CN103272408A - 用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法 - Google Patents

用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，包括以下步骤：流动相配制、溶解过滤、动态轴向压缩柱装填、系统平衡、洗脱分离、浓缩。本发明在一次分离纯化过程中，可以获得多种单体，且液相色谱法检测纯度在98.5%以上，收率在98%以上；工艺简单，所用有机溶剂价格便宜，消耗量少，且均可以回收再用；紫外检测器在线监测，操作简单，效率高，产品质量容易控制；等度洗脱，对设备性能要求低，生产周期短，可以轻易实现从实验室到工业化五味子单体的高效分离纯化。

Description

用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法。
背景技术
五味子，俗称山花椒、秤砣子、药五味子、面藤、五梅子等，古医书称它荎蕏、玄及、会及，最早列于神农本草经上品，五味子的作用有：1．五味子提取物和醇甲能减少小鼠自主活动，尚有镇痛作用、肌肉松弛作用；2．五味子醇提物及五味子甲素、乙素、丙素、醇甲、醇乙、酯甲、酯乙等对化学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用；3．五味子素、五味子丙素、去氧五味子素等对于离体狗肠系膜动脉收缩均有抑制作用，能增加脉鼠离体心脏及麻醉狗冠脉血流量；4．五味子乙素、五味子酚均具有抗氧化作用，能清除自由基、抑制过氧化脂质形成；5．五味子能增强小鼠慢性支气管炎支气管上皮细胞功能；6．五味子能促进肝糖原的合成，使糖代谢加强，又能增加肝细胞蛋白质的合成；7．五味子能抑制应激性溃疡的发生，使溃疡指数减少，并能抑制胃液分泌；8．五味子具有很好的安神作用。
公开号为CN101428062A的中国发明专利公开了一种五味子分离纯化方法，是先过色谱柱层析，再采用乙腈与水梯度洗脱过反相色谱柱，收集48-52min物质；此方法需要通过两次色谱柱，产生大量溶剂，能耗大、时间长；乙腈洗脱时，其毒性大，溶剂残留影响大；梯度洗脱对设备性能要求高，不适合工业化生产放大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，可以解决现有技术先过色谱柱层析，再采用乙腈与水梯度洗脱过反相色谱柱，需要通过两次色谱柱，产生大量溶剂，能耗大、时间长；而且乙腈其毒性大，溶剂残留影响大；梯度洗脱对设备性能要求高的问题。
本发明通过以下技术方案实现：
用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，包括以下步骤：
（1）流动相配制：用弱极性溶剂配制流动相，作为样品洗脱液；
（2）溶解过滤：将五味子粗品用溶剂溶解，超声过滤后，将滤液用步骤（1）配制的流动相稀释作为样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将色谱填料用步骤（1）配制的流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的流动相冲洗步骤（3）装填的动态轴向压缩柱，持续10-20min，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）洗脱分离：将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的动态轴向压缩柱，用紫外检测器检测样品分离情况，根据保留时间和峰高确定每种五味子单体开始收集和停止收集的时间点；
（6）浓缩：将步骤（5）收集到的每种单体分别减压浓缩，去除溶剂。
本发明的进一步改进方案是，步骤（1）配制流动相的弱极性溶剂为正己烷、乙酸乙酯、异丙醇，体积比例60~95：2~30:3~10。
本发明的进一步改进方案是，步骤（2）采用0.45μm有机滤膜对溶解有五味子粗品的溶剂进行过滤。
本发明的进一步改进方案是，步骤（2）的溶剂由正己烷、乙酸乙酯、异丙醇中的一种或两种或两种以上混合而成。
本发明的进一步改进方案是，步骤（2）的样品浓度为0.28~0.5g/ml。
本发明的进一步改进方案是，步骤（3）的色谱填料为200~800目极性硅胶填料。
本发明的进一步改进方案是，步骤（4）动态轴向压缩柱的填料高度为250mm。
本发明的进一步改进方案是，步骤（5）的紫外检测器的检测波长为250nm。
本发明的与现有技术相比的优点在于：
一、在一次分离纯化过程中，可以获得多种单体，且液相色谱法检测纯度在98.5%以上，收率在98%以上；
二、工艺简单，所用有机溶剂价格便宜，消耗量少，且均可以回收再用；
三、紫外检测器在线监测，操作简单，效率高，产品质量容易控制；
四、等度洗脱，对设备性能要求低，生产周期短，可以轻易实现从实验室到工业化五味子单体的高效分离纯化。
附图说明
图1为五味子粗品的反相梯度检测图谱。
图2为步骤（5）检测样品分离情况的HPLC图谱。
图3为收集的五味子甲素的反相梯度检测图谱。
图4为收集的五味子乙素的反相梯度检测图谱。
图5为动态轴向压缩柱结构示意图。
具体实施方式
实施例1
用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，包括以下步骤：
（1）流动相配制：用正己烷、乙酸乙酯、异丙醇按照体积比例95:2:3配制流动相，作为样品洗脱液；
（2）溶解过滤：将10g五味子粗品用体积比例为3:1:6的正己烷、乙酸乙酯、异丙醇混合溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液用步骤（1）配制的流动相稀释成浓度为0.5g/ml的样品；其中五味子粗品由五味子药材经水煮、过滤，将得到的药渣用浓度为80%的乙醇提纯、过滤，得到滤液，待滤液中的乙醇全部挥发后，将剩余物质用水沉淀，将所得沉淀物质用有机溶剂萃取（例如用汽油与浓度为80%的乙醇混合物萃取），再浓缩去除溶剂得到五味子粗品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将240g的200~800目极性硅胶填料用步骤（1）配制的流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入直径为50mm的动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的流动相冲洗步骤（3）装填的动态轴向压缩柱，持续10~20min，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）洗脱分离：设定紫外检测器的检测波长为250nm，输液泵的流速为100ml/min，将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的动态轴向压缩柱，用紫外检测器检测样品分离情况，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，从10min后的色谱峰逐个收集五味子单体，根据保留时间和峰高确定每种五味子单体开始收集和停止收集的时间点，所收集到的五味子单体包括：五味子醇甲、甲素、乙素、酯甲、丙素；
（6）浓缩：将步骤（5）收集到的每种单体分别减压浓缩，去除溶剂，取每种单体0.05g，分别溶解后定容到100ml，再分别从中取20ul，分别采用液相色谱法检测，纯度均达99.5%以上。
如图5所示的动态轴向压缩柱，包括柱管9，所述柱管9上、下两端分别通过A法兰4和B法兰11连接有上盖板3、下盖板10，所述上盖板3上设有孔5，所述下盖板10上设有出料口12，还包括活塞7和活塞7的驱动装置，所述活塞7设置于柱管9内腔，所述活塞7上设有A流体分配装置15，所述A流体分配装置15的流动相入口8通过弹簧形盘管与孔5连通，所述A流体分配装置15的分配口位于活塞7的下端面；所述活塞7与上盖板3之间设有限位柱13，所述限位柱13的一端垂直连接于活塞7，另一端朝向上盖板3；所述柱管9在活塞7与下盖板10之间的壁上设有连通内腔的进料口14；所述下盖板10上设有B流体分配装置16，所述B流体分配装置16的分配口设于下盖板10朝向活塞7的一端，所述B流体分配装置16的流动相出口连通于出料口12。
实施例2
用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，包括以下步骤：
（1）流动相配制：用正己烷、乙酸乙酯、异丙醇按照体积比例70:23:7配制流动相，作为样品洗脱液；
（2）溶解过滤：将100g五味子粗品用体积比例为1:1的乙酸乙酯、异丙醇混合溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液用步骤（1）配制的流动相稀释成浓度为0.4g/ml的样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将2000g的200~800目极性硅胶填料用步骤（1）配制的流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入直径为150mm的动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的流动相冲洗步骤（3）装填的动态轴向压缩柱，持续10~20min，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）洗脱分离：设定紫外检测器的检测波长为250nm，输液泵的流速为800ml/min，将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的动态轴向压缩柱，用紫外检测器检测样品分离情况，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，从10min后的色谱峰逐个收集五味子单体，根据保留时间和峰高确定每种五味子单体开始收集和停止收集的时间点；
（6）浓缩：将步骤（5）收集到的每种单体分别减压浓缩，去除溶剂，取每种单体0.05g，溶解后定容到100ml，再从中取20ul，采用液相色谱法检测纯度可达99.3%以上。
其余实施如实施例1。
实施例3
用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，包括以下步骤：
（1）流动相配制：用正己烷、乙酸乙酯、异丙醇按照体积比例60:30:10配制流动相，作为样品洗脱液；
（2）溶解过滤：将500g五味子粗品用正己烷溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液用步骤（1）配制的流动相稀释成浓度为0.28g/ml的样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将8000g的200~800目极性硅胶填料用步骤（1）配制的流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入直径为300mm的动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的流动相冲洗步骤（3）装填的动态轴向压缩柱，持续10~20min，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）洗脱分离：设定紫外检测器的检测波长为250nm，输液泵的流速为3500ml/min，将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的动态轴向压缩柱，用紫外检测器检测样品分离情况，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，从13min后的色谱峰逐个收集五味子单体，根据保留时间和峰高确定每种五味子单体开始收集和停止收集的时间点；
（6）浓缩：将步骤（5）收集到的每种单体分别减压浓缩，去除溶剂，取每种单体0.05g，溶解后定容到100ml，再从中取20ul，采用液相色谱法检测纯度可达98.8%以上。
其余实施如实施例1。

