CN103251658A - 牛樟芝萃取浓缩物及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种牛樟芝萃取浓缩方法和牛樟芝萃取浓缩物，所述牛樟芝萃取浓缩方法包括萃取步骤，将牛樟芝样品置于萃取溶剂中共同形成牛樟芝萃取液，以使牛樟芝中抑制癌细胞的活性成分溶于所述牛樟芝萃取液中；以及浓缩步骤，采用模拟移动床，将所述牛樟芝萃取液中亨利常数为2.8以上的组份通过碳18固体吸附剂分离并浓缩。通过本发明的牛樟芝萃取浓缩方法，不仅能够将特定生理活性的成份分离及浓缩，并可以符合工业化大规模生产方式制备各所述组份的浓缩物，同时达到降低生产成本的功效。

Description

牛樟芝萃取浓缩物及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种牛樟芝萃取浓缩方法及其萃取浓缩物，特别涉及一种用以提升有效抑制癌细胞活性成分的牛樟芝萃取浓缩方法及其牛樟芝萃取浓缩物。

背景技术

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是中国台湾特有真菌，属真菌分类学中担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌属(Antrodia)的多年生菌类，仅生长于中国台湾特有牛樟树(Cinnamomum kanehirai)的中空芯材内壁，其子实体为一年生至多年生，呈鲜红色、橘红色或淡肉桂色，具有樟树香气。

牛樟芝是具有广泛生理活性的药用真菌，其具有治疗癌症、提高免疫力、抗氧化、消炎及抗菌等功能，牛樟芝包含有三萜类化合物(Tritepeenoids)、多醣体(Poly-saccharides)及β-葡聚糖(β-glucan)等，其中，该三萜类化合物为牛樟芝所含有用以抑制癌细胞的主要活性成分，然而，由于牛樟芝中的三萜类化合物含量极低，粗略估计三萜类化合物仅占牛樟芝子实体中重量百分比不到3％，因此，萃取或分离该牛樟芝中的三萜类化合物并不容易，欲获取牛樟芝三萜类成分时，仅能将牛樟芝子实体磨粉打锭服用，以直接摄取牛樟芝子实体所含有三萜类化合物，避免三萜类化合物因萃取或分离的操作步骤而流失。

请参照中国台湾公告第I352612号“分段式樟芝萃取方法”专利，如图1所示，提供一种提高牛樟芝萃取物中的特定生理活性成分含量的樟芝萃取方法，包含：有机萃取步骤S91，是将樟芝干燥颗粒浸泡于酒精溶液中，并得到有机萃取溶液及经有机萃取后的樟芝萃余物，以及水溶性萃取步骤S92，是将该樟芝萃余物浸泡于酸性水溶液中，从而得到水溶性萃取溶液，分别将该有机萃取溶液及该水溶性萃取溶液冷冻干燥后，获得有机萃取物及水溶性萃取物，其包含有较高含量的多醣体或β-葡聚糖。然而，该专利案所揭示的樟芝萃取方法，是提高该两种萃取物中多醣体或β-葡聚糖含量，该专利案仍无法用以分离其他如三萜类化合物的特定生理活性成分，以提供特定生理活性成分的摄取。

由上述可知，因牛樟芝所含生理活性成分种类繁多且各成分含量低，故不易以现有技术的萃取方法获得其特定生理活性成分，也无法对现有萃取方法所获得的萃取物加以分离或纯化。此外，现有萃取方法或上述专利案所揭示的萃取方法都是对牛樟芝进行批次式萃取，其所获得萃取物中的特定生理活性成分含量有限，因此无法应用于工业化连续式大规模生产的作业程序，使得萃取牛樟芝制作成本高，且萃取或分离的效率低。

因此，有必要提供一种改良的牛樟芝萃取浓缩方法，能够依照使用者需求来提供特定生理活性成份。

发明内容

为了解决上述现有技术不足之处，本发明目的是提供一种改良的牛樟芝萃取浓缩方法，以克服现有技术中的缺陷。

本发明的主要目的是提供一种牛樟芝萃取浓缩方法，能够将牛樟芝萃取液中的特定生理活性成分进行分离及浓缩。此外，该牛樟芝萃取浓缩方法能够以连续式进料方式，将牛樟芝萃取液中的特定生理活性成分进行浓缩者。

