CN1325062C - 从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法及其所用大孔吸附树脂的应用 - Google Patents

从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法及其所用大孔吸附树脂的应用 Download PDF

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Abstract

一种从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法及其所用大孔吸附树脂的应用，其包括第一步对原料孕马尿进行预处理、第二步用大孔吸附树脂吸附孕马尿中的结合雌激素混合物、第三步用碱性水溶液洗涤负载结合雌激素混合物的大孔吸附树脂、第四步从大孔吸附树脂上洗脱并获得结合雌激素混合物，其中，大孔吸附树脂选用具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂。本发明从根本上克服了传统的液-液萃取提取方法的不足，解决了现有树脂提取方法的吸附容量低的缺点，使从孕马尿中吸附结合雌激素混合物能力大大提高，并且对于不同含量的孕马尿均有很强的吸附能力，从而具有更高的提取效率，更低的提取成本和利于环保要求，非常适合于大规模生产的需要。

Description

从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法及其所用大孔吸附树脂的应用
技术领域
本发明涉及利用吸附树脂从孕马尿中提取结合雌激素混合物的技术领域，是一种从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法及其所用大孔吸附树脂的应用。
背景技术
从怀孕母马的尿液(简称孕马尿)中提取结合雌激素混合物的方法自上世纪30年代就已经开始研究，由于天然的结合雌激素混合物具有确切的疗效和可靠的安全性，在临床上用于治疗和预防女性生理或人工绝经期后出现的更年期综合症，以及预防和治疗骨质疏松症，得到长期的应用和认可。提取方法在近70年的研究中不断创新，近年内又有所发展。
早期报道的结合雌激素混合物提取方法的专利有美国专利：US2429398、US 2519516、US 2696265、US 2711988、US 2834712等，主要是采用有机溶剂萃取的方法，目前已不多用。上世纪60年代开始出现采用活性炭，离子交换树脂，反向硅胶等方法从孕马尿中提取结合雌激素混合物的方法。这些方法的吸附容量很低，不适合大规模生产的需要。
从上世纪90年代末应用新型的大孔吸附树脂从孕马尿中获取结合雌激素混合物的方法逐渐显露出前所未有的优势。专利号为5723454的美国专利文献(Ivan Ban为发明人之一)公开了一种以非离子半极性大孔交联聚丙烯酸酯树脂从孕马尿中获得含结合雌激素天然混合物的提取物的方法；公开号为CN 1381240A的中国专利文献(宋瓦拉帕为发明人之一)公开了一种以聚苯乙烯树脂从孕马尿中提取结合雌激素混合物方法；公开号为CN 1381240A的中国专利文献(周涛为发明人之一)公开了一种以含亚砜基的极性吸附树脂从孕马尿中提取结合雌激素混合物并以淋萃洗脱的方法获得结合雌激素混合物的提取方法。
现有利用大孔吸附树脂从孕马尿中提取结合雌激素混合物的方法一般包括以下步骤：第一步对原料孕马尿进行预处理、第二步利用大孔吸附树脂吸附孕马尿中的结合雌激素混合物、第三步用碱性或中性水溶液洗涤负载结合雌激素混合物的大孔吸附树脂、第四步从大孔吸附树脂上洗脱并获得结合雌激素混合物。这些大孔吸附树脂提取方法实现了快速、简便地从孕马尿中获得富集的结合雌激素混合物成分，但仍存在以下问题尚未解决。
研究发现，孕马尿中的结合雌激素混合物含量随孕期不同有很大差异。分别采集怀孕3-9个月(孕马尿的有效利用期)妊娠母马的尿液，并对其中的结合雌激素混合物进行检测，可以发现不同孕期的孕马尿中结合雌激素混合物含量可以从30至300mg/L变化；在最佳的采集期内(母马怀孕5-7个月)，孕马尿中的结合雌激素混合物成分普遍在100mg/L以上，甚至更高。但是，应用上述已经公开的方法处理结合雌激素含量较高的孕马尿中时，树脂与孕马尿的吸附比率都明显较低，尤其是当孕马尿中结合雌激素含量超过100mg/L，上述方法中树脂与孕马尿的吸附比率往往不到1∶30，对于大规模生产而言，这个吸附比率是难以满足实际需要的。有效提高吸附树脂吸附孕马尿中的结合雌激素混合物的能力是本发明所要解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法及其所用大孔吸附树脂的应用，其采用了不同以往的含有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂，克服了现有技术之不足，其从孕马尿中吸附结合雌激素混合物能力大大提高，对于不同含量的孕马尿均有很强的吸附能力，非常适合于大规模生产化的实施。
