반 샘플로부터 단백질을 추출하기 위한 고속 수단;

(b) 펩티드를 단일 단계로 분리하기 위한 분리 모듈;

(c) 알려진 아미노산 서열을 갖는 관심 단백질로부터 복수의 시그너쳐 펩티드를 선택하기 위한 선택 모듈; 및

(d) 복수의 시그너쳐 펩티드를 측정하기 위한 고분해능 정밀 질량 분광 분석기 (HRAM MS).

한 실시양태에서, 분리 모듈은 컬럼 크로마토그래피를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 컬럼 크로마토그래피는 액체 컬럼 크로마토그래피를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 고분해능 정밀 질량 분광 분석기 (HRAM MS)는 탠덤 (tandem) 질량 분광계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 고분해능 정밀 질량 분광 분석기 (HRAM MS)는 탠덤 질량 분광계를 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 식물-기반 샘플은 트랜스제닉 식물로부터 유래된다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 트랜스제닉 식물에서 예상된 트랜스진 발현 생성물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 5'-에놀피루빌-3'-포스포쉬키메이트 합성효소 (EPSPS)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 관심 단백질은 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (2mEPSPS)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 2-25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 2-25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 2-25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 3, 12, 및 21을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 시그너쳐 펩티드는 서열식별번호: 3, 12, 및 21로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 식물-기반 샘플 내의 알려진 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 관심 단백질의 고속 정량 방법이 제공된다. 이 방법은 본원에서 제공되는 시스템의 이용을 포함한다.

도 1은 본원에 개시된 방법 및 시스템에 대한 대표적인 분석 작업 흐름을 보여준다.
도 2는 표준 크로마토그램 500 ng/mL 합성 펩티드에 대한 HRAM LC-MS로부터의 또 다른 대표적인 데이타를 보여준다: 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 367.2082 m/z - EISGTVK (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 367.1850 m/z - DVASWR (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 484.7798 m/z - VNGIGGLPGGK (2+) (하부로부터의 제1 패널). 추출된 윈도우 (window)는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.
도 3은 트립신 소화된 트랜스제닉 대두 샘플 크로마토그램에 대한 HRAM LC-MS로부터의 대표적인 데이타를 보여준다: 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 367.2082 m/z - EISGTVK (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 367.1850 m/z - DVASWR (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 484.7798 m/z - VNGIGGLPGGK (2+) (하부로부터의 제1 패널). 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.
도 4는 정량을 위한 펩티드 표시와 함께 중첩된 HRAM LC-MS 표준 (상부 패널) 및 트랜스제닉 (하부 패널) 추출된 이온 크로마토그램의 대표적인 데이타를 보여준다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.
도 5는 표준 크로마토그램 500 ng/mL 합성 펩티드에 대한 HRAM LC-MS로부터의 또 다른 대표적인 데이타를 보여준다: 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 346.6889 m/z - FGAIER (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 621.8563 m/z - IGGGDIVAISNVK (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 598.2831 m/z - AAYDALDEATR (2+) (하부로부터의 제1 패널). 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.
도 6은 트립신 소화된 트랜스제닉 대두 샘플 크로마토그램에 대한 HRAM LC-MS로부터의 대표적인 데이타를 보여준다: 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 346.6889 m/z - FGAIER (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 621.8563 m/z - IGGGDIVAISNVK (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 598.2831 m/z - AAYDALDEATR (2+) (하부로부터의 제1 패널). 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.
도 7은 정량을 위한 펩티드 표시와 함께 중첩된 HRAM LC-MS 표준 (상부 패널) 및 트랜스제닉 (하부 패널) 추출된 이온 크로마토그램의 대표적인 데이타를 보여준다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다
도 8은 표준 크로마토그램 500 ng/mL 합성 펩티드에 대한 HRAM LC-MS로부터의 또 다른 대표적인 데이타를 보여준다: 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 928.9367 m/z - TEPQTPQEWIDDLER (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 761.9330 m/z - SVVAVIGLPNDPSVR (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 565.8013 m/z - LHEALGYTAR (2+) (하부로부터의 제1 패널). 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.
도 9는 트립신 소화된 트랜스제닉 대두 샘플 크로마토그램에 대한 HRAM LC-MS로부터의 대표적인 데이타를 보여준다: 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 928.9367 m/z - TEPQTPQEWIDDLER (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 761.9330 m/z - SVVAVIGLPNDPSVR (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 565.8013 m/z - LHEALGYTAR (2+) (하부로부터의 제1 패널). 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.
도 10은 정량을 위한 펩티드 표시와 함께 중첩된 HRAM LC-MS 표준 (상부 패널) 및 트랜스제닉 (하부 패널) 추출된 이온 크로마토그램의 대표적인 데이타를 보여준다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 전구체 단백질로부터 선택된 시그너쳐 펩티드가 특정 기구를 사용한 다중 분석 동안 민감한 정량을 제시할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 구체적으로, 한 실시양태에서, 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (2mEPSPS)의 단백질 발현 수준을 검출하기 위해 액체 크로마토그래피가 고분해능 정밀 질량 분광 분석 (LC-HRAM MS) 방법과 결합된다. 본원에 개시된 방법 및 시스템은 2mEPSPS 단독을 분석하거나 또는 식물 추출물에서 정량적 분석을 위한 다중화 검정을 위해 추가의 단백질과 조합될 수 있다. 구체적으로, 또 다른 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제-12 (AAD-12)의 단백질 발현 수준을 검출하기 위해 액체 크로마토그래피가 고분해능 정밀 질량 분광 분석 (LC-HRAM MS) 방법과 결합된다. 본원에 개시된 방법 및 시스템은 AAD-12 단독을 분석하거나 또는 식물 추출물에서 정량적 분석을 위한 다중화 검정을 위해 추가의 단백질과 조합될 수 있다. 구체적으로, 또 다른 실시양태에서, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT)의 단백질 발현 수준을 검출하기 위해 액체 크로마토그래피가 고분해능 정밀 질량 분광 분석 (LC-HRAM MS) 방법과 결합된다. 본원에 개시된 방법 및 시스템은 PAT 단독을 분석하거나 또는 식물 추출물에서 정량적 분석을 위한 다중화 검정을 위해 추가의 단백질과 조합될 수 있다.

다수의 제초제에 대한 내성을 달성하거나 곤충 저항성을 위한 다중 작용 방식을 제공하기 위해 동시 발현되거나 "중첩되는" 트랜스제닉 단백질의 수의 증가 때문에 다수의 트랜스제닉 관심 단백질을 선택적으로 검출할 수 있는 민감한 다중 검정을 갖는 것은 중요하다. 현재, 트랜스제닉 단백질 발현 검출을 위한 모든 관련 기술은 샘플마다 생성될 필요가 있는 데이타의 부피를 수용해야 하는 과제를 제시하는 전통적인 면역화학 기술에 크게 의존한다.

