TWI526215B - Methods for separating functional constituents from the placenta - Google Patents
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Description
本發明係與分離胎盤中活性成分之技術有關，更詳而言之是指一種可分離出胎盤中雌激素、胜肽與維生素和微量元素等機能成分之方法者。
按，胎盤為胎兒的營養來源，含有必需的氨基酸及具有藥理活性的胜肽、維生素、礦物質和各種生長因子，經科學研究，發現其機能重要成份是免疫球蛋白和延緩衰老基因的胜肽，還含有豐富的卵磷脂、腦磷脂、脂多醣、多種維生素和微量元素，更有轉移因子、蛋白質活性因子、膠原蛋白素和核酸化合物等成分。因此，胎盤成分具有抗衰老、靚麗肌膚、提高免疫力與調節內分泌等機能，不過，胎盤中的雌激素(estrogen)及黃體酮(progesterone)等成分，過量使用會造成心血管疾病與引發癌症等問題。
習知萃取分離胎盤胜肽的方法，有反覆凍融法、酸或鹼水解法、酶解法等，如美國發明公開US20130072466A1使用混合溶劑乙酸乙酯、氯仿、乙醚、己烷等有機溶劑萃取胎盤中雌激素等成分，萃取後再加入額外的鹼性物質沉澱，最後用酸性物中和萃取物，此法製程時間
長，會產生大量酸、鹼與有機溶劑等廢液，造成機能成分分解與毒性殘留等缺點；中國專利CN101837005B利用鹼溶液水解豬胎盤預處理後，經蛋白酶水解，再以有機溶劑沉澱胎盤中胎盤脂多醣等機能性成分；美國專利US3041245使用酸性水-丙酮有機溶劑，萃取哺乳動物的胎盤中白蛋白護膚成分；美國發明公開US20130072466A1係使用混合有機溶劑，萃取胎盤中雌激素等成分。
前揭習知萃取胎盤成分之技術，不是製程複雜耗時，製程中常添加大量的酸、鹼、有機溶劑，有機溶劑可能會與機能成分產生化學反應，完成後溶劑去除與濃縮過程中，加熱蒸發溶劑，易造成機能成分被部分破壞，溶劑會殘留於分離物或純化物中，皆無法一次簡單、安全而有效率地分離與完整保留胎盤中雌激素、胜肽與維生素和微量元素等機能成分。
本發明之主要目的即在提供一種分離胎盤中雌激素之方法，其可分離出胎盤油脂與雌激素，不需再經繁複的溶劑去除與濃縮、分離程序，且無溶劑殘留等安全疑慮，且成本低，能有效改善胎盤粉末產品風味與營養，提高胎盤胜肽的吸收效果及良好風味口感，甚為環保、安全，具實用價值者。
緣是，為達成前述之目的，本發明係提供一種
分離胎盤中機能成分之方法，其步驟包含有：去味與萃取：在預定溫度與壓力之操作條件下，將胎盤粉末放置於一萃取槽內，再將超臨界狀態溶劑通入該萃取槽內，用以去除胎盤粉末之魚腥味與萃取胎盤粉末中之油脂；吸附雌激素：與前述相同之操作條件下，將去除魚腥味與萃取胎盤油脂後之胎盤粉末與超臨界狀態溶劑以預定體積流速比例流入一吸附槽，用以使胎盤粉末中之雌激素被該吸附槽吸附，獲致去除雌激素之胎盤萃取物；分離：在預定溫度與壓力之操作條件下，快速降壓分離超臨界狀態溶劑，以獲得胎盤粉末中之機能成分。
進一步地，胎盤粉末可為乾燥之人體或羊、豬、鹿等動物之胎盤粉末。
進一步地，去味與萃取之步驟中，係在壓力2000-4000Psi、溫度40-60℃之操作條件下，將1-2Kg胎盤素粉末放置於萃取槽，超臨界狀態溶劑係超臨界二氧化碳/乙醇，以15：1之體積流速比例流入萃取槽，萃取時間為2-3小時。
進一步地，分離之步驟中，係在壓力1000-1200Psi與溫度40℃之操作條件下，快速降壓分離超臨界狀態溶劑。