为了达到前述发明目的，本发明的牛樟芝萃取浓缩方法包括如下步骤：(1)萃取步骤，将牛樟芝样品置于萃取溶剂中共同形成牛樟芝萃取液，以使牛樟芝中抑制癌细胞的活性成分溶于所述牛樟芝萃取液中；以及(2)浓缩步骤，采用模拟移动床，将所述牛樟芝萃取液中亨利常数为2.8以上的组份通过碳18固体吸附剂分离并浓缩。

优选地，所述亨利常数为2.8以上的组份包含具有抑制癌细胞特性的活性成分。

优选地，在浓缩步骤后，得到牛樟芝萃取浓缩液，所述亨利常数为2.8以上的组份占所述牛樟芝萃取浓缩液的重量百分比50％以上。

优选地，所述碳18固体吸附剂为SUPELCO Ascentis^TM C18管柱。

优选地，所述移动相为含有0.05％醋酸的去离子水与甲醇所组成的水溶液。

优选地，所述牛樟芝样品为牛樟芝的子实体或菌丝体。

优选地，所述牛樟芝样品为小于5毫米见方的颗粒。

本发明的另一目的是提供一种通过所述牛樟芝萃取浓缩方法获得的牛樟芝萃取浓缩物，所述牛樟芝萃取浓缩物包括有效抑制癌细胞的生理活性成分。优选地，所述牛樟芝萃取浓缩物包括通过碳18固体吸附剂的亨利常数为2.8以上的组份。优选地，所述亨利常数2.8以上的组份包含抑制癌细胞特性的活性成分。优选地，所述癌细胞为肺癌细胞或肝癌细胞。

因此，本发明的牛樟芝萃取浓缩方法能够将牛樟芝萃取液中的特定生理活性成分分离，以达到有效分离不同生理活性的功效。此外，

本发明的牛樟芝萃取浓缩方法能够通过模拟移动床以连续式进料方式，从牛樟芝萃取液中获得较高含量的生理活性成分，以达到工业化量产的功效。本发明的牛樟芝萃取浓缩物包含有效抑制癌细胞的生理活性成分，其含量能够达到50％以上，具有提高抑制癌细胞存活率的功效。

附图说明

图1是现有技术牛樟芝萃取方法的步骤方块图；

图2是本发明牛樟芝萃取浓缩方法的步骤方块图(一)；

图3是本发明实施例超临界二氧化碳萃取装置示意图；

图4是本发明实施例第A1-1至A1-12组的牛樟芝萃取物产率折线图；

图5是本发明实施例第A1-1至A1-12组的HPLC层析图；

图6是本发明实施例第A1-1至A1-12组中亨利常数为2.8以上的组份A百分率；

图7是本发明实施例第B1及B2组的HPLC层析图；

图8是本发明实施例三区域模拟移动床的管柱配置示意图；

图9是三角理论的纯化条件示意图；

图10是本发明实施例第B1组的第一出料口O_α及第二出料口O_γ浓缩物HPLC层析图；

图11是本发明实施例第B1组的第一出料口O_α浓缩物的各成分所占重量百分比的XY散布图；

图12是本发明实施例第B1组的第二出料口O_γ浓缩物的各成分所占重量百分比的XY散布图；

图13是本发明实施例第B2组的第一出料口O_α及第二出料口O_γ浓缩物HPLC层析图；

图14是本发明实施例第B2组的第一出料口O_α浓缩物的各成分所占重量百分比的XY散布图；

图15是本发明实施例第B2组的第二出料口O_γ浓缩物的各成分所占重量百分比的XY散布图。

附图标记说明如下：

本发明中：萃取步骤S1、浓缩步骤S2、二氧化碳储槽1、辅溶剂储槽2、萃取槽3、背压阀4、温度调节器5、气液分离槽6、液泵7、阀门8、吸附管柱9、α区域α、β区域β、γ区域γ、管柱c、第一出料口O_α、进料口I、第二出料口O_γ。