本发明的技术方案之一是这样来实现的：一种从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法，该方法包括第一步对原料孕马尿进行预处理、第二步用大孔吸附树脂吸附孕马尿中的结合雌激素混合物、第三步用碱性水溶液洗涤负载结合雌激素混合物的大孔吸附树脂、第四步从大孔吸附树脂上洗脱并获得结合雌激素混合物，其中，大孔吸附树脂选用具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂。
本发明的技术方案之二是这样来实现的：一种具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂在从孕马尿中获取结合雌激素方法中的应用。
下面是对上述技术方案的进一步优化和/或选择：
上述具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂可选用由羧酸酯、苯乙烯-二乙烯苯聚合而成的具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性的大孔吸附树脂。
上述具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂的平均孔径可在50至120A°范围内、比表面可在400至1000m2/g范围内。
上述具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂可选用HPD-400、HPD-400A、HPD-450、HPD-100、AB-8牌号的中极性大孔吸附树脂中的一种或几种。
在第三步中，在温度为20℃至60℃下，用pH值为11.0至14.0的碱性水溶液洗涤负载结合雌激素混合物的大孔吸附树脂。
在第四步中，在温度为20℃至60℃下，用含有能与水混溶的低级醇或/和低级酮的极性有机溶剂的水溶液从大孔吸附树脂上洗脱并获得结合雌激素混合物，该用于洗脱的溶液即洗脱剂的pH为9至14，用无机碱或氢氧化钠或氢氧化钾或碳酸钠或碳酸钾或碳酸氢钾或碳酸氢钠来调节pH值，其极性有机溶剂与水的体积比为90∶10至20∶80。
上述碱性水溶液为无机碱水溶液或氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液或碳酸钠水溶液或碳酸钾水溶液或碳酸氢钾水溶液或碳酸氢钠水溶液，碱性水溶液的洗涤体积是吸附树脂体积的2倍至10倍，碱性水溶液通过装有吸附树脂的容器的流通速度为3份至10份碱性水溶液/1份吸附树脂/小时。
上述洗脱剂中的低级醇用甲醇或乙醇或正丙醇或异丙醇或丁醇，洗脱剂中的低级酮用丙酮或丁酮，洗脱剂的量为2份至10份/1份吸附树脂，洗脱剂流通吸附树脂容器的流通速度为3份至10份洗脱剂/1份吸附树脂/小时。
上述HPD-400、HPD-400A、HPD-450、HPD-100牌号的中极性大孔吸附树脂为沧州宝恩公司生产并在市场上销售的产品，上述AB-8牌号的中极性大孔吸附树脂为天津大学化工厂生产并在市场上销售的产品，该类树脂具有相似的结构单元如下：
在本发明的具体操作过程中，可以将上述中极性大孔吸附树脂装在吸附容器中，孕马尿与该中极性大孔吸附树脂在容器中充分接触。可以是将孕马尿与该树脂按一定比例混合，并有足够的搅拌混合时间，称之为静态吸附；或者孕马尿以一定的流速动态流通装载有该中极性大孔吸附树脂的吸附容器，称之为动态吸附。本发明优选动态吸附。
在本发明中，孕马尿与上述中极性大孔吸附树脂在容器中的动态吸附的马尿流通速率可以按1-10份孕马尿/1份树脂/小时的速度上柱吸附，并优选按4-6份孕马尿/1份树脂/小时的速度进行吸附。
在本发明中，上述中极性大孔吸附树脂具有良好的从孕马尿中吸附结合雌激素混合物的性能，按动态吸附方法，每份树脂最多可吸附150份体积的孕马尿，优选按40-100份孕马尿/1份树脂进行吸附。
在本发明中，收集所有流出吸附树脂容器洗脱剂，可以用浓缩、干燥等已知的常规方法获得结合雌激素混合物提取物，或可进一步经萃取提纯处理，用以制备符合制剂要求的结合雌激素混合物药物。