進一步地，最適之操作條件為：壓力為4000Psi、溫度為60℃對油脂產率最大。
進一步地，最適之操作條件為：壓力4000Psi、溫度為40℃可分離胎盤粉末中90-95%之雌激素成分，且由胎盤粉中萃取分離之機能成分，最適合促進脂肪組織來源的幹細胞的活化與再生能力。
進一步地，最適之操作條件為：壓力3000Psi、溫度50℃下，可從胎盤粉中萃取最高蛋白質含量、壓力4000Psi、溫度40℃與60℃下，從胎盤粉中萃取分離之蛋白質機能成分最高。
進一步地，該萃取槽係內徑60mm、高度745mm的不鏽鋼槽體。
進一步地，該吸附槽係內徑60mm與高度450mm的不鏽鋼槽體，其內充填有可吸附雌激素之吸附劑。
進一步地，該吸附劑係矽膠或樹脂等可吸附雌激素之吸附劑。
100‧‧‧分離胎盤中機能成分之方法
110‧‧‧去味與萃取
120‧‧‧吸附雌激素
130‧‧‧分離
圖一係本發明一較佳實施例之流程圖。
圖二係本發明一較佳實施例中胎盤粉末於萃取槽中的油脂產率圖。
圖三係本發明一較佳實施例中雌激素成分於萃取槽與吸附槽中被萃取分離的效率分析圖。
圖四係本發明一較佳實施例中ADSC存活率分析圖。
圖五係本發明一較佳實施例中萃取蛋白質之含量分析圖。
圖六(a)係本發明一較佳實施例中蛋白質分子量58000時之含量分析圖，(b)係蛋白質分子量14600時之含量分析圖。
圖七係本發明一較佳實施例中蛋白質之胜肽機能成分之含量分析圖。
以下，茲舉本發明一較佳實施例，並配合圖式做進一步之詳細說明如後：首先，請參閱圖一所示，本發明一較佳實施例分離胎盤中機能成分之方法100，係可去除胎盤粉末之魚腥味、萃取胎盤油脂、雌激素、胜肽與維生素和微量元素，其第一步驟係去味與萃取110：係在壓力2000-4000Psi、溫度40-60℃之操作條件下，將1-2Kg胎盤素粉末放置於一萃取槽，再將超臨界狀態溶劑通入萃取槽內，進行萃取油脂流程，萃取時間為2-3小時，用以萃取胎盤粉末中之油脂，將其收集於萃取槽底部。胎盤粉末可為乾燥之人體或羊、豬、鹿等動物之胎盤粉末，超臨界狀態溶劑係超臨界狀態二氧化碳SC-CO2/乙醇溶劑，該萃取槽係內徑60mm、高度745mm的不鏽鋼槽體，其內充填有不鏽鋼單體片。
本發明之第二步驟係吸附雌激素120：係在與前
述相同之操作條件(壓力2000-4000Psi、溫度40-60℃)下，將去除魚腥味與萃取胎盤油脂後之胎盤粉末，與體積流速比例為15：1之超臨界狀態溶劑流入萃取槽，並同時再經過一吸附槽內，使胎盤粉末中之雌激素被該吸附槽吸附，吸附時間為2-3小時。該吸附槽係內徑60mm與高度450mm的不鏽鋼槽體，內部充填有如矽膠Silica gel、Sephadex(聚醯胺)或Resin(樹脂)等可吸附雌激素之吸附劑。
本發明之第三步驟係分離130：在壓力1000-1200Psi與溫度40℃之操作條件下，快速降壓分離超臨界狀態溶劑，用以可從吸附槽底部收集胎盤粉末萃取之機能成分。
以下，茲利用不同之操作條件(改變壓力與超臨界狀態溶劑之體積流速比例)實施前揭方法，係取胎盤粉末樣品、萃取槽底部之收集樣品與吸附槽底部之收集樣品，分析定量以下物化性質：(1)油脂產率、(2)雌激素濃度、(3)脂肪組織來源的幹細胞(adipose derived stem cells；ADSC)的活化能力、(4)蛋白質濃度、(5)蛋白質電泳、(6)胜肽濃度。
油脂產率之測量，乃計算收集萃取槽底部之油脂質量，比較放置於萃取槽中之胎盤粉末質量，以%單位表示。雌激素濃度之測量，乃計算吸附槽底部之收集樣品，比較放置於萃取槽中之胎盤粉末樣品，以ELISA定量雌激素濃度，計算去除雌激素的去除率(Rejection,%)。ADSC活化能
