CN103040866B - 含有结合雌激素的提取物及其提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有结合雌激素的提取物及其提取纯化方法，包括以下步骤：将采集的孕驴尿样品经过大孔树脂吸附柱分离，采用水混溶性溶剂进行梯度洗脱，得到含有结合态雌激素的浓缩液；将提取的结合态雌激素浓缩液，经反相C18柱富集纯化，进行上样、水混溶性溶剂梯度洗脱、收集组分浓缩，得到纯化的结合态雌激素混合物；将纯化的结合态雌激素混合物，加水和醋酸缓冲液，震荡，然后加酶进行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游离雌激素混合物。本发明采用苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂，再经C18反相柱纯化，首次从孕驴尿中得到结合态雌激素提取物，工艺简单，树脂可再生，节约成本，同时避免了常规使用的液-液和固-液提取法所产生的弊端。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有结合雌激素的提取物及其提取纯化方法，特别是涉及一种从孕驴尿中提取的含有结合雌激素的提取物及提取纯化方法。
背景技术
结合雌激素类药物主要用于激素替代疗法（Hormone Replacement Therapy，HRT），用于缓解任何雌激素不足的临床症状，治疗和预防女性生理或人工绝经后出现的更年期综合症，能够预防和治疗骨质疏松症和冠心病。许多妇女把结合雌激素看作是一种能延缓衰老，留住青春的“灵丹妙药”，美国惠氏公司也因此开始了在世界范围内对雌激素产品长达65年的垄断。
早期结合态雌激素提取研究中主要采用有机溶剂萃取方法，如低碳醇、酯、卤代烃等，有美国专利US2834712、US2429398、US2711988、US2519516，但该方法易产生乳化、沉淀现象，导致萃取效率低，雌激素损失过多等问题。上世纪60年代，美国专利US2551205开始采用活性炭提取结合雌激素混合物，之后相继出现了离子交换树脂、聚丙烯酸酯吸附树脂、反相硅胶进行提取的案例。但这些方法普遍存在再生困难，吸附效率低，工业成本高等特点。在近几年关于结合态雌激素的提取研究中，应用新型的大孔吸附树脂从孕马尿中提取雌激素的方法逐渐显露出前所未有的优势。该方法成本低、树脂可再生、吸附效率高，易于工业化生产。
孕马尿中富含雌激素，每升孕马尿中雌激素的平均含量为70~130mg，每匹孕马在孕期内可形成雌激素50～100g。目前市售的结合雌激素药物多为从孕马尿中提取的天然雌激素。驴和马同属马属，有着共同的起源，有不少共同特征。但从驴尿中提取含有结合态雌激素的提取物还未见有报道。本发明在现有技术基础上，采用苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂对孕驴尿中结合态雌激素进行吸附分离，并开创性的结合反相柱纯化工艺，成功从孕驴尿中提取到结合态雌激素混合物，填补了孕驴尿应用的空白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从孕驴尿中提取纯化结合态雌激素的方法及由此方法得到的含有结合雌激素的提取物。
为达上述目的，本发明一种从孕驴尿中提取纯化结合雌激素的方法，包括以下步骤：
（1）将采集的孕驴尿样品经过大孔树脂吸附柱分离，采用水混溶性溶剂进行梯度洗脱，得到含有结合态雌激素的浓缩液；
（2）将提取的结合态雌激素浓缩液，经反相C18柱富集纯化，进行上样、水混溶性溶剂梯度洗脱、收集组分浓缩，得到纯化的结合态雌激素混合物；
（3）将纯化的结合态雌激素混合物，加水和醋酸缓冲液，震荡，然后加酶进行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游离雌激素混合物。
本发明的方法，其中优选所述步骤（1）所用的大孔吸附树脂为苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂，市场有售。
本发明的方法，其中优选所述步骤（2）所用纯化方法为反相C18柱分离纯化，且上样前，C18反相柱经洗脱溶剂冲洗，预先平衡直到获得稳定的基线。
本发明的方法，其中优选所述步骤（3）醋酸缓冲液浓度为0.2M，pH=5.2。
本发明的方法，其中优选所述步骤（3）中所用酶为硫酸酯酶。
本发明的方法，其中优选所述水混溶性洗脱溶剂选自低级链烷醇，更优选为甲醇或乙醇。
本发明的方法，其中优选所述步骤（1）中的孕驴尿为孕期在3个月到10个月之间的孕驴尿液。
本发明还涉及由上述方法得到的含有结合雌激素的提取物。
进一步地，本发明含有结合雌激素的提取物中三种主要结合态雌激素为雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠。
本发明与现有技术不同之处在于，相比之前结合态雌激素多从孕马尿中提取，本发明首次从孕驴尿中提取结合态雌激素，得到了含有雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠三种结合态雌激素的混合物。本发明在现有技术基础上，采用市售苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂进行吸附分离，再经C18反相柱纯化、进行上样、水混溶性溶剂梯度洗脱，从孕驴尿中得到结合态雌激素提取物，由于常规使用的液-液和固-液提取方法中出现的诸多问题，如乳化层形成、沉淀、再生困难等现象，导致提取过程损失严重、成本增加、效率低。本发明克服了上述方法所产生的弊端，采用大孔吸附树脂方法实现了快速、简便地从孕驴尿中获得富集的结合雌激素混合物成分，并开创性的结合反相柱分离对富集的结合雌激素混合物进行了纯化，得到的提取产品中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠成分含量高。本发明工艺简单，树脂可再生，节约成本，产品收率高，易于工业化生产。