정량 연구를 위한 질량 분광 분석 검출은 대개 선택된 반응 모니터링 (SRM)을 사용하여 달성된다. 특정 종류의 기기를 사용하여, 공급원에 형성된 관심 이온의 초기 집단-선택, 이어서 질량 분광계 (MS)의 충돌 영역 내에서 상기 전구체 (단백질) 이온의 해리, 특정 생성물 (펩티드) 이온의 집단-선택, 및 계수가 수행된다. 일부 실시양태에서, 단위 시간당 총수는 그로부터 분석물의 양 또는 농도가 결정될 수 있는 적분가능한 피크 면적을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, HRAM 실시가능 질량 분광계에서 수행된, 정량을 위한 고분해능 정밀 질량 (HRAM) 모니터링의 사용은 비제한적으로, 혼성 4중극자 비행시간 (hybrid quadrupole-time-of-flight), 4중극자-오비트랩 (quadrupole-orbitrap), 이온 트랩-오비트랩, 또는 4중극자-이온 트랩-오비트랩 (트리브리드 (tribrid)) 질량 분광계를 포함할 수 있다. 특정 종류의 기기를 사용하여, 펩티드는 단편화 조건에 적용되지 않고, 전체 스캔 또는 표적화 스캔 방식 (예를 들어 선택적인 이온 모니터링 방식 또는 SIM)을 사용하여 무손상 펩티드로서 측정된다. 적분가능한 피크 면적은 각각의 특정 분석물에 대해 추출된 이온 크로마토그램을 생성함으로써 결정될 수 있고, 분석물의 양 또는 농도가 계산될 수 있다. 데이타의 고분해능 및 정밀한 질량 특성 때문에, 관심 분석물 (단백질 및/또는 펩티드)에 대한 고 특이적이고 민감한 이온 신호를 얻을 수 있다.

달리 언급되지 않으면, 명세서 및 청구범위를 비롯하여 본원에서 사용되는 다음 용어는 아래에 제시된 정의를 갖는다. 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 ("a," "an," 및 "the")는 문맥이 달리 분명하게 나타내지 않으면 복수 지시대상을 포함함에 유의하여야 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물제한 (bioconfinement)"은 유전적으로 변형된 식물 또는 그의 유전적 물질의 지정된 영역으로의 이동의 제한을 의미한다. 이 용어는 물리적, 물리화학적, 생물학적 제한뿐만 아니라, 자연 환경 또는 인공 성장 조건에서 유전적으로 변형된 식물의 생존, 전파 또는 번식을 억제하는 다른 형태의 제한을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "복합 단백질 샘플"은 샘플을 정제된 단백질 샘플과 구별하기 위해 사용된다. 복합 단백질 샘플은 다수의 단백질을 함유하고, 추가로 다른 오염물질을 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 일반 용어 "질량 분광 분석" 또는 "MS"는 예를 들어, 전기분무 이온화 (ESI), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI) MS, MALDI-비행시간 (TOF) MS, 대기압 (AP) MALDI MS, 진공 MALDI MS, 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 적합한 질량 분광 분석 방법, 장치 또는 구성을 의미한다. 질량 분광 분석 장치는 자기장 및 전기장의 세트를 통한 분자의 비행 경로를 측정함으로써 분자의 분자 질량을 (분자의 질량 대 전하 비의 함수로서) 측정한다. 질량 대 전하 비는 하전된 입자의 전기역학에서 널리 사용되는 물리적 양이다. 특정 펩티드의 질량 대 전하 비는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 선험적으로 계산될 수 있다. 상이한 질량 대 전하 비를 갖는 2개의 입자는 동일한 전기장 및 자기장에 적용될 때 진공 내에서 동일한 경로로 이동하지 않을 것이다.

질량 분광 분석 계기는 다음 3개의 모듈로 이루어진다: 샘플 분자를 이온으로 분열시키는 이온 공급원; 전자기장 인가시에 이온을 그 질량에 의해 분류하는 질량 분석기; 및 인디케이터의 양을 측정하고 따라서 존재하는 각각의 이온의 풍부도 (abundance)를 계산하기 위한 데이타를 제공하는 검출기. 기술은 정성적 및 정량적 분석 둘 모두에 적용될 수 있다. 이들은 미지의 화합물의 동정, 분자 내의 요소의 동위원소 조성의 결정, 화합물의 단편화를 관찰함으로써 그의 구조 결정, 및 샘플 내의 화합물의 양 정량을 포함한다.

질량 분광 분석 방법 및 장비에 대한 상세한 개요는 본원에 참고로 포함된 다음 참고문헌에서 볼 수 있다: [Can and Annan (1997) Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.21.1-10.21.27]; [Paterson and Aebersold (1995) Electrophoresis 16: 1791-1814]; [Patterson (1998) Protein identification and characterization by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.22.1-10.22.24]; 및 [Domon and Aebersold (2006) Science 312(5771):212-17].

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 단백질 및/또는 펩티드는 2 이상의 관심 단백질 및/또는 펩티드가 동일한 샘플에 존재할 때 "다중화"된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "식물 형질"은 식물의 임의의 단일 특징 또는 정량가능한 치수를 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "펩티드" 또는 펩티드"는 α-아미노산을 규정된 순서로 연결함으로써 형성되는 짧은 중합체를 의미할 수 있다. 펩티드는 또한 프로테아제에 의한 폴리펩티드, 예를 들어 단백질의 소화에 의해 생성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "단백질" 또는 단백질들"은 선형 사슬로 배열되고 인접 아미노산 잔기의 카르복실기와 아미노기 사이의 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어진 유기 화합물을 의미할 수 있다. 단백질 내의 아미노산의 서열은 유전자 코드에서 코딩되는 유전자의 서열에 의해 규정된다. 일반적으로, 유전자 코드는 20개의 표준 아미노산을 특정하지만, 특정 유기체 내에서, 유전자 코드는 셀레노시스테인을, 특정 고세균에서 피롤라이신을 포함할 수 있다. 단백질 내의 잔기는 종종 번역후 변형에 의해 화학적으로 변형되는 것으로 관찰되고, 이것은 단백질이 세포에서 사용되기 전에, 또는 제어 기전의 일부로서 발생할 수 있다. 단백질 잔기는 또한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 익숙한 기술에 따라 설계에 의해 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 천연 생성 아미노산, 합성 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 상기한 것의 임의의 것 또는 전부의 조합을 포함하는 선형 사슬을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 주입"은 MS 또는 LC-MS 장치 작동의 초기 단계를 의미한다. 단백질 샘플이 장치 내로 단일 주입에 의해 도입될 때, 전체 샘플은 단일 단계로 도입된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "시그너쳐 펩티드"는 특정 단백질의 식별자 (identifier) (짧은 펩티드) 서열을 의미한다. 임의의 단백질은 평균 10 내지 100개의 시그너쳐 펩티드를 함유할 수 있다. 전형적으로, 시그너쳐 펩티드는 적어도 하나의 다음 기준을 갖는다: 질량 분광학에 의해 쉽게 검출됨, 액체 크로마토그래피 (LC) 컬럼으로부터 예측가능하고 안정적으로 용리됨, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 풍부화됨, 양호한 이온화, 양호한 단편화, 또는 이들의 조합. 질량 분광 분석에 의해 쉽게 정량되는 펩티드는 일반적으로 적어도 하나의 다음 기준을 갖는다: 쉽게 합성됨, 고도로 정제되는 능력 (>97%), ≤20% 아세토니트릴 내 가용성, 낮은 비-특이적 결합, 산화 저항성, 합성 후 변형 저항성, 및 소수성 또는 소수성 지수 ≥10 및 ≤40. 소수성 지수는 본원에 참고로 포함된 문헌 [Krokhin, Molecular and Cellular Proteomics 3 (2004) 908]에 따라 계산될 수 있다. 소수성 지수가 10 미만이거나 40 초과인 펩티드는 RP-HPLC 컬럼에 의해 재현가능하게 분해되거나 용리될 수 없는 것으로 알려져 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중첩된"은 식물의 게놈 내로 통합된 다수의 이종성 폴리뉴클레오티드의 존재를 의미한다.

