CN107573396B - 一种利用色谱-3和动态轴向压缩柱色谱法纯化制备高纯度鹅去氧胆酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鹅去氧胆酸的纯化方法，具体涉及一种利用色谱‑3柱色谱和动态轴向压缩柱色谱两步法纯化制备高纯度鹅去氧胆酸的方法。其步骤为：将待纯化处理的低含量的CDCA样品用装填聚苯乙烯/二乙烯基苯型色谱填料的色谱‑3柱色谱分离纯化，获得CDCA粗品，然后将CDCA粗品动态轴向压缩柱色谱分离纯化，获得高纯度CDCA。本发明工艺可纯化15‑20％纯度的鹅去氧胆酸得到70‑80％纯度的CDCA，再经DAC纯化可得到纯度97.5％以上，收率在90％以上，是一种高效、环保、适用性强的工业制备高纯度鹅去氧胆酸的分离纯化方法，可以轻易实现从实验室到工业化鹅去氧胆酸单体的高效分离纯化。

Description

一种利用色谱-3和动态轴向压缩柱色谱法纯化制备高纯度鹅 去氧胆酸的方法

技术领域

本发明涉及鹅去氧胆酸的纯化方法，具体涉及利用色谱-3和动态轴向压缩柱色谱法纯化制备高纯度鹅去氧胆酸的方法。

背景技术

熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酸，是一种具有无毒性的亲水胆酸，具有广泛的治疗作用。目前熊去氧胆酸主要用于治疗固醇性胆结石、原发性硬化性胆管炎、胆源性膜腺炎和胆汁反流性胃炎等疾病，也是用于治疗胆汁淤积性肝病的首选药物，并且可以用于治疗慢性肝炎和肝移植后排斥反应，临床效果良好。熊去氧胆酸是熊类胆汁中特有的胆汁酸成分，结构式如通式⑴所示：

目前获得熊去氧胆酸的方法主要有两种。第一种方法是通过养殖熊，然后通过活体引流的方法取其的胆汁，再经提取分离得到熊去氧胆酸。但该方法的效率不高，时间周期较长，且较大程度上伤害了熊的身体。第二种是通过其他原料合成熊去氧胆酸，如鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸。鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)是UDCA的7α差向异构体，化学名为3α,7α-二羟基-5β-胆烷-24-酸。其结构式如通式⑵所示：

文献报道CDCA合成UDCA的路线主要有3种。①以CDCA为原料，经甲酯化、选择性保护羟基、Jones试剂氧化、金属钠和二氯化镍还原得UDCA，总收率42％。②以CDCA为原料，在800℃、选用高专一性复合型Ni-Al₂O₃催化剂、高压、加氢还原制得UDCA，总收率65％。③以7-酮石胆酸为原料，用氢气-Raney镍高压还原或电化学还原得到UDCA，收率大于90％。其中7-酮石胆酸的合成可以CDCA为原料，丙酮和水为介质，经N-溴代丁二酰亚胺(NBS)氧化制得，收率达89％。

鹅去氧胆酸本身是目前世界上用量最大的治疗胆结石药物之一，同时也是合成熊去氧胆酸和其他甾体化合物的主要医药中间体原料。由于鹅去氧胆酸的来源比较广泛，可以从其他动物的胆中获得，例如鸡胆、鸭胆和猪胆，所以在工业上，通常采用鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸。传统制备CDCA的方法具有普遍性的不足，例如：产品收率较低，纯度不高等。上世纪80年使用的酒精法和盐析法方法落后繁琐，所得产品纯度较低，仅60％左右(商业部动物生物制药学，人民卫生出版社，1980：256)，该方法现基本不采用。CN102827234A公开了利用鸭胆汁提取鹅去氧胆酸的方法，但该方法大量使用乙酸乙酯、污染性大、工艺参数可重复性差；而CN1775798A公开的利用禽类胆汁提取鹅去氧胆酸的方法，由于该方法经皂化之后直接进用大孔树脂进行分离纯化，分离效果差，再进行超滤纯化，增加了该工艺的复杂性，使CDCA损失增多。2012年10月03日中国专利CN102703556A公开了“一种大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法”。该工艺分为两步：第一步为微生物溶液制作，第二步为大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸。该工艺操作比较复杂，耗时也较长，采用了甲醇等有毒有机溶剂及较多种类的无机试剂。