力之測量，乃收集吸附槽底部之收集樣品，以細胞流式儀分析，單位以%表示。蛋白質濃度之測量，乃分析吸附槽底部之收集樣品，以Bradford蛋白濃度測定試劑定量分析，單位以mg/g dw表示。蛋白質電泳分析，乃分析吸附槽底部之收集樣品，以SDS-PAGE蛋白質電泳膠體分析，單位以g/g dw表示。胜肽濃度之測量，乃分析吸附槽底部之收集樣品，以C18管柱之HPLC定量分析，單位以mg/g dw表示。
實驗結果分為四部分：(1)油脂產率的最適萃取條件，(2)胎盤中的雌激素成分最適分離條件，(3)ADSC化能力的萃取條件選擇，(4)蛋白質、胜肽與活性成分濃度的萃取條件選擇，數據分析如圖二至圖七所示。圖二的曲線代表，超臨界狀態溶劑在操作壓力2000-4000Psi與溫度40-60℃下，胎盤粉末於萃取槽的油脂產率。當將壓力從2000增加至為4000psi，溫度從40增加至為60℃，油脂產率之效率顯著增加。隨著超臨界狀態溶劑操作壓力與密度的上升，超臨界狀態溶劑與油脂的溶解度相對增加，溫度的升高亦提升油脂的蒸氣壓，進而油脂的溶解度增大。因此，圖二顯示壓力4000Psi與溫度60℃對油脂產率最大。圖三的曲線顯示，以體積比例為15：1之超臨界狀態溶劑，在操作壓力2000-4000Psi與溫度40-60℃下，雌激素成分於萃取槽與吸附槽中被萃取分離的效率。6-7%含量的乙醇被當為超臨界二氧化碳的共溶劑，促進超臨界狀態溶劑容易滲透於胎盤粉中，
提高胎盤粉中雌激素成分萃取率和分離效果。因此，圖三顯示壓力4000Psi下的高質傳與低黏度等效果，配合溫度40℃操作條件下，分離胎盤粉中90-95%之雌激素成分。相似的現象亦於圖四的實驗結果顯示，分析收集吸附槽底部之樣品的ADSC活化能力表現，顯示超臨界狀態溶劑，在操作壓力4000Psi與溫度40℃下，從胎盤粉中萃取分離之機能成分，最適合促進脂肪組織來源的幹細胞的活化與再生能力。圖五實驗圖解中，以超臨界狀態溶劑，於操作壓力3000Psi與溫度50℃下，可以從胎盤粉中萃取最高蛋白質含量。以蛋白質電泳膠體分析相同這些分離條件得到的樣品，對照標準之蛋白質分子量11,000至180,000與樣品分析膠體圖譜，分別於分子量14,600與58,000顯示，分析結果顯示於圖六之(a)與(b)圖。在操作壓力4000Psi與溫度40℃與60℃下，從胎盤粉中萃取分離之蛋白質機能成分最高。比較圖五與圖六之數據顯示，選擇操作壓力4000Psi與溫度60℃，有利分子量58,000之蛋白質機能成分之分離。圖七的實驗結果顯示，利用HPLC分析分離蛋白質中之胜肽機能成分，選擇操作壓力4000Psi，有利小分子量之胜肽機能成分之分離。
運用超臨界二氧化碳、超臨界二氧化碳與乙醇當為溶劑，具有高的溶解度及質傳速率，且使用低溫、低黏度及高密度促進萃取機能成分之接觸機會大，可加速且有選擇性從胎盤粉末中，分離胎盤中如雌激素、胜肽與維生素和
微量元素等機能成分。因此，本專利提出之製備方法，可避免習知以酸、鹼與酵素分解時，使用大量有機溶劑進行水解雌激素成分結構所產生之缺點。
此外，為比較本發明與習知傳統透析萃取技術功效上之差異，茲進行下列實驗：(1)胎盤粉末加入質量20倍之生理食鹽水均質後，以排拒分子量14,000透析管，放置5倍均質液之RO水透析6小時，得到萃取樣品；(2)本發明之方法。將二種處理方式所得到之萃取液，分析以下物化性質：(1)顏色、(2)魚腥味、(3)雌激素濃度、(4)ADSC活性、(5)蛋白質濃度、(6)胜肽濃度。顏色變化以日本Denshoku Σ90色差儀測量，以Hunter L，a，b值表示。魚腥味以專業人員聞萃取樣品，品評分數由0至10分，10分為最被認可，0分為最無法被接受。