탠덤 질량 분광 분석: 탠덤 질량 분광 분석에서, 관심 분자로부터 생성된 모 이온은 질량 분광 분석 계기에서 여과할 수 있고, 모 이온은 후속적으로 단편화되어 하나 이상의 딸 이온을 생성하고, 이것은 제2 질량 분광 분석 절차에서 분석 (검출 및/또는 정량)된다. 일부 실시양태에서, 탠덤 질량 분광 분석의 사용은 배제된다. 상기 실시양태에서, 탠덤 질량 분광 분석은 제공된 방법 및 시스템에서 사용되지 않는다. 따라서, 모 이온 및 딸 이온은 이들 실시양태에서 생성되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "트랜스제닉 식물"은 그의 게놈 내에 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물에 대한 언급을 포함한다. 일반적으로, 이종성 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 후속 세대에 전달되도록 게놈 내에 안정적으로 통합된다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 재조합 발현 카세트의 일부로서 게놈 내에 통합될 수 있다. "트랜스제닉"은 본원에서 초기에 변경된 트랜스제닉 식물뿐만 아니라 초기 트랜스제닉 식물로부터 유성 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것을 비롯하여 그의 유전자형이 이종성 핵산의 존재에 의해 변경된 임의의 세포, 세포주, 캘러스 (callus), 조직, 식물 부분 또는 식물을 포함하도록 사용된다.

유용한 식물 부분을 제공하는 임의의 식물은 본 발명의 실행시에 처리될 수 있다. 그 예는 꽃, 열매, 채소, 및 알곡을 제공하는 식물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "식물"은 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물을 포함한다. 쌍자엽 식물의 예는 담배, 애기장대, 대두, 토마토, 파파야, 카놀라, 해바라기, 목화, 알팔파, 감자, 포도덩굴, 열대 콩과 관목 (pigeon pea), 완두콩, 브라시카(Brassica), 병아리콩, 사탕무, 평지씨, 수박, 멜론, 후추, 땅콩, 호박, 무, 시금치, 애호박, 브로콜리, 양배추, 당근, 꽃양배추, 셀러리, 배추, 오이, 가지, 및 상추를 포함한다. 단자엽 식물의 예는 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장, 및 라이밀을 포함한다. 열매의 예는 바나나, 파인애플, 오렌지, 포도, 그레이프프루트, 수박, 멜론, 사과, 복숭아, 배, 키위, 망고, 승도복숭아, 구아바, 감, 아보카도, 레몬, 무화과, 및 베리를 포함한다. 꽃의 예는 아지랑이꽃, 카네이션, 달리아, 수선화, 제라늄, 솜나물, 백합, 난초, 모란, 야생 당근, 장미, 금어초, 또는 다른 절화 또는 장식용 꽃, 화분에 심은 꽃, 및 꽃 구근을 포함한다.

복합 샘플로부터 단일 단백질을 확인하기 위한 질량 분광 분석 방법에서 허용되는 특이성은 관심 단백질을 확인하기 위해 관심 단백질의 서열만이 필요하다는 점에서 특유한 것이다. 다른 다중화 방식에 비해, 질량 분광 분석은 비-특이적 검출을 실질적으로 제거하기 위해 단백질의 1차 아미노산 서열의 전체 길이를 단백질의 1차 아미노산 서열의 특유한 식별자-타입 부분을 표적화하기 위해 이용할 수 있다는 점에서 특유한 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 관심 단백질(들)을 특유하게 확인하는 단백질 분해 단편 또는 단백질 분해 단편의 세트는 복합 단백질 샘플 내의 관심 단백질(들)을 검출하기 위해 사용된다.

일부 실시양태에서, 개시된 방법을 통해, 각각의 관심 단백질을 개별적으로 다수회 측정하고 개별적인 결과를 하나의 샘플 결과로 편집하는 것과 달리, 단일 질량 분광 분석에 의해 복합 단백질 샘플 내의 다수의 단백질의 정량 또는 다수의 단백질의 비의 결정이 가능하다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 트랜스제닉 식물 기술의 개발 및 사용에 유용한 방법을 제공한다. 구체적으로, 개시된 방법은 후속 세대를 통해 트랜스제닉 식물의 유전자형을 유지하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태는 예를 들어 타가 수분에 의해 이웃 식물로부터의 트랜스진으로 오염될 위험이 있는 비-트랜스제닉 식물에 대한 고속 분석을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이들 실시양태에 의해, 트랜스진의 생물제한이 용이해지고/지거나 달성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 바람직한 발현 특징을 보이는 형질전환체를 확인하기 위해 고속 방식으로 식물 형질전환 절차의 결과를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

트랜스제닉 발현 기술을 통해 식물 내로 도입되는 임의의 단백질이 본 발명의 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 본 발명에 따른 다중화 분석에 적합한 단백질은 트랜스제닉 식물을 그의 비트랜스제닉 대응물보다 우수하게 만드는 품질관련 형질을 부여할 수 있다. 부여될 수 있는 바람직한 형질의 비-제한적인 예는 제초제 내성, 곤충 저항성, 질병 내성, 환경 스트레스 내성, 향상된 수율, 개선된 영양가, 개선된 저장 수명, 변경된 오일 함량, 변경된 오일 조성, 변경된 당 함량, 변경된 전분 함량, 식물-기반 제약물질의 생산, 산업 제품 (예를 들어 폴리히드록시알카노에이트: 석유-유래 플라스틱을 대체하기 위해 이상적으로 것으로 간주되는 거대분자 폴리에스테르)의 생산, 및 생물학적 정화의 잠재력을 포함한다. 또한, 단일 식물 종 내의 하나 이상의 트랜스제닉 단백질의 발현은 본 개시내용의 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 2개 이상의 유전자 또는 요구되는 형질의 관심 단일 종 내로의 부가 또는 조정은 유전자 스택킹으로 알려져 있다. 또한, 하나 이상의 트랜스제닉 단백질의 발현은 하나 이상의 내인성 식물 단백질을 사용하여 본원에서 개시되는 다중화 분석에서 동시에 분석될 수 있다.