综上现有技术鹅去氧胆酸的纯化方法主要存在如下不足：1.大量使用有毒有害有机溶剂，污染大，对操作人员造成伤害。2.工艺复杂，可重复性差。3.产品纯度及收率低，达不到市场对鹅去氧胆酸产品高纯度(95％以上)的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足而提供一种利用色谱-3柱色谱和动态轴向压缩柱色谱两步法纯化制备高纯度鹅去氧胆酸的方法。本发明通过采用一种新型的高分子材料色谱-3柱色谱和动态轴向压缩柱色谱两步法纯化制备高纯度鹅去氧胆酸的方法，工艺过程简便，可重复性强；使用溶剂无毒无害；产品纯度高。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

提供一种利用色谱-3柱色谱和动态轴向压缩柱色谱两步法纯化制备高纯度鹅去氧胆酸的方法，其步骤为：

将待纯化处理的低含量的CDCA样品溶液用装填聚苯乙烯/二乙烯基苯型(PS/DVB)色谱填料的色谱-3柱色谱分离纯化，获得CDCA粗品，然后将CDCA粗品动态轴向压缩柱色谱分离纯化，获得高纯度CDCA；

其中：所述的色谱-3柱色谱分离纯化步骤为：将色谱-3柱预处理，吸附剂即色谱填料装柱，将待纯化的低含量CDCA样品上样于色谱-3柱中，用洗脱剂洗脱浓缩，得到CDCA粗品；

所述的动态轴向压缩柱色谱分离纯化步骤为：将动态轴向压缩柱装填填料，系统平衡，然后将上述色谱-3柱色谱分离纯化后的CDCA粗品配成样品溶液注入平衡后的动态轴向压缩柱，洗脱，浓缩获得CDCA成品。

按上述方案，所述色谱分离纯化工艺中待纯化处理的低含量的CDCA样品用30％-80％的乙醇将CDCA配成50-90mg/ml的样品溶液；所述CDCA样品可选自初级加工的CDCA含量15-20％的鹅去氧胆酸。

按上述方案，所述的色谱-3柱预处理为：采用95％乙醇膨胀24小时；再用水洗至无浑浊；40％乙醇洗脱5–6BV。

按上述方案，所述色谱分离纯化工艺中将为待分离的CDCA样品量5-20倍量的色谱-3吸附剂聚苯乙烯/二乙烯基苯型(PS/DVB)色谱填料采用湿法上柱。

按上述方案，所用色谱分离纯化工艺中色谱柱柱尺寸为直径2cm*20cm(上样柱长：约7.1cm，柱体积约23ml，保留体积约40ml)。

按上述方案，所述的色谱分离纯化工艺中：先用30％-45％乙醇洗脱，去掉杂质，再用47％-60％的乙醇洗脱，洗脱色谱-3柱上吸附的CDCA样品，洗脱过程中用硅胶TLC检测分离情况，当TLC检测到收集到的样品基本为CDCA时，开始收集样品，然后当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。

按上述方案，TLC展开剂为体积比为5：5：0.6的石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸混合溶液。

按上述方案，所述的色谱分离纯化工艺中的浓缩为：将洗脱收集到的含鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品。

按上述方案，所述第一步色谱分离纯化工艺获得的鹅去氧胆酸粗品(CDCA粗品)纯度为70-80％；最后得到的CDCA成品纯度大于97％，收率大于90％。

按上述方案，所述的动态轴向压缩柱色谱分离纯化工艺为：

将200～800目硅胶填料用流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；用流动相冲洗装填后的动态轴向压缩柱，持续一段时间，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；

将上述色谱-3柱色谱分离纯化后的CDCA粗品配成样品溶液注入平衡后的动态轴向压缩柱，流动相洗脱，收集样品，浓缩，得到CDCA粗品；

CDCA粗品样品溶液的浓度为0.2-0.8g/ml；所述的流动相为石油醚、乙酸乙酯、甲酸按照体积比例9:5:0.6-13:5:0.6组成的混合液。

按上述方案，所述的CDCA粗品用流动相溶解超声后过滤，将滤液用流动相稀释成样品溶液。

按上述方案，所述的动态轴向压缩柱尺寸为直径50cm*250cm。

按上述方案，所述的动态轴向压缩柱色谱分离纯化工艺洗脱过程中用硅胶TLC检测样品分离情况，收集含鹅去氧胆酸部分，当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。