现有技术中：有机萃取步骤S91、水溶性萃取步骤S92。

具体实施方式

为使审查员能进一步了解本发明的结构、特征及其他目的，现结合所附较佳实施例附以附图详细说明如下，本附图所说明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明提供的牛樟芝萃取浓缩方法，能够萃取及浓缩牛樟芝中不同生理活性成分，获得至少一种牛樟芝萃取浓缩物，所述牛樟芝萃取浓缩物中包含有效抑制癌细胞的活性成分。举例说明，所述牛樟芝萃取浓缩物可以包含有亨利常数为2.8以上的组份A，所述组分A具有抑制癌细胞的活性成分。

本发明所指的“牛樟芝”是不限定野生采集或人工培育方式获得的子实体或菌丝体，其中，人工培育方式可以选择将牛樟芝菌丝体以固态发酵或液态发酵方式培养，以获得菌丝体。

本发明所指的“萃取”，是将牛樟芝子实体或菌丝体中的活性成分溶于萃取溶剂的程序。

本发明所指的“浓缩”，是将含有牛樟芝活性成分的萃取液，经由模拟移动床(Simulated Moving Bed，简称SMB)，并根据所述牛樟芝活性成分的极性特性(亨利常数H)，将所述牛樟芝的活性成分分离并浓缩的程序，例如分离牛樟芝中具有抑制癌细胞特性的活性成分。

本发明所指的“组份”，是指通过特定固定相及移动相的层析管柱或模拟移动床，将牛樟芝萃取物中不同极性特性的成分进行层析，所述极性特性以亨利常数作为判断依据，根据不同滞留时间的层析区段所得到的一群特定极性的成分，统称为一个组份。

请参照图2所示，本发明的牛樟芝萃取浓缩方法包括萃取步骤S1及浓缩步骤S2。

本发明的萃取步骤S1，将牛樟芝样品置于萃取溶剂中共同形成牛樟芝萃取液，使所述牛樟芝中抑制癌细胞的活性成分溶于所述牛樟芝萃取液中。所述牛樟芝可以选择为子实体或菌丝体，优选将牛樟芝的子实体或菌丝体干燥至含水量低于10％以下，进一步优选将所述牛樟芝子实体或菌丝体破碎成较小颗粒，例如小于5毫米见方的颗粒，以增进萃取步骤S1的萃取效率。本实施例的牛樟芝是由乔本生医股份有限公司所提供的牛樟芝子实体。

该萃取步骤S1的萃取溶剂，根据所欲萃取成分的极性特性来选择，所述萃取溶剂可以为水、有机溶剂或超临界流体，其中所述有机溶剂及超临界流体利于萃取极性特性较低的活性成分，水则是利于萃取极性特性较高的活性成分。本实施例选择亲有机性(或低极性)的超临界流体，特别是超临界态二氧化碳流体做为萃取溶剂。

举例说明，本发明该萃取步骤S1的第一实施例选择超临界流体萃取法，提供一个如图3所示的超临界二氧化碳萃取装置(超临界二氧化碳萃取设备，NATEX)，所述装置包括二氧化碳储槽1及一个辅溶剂储槽2，分别与一个萃取槽3连通，以一个背压阀4调节该萃取槽3的内部压力，另以多个温度调节器5调控所述超临界二氧化碳萃取装置的内部温度，使通入该萃取槽3的二氧化碳能够在达到临界压力及临界温度时转变为超临界流体以进行萃取，该萃取槽3与一个气液分离槽6连通，以供减压时回复成气态的二氧化碳流入，并且回收至该二氧化碳储槽1，其中，所述超临界二氧化碳萃取装置中设有多个液泵7及多个阀门8，以调控所述二氧化碳或辅溶剂于在所述超临界二氧化碳萃取装置的流动，该二氧化碳储槽1及该气液分离槽6之间优选包含一个吸附管柱9，以去除二氧化碳气体内的杂质。具体地说，二氧化碳气体以大于临界压力72巴(Bar)，及大于临界温度31.1℃以上的条件，即可形成超临界二氧化碳流体，优选压力为300～400bar，温度为32～50℃的条件下所形成的超临界二氧化碳流体进行萃取；超临界流体萃取法亦可混合辅溶剂，帮助改变超临界流体的物化特性，增进萃取效率。