本发明与现有技术相比，应用本发明从孕马尿中提取结合雌激素混合物成分，从根本上克服了传统的液—液萃取提取方法的不足，解决了现有树脂提取方法的吸附容量低的缺点，使从孕马尿中吸附结合雌激素混合物能力大大提高，并且对于不同含量的孕马尿均有很强的吸附能力，从而具有更高的提取效率，更低的提取成本和利于环保要求，非常适合于大规模生产的需要。
具体实施方式
应用本发明提供的方法，以大孔吸附树脂从孕马尿中提取结合雌激素混合物的方法一般包括以下步骤：第一步对原料孕马尿进行预处理、第二步用大孔吸附树脂吸附孕马尿中的结合雌激素混合物、第三步用碱性水溶液洗涤负载结合雌激素混合物的大孔吸附树脂、第四步从大孔吸附树脂上洗脱并获得结合雌激素混合物，其中，大孔吸附树脂选用具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂。
根据本发明的方法，孕马尿在使用之前应经过预先处理，以获得尽量不含机械杂质成分的澄清的尿液，其目的防止是不洁的孕马尿在树脂吸附过程中对树脂性能产生影响。预先处理方法可以使用沉降和(或)过滤。一般而言，马尿经过24小时自然静置沉降后上层尿液也可以变的较为澄清。也可以使用机械的方法，如孕马尿经过离心沉降机离心沉降也可以变的较为澄清。如果需要获得更为澄清的孕马尿，则可以使用过滤的方法，如板式过滤器，膜过滤器，超滤等常规的方法。也可以通过组合的方法，如孕马尿先经过自然沉降和(或)机械沉降，然后在过滤可以获得更为澄清的孕马尿。
根据本发明的方法，所涉及的中极性大孔吸附树脂是一些新型的大孔吸附树脂，与以往从孕马尿中提取结合雌激素混合物的方法所涉及的大孔吸附树脂所不同的，是具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯大孔吸附树脂，具有中等极性和交联网状结构。具有这类结构的树脂有沧州宝恩公司的HPD-400，HPD-400A，HPD-450，HPD-100等牌号的树脂以及天津大学化工厂的AB-8等牌号的树脂。
根据本发明的方法，所涉及的具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯大孔吸附树脂，如采用动态吸附法，1份该树脂最多可以吸附150份孕马尿，优选40-100份马尿/1份树脂。
根据本发明的方法，负载结合雌激素混合物的该大孔吸附树脂可以用碱性水溶液洗涤，以除掉结合雌激素混合物成分以外的杂质成分。如果使用的是碱性水溶液，其pH值应在11-14之间，温度为20-80℃，而且碱性水溶液的洗涤量为2倍至10倍树脂体积。
根据本发明的方法，用极性有机溶剂或碱性的极性有机溶剂与水的混合溶液作为洗脱剂，从该大孔吸附树脂上洗脱结合雌激素混合物。该洗脱剂可以是一种或几种可与水混溶的低级烷醇、低级酮等极性有机溶剂，或者该洗脱剂为一种或几种可与水混溶的低级烷醇、低级酮等极性有机溶剂与水的混合液，并用碱性物质调整pH值为9.0-14.0。
本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
下面分别将本发明涉及的HPD-400牌号的树脂100mL装于柱径×柱高为2.4cm×30cm的柱中，用于下述实施例中。
实施例1：
将7000mL经过沉淀24小时和超滤的澄清孕马尿(结合雌激素混合物含量为115.1mg/L)在室温下以500mL/h的流速通过装载有上述吸附柱被吸附，吸附比率为1∶70；当7000mL孕马尿吸附到将要结束时，收集流出液，经HPLC检测，只有4.01mg/L的结合雌激素混合物泄露。然后先用600mL pH为12.0的氢氧化钠水溶液(温度为30℃)洗涤负载树脂，再以500mL的甲醇∶丙酮∶水为20∶30∶50的洗脱剂(用氢氧化钠调整pH13.0，控制洗脱温度为20℃)洗脱吸附树脂，并收集流出树脂柱的洗脱剂500mL。
实施例2：
将15000mL经过板框过滤器过滤的澄清孕马尿(结合雌激素混合物含量为56.7mg/L)在室温下以600mL/h的流速通过装载有上述吸附柱被吸附，吸附比率为1∶150；当15000mL孕马尿吸附到将要结束时，收集流出液，经HPLC检测，只有9.55mg/L的结合雌激素混合物泄露。然后先用500mL pH为13的氢氧化钾水溶液(温度为40℃)洗涤负载树脂，再以700mL的甲醇∶水为20∶80的洗脱剂(用碳酸钠调整pH11，控制洗脱温度为40℃)洗脱吸附树脂，并收集流出树脂柱的洗脱剂700mL。
实施例3：