按上述方案，上述TLC展开剂为体积比为5：5：0.6的石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸混合液。

按上述方案，所述的动态轴向压缩柱色谱分离纯化工艺中浓缩为将洗脱收集到的鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品。

本专利方法的优势：

本发明公开了一种两步法纯化鹅去氧胆酸的方法：色谱-3初步纯化和动态轴向压缩柱(DAC)精细纯化鹅去氧胆酸(CDCA)单体技术，本发明工艺可纯化15-20％纯度的鹅去氧胆酸得到70-80％纯度的CDCA，再经DAC纯化可得到纯度97.5％以上，收率在90％以上。工艺简单，所用有机溶剂价格便宜，消耗量少，且均可以回收再用，有效降低生产成本；采用的高分子材料色谱-3(聚苯乙烯/二乙烯基苯型(PS/DVB)聚合物类型填料)用在鹅去氧胆酸的分离上与其疏水性、吸附性相适配，对CDCA与其他杂质的选择性好；操作简单，生产效率高，产品质量容易控制；等度洗脱，对设备性能要求低，生产周期短，连续进样可大大节省制备时间，是一种高效、环保、适用性强的工业制备高纯度鹅去氧胆酸的分离纯化方法，可以轻易实现从实验室到工业化鹅去氧胆酸单体的高效分离纯化。

附图说明

图1.TLC检测CDCA经色谱-3纯化后结果图；

图2.TLC检测CDCA经DAC纯化后结果图；

图3.HPLC检测CDCA初级产品(含量15％)色谱图；

图4.HPLC检测CDCA经色谱-3纯化后结果图；

图5.HPLC检测CDCA经DAC纯化后结果图。从图1中可以看出：色谱-3纯化15％CDCA粗品，流分26份以前基本是杂质比较多的洗下，没有鹅去氧胆酸；27以后基本上是鹅去氧胆酸洗脱下来，但还是有一部分杂质在其中，37以后检测均为一个CDCA的斑点，可收集。

从图2中可以看出：经DAC纯化70-80％的CDCA时，从流份37直至65基本上都是只有一个鹅去氧胆酸斑点。

从图3中可以看出：经HPLC检测CDCA初级产品(含量15％)，里面杂质非常多，t_R22.54是CDCA的峰。

从图4可以看出：经HPLC检测色谱-3纯化后的CDCA，杂质含量比较少，t_R 22.90是CDCA的峰。

从图5可以看出：经HPLC检测DAC纯化后的CDCA，杂质很少，t_R 22.59是CDCA的峰。

具体实施方式

实施例1

1.色谱-3柱色谱分离纯化工艺步骤：

(1)色谱-3预处理：采用95％乙醇膨胀24小时；再用水洗至无浑浊；40％乙醇平衡5–6BV。

(2)样品溶液的配制：取CDCA粗品(纯度为15％)3g用40％乙醇配成含CDCA约60mg/ml的样品溶液，约50ml。

(3)吸附剂装柱：取15g色谱-3填料(聚苯乙烯/二乙烯基苯型(PS/DVB)色谱填料)，采用湿法上柱，所用色谱柱柱尺寸为直径2cm*20cm(上样柱长：约7.1cm，柱体积约23ml，保留体积约40ml)。

(4)上样：将样品溶液沿色谱管壁缓缓加入装有色谱-3的色谱柱中，注意勿使吸附剂翻起。上样后，20-30％乙醇洗脱，收集洗出液(约5-6BV)用TLC检测，TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(体积比为：5：5：0.6)，发现没有CDCA斑点，表明没有过载。

(5)洗脱：先用40％乙醇洗脱去掉杂质，再用50％乙醇洗脱下CDCA产品。洗脱过程中硅胶TLC检测分离情况，TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(5：5：0.6)。当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。具体地：用40％乙醇洗脱，每份收集5ml，fr5-17硅胶TLC检测为杂质斑点,共约65ml，约3BV。用50％乙醇洗脱，fr18-36TLC检测为CDCA与HDCA及其他杂质的混合物，约4BV；继续洗脱程中，fr37～70硅胶TLC检测均为一个CDCA的斑点，合并，共约170m，约7BV，即收集得到的含鹅去氧胆酸单体溶液。