트랜스제닉 식물에서 발현되는 특히 적합한 단백질은 제초제에 대한 내성을 부여하는 것, 예를 들어 글리포세이트 제초제에 대한 내성을 부여하기 위한 5'-에놀피루빌-3'-포스포쉬키메이트 합성효소 (EPSPS) 또는 그의 임의의 변이체의 유전자, 2,4-D 제초제에 대한 내성을 부여하기 위한 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD), 글리포시네이트 제초제에 대한 내성을 부여하기 위한 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT), 또는 이들의 조합물이다.

질량 대 전하 비는 4중극자 분석기를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, "4중극자" 또는 "4중극자 이온 트랩 (trap)" 계기에서, 발진하는 고주파 장 (field) 내의 이온은 전극 사이에 인가된 DC 전위, RF 신호의 진폭, 및 m/z에 비례하는 힘을 경험한다. 전압 및 진폭은, 모든 다른 이온은 편향되면서 특정 m/z를 갖는 이온만 4중극자의 길이를 이동하도록 선택될 수 있다. 따라서, 4중극자 계기는 계기 내로 주입되는 이온에 대한 "질량 필터" 및 "질량 검출기"로서 작용할 수 있다.

충돌-유도 해리 ("CID")는 종종 추가의 검출을 위한 딸 이온을 발생시키기 위해 사용된다. CID에서, 모 이온은 불활성 가스, 예컨대 아르곤과의 충돌을 통해 에너지를 얻고, "단분자 분해"로 언급되는 과정에 의해 후속적으로 단편화된다. 이온 내의 특정 결합이 증가된 에너지에 의해 붕괴될 수 있도록 모 이온 내에 충분한 에너지가 축적되어야 한다.

질량 분광계는 일반적으로 사용자에게 이온 스캔; 즉, 제시된 범위 (예를 들어 10 내지 1200 amu)에 걸친 각각의 m/z의 상대적인 풍부도를 제공한다. 분석물 검정, 즉 질량 스펙트럼의 결과는 관련 기술 분야에 공지된 많은 방법에 의해 본래의 샘플 내의 분석물의 양에 관련될 수 있다. 예를 들어, 샘플링 및 분석 파라미터가 유의하게 제어됨을 고려하여, 제시된 이온의 상대적인 풍부도는 상대적인 풍부도를 본래의 분자의 절대적인 양으로 전환하는 표에 비교될 수 있다. 별법으로, 분자 표준 (예를 들어, 내부 표준 및 외부 표준)은 샘플과 함께 진행되고, 표준 곡선은 상기 표준으로부터 생성된 이온을 기초로 하여 작성될 수 있다. 상기 표준 곡선을 사용하여, 제시된 이온의 상대적인 풍부도는 본래의 분자의 절대적인 양으로 전환될 수 있다. 이온의 존재 또는 양을 본래의 분자의 존재 또는 양에 관련시키는 많은 다른 방법이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

이온화 방법의 선택은 측정되는 분석물, 샘플의 종류, 검출기의 종류, 양이온 대 음이온 방식의 선택 등에 기초로 하여 결정될 수 있다. 이온은 전자 이온화, 화학적 이온화, 고속 원자 충격, 장 탈착, 및 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI), 표면 증강된 레이저 탈착 이온화 (SELDI), 탈착 전기분무 이온화 (DESI), 광자 이온화, 전기분무 이온화, 및 유도 결합 플라즈마를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 전기분무 이온화는 그의 끝부분에 높은 양 또는 음 전위가 인가되는 모세관의 짧은 길이를 따라 용액이 통과하는 방법이다. 모세관의 끝부분에 도달하는 용액은 용매 증기 중의 용액의 매우 작은 소적의 제트 (jet) 또는 스프레이 (spray)로 기화 (연무화)된다. 상기 소적의 미스트 (mist)는 응축을 방지하고 용매를 증발시키기 위해 가열되는 증발 챔버를 통해 유동한다. 소적이 보다 작아지면서, 전기 표면 전하 밀도는, 유사한 전하 사이의 자연적 척력이 이온뿐만 아니라 중성 분자가 방출되도록 유도할 때까지 증가한다.

LC의 배출액은 전기분무 장치 내로 직접 및 자동으로 (즉, "인-라인 (in-line)") 주입될 수 있다. 일부 실시양태에서, LC 배출액에 함유된 단백질은 먼저 전기분무에 의해 모 이온으로 이온화된다.

다양한 상이한 질량 분석기가 액체 크로마토그래피-질량 분광 분석 조합 (LC-MS)에 사용될 수 있다. 예시적인 질량 분석기는 단일 4중극자, 삼중 4중극자, 이온 트랩, TOF (비행시간), 및 4중극자-비행시간 (Q-TOF)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

4중극자 질량 분석기는 서로 평행하게 설정된 4개의 환상 막대로 이루어질 수 있다. 4중극자 질량 분광계 (QMS)에서, 4중극자는 질량 대 전하 비 (m/z)를 기초로 하여 샘플 이온의 여과를 책임지는 계기의 구성요소이다. 이온은 막대에 인가되는 발진하는 전기장 내의 그의 궤도의 안정성을 기초로 하여 4중극자에서 분리된다.

이온 트랩은 진공 시스템 또는 진공관의 영역 내에서 이온을 포획하는 전기장 또는 자기장의 조합체이다. 이온 트랩은 이온의 양자 상태를 조작하면서 질량 분광 분석에서 사용될 수 있다.

비행시간 질량 분광 분석 (TOFMS)은 이온의 질량 대 전하 비가 시간 측정을 통해 결정되는 질량 분광 분석의 방법이다. 이온은 공지의 강도의 전기장에 의해 가속된다. 상기 가속은 동일한 전하를 갖는 임의의 다른 이온과 동일한 운동 에너지를 갖는 이온을 유발한다. 이온의 속도는 질량 대 전하 비에 따라 결정된다. 후속적으로, 입자가 알려진 거리에서 검출기에 도달하는데 소요되는 시간이 측정된다. 이 시간은 입자의 질량 대 전하 비에 따라 결정될 것이다 (무거운 입자일수록 더 느린 속도로 도달한다). 상기 시간 및 알려진 실험 파라미터로부터, 이온의 질량 대 전하 비를 알 수 있다.

일부 실시양태에서, 제공되는 방법 및/또는 시스템에 의해 사용되는 특정 계기는 고 단편화 방식 및 저 단편화 방식 (또는 별법으로 비-단편화 방식)을 포함할 수 있다. 상기 상이한 방식은 고분해능 질량 데이타를 생성하기 위해 교대 스캔 고 및 저 에너지 획득 방법을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고분해능 질량 데이타는 생성물 데이타 세트 (예를 들어 고 단편화 방식 하에 생성물 이온 (product ion) 단편화된 이온)으로부터 유래된 데이타) 및 전구체 데이타 세트 (예를 들어 저 단편화 또는 비-단편화 방식 하에 전구체 이온 (비단편화된 이온)으로부터 유래된 데이타)를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제공된 방법 및/또는 시스템은 선택 단계에서 사용될 수 있는 여과 장치를 포함하는 질량 분광계, 단편화 단계에서 사용될 수 있는 단편화 장치, 및/또는 획득 및/또는 질량 스펙트럼 생성 단계 또는 단계들에서 사용될 수 있는 하나 이상의 질량 분석기를 사용한다.