具体实施方式
以下结合实施例和试验数据，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
本发明具体实施例中所涉及的实验材料来源：
1、孕驴尿液采自新疆喀什岳普湖。
2、洗脱及萃取溶剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
3、硫酸酯酶购自上海西格玛奥德里奇有限公司。
4、液相检测所用标准品雌酮、马烯雌酮、17α-雌二醇购自上海西格玛奥德里奇有限公司。
实施例1
将1L采集的孕期在3个月到10个月之间的孕驴尿样品经过苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂吸附柱分离，分别用0％，15％，60%，100%乙醇洗脱3个柱体积，取60%洗脱部分浓缩20倍得浓缩液。将得到的孕驴尿浓缩液，经C18反相柱纯化，依次用20%，40%，60%，80%，90%，100%甲醇各1000mL洗脱，收集馏分并分别浓缩至100mL，得到纯化的结合态雌激素混合物。取90%甲醇洗脱部分纯化的混合物1mL，加水100mL，加0.2M、pH5.2的醋酸缓冲液100mL，震荡30min，然后加硫酸酯酶约100mg，在磁力搅拌器上搅拌加热1小时，温度40℃。水解后，用等体积的乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯萃取液合并浓缩至几乎干，加入5mL甲醇，得到结合态雌激素提取物。经高效液相检测（检测过程请参见试验例1）提取物中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠三种结合态雌激素，含量分别为2.91mg/L、2.14mg/L、20.45mg/L。
实施例2
将1L采集的孕期在3个月到10个月之间的孕驴尿样品经过苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂吸附柱分离，分别用10％，30%，50%，100%乙醇洗脱3个柱体积，取50%洗脱部分浓缩20倍得浓缩液。将得到的孕驴尿浓缩液，经C18反相柱纯化，依次用20%，40%，60%，80%，90%，100%甲醇各1000mL洗脱，收集馏分并分别浓缩至100mL，得到纯化的结合态雌激素混合物。取90%甲醇洗脱部分纯化的混合物1mL，加水100mL，加0.2M、pH5.2的醋酸缓冲液100mL，震荡30min，然后加硫酸酯酶约100mg，在磁力搅拌器上搅拌加热1小时，温度40℃。水解后，用等体积的乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯萃取液合并浓缩至几乎干，加入5mL甲醇，得到结合态雌激素提取物。经高效液相检测（检测过程请参见试验例1）提取物中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠含量分别为3.11mg/L、4.2mg/L、18.58mg/L。
实施例3
将1L采集的孕期在3个月到10个月之间的孕驴尿样品经过苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂吸附柱分离，分别用0%，15%，60%，100%乙醇洗脱3个柱体积，取60%洗脱部分浓缩20倍得浓缩液。将得到的孕驴尿浓缩液，经C18反相柱纯化，依次用20%，50%，80%，100%甲醇各1000mL洗脱，收集馏分并分别浓缩至100mL，得到纯化的结合态雌激素混合物。取100%甲醇洗脱部分纯化的混合物1mL，加水100mL，加0.2M、pH5.2的醋酸缓冲液100mL，震荡30min，然后加硫酸酯酶约100mg，在磁力搅拌器上搅拌加热1小时，温度40℃。水解后，用等体积的乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯萃取液合并浓缩至几乎干，加入5mL甲醇，得到结合态雌激素提取物。经高效液相检测（检测过程请参见试验例1）提取物中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠三种结合态雌激素，含量分别为2.91mg/L、2.14mg/L、20.45mg/L。
实施例4
将1L采集的孕期在3个月到10个月之间的孕驴尿样品经过苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂吸附柱分离，分别用0%，15%，60%，100%乙醇洗脱3个柱体积，取60%洗脱部分浓缩20倍得浓缩液。将得到的孕驴尿浓缩液，经C18反相柱纯化，依次用20%，40%，60%，80%，90%，100%甲醇各1000mL洗脱，收集馏分并分别浓缩至100mL，得到纯化的结合态雌激素混合物。取90%甲醇洗脱部分纯化的混合物1mL，加水100mL，加0.2M、pH5.2的醋酸缓冲液100mL，震荡30min，然后加硫酸酯酶约50mg，在磁力搅拌器上搅拌加热1小时，温度40℃。水解后，用等体积的乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯萃取液合并浓缩至几乎干，加入5mL甲醇，得到结合态雌激素提取物。经高效液相检测（检测过程请参见试验例1）提取物中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠三种结合态雌激素，含量分别为1.87mg/L、0.95mg/L、11.23mg/L。