(6)浓缩：将步骤(5)收集到的含鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品，约0.4103g(理论量为0.45，以CDCA含量15％计算)，收率：91％。

(7)高效液相检测：取CDCA单体0.05g，溶解后定容到100ml，再分别从中取20ul，分别采用液相色谱法检测，纯度达75.2％以上。样品分析色谱条件Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈-0.05％磷酸水(45∶55)，流速1.0ml·min^-1，柱温30℃，进样量：20μl，检测波长：195nm。

2.动态轴向压缩柱色谱分离纯化技术步骤：

(1)流动相配制：用石油醚、乙酸乙酯、甲酸按照体积比例11:5:0.6配制流动相，作为样品洗脱液；

(2)溶解过滤：将10g鹅去氧胆酸粗品用体积比例为11:5:0.6的石油醚、乙酸乙酯、甲酸混合溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液用步骤(1)配制的流动相稀释成浓度为0.5g/ml的样品；

(3)动态轴向压缩柱装填：将250g的200～800目极性硅胶填料用步骤(1)配制的流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入尺寸为直径50cm*250cm的动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；

(4)系统平衡：用步骤(1)配制的流动相冲洗步骤(3)装填的动态轴向压缩柱，持续10～20min，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；

(5)洗脱分离：将步骤(2)所得样品注入步骤(4)平衡后的动态轴向压缩柱，流动相洗脱，输液泵的流速为200ml/min，洗脱过程中用硅胶TLC检测样品分离情况，收集含鹅去氧胆酸部分，当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(5：5：0.6)。

(6)浓缩：将步骤(5)收集到的鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品。

(7)高效液相检测：取CDCA单体0.05g，溶解后定容到100ml，再分别从中取20ul，分别采用液相色谱法检测，纯度均达97.5％以上。样品分析色谱条件Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈-0.05％磷酸水(45∶55)，流速1.0ml·min^-1，柱温30℃，进样量：20μl，检测波长：195nm。

实施例2

1.色谱-3柱色谱分离纯化工艺步骤：

(1)色谱-3预处理：采用95％乙醇膨胀24小时；再用水洗至无浑浊；40％乙醇平衡5–6BV。

(2)样品溶液的配制：取CDCA粗品(纯度为15％)3g用50％乙醇配成含CDCA约80mg/ml的样品溶液，约50ml。

(3)吸附剂装柱：取15g色谱-3填料(聚苯乙烯/二乙烯基苯型(PS/DVB)色谱填料)，采用湿法上柱，所用色谱柱柱尺寸为直径2cm*20cm(上样柱长：约7.1cm，柱体积约23ml，保留体积约40ml)。

(4)上样：将样品溶液沿色谱管壁缓缓加入装有色谱-3的色谱柱中，注意勿使吸附剂翻起。上样后，20-30％乙醇洗脱，收集洗出液(约5-6BV)用TLC检测，TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(体积比为：5：5：0.6)，发现没有CDCA斑点，表明没有过载。

(5)洗脱：用37％和57％的乙醇洗脱，洗脱过程中硅胶TLC检测分离情况，TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(5：5：0.6)。当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。具体地：

用37％乙醇洗脱,每份收集5ml，fr5-17硅胶TLC检测为杂质斑点,共约65ml，约3BV。

用57％乙醇洗脱，TLC检测，硅胶TLC检测为CDCA与HDCA及其他杂质的混合物，共约95ml，约4BV；硅胶TLC检测均为一个CDCA的斑点，合并，共约170m，约7BV。

(6)浓缩：将步骤(5)收集到的含鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品，约0.4112g(理论量为0.45，以CDCA含量15％计算)，收率：90.5％。

(7)高效液相检测：取CDCA单体0.05g，溶解后定容到100ml，再分别从中取20ul，分别采用液相色谱法检测，纯度均达75％以上。样品分析色谱条件Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈-0.05％磷酸水(45∶55)，流速1.0ml·min^-1，柱温30℃，进样量：20μl，检测波长：195nm。