實驗結果之數據分析如表一所示。表一中顯示本發明與傳統透析處理的胎盤粉樣品中，本發明所萃取得到樣品之L值接近94。Hunter L值可由0至100表示，越接近100時，即表示其透明度與澄清度越高。當Hunter a值越高，即表示其顏色之紅色色度越深，而Hunter b值越高時，顯示其顏色黃色濃度越濃，透析處理的胎盤粉樣品呈現深黃的混濁狀，因此傳統透析處理的胎盤樣品其外觀、顏色與澄清度較無法被接受。本發明製備之樣品除了具有清澈外觀感覺，樣品亦無魚腥味與雌激素。再如表一所示，本發明製備之樣品
亦具有高含量蛋白質與胜肽濃度與高的ADSC活性能力。
由上可知，本發明所提供分離胎盤中機能成分之方法，其採用安全無毒的超臨界狀態溶劑，配合物理方式之去味與萃取、吸附與分離之步驟，在超臨界狀態溶劑之高溶解度、低黏度與高質傳效率下，可加速且有選擇性從胎盤粉末中，分離出如雌激素、胜肽與維生素和微量元素等機能成分，且無溶劑殘留等安全疑慮，環保、安全，超臨界狀態溶劑更可回收再利用，相較於習知以酸、鹼與酵素分解再配合大量有機溶劑水解之方式，導致有殘留溶劑之安全疑慮之缺點，本發明顯然更具進步性，甚具實用價值。
100‧‧‧分離胎盤中機能成分之方法
110‧‧‧去味與萃取
120‧‧‧吸附雌激素
130‧‧‧分離
Claims (6)
- 一種分離胎盤中機能成分之方法，係運用超臨界流體技術實施以下步驟：去味與萃取：在壓力2000-4000Psi、溫度40-60℃之操作條件下，將1-2Kg胎盤粉末放置於一萃取槽內，再將超臨界狀態溶劑通入該萃取槽內，超臨界狀態溶劑係超臨界二氧化碳/乙醇，係以15：1之體積流量比流入萃取槽，萃取時間為2-3小時，用以去除胎盤粉末之魚腥味與萃取胎盤粉末中之油脂，該萃取槽係內徑60mm、高度745mm的不鏽鋼槽體；吸附雌激素：與前述相同之操作條件下，將去除魚腥味與萃取胎盤油脂後之胎盤粉末與超臨界狀態溶劑以預定體積流速比例流入一吸附槽，用以使胎盤粉末中之雌激素被該吸附槽吸附，獲致去除雌激素之胎盤萃取物，該吸附槽係內徑60mm與高度450mm的不鏽鋼槽體，其內充填有可吸附雌激素之吸附劑；及分離：在溫度40℃與壓力1000-1200Psi之操作條件下，快速降壓分離超臨界狀態溶劑，以獲得胎盤粉末中之機能成分。
- 如申請專利範圍第1項所述分離胎盤中機能成分之方法，其中，去味與萃取之步驟中，胎盤粉末可為乾燥之人體或羊、豬、鹿等動物之胎盤粉末。
- 如申請專利範圍第1項所述分離胎盤中機能成分之方法，其中，最適之操作條件為：壓力為4000Psi、溫度為60℃ 對油脂產率最大。
- 如申請專利範圍第1項所述分離胎盤中機能成分之方法，其中，最適之操作條件為：壓力4000Psi、溫度為40℃可分離胎盤粉末中90-95%之雌激素成分，且從胎盤粉中萃取分離之機能成分，最適合促進脂肪組織來源的幹細胞的活化與再生能力。
- 如申請專利範圍第1項所述分離胎盤中機能成分之方法，其中，最適之操作條件為：壓力3000Psi、溫度50℃下，可從胎盤粉中萃取最高蛋白質含量，壓力4000Psi、溫度40℃與60℃下，從胎盤粉中萃取分離之蛋白質機能成分最高。
- 如申請專利範圍第1項所述分離胎盤中機能成分之方法，其中，該吸附劑係矽膠Silica gel、Sephadex(聚醯胺)或Resin(樹脂)等可吸附雌激素之吸附劑。
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