更具体地说，本发明该萃取步骤S1的第一实施例取105公克的牛樟芝子实体，破碎成颗粒大小约为5毫米见方的颗粒，置于该萃取槽3中，设定该萃取槽3的内部压力为350bar，内部温度为50℃，辅溶剂为95％乙醇，并以每分钟3毫升的速率进料，自所述辅溶剂进料之时起算第30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330及360分钟，分别收取各时点的牛樟芝萃取液(依序为第A1至A12组)，由于牛樟芝萃取液呈膏状，其中仍包含有95％乙醇，本实施例另以温度设定为30～35℃烘箱将膏状牛樟芝萃取液中的乙醇去除，以便进行后续的浓缩步骤S2。

通过超临界二氧化碳流体萃取，不仅能够简化有机溶剂萃取法的溶剂成本及操作步骤，以超临界二氧化碳流体完成萃取后，以减压方式就能够将牛樟芝萃取液中的活性成分与萃取溶剂完全分离而不会残留萃取溶剂，因此可以减低后续浓缩处理的成本；此外，当二氧化碳形成超临界流体型态，具亲有机性(或低极性)，故对于萃取低极性成分而言，具有良好萃取效率。

将本发明该萃取步骤S1的第一实施例在不同萃取时间所获得的牛樟芝萃取液干燥后，获得一个牛樟芝萃取物秤重，以计算所述牛樟芝萃取物的产率。请参照图4所示，为本发明所述萃取步骤S1的第一实施例的牛樟芝萃取物产率折线图，随着萃取时间的增加，所述牛樟芝萃取物的产率亦随之增加，待萃取至第210分钟时，所述萃取物的产率达到28％并趋于稳定。

请参照图5所示，为本发明该萃取步骤S1的第一实施例在不同萃取时间(0～360分钟，分别为第A1至A12组)所获得的牛樟芝萃取物，分别以HPLC层析管柱(SUPELCO Ascentis^TM C18管柱，其内径4.6mm，长度为15cm)结合分光光度计(L-2455Diode ArrayDetector)，测量所述牛樟芝萃取物经层析后在波长240～260nm的吸光强度，并以所述吸光强度所绘制的折线图，对特定滞留时间内的面积积分，以推算所述牛樟芝萃取物中亨利常数为2.8以上的组份A百分率，其中，该组份A为属于滞留时间超过8分钟，其包含有抑制癌细胞的活性成分。

请参照图6所示，为分析第A1至A12组所获得的萃取物中，其所占亨利常数为2.8以上的组份A百分率，在萃取时间为0～120分钟时，可以获得较多含量的组份A，且该组份A占所述牛樟芝萃取物重量百分比40％以上。

此外，本发明该萃取步骤S1的第二实施例为选择以乙醇进行萃取，取干燥的牛樟芝子实体破碎至2毫米见方左右，取0.2公克的破碎子实体置于10毫升乙醇中，于温度40℃下进行超音波震荡90分钟后，将牛樟芝萃取物以抽气过滤方式去除，获得牛樟芝萃取液，再将所述牛樟芝萃取液进行真空干燥，获得牛樟芝萃取物，并以所述牛樟芝萃取物进行后续的浓缩步骤S2。

分别将该萃取步骤S1的第一实施例(萃取时间为90分钟)及第二实施例所获得的牛樟芝萃取物以甲醇溶解后，以HPLC层析管柱(SUPELCO Ascentis^TM C18管柱，其内径4.6mm，长度为15cm)结合分光光度计(L-2455 Diode Array Detector)，测量所述牛樟芝萃取物经HPLC层析后在波长240～260nm的吸光强度，并与本发明该萃取步骤S1的第一实施例的牛樟芝萃取物比较其图谱。