2.动态轴向压缩柱色谱分离纯化技术步骤：

(1)流动相配制：用石油醚、乙酸乙酯、甲酸按照体积比例10:5:0.6配制流动相，作为样品洗脱液；

(2)溶解过滤：将10g鹅去氧胆酸粗品用体积比例为10:5:0.6的石油醚、乙酸乙酯、甲酸混合溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液用步骤(1)配制的流动相稀释成浓度为0.5g/ml的样品；其中鹅去氧胆酸粗品由色谱-3柱色谱纯化得到，纯度为75.7％

(3)动态轴向压缩柱装填：将250g的200～800目极性硅胶填料用步骤(1)配制的流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入尺寸为直径50cm*250cm的动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；

(4)系统平衡：用步骤(1)配制的流动相冲洗步骤(3)装填的动态轴向压缩柱，持续10～20min，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；

(5)洗脱分离：将步骤(2)所得样品注入步骤(4)平衡后的动态轴向压缩柱，流动相洗脱，输液泵的流速为200ml/min，洗脱过程中用硅胶TLC检测样品分离情况，收集含鹅去氧胆酸部分，当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(5：5：0.6)。

(6)浓缩：将步骤(5)收集到的鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品。

(7)高效液相检测：取CDCA单体0.05g，溶解后定容到100ml，再分别从中取20ul，分别采用液相色谱法检测，纯度达97.7％以上。样品分析色谱条件Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈-0.05％磷酸水(45∶55)，流速1.0ml·min^-1，柱温30℃，进样量：20μl，检测波长：195nm。

实施例3

1.色谱-3柱色谱分离纯化工艺步骤：

(1)色谱-3预处理：采用95％乙醇膨胀24小时；再用水洗至无浑浊；40％乙醇平衡5–6BV。

(2)样品溶液的配制：取CDCA粗品(纯度为15％)3g用40％乙醇配成含CDCA约60mg/ml的样品溶液，约50ml。

(3)吸附剂装柱：取15g色谱-3填料(聚苯乙烯/二乙烯基苯型(PS/DVB)色谱填料)，采用湿法上柱，所用色谱柱柱尺寸为直径2cm*20cm(上样柱长：约7.1cm，柱体积约23ml，保留体积约40ml)。

(4)上样：将样品溶液沿色谱管壁缓缓加入装有色谱-3的色谱柱中，注意勿使吸附剂翻起，上样后，20-30％乙醇洗脱，收集洗出液(约5-6BV)用TLC检测，TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(体积比为：5：5：0.6)，发现没有CDCA斑点，表明没有过载。

(5)洗脱：用35％和55％的乙醇洗脱，洗脱过程中硅胶TLC检测分离情况，TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(5：5：0.6)。当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。具体地：

用35％乙醇洗脱,每份收集5ml，fr5-17硅胶TLC检测为杂质斑点,共约65ml，约3BV。

用55％乙醇洗脱，TLC检测，检测为CDCA与HDCA及其他杂质的混合物，共约95ml，约4BV；硅胶TLC检测均为一个CDCA的斑点，合并，共约170m，约7BV。

(6)浓缩：将步骤(5)收集到的含鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品，约0.4050g(理论量为0.45，以CDCA含量15％计算)，收率：90.4％。

(7)高效液相检测：取CDCA单体0.05g，溶解后定容到100ml，再分别从中取20ul，分别采用液相色谱法检测，纯度均达75％以上。样品分析色谱条件Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈-0.05％磷酸水(45∶55)，流速1.0ml·min^-1，柱温30℃，进样量：20μl，检测波长：195nm。

2.动态轴向压缩柱色谱分离纯化技术步骤：

(1)流动相配制：用石油醚、乙酸乙酯、甲酸按照体积比例10:5:0.6配制流动相，作为样品洗脱液；

(2)溶解过滤：将10g鹅去氧胆酸粗品用体积比例为10:5:0.6的石油醚、乙酸乙酯、甲酸混合溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液用步骤(1)配制的流动相稀释成浓度为0.5g/ml的样品；其中鹅去氧胆酸粗品由色谱-3柱色谱纯化得到，纯度为74.7％

(3)动态轴向压缩柱装填：将250g的200～800目极性硅胶填料用步骤(1)配制的流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入尺寸为直径50cm*250cm的动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；

(4)系统平衡：用步骤(1)配制的流动相冲洗步骤(3)装填的动态轴向压缩柱，持续10～20min，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；

