TWI526216B - The method of separating and purifying functional components in placenta by supercritical fluid technology - Google Patents

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Description

以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法
本發明係與分離胎盤中活性成分之技術有關，更詳而言之是指一種以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法者。
胎盤是胎兒與母體組織之間的結合結構，提供胚胎所有營養物質和保護，科學研究發現，胎盤中含有豐富的生長因子、激素、蛋白質、胜肽、核酸、抗體和其他濃縮營養成分，可以促進身體組織的健康。它含有豐富的生長因子如肝細胞生長因子、神經生長因子、表皮纖維細胞因子、胰島素生長因子、血小板衍生生長因子、造血細胞生長因子、血管內皮細胞因子等促進幹細胞的生長因子，這些生長因子具有調節自主神經系統，改善心血管循環，傷口組織癒合，增強神經再生，平衡多種荷爾蒙，免疫增強功能(抗過敏)，鎮痛作用和腸道健康的改善。
習知從胎盤中萃取生物活性胜肽成分的方法甚多，如美國專利US3409605係以離子交換樹脂吸附、濃縮和純化胎盤中生長因子，美國專利US4169139則以丙酮、稀醋酸鉛和稀硫酸銨分離沉澱組織中的蛋白質成分，中國 CN1298736C與CN102488713B專利係採用新鮮胎盤以無菌水清洗，加入10-100倍食鹽水，高速組織均質化，先經透析脫鹽與超過濾膜澄清處理，得到一種無色或微帶黃色透明液體，再經陰離子交換層析、凝膠排阻層析、逆相高效液相層析多重步驟分離純化，透析凍乾得到萃取純化的成品。亦有如中國CN101658534 A專利，其採用液態氮冷凍解凍法，高速研磨後，再經過透析脫鹽與超過濾膜澄清處理，以離子交換樹脂吸附和洗脫條件下，得到活性胜肽成分。
現有萃取與純化胎盤相關機能成分之方法繁雜，分離與純化胎盤中之胜肽、蛋白質與活化因子等機能成分較為耗時，且需使用大量的有機溶劑，於製作過程中有機溶劑可能會與機能成分產生化學反應之情形，不僅製作完成後溶劑去除與濃縮過程中，加熱蒸發溶劑易造成機能成分部分破壞，且溶劑易殘留於分離物或純化物中，造成機能成分純度不足之情形，顯有改進之處。
本發明之主要目的即在提供一種以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法，其可分離與純化胎盤中的活性成分，不但成本低，製作簡單、操作性強、適合於規模化生產，且能保持胎盤中生物活性成分的活性，不需再經繁複的溶劑去除與濃縮、分離程序，且超臨界流體可回收再利用，不需再經濃縮過程去除溶劑的步驟，無溶劑殘留 等安全疑慮，甚為環保、安全，具實用價值者。
緣是，為達成前述之目的，本發明係提供一種以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法，其至少包含以下步驟：萃取：在預定溫度與壓力之操作條件下，以預定之流速持續將胎盤萃取液與超臨界狀態溶劑通入一分餾槽內，用以自胎盤萃取液萃取出胜肽與蛋白質等機能成分；純化：持續在預定溫度與低於前述壓力之操作條件下分離超臨界狀態溶劑，以獲得胎盤萃取液中之胜肽、蛋白質與活化因子等機能成分。
進一步地，係將該分餾槽內萃取出之機能成分輸送至若干分離槽進行純化。
進一步地，係將該分餾槽內萃取出之機能成分依序輸送經過連接之三個分離槽逐步降壓，用以可選擇性分離、區分與純化胎盤胜肽與蛋白質之含量與純度。
進一步地，胎盤萃取液係以1：10(W/V)的比例將胎盤粉末與乙醇混合離心而成。
進一步地，胎盤粉末可為乾燥之人體或羊、豬、鹿等動物之胎盤粉末。
進一步地，係在壓力2000-4000Psi、溫度40℃或60℃之操作條件下，將胎盤萃取液放置於分餾槽，超臨界狀態溶劑係超臨界二氧化碳/乙醇，以超臨界流體流速3-9L/hr、胎盤萃取液流速1-3L/hr流入分餾槽。
進一步地，純化之步驟中，係在溫度40℃或60℃下，依序分別以3000、2000、1000psi之壓力於三個分離槽快速降壓分離超臨界狀態溶劑。
進一步地，萃取之步驟中，最適之操作條件為：壓力為4000Psi、溫度為40℃。