여과 장치 및/또는 질량 분석기는 4중극자를 포함할 수 있다. 선택 단계 및/또는 획득 단계 및/또는 질량 스펙트럼 생성 단계 또는 단계들은 분해 4중극자의 사용을 수반할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 여과 장치는 2차원 또는 3차원 이온 트랩 또는 비행시간 (ToF) 질량 분석기를 포함할 수 있다. 질량 분석기 또는 질량 분석기들은 하나 이상의 비행시간 질량 분석기 및/또는 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기 및/또는 오비트랩 질량 분석기 및/또는 2차원 또는 3차원 이온 트랩을 포함할 수 있거나 추가로 포함할 수 있다.

질량 대 전하 비 (m/z)를 기초로 한 선택에 의한 여과는 m/z를 기초로 하여 이온을 선택할 수 있는 질량 분석기, 예를 들어 4중극자를 사용하여; 또는 넓은 m/z 범위를 전달하고, 그의 m/z에 따라 이온을 분리한 후, 그의 m/z 값에 의해 관심 이온을 선택함으로써 달성될 수 있다. 후자의 예는 시한 이온 선택기(timed ion selector)(들)과 조합된 비행시간 질량 분석기일 것이다. 제공된 방법 및/또는 시스템은 크로마토그래피 기술, 예를 들어 액체 크로마토그래피 (LC)를 사용하여 하나 이상의 관심 단백질을, 예를 들어 2 이상의 다수의 단백질로부터 단리 및/또는 분리하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 관심 단백질에 대한 용리 시간의 측정 및/또는 측정된 용리 시간과 예상된 용리 시간의 비교를 추가로 포함할 수 있다.

추가로 또는 별법으로, 관심 단백질은 이온 이동성 셀 (cell)을 사용하여 수행될 수 있는 이온 이동성 (mobility) 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 추가로, 관심 단백질은 이온 이동성 드리프트 (drift)의 순서 또는 시간에 의해 선택될 수 있다. 이 방법은 관심 단백질에 대한 드리프트 시간의 측정 및/또는 측정된 드리프트 시간과 예상된 드리프트 시간의 비교를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제공된 방법 및/또는 시스템은 표지 미사용 방식이고, 여기서 정량은 주입 사이 및 샘플에 걸친 피크 강도, 또는 관심 전구체 또는 생성물 m/z 값에 대한 질량 스펙트럼 피크 하 면적의 비교에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내부 표준 정규화가 임의의 알려진 관련 분석 오류를 설명하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 표지 미사용 정량 방법인 스펙트럼 계수는 비-중복 (redundant) 또는 중복 방식으로 각각의 제시된 펩티드에 대해 획득된 단편 이온 스펙트럼, 또는 스캔의 수를 집계하는 것을 수반한다. 이어서, 각각의 단백질에 대한 관련 펩티드 질량 스펙트럼의 수를 집계하여, 단백질당 스캔의 수의 측정치를 제공하고, 이것은 그의 풍부도에 비례한다. 이어서, 샘플/주입 사이에 비교가 이루어질 수 있다.

일부 실시양태에서, 이온 공급원은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: (1) 전기분무 이온화 ("ESI") 이온 공급원; (2) 대기압 광 이온화 ("APPI") 이온 공급원; (3) 대기압 화학적 이온화 ("APCI") 이온 공급원; (4) 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 ("MALDI") 이온 공급원; (5) 레이저 탈착 이온화 ("LDI") 이온 공급원; (6) 대기압 이온화 ("API") 이온 공급원; (7) 규소 상의 탈착 이온화 ("DIOS") 이온 공급원; (8) 전자 충격 ("EI") 이온 공급원; (9) 화학적 이온화 ("CI") 이온 공급원; (10) 장 이온화 ("FI") 이온 공급원; (11) 장 탈착 ("FD") 이온 공급원; (12) 유도 결합 플라즈마 ("ICP") 이온 공급원; (13) 고속 원자 충격 ("FAB") 이온 공급원; (14) 액체 2차 이온 질량 분광 분석 ("LSIMS") 이온 공급원; (15) 탈착 전기분무 이온화 ("DESI") 이온 공급원; (16) 니켈-63 방사성 이온 공급원; (17) 대기압 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 이온 공급원; 및 (18) 열분무 이온 공급원.

일부 실시양태에서, 제공된 방법 및/또는 시스템은 프로세서가 방법을 수행하기 위한 절차를 실행하도록 유도하기 위한 컴퓨터 판독가능 프로그램 코드 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램 요소를 실행하도록 배치된 장치 및/또는 제어 시스템을 포함한다.

일부 실시양태에서, 제공된 방법 및/또는 시스템은 교대하는 낮은 및 상승된 에너지 스캔 기능을 식물 추출물의 액체 크로마토그래피 분리와 조합하여 사용한다. 비제한적으로 전구체 이온의 m/z, 생성물 이온의 m/z, 체류 시간, 이온 이동성 드리프트 시간 및 이동성 변화율을 비롯한 관심 단백질에 대한 정보의 목록이 제공될 수 있다. LC 분리 과정 동안 및 표적 이온이 질량 분광계 내로 용리하면서 (및 낮은 에너지 전구체 이온, 또는 상승된 에너지 생성물 이온이 검출되거나, 또는 체류 시간 윈도우가 작동되면서), 제공된 방법 및/또는 시스템의 질량 분석기는 이온을 가스 셀로 통과시키기 위해 좁은 m/z 범위 (가변 및 변경가능한 폭의)를 선택할 수 있다. 따라서, 신호 대 노이즈 비는 관심 단백질의 정량을 위해 유의하게 증강될 수 있다.

일부 실시양태에서, 표적화된 관심 단백질이 질량 분광계 이온 공급원 내로 막 용리되는 크로마토그래피 체류 시간에서, 제공된 방법 및/또는 시스템의 질량 분석기는 표적화된 전구체 이온에 따라 좁은 m/z 범위 (가변 및 변경가능한 폭의)를 선택할 수 있다. 이어서, 상기 선택된 이온은 샘플 전구체 이온이 생성물 이온으로 실질적으로 단편화되는 고 단편화 방식과, 샘플 전구체 이온이 실질적으로 단편화되지 않는 저 단편화 방식 (또는 비-단편화 방식) 사이의 교대의 및 반복된 전환에 의해 이온을 해리할 수 있는 계기의 스테이지로 전달된다. 전형적으로, 고분해능 정밀 질량 스펙트럼이 두 방식 모두에서 획득되고, 실험 종료시에 연관된 전구체 및 생성물 이온은 그의 크로마토그래피 용리 시간의 적합 근접도 및 임의로 다른 물리화학적 특성에 의해 인지된다. 표적화된 관심 단백질과 연관된 전구체 이온 또는 생성물 이온의 신호 강도를 사용하여 식물 추출물 내의 단백질의 양을 결정할 수 있다.