请参照图7，第B1组为乙醇萃取的牛樟芝萃取物HPLC层析图谱，而第B2组为超临界二氧化碳流体萃取的牛樟芝萃取物HPLC层析图，由此可知，以乙醇辅以超音波震荡萃取而得的牛樟芝萃取物，或以超临界二氧化碳流体萃取的牛樟芝萃取物的组成大致相同，部分组份的萃取量略有不同，特别是指以超临界二氧化碳流体所获得低极性物质(滞留时间大于8分钟以上)的含量较高。

本发明的萃取步骤S1不限于以有机溶剂或超临界流体萃取牛樟芝的生理活性成分，而优选以超临界二氧化碳流体萃取亨利常数为2.8以上的组份，能够达到提高活性成分萃取量的功效，又可避免在完成萃取后不会有溶剂残留的问题。

本发明的浓缩步骤S2，采用模拟移动床将所述牛樟芝萃取液中的亨利常数为2.8以上的组份A通过碳18固体吸附剂分离并浓缩。更详细地说，所述亨利常数为2.8以上的组份A为具有低极性特性的成分，相对而言，所述牛樟芝萃取物中另外包含亨利常数为2.8以下的组份B，其为具有高极性特性的成分。本发明的浓缩步骤S2为不限于由水、有机溶剂或超临界流体萃取所获得的牛樟芝萃取液，并能够依照所欲萃取组份的不同极性从所述牛樟芝萃取液中分离并浓缩，特别是通过模拟移动床进行分离及浓缩，达到节省现有技术中用以分离牛樟芝活性成分的方法的成本，更能够以工业化大规模生产的连续式操作方法，达到更高的分离效率。

本发明该浓缩步骤S2的较佳实施例，是提供如图8所示的模拟移动床作为一种连续进料式的纯化平台，对牛樟芝萃取液中不同亨利常数的成份进行群组分离；本实施例优选是将该萃取步骤S1的牛樟芝萃取液先进行干燥，获得牛樟芝萃取物后，再以适当的移动相溶液将所述牛樟芝萃取物溶解，以进行该浓缩步骤S2。

本实施例模拟移动床的固定相(Stationary phase，简称SP)选择与低极性物质具有吸附性的碳18管柱，本实施例的移动相(Mobilephase，简称MP)是用以溶解牛樟芝萃取物，本实施例的移动相选择水及甲醇的混合液，所述水含有0.05％的醋酸，以所述移动相溶解所述牛樟芝萃取物，所述水及甲醇的重量比例较佳优选为20∶80至40∶60，所述水及甲醇更佳进一步优选的重量比例为22∶78，使所述移动相的选择因子(Selective factor)为大于1.3，能够更有效地分离出不同极性特性的组份A及组份B。

本实施例的模拟移动床优选包含至少三个分离区域，其依序为α、β及γ区域，其中所述α区域的后端设有一个第一出料口O_α(称作Extract outlet)，所述γ区域的后端设有一个第二出料口O_γ(称作Raffinate outlet)，该进料口I(称作Feed inlet)则设于所述β及γ区域之间。

所述三个分离区域α、β及γ系分别由二个管柱c组成，所述三个分离区域的管柱c相互连通，该管柱c内系填充固定相，特别地所述固定相的颗粒间具有孔隙供移动相通过，并使所述移动相朝同一方向依序流经所述α、β及γ区域的管柱c内，所述固定相则系以一个进料口切换装置于进料口切换时间T_sw后改变该进料口I在所述三个分离区域的相对位置，使所述固定相相对所述移动相朝另一方向模拟移动。

根据模拟移动床的三角理论，所欲分离组份包括：亨利常数为2.8以上的组份A及亨利常数为2.8以下的组份B，各三个分离区域α、β及γ中，所述组份A的净质量通量F_A及所述组份B的净质量通量F_B符合表1的条件，使所述组份A往所述区域α移动，所述组份B往所述区域γ移动，且所述三个分离区域α、β及γ的流速比值n(各分离区域α、β及γ的流速比值分别为n_α、n_β及n_γ)与所欲分离组份的极性(即组份A的亨利常数为H_A，组份B的亨利常数为H_B)相关，各流速比值n_α、n_β及n_γ应符合如表1及图9中斜线区域的条件，其中，各组份的亨利常数H系根据公式I计算而得，T0为不被固定相吸附的物质流经管柱的滞留时间(T0＝1.71)，Tr为欲分离组份的滞留时间，ε为本实施例所使用管柱的孔隙度(0.412)。