实施例5
将1L采集的孕期在3个月到10个月之间的孕驴尿样品经过苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂吸附柱分离，分别用0%，15%，60%，100%乙醇洗脱3个柱体积，取60%洗脱部分浓缩20倍得浓缩液。将得到的孕驴尿浓缩液，经C18反相柱纯化，依次用20%，40%，60%，80%，90%，100%甲醇各1000mL洗脱，收集馏分并分别浓缩至100mL，得到纯化的结合态雌激素混合物。取90%甲醇洗脱部分纯化的混合物1mL，加水100mL，加0.2M、pH5.2的醋酸缓冲液100mL，震荡30min，然后加硫酸酯酶约100mg，在磁力搅拌器上搅拌加热2小时，温度40℃。水解后，用等体积的乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯萃取液合并浓缩至几乎干，加入5mL甲醇，得到结合态雌激素提取物。经高效液相检测（检测过程请参见试验例1）提取物中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠三种结合态雌激素，含量分别为3.51mg/L、4.51mg/L、17.59mg/L。
实施例6
将1L采集的孕期在3个月到10个月之间的孕驴尿样品经过苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂吸附柱分离，分别用10%，20%，50%，70%，80%，100%甲醇洗脱3个柱体积，取50%和70%洗脱部分浓缩20倍得浓缩液。将得到的孕驴尿浓缩液，经C18反相柱纯化，依次用20%，50%，80%，100%乙醇各1000mL洗脱，收集馏分并分别浓缩至100mL，得到纯化的结合态雌激素混合物。取100%甲醇洗脱部分纯化的混合物1mL，加水100mL，加0.2M、pH5.2的醋酸缓冲液100mL，震荡30min，然后加硫酸酯酶约100mg，在磁力搅拌器上搅拌加热1小时，温度40℃。水解后，用等体积的乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯萃取液合并浓缩至几乎干，加入5mL甲醇，得到结合态雌激素提取物。经高效液相检测（检测过程请参见试验例1）提取物中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠三种结合态雌激素，含量分别为5.21mg/L、2.67mg/L、21.33mg/L。
将上述实施例1-6提取纯化得到的结合态雌激素混合物进行含量检测如下：
试验例1孕驴尿雌激素提取物高效液相色谱检测
测试仪器：高效液相色谱仪（Agilent1100）色谱柱：C185μm，250×4.6nm
流动相：A相为0.3%乙酸，B相为纯乙腈；
洗脱条件：0~10min，80%~60%A；10~20min，60%~30%A；20~30min，30%-5%A；30~35min，5%~0%A。
检测条件：柱温为28℃，流速，1ml/min，检测波长270nm，进样体积20μl。
测试步骤：
取1ml上述实施例得到的结合态雌激素提取物，通过0.22μm一次性过滤器过滤，滤液加入进样瓶中经液相检测。样品测定采用色谱峰的保留时间定性，采用外标法以峰面积定量，测量结果如上述实施例中所述。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种从孕驴尿中提取纯化结合雌激素的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将采集的孕驴尿样品经过大孔树脂吸附柱分离，采用水混溶性溶剂进行梯度洗脱，得到含有结合态雌激素的浓缩液；
（2）将提取的结合态雌激素浓缩液，经反相C18柱富集纯化，进行上样、水混溶性溶剂梯度洗脱、收集组分浓缩，得到纯化的结合态雌激素混合物；
（3）将纯化的结合态雌激素混合物，加水和醋酸缓冲液，震荡，然后加酶进行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游离雌激素混合物；
其中，
所述步骤（1）所用的大孔吸附树脂为苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂；所述洗脱溶剂为甲醇或乙醇；所述孕驴尿为孕期在3个月到10个月之间的孕驴尿液；
所述步骤（2）所用纯化方法为反相C18柱分离纯化，且上样前，C18反相柱经洗脱溶剂预先平衡；
所述步骤（3）醋酸缓冲液浓度为0.2M，pH=5.2，所述步骤（3）中所用酶为硫酸酯酶。
2.权利要求1所述的方法得到的含有结合雌激素的提取物。
3.根据权利要求2所述的提取物，其特征在于：所述的提取物混合物中三种主要结合态雌激素为雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-雌二醇硫酸钠。
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