관련 기술 분야의 통상의 기술자는 제공된 개시내용에 기초하여 여러 변이가 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 제공되고, 본 발명 또는 청구항의 범위에 대한 제한으로서 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1

식물 샘플 (예를 들어 알곡, 잎, 뿌리, 목초 (forage), 화분)을 디티오트레이톨 (DTT)과 조합한 검정 완충제 PBST를 사용하여 추출하였다. 서열식별번호: 1은 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (2mEPSPS)의 단백질 서열을 제공한다:

<표 1>

추출된 단백질을 변성시킨 후, 트립신 프로테아제를 첨가하고 37℃에서 15-20시간 동안 인큐베이팅함으로써 단백질 분해적으로 소화시켰다. 이어서, 소화 반응액을 포름산 (pH = 1-2)으로 산성화시키고, LC-MS를 사용하여 분석하였다. 2mEPSPS에 대한 단백질 서열을 가상 환경에서 (in silico) 분석하고 소화시켜 LC-MS에 의해 검출하고 측정할 이론적 펩티드 단편을 생성하였다. 트립신 소화 후에 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (2mEPSPS)에 대한 후보 시그너쳐 펩티드를 표 1에 나열한다.

놀랍게도, 3개의 후보 시그너쳐 펩티드는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 다른 정량 방법으로부터의 결과에 비해, LC-MS를 이용하는 정량에 대해 양호한 상관성을 제공한다. 이들 3개의 시그너쳐 펩티드는 EISGTVK (서열식별번호: 3), DVASWR (서열식별번호: 21), 및 VNGIGGLPGGK (서열식별번호: 12)이다. 이들 서열의 상업적으로 합성된 펩티드 및 미생물 유래 2mEPSPS 단백질 둘 다가 상기한 바와 동일한 소화 과정을 거쳐 분석 참조 표준물로서 사용되고, 여기서 합성 펩티드는 직접적으로 단백질 정량을 위한 분석 참조 표준물로서 역할을 할 수 있다.

표준 크로마토그램 500 ng/mL 합성 펩티드에 대한 HRAM LC-MS로부터의 대표적인 데이타를 도 2에 제시하고, 여기서 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 367.2082 m/z - EISGTVK (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 367.1850 m/z - DVASWR (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 484.7798 m/z - VNGIGGLPGGK (2+) (하부로부터의 제1 패널) 사이의 비교는 각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)을 확인할 수 있다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

트립신 소화된 트랜스제닉 대두 샘플 크로마토그램에 대한 HRAM LC-MS로부터의 또 다른 대표적인 데이타를 도 3에 제시하고, 여기서 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 367.2082 m/z - EISGTVK (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 367.1850 m/z - DVASWR (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 484.7798 m/z - VNGIGGLPGGK (2+) (하부로부터의 제1 패널) 사이의 비교는 또한 각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)을 확인할 수 있다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)의 피크 면적을 계산할 수 있고, 중첩된 HRAM LC-MS 표준 (상부 패널) 및 트랜스제닉 (하부 패널) 추출된 이온 크로마토그램의 대표적인 데이타를 펩티드 표시와 함께 정량을 위해 도 4에 제시한다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

실시예 2

식물 샘플 (예를 들어 알곡, 잎, 뿌리, 목초, 화분)을 디티오트레이톨 (DTT)과 조합한 검정 완충제 PBST를 사용하여 추출하였다. 추출된 단백질을 변성시킨 후, 트립신 프로테아제를 첨가하고 37℃에서 15-20시간 동안 인큐베이팅함으로써 단백질 분해적으로 소화시켰다. 이어서, 소화 반응액을 포름산 (pH = 1-2)으로 산성화시키고, LC-MS를 사용하여 분석하였다. 서열식별번호: 26은 AAD-12 단백질 서열을 제공한다:

<표 2>

AAD-12에 대한 단백질 서열을 가상 환경에서 분석하고 소화시켜, LC-MS에 의해 검출하고 측정할 이론적 펩티드 단편을 생성하였다. 트립신 소화 후에 AAD-12에 대한 후보 시그너쳐 펩티드를 표 2에 나열한다.

놀랍게도, 3개의 후보 시그너쳐 펩티드는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 다른 정량 방법으로부터의 결과에 비해, LC-MS를 이용하는 정량에 대해 양호한 상관성을 제공한다. 이들 3개의 시그너쳐 펩티드는 FGAIER (서열식별번호: 28), IGGGDIVAISNVK (서열식별번호: 29), 및 AAYDALDEATR (서열식별번호: 34)이다. 이들 서열의 상업적으로 합성된 펩티드 및 미생물-유래 AAD-12 단백질 둘 다가 상기한 바와 동일한 소화 과정을 거쳐 분석 참조 표준물로서 사용되고, 여기서 합성 펩티드는 직접적으로 단백질 정량을 위한 분석 참조 표준물로서 역할을 할 수 있다.

표준 크로마토그램 500 ng/mL 합성 펩티드에 대한 HRAM LC-MS로부터의 대표적인 데이타를 도 5에 제시하고, 여기서 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 346.6889 m/z - FGAIER (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 621.8563 m/z - IGGGDIVAISNVK (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 598.2831 m/z - AAYDALDEATR (2+) (하부로부터의 제1 패널) 사이의 비교는 각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)을 확인할 수 있다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

트립신 소화된 트랜스제닉 대두 샘플 크로마토그램에 대한 HRAM LC-MS로부터의 또 다른 대표적인 데이타를 도 6에 제시하고, 여기서 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 346.6889 m/z - FGAIER (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 621.8563 m/z - IGGGDIVAISNVK (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 598.2831 m/z - AAYDALDEATR (2+) (하부로부터의 제1 패널) 사이의 비교는 또한 각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)을 확인할 수 있다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)의 피크 면적을 계산할 수 있고, 중첩된 HRAM LC-MS 표준 (상부 패널) 및 트랜스제닉 (하부 패널) 추출된 이온 크로마토그램의 대표적인 데이타를 펩티드 표시와 함께 정량을 위해 도 7에 제시한다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

실시예 3

식물 샘플 (예를 들어 알곡, 잎, 뿌리, 목초, 화분)을 디티오트레이톨 (DTT)과 조합한 검정 완충제 PBST를 사용하여 추출하였다. 추출된 단백질을 변성시킨 후, 트립신 프로테아제를 첨가하고 37℃에서 15-20시간 동안 인큐베이팅함으로써 단백질 분해적으로 소화시켰다. 이어서, 소화 반응액을 포름산 (pH = 1-2)으로 산성화시키고, LC-MS를 사용하여 분석하였다. 서열식별번호: 46은 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT)의 단백질 서열을 제공한다:

PAT에 대한 단백질 서열을 가상 환경에서 분석하고 소화시켜, LC-MS에 의해 검출하고 측정할 이론적 펩티드 단편을 생성하였다. 트립신 소화 후에 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT)에 대한 후보 시그너쳐 펩티드를 표 3에 나열한다.