Claims (8)

1. 用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）流动相配制：用弱极性溶剂配制流动相，作为样品洗脱液；
（2）溶解过滤：将五味子粗品用溶剂溶解，超声过滤后，将滤液用步骤（1）配制的流动相稀释作为样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将色谱填料用步骤（1）配制的流动相匀浆得到匀浆液，将匀浆液送入动态轴向压缩柱，排出流动相后压实色谱填料，完成动态轴向压缩柱的装填；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的流动相冲洗步骤（3）装填的动态轴向压缩柱，持续10-20min，直到色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）洗脱分离：将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的动态轴向压缩柱，用紫外检测器检测样品分离情况，根据保留时间和峰高确定每种五味子单体开始收集和停止收集的时间点；
（6）浓缩：将步骤（5）收集到的每种单体分别减压浓缩，去除溶剂。
2. 如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，其特征在于：步骤（1）配制流动相的弱极性溶剂为正己烷、乙酸乙酯、异丙醇，体积比例60~95：2~30:3~10。
3. 如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，其特征在于：步骤（2）采用0.45μm有机滤膜对溶解有五味子粗品的溶剂进行过滤。
4. 如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，其特征在于：步骤（2）的溶剂由正己烷、乙酸乙酯、异丙醇中的一种或两种或两种以上混合而成。
5. 如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，其特征在于：步骤（2）的样品浓度为0.28~0.5g/ml。
6. 如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，其特征在于：步骤（3）的色谱填料为200~800目极性硅胶填料。
7. 如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，其特征在于：步骤（4）动态轴向压缩柱的填料高度为250mm。
8. 如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化五味子单体的方法，其特征在于：步骤（5）的紫外检测器的检测波长为250nm。
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