表1：本实施例各分离区域的净质量通量F、流速比值n与亨利常数H的条件设定

区域	α	β	γ
				净质量通量F	FB＞0；FA＞0	FB＞0；FA＜0	FB＞0；FA＜0
流速比值n	nα＞HA＞HB	HA＞nβ＞HB	HA＞nγ＞HB

本发明浓缩步骤S2的较佳实施例中，为取本发明萃取步骤S1的第一实施例萃取时间为90分钟所获得的牛樟芝萃取物进行分离及浓缩，故本发明的牛樟萃取物的萃取步骤S1的操作不再赘述。

本实施例浓缩步骤S2的固定相系选择为碳18固体吸附剂，所述碳18固体吸附剂以硅胶(silica gel)为主碳链，所述主碳链上可以与不同官能基结合，所述官能基可以是由十八烷基(Octadecyl)等所组成的群组；本实施例的碳18固体吸附剂选择SUPELCO Ascentis^TMC18管柱(管柱内径4.6mm，长度为15cm，其官能基为十八烷基硅烷(octadecylsilane)，移动相由含0.05％醋酸的去离子水与甲醇所组成的水溶液，移动相流速为每分钟1毫升。本实施例的模拟移动床由一个液泵(HITACHI L-2130)进行加压，使移动相于在各区域的管柱内朝向同一方向流动，设定本实施例SMB的进料口切换时间T_sw，以模拟所述固定相朝向与所述移动相流向相反的条件，并以表2所示的条件分离牛樟芝萃取物，并于该第一出料口O_α获得该亨利常数为2.8以上的组份A，该第二出料口O_γ获得该亨利常数为2.8以下的组份B。

表2：本实施例第B1及B2组的SMB分离及浓缩条件

分离及浓缩条件	第B1组	第B2组
			进料口切换时间Tsw(min)	26	26
移动相流速(ml/min)	0.423	0.480
			进料口流速(ml/min)	0.030	0.030
第一出料口Oα(ml/min)	0.200	0.240
			流速比值nα	5.4419	7.8135
流速比值nβ	1.8943	2.1958
			流速比值nγ	2.4264	2.7280

本实施例将SFE萃取牛樟芝子实体90分钟所得的牛樟芝萃取物，以第B1组的条件连续式的进料至少1500分钟以上，分离并浓缩所述牛樟芝萃取物中的组份A或组份B，并将该第一出料口O_α及第二出料口O_γ所获得的浓缩物进行HPLC层析。

请参照图10所示，分别对第B1组的第一出料口O_α及第二出料口O_γ浓缩物进行HPLC分析的层析图，X轴为滞留时间(min)，Y轴为吸光强度(AU)，其中，该第一出料口O_α的浓缩物主要为滞留时间为8分钟以上的组分，属于亨利常数为2.8以上的组份A，其包含有抑制癌细胞的活性成分，该第二出料口O_γ的浓缩物主要为滞留时间小于8分钟的组分，为亨利常数为2.8以下的组份B，由图10的积分面积计算，该第一出料口O_α的浓缩物中至少含有重量百分比为80％以上的组份A。

本实施例以第B1组的条件连续式进料0～8000分钟，收集并分析第500、1800及3000分钟的浓缩物中各组份的所占重量百分比，请参照图11所示，系该第一出料口Oα的浓缩物中各组份的所占重量百分率分析图，该组份A中，至少重量百分比70％以上为三萜类化合物(滞留时间为7～12min)，其余部份为其他未知结构的低极性物质(滞留时间为12min以上)，而关于组份B如多醣体或β-葡聚糖成份(滞留时间为6min以下)则几乎不存在；请参照图12所示，为同样条件下于第二出料口O_γ的浓缩物，其中该组份B占所述浓缩物重量百分比至少80％以上，其余三萜类化合物及低极性物质则占不到20％。