進一步地，純化之步驟中，最適之操作條件為：溫度為60℃、壓力為3000psi時，最適於將胎盤胜肽與蛋白質純化區分於三個分離槽中。
100‧‧‧以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法
110‧‧‧萃取
120‧‧‧純化
圖一係本發明一較佳實施例之流程圖。
圖二係本發明一較佳實施例之壓力-胎盤胜肽分離效率分析圖。
圖三係本發明一較佳實施例之壓力-胎盤蛋白質分離效率分析圖。
圖四係本發明一較佳實施例之壓力-選擇性值分析圖。
圖五與圖六係本發明一較佳實施例之胎盤胜肽與蛋白質成分於胎盤萃取液(Feed)、分餾槽底部殘餘物(R)與三分離槽F1、F2、F3之濃度分佈圖。
圖七係本發明一較佳實施例之壓力-ADSC活化能力分析圖。
圖八係本發明一較佳實施例之ADSC生長因子於胎盤萃 取液(Feed)、分餾槽底部殘餘物(R)與三分離槽F1、F2、F3之濃度分佈圖。
以下，茲舉本發明一較佳實施例，並配合圖式做進一步之詳細說明如後：請參閱圖一所示，本發明一較佳實施例以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法100，係可分離與純化胜肽、蛋白質與活化因子等機能成分，其第一步驟係萃取110：係備取1-2Kg之胎盤粉末(可為乾燥之人體或羊、豬、鹿等動物之胎盤粉末)，以1：10(W/V)的比例用乙醇混合離心而製備胎盤萃取液(Feed)，接著在壓力2000-4000Psi、溫度40與60℃、超臨界流體(二氧化碳SC-CO2/乙醇溶劑)流速3-9L/hr與胎盤萃取液流速1-3L/hr之操作條件下，連續通入一分餾槽內進行萃取，用以可於該分餾槽中之頂端與底端分別萃取出胜肽與蛋白質等機能成分。該分餾槽係內徑36mm、高度1000mm的不鏽鋼槽體，其內充填有不鏽鋼單體片。
本發明之第二步驟係純化120：係在溫度40℃或60℃下，將該分餾槽內萃取出之胜肽與蛋白質等機能成分，連續地依序輸送經過連接之三個分離槽，分別以3000、2000、1000psi之壓力逐步降壓，亦即，第一分離槽係3000psi之壓力，第二分離槽係2000psi之壓力，而最後之第三分離槽 係1000psi之壓力，用以可分離超臨界狀態溶劑，獲得胎盤萃取液中之胜肽、蛋白質與活化因子等機能成分。三個分離槽皆係內徑36mm、高度500mm的不鏽鋼槽體。
以下，茲利用不同之操作條件(改變壓力與溫度)實施前揭方法，係取胎盤萃取液(Feed)、分餾槽頂部萃取物(Extract)、分餾槽底部殘餘物(Raffinate，R)，及三個分離槽分別得到的胜肽、蛋白質與活化因子等機能成分(後稱區分物F1、F2與F3)，分析以下生化性質：(1)脂肪組織來源的幹細胞(adipose derived stem cells；ADSC)的活化能力、(2)蛋白質濃度、(3)蛋白質電泳、(4)胜肽濃度。
ADSC活化能力之測量，係以細胞流式儀分析，單位以%表示。蛋白質濃度之測量，以Bradford蛋白濃度測定試劑定量分析，單位以mg/g dw表示。蛋白質電泳分析，以SDS-PAGE蛋白質電泳膠體分析，單位以mg/g dw表示。胜肽濃度之測量，以C18管柱之HPLC定量分析，單位以mg/g dw表示。
實驗結果分為二部分：(1)胎盤中的機能成分最適分離與純化條件，(2)蛋白質成分、胜肽濃度與ADSC活性的量產製程，數據分析如圖二至圖八所示。
首先，於該連續式純化反應系統將胎盤萃取液分離後，收集該分餾槽頂部與底部之樣品，分析二者含量並計算出胎盤胜肽之分離效率(K-value of peptide； Kpeptides)、胎盤蛋白質之分離效率(K-value of protein；Kproteins)與二者含量之選擇性值(selectivity)。定義如下：Kpeptides=分餾槽頂部胎盤胜肽含量÷分餾槽底部胎盤胜肽含量。Kproteins=分餾槽頂部胎盤蛋白質含量÷分餾槽底部胎盤蛋白質含量。選擇性定義=Kpeptides÷Kproteins。
當Kpeptides=1時，表示該分餾槽頂部胎盤胜肽含量等於分餾槽底部胎盤胜肽含量。Kpeptides>>1時，表示胎盤胜肽含量容易被分離於分餾槽之頂部；Kproteins<<1時，表示胎盤蛋白質含量容易被分離於該分餾槽底部。