<표 3>

놀랍게도, 3개의 후보 시그너쳐 펩티드는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 다른 정량 방법으로부터의 결과에 비해, LC-MS를 이용하는 정량에 대해 양호한 상관성을 제공한다. 이들 3개의 시그너쳐 펩티드는 TEPQTPQEWIDDLER (서열식별번호: 49), SVVAVIGLPNDPSVR (서열식별번호: 55), 및 LHEALGYTAR (서열식별번호: 56)이다. 이들 서열의 상업적으로 합성된 펩티드 및 미생물 유래 PAT 단백질 둘 다가 상기한 바와 동일한 소화 과정을 거쳐 분석 참조 표준물로서 사용되고, 여기서 합성 펩티드는 직접적으로 단백질 정량을 위한 분석 참조 표준물로서 역할을 할 수 있다.

표준 크로마토그램 500 ng/mL 합성 펩티드에 대한 HRAM LC-MS로부터의 대표적인 데이타를 도 8에 제시하고, 여기서 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 928.9367 m/z - TEPQTPQEWIDDLER (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 761.9330 m/z - SVVAVIGLPNDPSVR (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 565.8013 m/z - LHEALGYTAR (2+) (하부로부터의 제1 패널) 사이의 비교는 각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)을 확인할 수 있다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

트립신 소화된 트랜스제닉 대두 샘플 크로마토그램에 대한 HRAM LC-MS로부터의 또 다른 대표적인 데이타를 도 9에 제시하고, 여기서 총 이온 전류 (상부로부터의 제1 패널); 조합된 추출된 이온 (상부로부터의 제2 패널); 추출된 이온 928.9367 m/z - TEPQTPQEWIDDLER (2+) (상부로부터의 제3 패널, 즉 중앙 패널); 추출된 이온 761.9330 m/z - SVVAVIGLPNDPSVR (2+) (하부로부터의 제2 패널); 및 추출된 이온 565.8013 m/z - LHEALGYTAR (2+) (하부로부터의 제1 패널) 사이의 비교는 또한 각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)을 확인할 수 있다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

각각의 시그너쳐 펩티드에 대한 시그너쳐 피크(들)의 피크 면적을 계산할 수 있고, 중첩된 HRAM LC-MS 표준 (상부 패널) 및 트랜스제닉 (하부 패널) 추출된 이온 크로마토그램의 대표적인 데이타를 펩티드 표시와 함께 정량을 위해 도 10에 제시한다. 추출된 윈도우는 모든 이온에 대해 2.0 ppm이다.

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Oman, Trent J. Hill, Ryan C. Schafer, Barry W. Gilbert, Jeffrey R. Shan, Guomin <120> QUANTITATIVE ANALYSIS OF TRANSGENIC PROTEINS <130> 75620 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 445 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser 1 5 10 15 Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu 20 25 30 Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu 35 40 45 Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly 50 55 60 Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly 65 70 75 80 Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu 85 90 95 Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val 100 105 110 Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg 115 120 125 Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu 130 135 140 Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg 145 150 155 160 Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly 165 170 175 Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu 180 185 190 Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile 195 200 205 Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys 210 215 220 Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln 225 230 235 240 Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser 245 250 255 Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr 260 265 270 Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala 275 280 285 Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser 290 295 300 Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu 305 310 315 320 Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr 325 330 335 Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp 340 345 350 Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg 355 360 365 Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr 370 375 380 Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr 385 390 395 400 Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala 405 410 415 Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe 420 425 430 Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 445 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 2 Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 3 Glu Ile Ser Gly Thr Val Lys 1 5 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 4 Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn 1 5 10 15 Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Lys Gly Ala Leu Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 5 Thr Leu Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 6 Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly Lys 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 7 Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 8 Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg 1 5 10 15 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 9 Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val 1 5 10 15 Leu Asp Gly Val Pro Arg 20 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 10 Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 11 Gln Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro 1 5 10 15 Val Arg <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 12 Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 13 Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala 1 5 10 15 Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys 20 25 30 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 14 Leu Ile Ser Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 15 Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg 1 5 <210> 16 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 16 Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr 20 25 30 Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys 35 40 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 17 Phe Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 18 Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg 1 5 10 15 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 19 Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys 1 5 <210> 20 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 20 Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp 1 5 10 15 Gly Pro Thr Ala Ile Arg 20 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 21 Asp Val Ala Ser Trp Arg 1 5 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 22 Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro 1 5 10 15 Pro Glu Lys <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 23 Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 24 Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu Val Pro Val Thr 1 5 10 15 Ile Arg <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 25 Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 293 <212> PRT <213> Delftia acidovorans <400> 26 Met Ala Gln Thr Thr Leu Gln Ile Thr Pro Thr Gly Ala Thr Leu Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Gly Val His Leu Ala Thr Leu Asp Asp Ala Gly Phe 20 25 30 Ala Ala Leu His Ala Ala Trp Leu Gln His Ala Leu Leu Ile Phe Pro 35 40 45 Gly Gln His Leu Ser Asn Asp Gln Gln Ile Thr Phe Ala Lys Arg Phe 50 55 60 Gly Ala Ile Glu Arg Ile Gly Gly Gly Asp Ile Val Ala Ile Ser Asn 65 70 75 80 Val Lys Ala Asp Gly Thr Val Arg Gln His Ser Pro Ala Glu Trp Asp 85 90 95 Asp Met Met Lys Val Ile Val Gly Asn Met Ala Trp His Ala Asp Ser 100 105 110 Thr Tyr Met Pro Val Met Ala Gln Gly Ala Val Phe Ser Ala Glu Val 115 120 125 Val Pro Ala Val Gly Gly Arg Thr Cys Phe Ala Asp Met Arg Ala Ala 130 135 140 Tyr Asp Ala Leu Asp Glu Ala Thr Arg Ala Leu Val His Gln Arg Ser 145 150 155 160 Ala Arg His Ser Leu Val Tyr Ser Gln Ser Lys Leu Gly His Val Gln 165 170 175 Gln Ala Gly Ser Ala Tyr Ile Gly Tyr Gly Met Asp Thr Thr Ala Thr 180 185 190 Pro Leu Arg Pro Leu Val Lys Val His Pro Glu Thr Gly Arg Pro Ser 195 200 205 Leu Leu Ile Gly Arg His Ala His Ala Ile Pro Gly Met Asp Ala Ala 210 215 220 Glu Ser Glu Arg Phe Leu Glu Gly Leu Val Asp Trp Ala Cys Gln Ala 225 230 235 240 Pro Arg Val His Ala His Gln Trp Ala Ala Gly Asp Val Val Val Trp 245 250 255 Asp Asn Arg Cys Leu Leu His Arg Ala Glu Pro Trp Asp Phe Lys Leu 260 265 270 Pro Arg Val Met Trp His Ser Arg Leu Ala Gly Arg Pro Glu Thr Glu 275 280 285 Gly Ala Ala Leu Val 290 <210> 27 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 27 Met Ala Gln Thr Thr Leu Gln Ile Thr Pro Thr Gly Ala Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Ala Thr Val Thr Gly Val His Leu Ala Thr Leu Asp Asp Ala Gly 20 25 30 Phe Ala Ala Leu His Ala Ala Trp Leu Gln His Ala Leu Leu Ile Phe 35 40 45 Pro Gly Gln His Leu Ser Asn Asp Gln Gln Ile Thr Phe Ala Lys 50 55 60 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 28 Phe Gly Ala Ile Glu Arg 1 5 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 29 Ile Gly Gly Gly Asp Ile Val Ala Ile Ser Asn Val Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 30 Ala Asp Gly Thr Val Arg 1 5 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 31 Gln His Ser Pro Ala Glu Trp Asp Asp Met Met Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 32 Val Ile Val 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His Ser Arg 1 5 <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 45 Leu Ala Gly Arg Pro Glu Thr Glu Gly Ala Ala Leu Val 1 5 10 <210> 46 <211> 183 <212> PRT <213> Streptomyces viridochromogenes <400> 46 Met Ser Pro Glu Arg Arg Pro Val Glu Ile Arg Pro Ala Thr Ala Ala 1 5 10 15 Asp Met Ala Ala Val Cys Asp Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser 20 25 30 Thr Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gln Thr Pro Gln Glu Trp Ile Asp 35 40 45 Asp Leu Glu Arg Leu Gln Asp Arg Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val 50 55 60 Glu Gly Val Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg 65 70 75 80 Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Val Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser His Arg 85 90 95 His Gln Arg Leu Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys 100 105 110 Ser Met Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu 115 120 125 Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg Leu His Glu Ala Leu Gly Tyr Thr Ala 130 135 140 Arg Gly Thr Leu Arg Ala Ala Gly Tyr Lys His Gly Gly Trp His Asp 145 150 155 160 Val Gly Phe Trp Gln Arg Asp Phe Glu Leu Pro Ala Pro Pro Arg Pro 165 170 175 Val Arg Pro Val Thr Gln Ile 180 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 47 Met Ser Pro Glu Arg 1 5 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 48 Arg Pro Val Glu Ile Arg Pro Ala Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Val 1 5 10 15 Cys Asp Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser Thr Val Asn Phe Arg 20 25 30 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 49 Thr Glu Pro Gln Thr Pro Gln Glu Trp Ile Asp Asp Leu Glu Arg 1 5 10 15 <210> 50 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 50 Leu Gln Asp Arg 1 <210> 51 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 51 Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val Glu Gly Val Val Ala Gly Ile Ala 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Pro Trp Lys 20 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 52 Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Val Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser His Arg 1 5 10 15 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 53 Leu Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 54 Ser Met Glu Ala Gln Gly Phe Lys 1 5 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 55 Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg 1 5 10 15 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 56 Leu His Glu Ala Leu Gly Tyr Thr Ala Arg 1 5 10 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 57 Gly Thr Leu Arg 1 <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 58 Ala Ala Gly Tyr Lys 1 5 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 59 His Gly Gly Trp His Asp Val Gly Phe Trp Gln Arg 1 5 10 <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candidate signature peptide <400> 60 Asp Phe Glu Leu Pro Ala Pro Pro Arg Pro Val Arg Pro Val Thr Gln 1 5 10 15 Ile