请参照图13所示，分别是对第B2组的第一出料口O_α及第二出料口O_γ浓缩物进行HPLC分析的层析图，X轴为滞留时间(min)，Y轴为吸光强度(AU)，以积分面积计算，该第一出料口O_α的浓缩物中含有至少重量百分比为74％以上的组份A，表示本实施例SMB的条件设计也能够达到很好的分离浓缩效果。

本实施例再以第B2组的条件连续式进料0～8000分钟，收集并分析第500、1800及3000分钟的浓缩物中各组份所占重量百分比，请参照图14所示，该第一出料口Oα的浓缩物中，至少重量百分比60％以上为三萜类化合物(滞留时间为7～12min)，其余部份为其他未知结构的低极性物质(滞留时间为12min以上)，而关于组份B如多醣体或β-葡聚糖(滞留时间为6min以下)则几乎不存在；请参照图15所示，为同样条件下于第二出料口O_γ的浓缩物，其该组份B占所述浓缩物重量百分比几乎为100％，三萜类化合物及低极性物质则几乎不存在。

此外，以所述第B1及B2组的条件连续式进料长达8000分钟时，该第一出料口O_α的浓缩物中不会含有该组份B，而污染该第一出料口O_α浓缩物的情况发生，表示本发明的浓缩步骤S2也可以进行长时间操作，并且维持其分离及浓缩的稳定性。

由本发明较佳实施例可知，本发明的浓缩步骤S2确实能够有效分离不同极性特性的组份A及组份B，其中，该组份A由第一出料口分离而得，该组份B由第二出料口分离而得；且以工业操作系统下连续式进料方式0～8000分钟，能够提高该牛樟芝萃取浓缩物中所含组份A的产量，并且长时间操作下也不会有污染的情况发生，能够以工业量产方式获得较高纯度的组份A。

为证实本发明牛樟芝萃取浓缩方法确实能有效分离出亨利常数为2.8以上的组份A，且该组份A确实包含有有效抑制癌细胞的活性成分，以下为本发明牛樟芝萃取浓缩方法所获得牛樟芝萃取浓缩物进行癌细胞的存活率试验。

本实施例是以二氧化碳超临界流体萃取90分钟，并以如第B1组的模拟移动床参数条件进行分离及浓缩，所获得的第一出料口O_α浓缩物，分别施用于不同癌细胞，再以MTT细胞活性染色法(MTTassay)测量各癌细胞的存活率。

更详细地说，MTT细胞活性染色法系利用活细胞粒线体中所含有的琥珀酸去氢酶(Dehydrogenase)可代谢溶于细胞培养液中的黄色MTT(3-(4，5-cimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)化合物，将MTT化合物中的tetrazolium转为一蓝色产物formazan，该formazan会堆积在细胞中，另以DMSO将formazan溶解，测量于波长570nm处的吸光值，代表各组细胞的存活率，当活细胞数越多，则570nm的吸光值越高。

本实施例选用人类肺纤维正常细胞株MRC-5、肺癌细胞株A549及肝癌细胞株HepG2等细胞株测试所述牛樟芝萃取浓缩物(包括经SFE获得的牛樟芝萃取物、经SFE及SMB获得第一出料口O_α及第二出料口O_γ的牛樟芝萃取浓缩物)的抑制细胞增生效果，各该细胞株系购自中国台湾新竹食品工业科学研究所，各编号依序为BCRC60023、BCRC 60074及BCRC 60025。本实施例将该等细胞株培养于一个适当培养基中进行继代培养，当该等细胞数量增殖至培养容器的7～8分满，取一个缓冲液，将增殖培养的细胞由所述培养容器的器壁冲刷至所述缓冲液中，以方便进行细胞株的细胞计数，以及后续细胞存活率的分析。