将4000mL经过沉淀12小时和膜过滤的澄清孕马尿(结合雌激素混合物含量为216.4mg/L)在室温下以300mL/h的流速通过装载有上述吸附柱被吸附，吸附比率为1∶40；当4000mL孕马尿吸附到将要结束时，收集流出液，经HPLC检测，只有5.72mg/L的结合雌激素混合物泄露。然后先用400mL pH为14.0的氢氧化钠水溶液(温度为60℃)洗涤负载树脂，再以650mL的乙醇∶水为55∶45的洗脱剂(用氢氧化钾调整pH14.0，控制洗脱温度为60℃)洗脱吸附树脂，并收集流出树脂柱的洗脱剂650mL。
实施例4：
将6000mL经过沉淀24小时的澄清孕马尿(结合雌激素混合物含量为140.2mg/L)在室温下以400mL/h的流速通过装载有上述吸附柱被吸附，吸附比率为1∶60；当6000mL孕马尿吸附到将要结束时，收集流出液，经HPLC检测，只有7.93mg/L的结合雌激素混合物泄露。然后先用800mL pH为11.0的碳酸钠水溶液(温度为20℃)洗涤负载树脂，再以400mL的正丁醇∶水为90∶10的洗脱剂(用氢氧化钠调整pH12.0，控制洗脱温度为30℃)洗脱吸附树脂，并收集流出树脂柱的洗脱剂400mL。
从表一数据中我们可以看到，应用本发明的方法，对于不同结合雌激素混合物含量的孕马尿，其所涉及的树脂均有很好的吸附能力，并且最高可以达到150份孕马尿/1份吸附树脂的吸附比率，远高于公开的专利方法，较好的解决了以往方法吸附容量较低的问题。并且应用本发明的方法，经过后续的碱洗、洗脱等步骤，很容易将负载于树脂上的结合雌激素混合物成分洗脱下来，收率也较高。完全满足作为评价树脂提取工艺优劣的首选要求：吸附容量大，洗脱容易。
上述实施例实现了本发明的较佳效果，根据实际需要，还可将本发明中选项用的具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂应用到现有利用大孔吸附树脂从孕马尿中提取结合雌激素混合物的方法中，采用其现有技术中常规的技术手段和控制参数，也可以解决本发明所要解决的问题，并达到本发明的技术效果。
因此，应用本发明从孕马尿中提取结合雌激素混合物成分，从根本上克服了传统的液—液萃取提取方法的不足，解决了现有树脂提取方法的吸附容量低、无法适应不同含量的孕马尿吸附提取的缺点，具有更高的提取效率，更低的提取成本和利于环保要求，非常适合于大规模生产的需要。
                                            表一：实例有关数据
步骤 项目   单位    实施例1   实施例2  实施例3     实施例4
预处理步骤 沉降和(或)过滤    沉降24小时+超滤   板式过滤  沉降12小时+膜过滤     沉降24小时
吸附步骤 马尿量   mL    7000   15000  4000     6000
结合雌激素混合物含量   mg/L    115.1   56.7  216.4     140.2
孕马尿上柱吸附速度   mL/h    500   600  300     400
孕马尿与树脂的体积比吸附比率    70∶1   150∶1  40∶1     60∶1
孕马尿吸附结束时流出液的结合雌激素混合物含量 mg/L 4.01 9.55 5.72 7.93
洗涤步骤 用以调碱洗剂pH值的物质    氢氧化钠   氢氧化钾  氢氧化钠     碳酸钠
碱洗剂的体积   mL    600   500  400     800
碱洗剂的pH值    12   13  14     11
碱洗剂的温度   ℃    30   40  60     20
洗脱步骤 洗脱剂的体积   mL    500   700  650     400
洗脱剂的温度   ℃    20   40  60     30
用以调洗脱剂pH值的物质    氢氧化钠   碳酸钠  氢氧化钾     氢氧化钠
洗脱剂组成    甲醇∶丙酮∶水   甲醇∶水  乙醇∶水     正丁醇∶水
洗脱剂中有机溶剂与水的比例    20∶30∶50   20∶80  55∶45     90∶10
洗脱剂的pH值    13   11  14     12
收集的洗脱剂的体积   mL    500   700  650     400
收集的洗脱剂的结合雌激素混合物浓度   mg/L    1552.1   1111.7  1293.1     1995.7
总提取收率    96.3％   91.5％  97.1％     94.9％

Claims (10)