Claims

(a) 식물-기반 샘플로부터 단백질을 추출하고;
(b) 단계 (a)로부터 추출된 단백질을 소화시켜 펩티드를 얻고;
(c) 펩티드를 단일 단계로 분리하고;
(d) 알려진 아미노산 서열을 갖는 관심 단백질로부터 복수의 시그너쳐 펩티드를 결정하고;
(e) 고분해능 정밀 질량 분광 분석 (HRAM MS)을 사용하여 복수의 시그너쳐 펩티드를 측정하고;
(f) 시그너쳐 펩티드의 측정을 기초로 하여 알려진 아미노산 서열을 갖는 관심 단백질을 정량하는 것
을 포함하는, 식물-기반 샘플 내의 알려진 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 관심 단백질의 고속 정량 방법.
제1항에 있어서, 펩티드가 컬럼 크로마토그래피에 의해 단일 단계로 분리되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 컬럼 크로마토그래피가 액체 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 관심 단백질에 대응하는 펩티드에 대한 질량 스펙트럼 데이타가 단일 단계로 얻어지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 관심 단백질이 2개의 관심 단백질을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 관심 단백질이 4개의 관심 단백질을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 식물-기반 샘플이 트랜스제닉 식물로부터 유래되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 하나 이상의 관심 단백질이 트랜스제닉 식물에서 예상된 트랜스진 발현 생성물을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 관심 단백질이 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (2mEPSPS), 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제-12 (AAD-12), 및/또는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT)를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 서열식별번호(SEQ ID NO): 2-25, 27-45, 및 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 서열식별번호: 2-25, 27-45, 및 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 서열식별번호: 2-25, 27-45, 및 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 (1) 서열식별번호: 3, 12, 및 21; (2) 서열식별번호: 28, 29, 및 34; 및/또는 (3) 서열식별번호: 49, 55, 및 56을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 (1) 서열식별번호: 3, 12, 및 21; (2) 서열식별번호: 28, 29, 및 34; 및/또는 (3) 서열식별번호: 49, 55, 및 56으로 이루어지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드의 측정이 대응하는 피크 높이 또는 피크 면적의 계산을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드의 측정이 고 단편화 방식 및 저 단편화 방식으로부터의 데이타를 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
(a) 식물-기반 샘플로부터 단백질을 추출하기 위한 고속 수단;
(b) 펩티드를 단일 단계로 분리하기 위한 분리 모듈;
(c) 알려진 아미노산 서열을 갖는 관심 단백질로부터 복수의 시그너쳐 펩티드를 선택하기 위한 선택 모듈; 및
(d) 복수의 시그너쳐 펩티드를 측정하기 위한 고분해능 정밀 질량 분광 분석기 (HRAM MS)
를 포함하는, 식물-기반 샘플 내의 알려진 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 관심 단백질을 정량하기 위한 고속 시스템.
제17항에 있어서, 분리 모듈이 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 것인 시스템.
제18항에 있어서, 컬럼 크로마토그래피가 액체 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 고분해능 정밀 질량 분광 분석기 (HRAM MS)가 탠덤 질량 분광계를 포함하는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 고분해능 정밀 질량 분광 분석기 (HRAM MS)가 탠덤 질량 분광계를 포함하지 않는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 식물-기반 샘플이 트랜스제닉 식물로부터 유래되는 것인 시스템.
제22항에 있어서, 하나 이상의 관심 단백질이 트랜스제닉 식물에서 예상된 트랜스진 발현 생성물을 포함하는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 하나 이상의 관심 단백질이 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (2mEPSPS), 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제-12 (AAD-12), 및/또는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT)를 포함하는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 서열식별번호: 2-25, 27-45, 및 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 서열식별번호: 2-25, 27-45, 및 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 서열을 포함하는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 서열식별번호: 2-25, 27-45, 및 47-60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 서열을 포함하는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 (1) 서열식별번호: 3, 12, 및 21; (2) 서열식별번호: 28, 29, 및 34; 및/또는 (3) 서열식별번호: 49, 55, 및 56을 포함하는 것인 시스템.
제17항에 있어서, 복수의 시그너쳐 펩티드가 (1) 서열식별번호: 3, 12, 및 21; (2) 서열식별번호: 28, 29, 및 34; 및/또는 (3) 서열식별번호: 49, 55, 및 56으로 이루어지는 것인 시스템.
제17항의 시스템을 사용하는 것을 포함하는, 식물-기반 샘플 내의 알려진 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 관심 단백질의 고속 정량 방법.