(5)洗脱分离：将步骤(2)所得样品注入步骤(4)平衡后的动态轴向压缩柱，流动相洗脱，输液泵的流速为200ml/min，洗脱过程中用硅胶TLC检测样品分离情况，收集含鹅去氧胆酸部分，当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(5：5：0.6)。

(6)浓缩：将步骤(5)收集到的鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品。

(7)高效液相检测：取CDCA单体0.05g，溶解后定容到100ml，再分别从中取20ul，分别采用液相色谱法检测，纯度达97.7％以上。样品分析色谱条件Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈-0.05％磷酸水(45∶55)，流速1.0ml·min^-1，柱温30℃，进样量：20μl，检测波长：195nm。

Claims (10)

1.一种利用色谱-3柱色谱和动态轴向压缩柱色谱两步法纯化制备高纯度鹅去氧胆酸的方法，其特征在于：步骤为：

将待纯化处理的低含量的CDCA样品溶液用装填聚苯乙烯/二乙烯基苯型色谱填料的色谱-3柱色谱分离纯化，获得CDCA粗品，然后将CDCA粗品动态轴向压缩柱色谱分离纯化，获得高纯度CDCA；

其中：所述的色谱-3柱色谱分离纯化步骤为：将色谱-3柱预处理，吸附剂即色谱填料装柱，将待纯化的低含量CDCA样品上样于色谱-3柱中，用洗脱剂洗脱浓缩，得到CDCA粗品；

所述的动态轴向压缩柱色谱分离纯化步骤为：将动态轴向压缩柱装填填料，系统平衡，然后将上述色谱-3柱色谱分离纯化后的CDCA粗品配成样品溶液注入平衡后的动态轴向压缩柱，洗脱，浓缩获得CDCA成品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱分离纯化工艺中待纯化处理的低含量的CDCA样品用30％-80％的乙醇将CDCA配成50-90mg/ml的样品溶液；所述CDCA样品可选自初级加工的CDCA含量15-20％的鹅去氧胆酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱分离纯化工艺中将为待分离的CDCA样品量5-20倍量的色谱-3吸附剂聚苯乙烯/二乙烯基苯型色谱填料采用湿法上柱。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：色谱-3柱采用95％乙醇膨胀24小时；再用水洗至无浑浊；40％乙醇洗脱5–6BV；

所用色谱分离纯化工艺中色谱-3柱柱尺寸为直径2cm*20cm；

所述的色谱分离纯化工艺中的浓缩为：将洗脱收集到的含鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱分离纯化工艺中：先用30％-45％乙醇洗脱，去掉杂质，再用47％-60％的乙醇洗脱，洗脱色谱-3柱上吸附的CDCA样品，洗脱过程中用硅胶TLC检测分离情况，当TLC检测到收集到的样品基本为CDCA时，开始收集样品，然后当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的动态轴向压缩柱色谱分离纯化工艺为：

将200～800目硅胶填料用流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；用流动相冲洗装填后的动态轴向压缩柱，持续一段时间，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；

将上述色谱-3柱色谱分离纯化后的CDCA粗品配成样品溶液注入平衡后的动态轴向压缩柱，流动相洗脱，收集样品，浓缩，得到CDCA粗品；

CDCA粗品样品溶液的浓度为0.2-0.8g/ml；所述的流动相为石油醚、乙酸乙酯、甲酸按照体积比例9:5:0.6-13:5:0.6组成的混合液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的CDCA粗品用流动相溶解超声后过滤，将滤液用流动相稀释成样品溶液。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的动态轴向压缩柱色谱分离纯化工艺洗脱过程中用硅胶TLC检测样品分离情况，收集含鹅去氧胆酸部分，当TLC检测到鹅去氧胆酸含量极微时，洗脱结束。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的动态轴向压缩柱尺寸为直径50cm*250cm；

所述的动态轴向压缩柱色谱分离纯化工艺中浓缩为将洗脱收集到的鹅去氧胆酸单体溶液合并减压浓缩，至出现大量白色固体，抽滤，干燥，即得鹅去氧胆酸成品。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一步色谱分离纯化工艺获得的鹅去氧胆酸粗品纯度为70-80％；最后得到的CDCA成品纯度大于97％，收率大于90％。

Images