操作壓力與溫度會改變胎盤胜肽與蛋白質之分離效率。分餾後之數值結果顯示：如圖二所示，溫度於40℃範圍下，壓力越高時(即壓力達3000psi時)，胎盤胜肽之分離效率達3.0以上。如圖三所示，溫度於40℃範圍下，壓力越高時(即壓力達4000psi時)，胎盤蛋白質之分離效率達2.5。因此，採用溫度40℃與壓力4000psi時，最適於將胎盤胜肽與蛋白質分離於分餾槽之頂部。如圖四所示，當溫度於60℃範圍下與壓力達3000psi時，選擇性值達4.0，顯示於此操作條件下，最適於將胎盤胜肽與蛋白質純化區分於三個分離槽中(F1、F2、F3)。
舉例而言，選擇溫度40℃與壓力4000psi之操作條件下，將胎盤胜肽與蛋白質成分，分離於分餾槽之頂端， 再利用降壓(即降低壓力至3000、2000、1000psi於F1、F2、F3)，與提高溫度至60℃範圍下，可以選擇性分離、區分與純化胎盤胜肽與蛋白質之含量與純度，如圖五與圖六所示：胎盤胜肽與蛋白質成分於胎盤萃取液(Feed)、分餾槽底部得到殘餘物(R)，三個分離槽F1、F2、F3之濃度分佈，因此，於溫度40℃與壓力4000psi之操作條件下，得到胎盤蛋白質成分於分餾槽之底部；同時地，於溫度60℃與壓力3000、2000psi之操作條件下，得到胎盤胜肽成分於分離槽F1與F2中。
圖七的實驗結果顯示，分析收集分餾槽之樣品的ADSC活化能力表現，顯示超臨界狀態溶劑，在操作壓力4000Psi與溫度40℃下，最適合萃取出活化ADSC生長因子之機能成分，進而促進脂肪組織來源的幹細胞活化與再生之能力。
圖八的實驗結果顯示：於溫度40℃與壓力2000、1000psi條件下，最適合分離與純化活化ADSC生長因子之純化物於第二分離槽-區分物2(F2)與第三分離槽-區分物3(F3)中。
此外，為驗證本發明之純化技術應用於機能性食品與化妝品產業之功效，茲進行下列工業量產測試實驗：應用超臨界流體在溫度40℃與壓力4000psi條件下與胎盤萃取液於分餾槽內進行萃取處理後，同時地，再將 胎盤中最適合促進脂肪組織來源的幹細胞的活化與再生能力之生長因子，於溫度40℃與壓力2000psi條件下，分離活化ADSC生長因子之純化物於第二分離槽-區分物2(F2)。實驗配方與實驗結果之數據分析如表一所示。這些使用本發明技術從胎盤中所分離與純化之胜肽、蛋白質與活化因子等機能成分，添加於機能性飲品、食品(果凍)或精華液之化妝品中，可有效地促進ADSC活化與再生能力之生長因子，有效促進ADSC活性能力15-21%。
由上可知，本發明所提供以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法，其採用安全無毒的超臨界狀態溶劑，配合物理方式之萃取與純化之步驟，可將胎盤萃取液分離出活性成分--胜肽與蛋白質，且無溶劑殘留等安全疑慮，環保、安全，超臨界狀態溶劑更可回收再利用，相較於習知萃取與分離胎盤胜肽與蛋白質之方法，本發明更可量產、連續式運作，顯然甚具實用價值。
100‧‧‧以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法
110‧‧‧萃取
120‧‧‧純化

Claims (3)

  1. 一種以超臨界流體技術分離與純化胎盤中機能成分之方法，其至少包含以下步驟：萃取：係在壓力2000-4000Psi、溫度40℃或60℃之操作條件下，將胎盤萃取液放置於分餾槽，超臨界狀態溶劑係超臨界二氧化碳/乙醇，以超臨界流體流速3-9L/hr、胎盤萃取液流速1-3L/hr通入一分餾槽內，用以可於該分餾槽中之頂端與底端分別萃取出胜肽與蛋白質成分等機能成分，胎盤萃取液係以1：10(W/V)的比例將胎盤粉末與乙醇混合離心而成，胎盤粉末可為乾燥之人體或羊、豬、鹿等動物之胎盤粉末；及純化：持續在溫度40℃或60℃下，依序分別以3000、2000、1000psi之壓力於連接之三個分離槽逐步降壓，以分離超臨界狀態溶劑，用以可選擇性分離、區分與純化胎盤胜肽與蛋白質之含量與純度於不同分離槽，以獲得胎盤萃取液中之胜肽、蛋白質與活化因子等機能成分。
  2. 如申請專利範圍第1項所述以超臨界流體技術分離胎盤中機能成分之方法，其中，萃取之步驟中，最適之操作條件為：壓力為4000Psi、溫度為40℃。
  3. 如申請專利範圍第1項所述以超臨界流體技術分離胎盤中機能成分之方法，其中，純化之步驟中，最適之操作條件為：溫度為60℃、壓力為3000psi時，最適於將胎盤胜肽與蛋白質純化區分於三個分離槽中。
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