1、一种从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法，该方法包括第一步对原料孕马尿进行预处理、第二步用大孔吸附树脂吸附孕马尿中的结合雌激素混合物、第三步用碱性水溶液洗涤负载结合雌激素混合物的大孔吸附树脂、第四步从大孔吸附树脂上洗脱并获得结合雌激素混合物，其中，大孔吸附树脂选用具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂。
2、根据权利要求1所述的从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法，其特征在于具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂选用由羧酸酯、苯乙烯-二乙烯苯聚合而成的具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性的大孔吸附树脂。
3、据权利要求2所述的从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法，其特征在于具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂的平均孔径在50至120A°范围内、比表面在400至1000m2/g范围内。
4、据权利要求3所述的从孕马尿中获取结合雌激素混合物的方法，其特征在于具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂选用HPD-400、HPD-400A、HPD-450、HPD-100、AB-8牌号的中极性大孔吸附树脂中的一种或几种。
5、据权利要求1或2或3或4所述的从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法，其特征在于在第三步中，在温度为20℃至60℃下，用pH值为11.0至14.0的碱性水溶液洗涤负载结合雌激素混合物的大孔吸附树脂；或/和，在第四步中，在温度为20℃至60℃下，用含有能与水混溶的低级醇或/和低级酮的极性有机溶剂的水溶液从大孔吸附树脂上洗脱并获得结合雌激素混合物，该用于洗脱的溶液即洗脱剂的pH为9至14，用无机碱或氢氧化钠或氢氧化钾或碳酸钠或碳酸钾或碳酸氢钾或碳酸氢钠来调节pH值，其极性有机溶剂与水的体积比为90∶10至20∶80。
6、据权利要求5所述的从孕马尿中获取结合雌激素混合物方法，其特征在于碱性水溶液为无机碱水溶液或氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液或碳酸钠水溶液或碳酸钾水溶液或碳酸氢钾水溶液或碳酸氢钠水溶液，碱性水溶液的洗涤体积是吸附树脂体积的2倍至10倍，碱性水溶液通过装有吸附树脂的容器的流通速度为3份至10份碱性水溶液/1份吸附树脂/小时；洗脱剂中的低级醇用甲醇或乙醇或正丙醇或异丙醇或丁醇，洗脱剂中的低级酮用丙酮或丁酮，洗脱剂的量为2份至10份/1份吸附树脂，洗脱剂流通吸附树脂容器的流通速度为3份至10份洗脱剂/1份吸附树脂/小时。
7、一种具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂在从孕马尿中获取结合雌激素方法中的应用。
8、根据权利要求7所述的具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂在从孕马尿中获取结合雌激素方法中的应用，其特征在于具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂选用由羧酸酯、苯乙烯-二乙烯苯聚合而成的具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性的中极性大孔吸附树脂。
9、据权利要求8所述的具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂在从孕马尿中获取结合雌激素方法中的应用，其特征在于具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂的平均孔径在50至120A°范围内、比表面在400至1000m2/g范围内。
10、权利要求9所述的特定树脂在从孕马尿中获取结合雌激素方法中的应用，其特征在于具有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中极性大孔吸附树脂选用HPD-400、PD-400A、PD-450、B-8牌号的中极性大孔吸附树脂中的一种或几种。
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