更详细地说，本实施例选择但不限定将等细胞株于含有10％非活化的胎牛血清(Fetal bovine serum，简称FBS，10437，Gibco，GrandIsland，NY，USA)的DMEM培养基(Dulcbecco’s modified Eaglemedium，12800-017，Gibco，Grand Island，NY，USA)中增殖培养，其培养条件为含有5％二氧化碳的空气、温度为37℃，待该等细胞长至培养容器的七或八成满，以一个商用EDTA缓冲液(Ethylenediaminetetra-acetic acid；MERCK)重复冲洗培养容器，以便将贴壁生长的细胞冲刷至EDTA缓冲液，并进行细胞计数；本实施例含有10％FBS的DMEM培养基配方如表3所示。

表3：本实施例DMEM培养基配方(1公升，pH7.0～7.2)

配方	剂量
		每单位DMEM培养基粉末	预溶于800ml去离子水
FBS	100ml
		青霉素(Penicillin)	100unit/ml
链霉素(Streptomycin)	100μg/ml
		碳酸氢钠(NaHCO3)	0.2g
100×谷胺酰酸(L-Glutamine)	10g
		去离子水	添加至1000ml

本实施例取三种不同共培养物：(1)经SFE获得的牛樟芝萃取物、(2)经SFE及SMB获得第一出料口O_α的牛樟芝萃取浓缩物，及(3)经SFE及SMB获得第二出料口O_γ的牛樟芝萃取浓缩物，各三细胞株准备10组5×10³cell/ml的三细胞株于96孔培养盘中培养24小时后，分别添加不同浓度(0、1、1.5、2、2.5、3、5、7、10及100μg/ml)的共培养物72小时，以MTT细胞活性染色法测量各组细胞株的细胞存活率，其中，以未添加任何共培养物的细胞株的组别所测得的吸光值作为基准(即该组细胞株细胞存活率设为100％)，与其他添加不同浓度共培养物的组别相比较，计算各组不同浓度共培养物的细胞存活率，并且换算三种共培养物对于所述三细胞株的半抑制浓度(IC₅₀，单位：μg/ml)。

请参照表4所示，所述三种共培养物无论是与肺癌细胞、肝癌细胞或肺纤维正常细胞共培养，以(2)经SFE及SMB获得第一出料口O_α的牛樟芝萃取浓缩物共培养，其半抑制浓度皆小于(3)经SFE及SMB获得第二出料口O_γ的牛樟芝萃取浓缩物及(1)经SFE获得的牛樟芝萃取物的半抑制浓度。

表4：本实施例各组别的培养条件及其IC₅₀(μg/ml)

由本实施例可证实，牛樟芝子实体经SFE及SMB萃取浓缩后，于第一出料口O_α所获得的牛樟芝萃取浓缩物，确实能够有效提高抑制癌细胞的功效，特别是能够抑制肺癌细胞或肝癌细胞。

综上所述，本发明牛樟芝萃取浓缩方法，是通过该萃取步骤S1将牛樟芝子实体或菌丝体中所含的生理活性成分，萃取至牛樟芝萃取液中，并将所述牛樟芝萃取液以该浓缩步骤S2将牛樟芝萃取液中不同极性特性的生理活性成分进行分离及浓缩，特别是亨利常数为2.8以上的组份A系具有抑制癌细胞的效果，通过本发明的牛樟芝萃取浓缩方法，不仅能够将特定生理活性的成份分离及浓缩，并可以符合工业化大规模生产方式生产各组份的浓缩物，不仅能够达到改善现有技术批次式萃取方法所不能达到的大规模生产功效，又能达到降低用以浓缩牛樟芝所含不同生理活性成分所需成本的功效。

因此，本发明的牛樟芝萃取浓缩方法，能够通过萃取及浓缩步骤，将牛樟芝萃取液中的特定生理活性成分分离，能够达到有效分离不同生理活性的功效。

本发明的牛樟芝萃取浓缩方法，能够藉由模拟移动床以连续式进料方式，自牛樟芝萃取液中获得较高含量的生理活性成分，以达到工业化大规模生产的功效。

本发明的牛樟芝萃取浓缩物，包含有效抑制癌细胞的生理活性成分，其含量能够达到50％以上，具有提高抑制癌细胞存活率的功效。

需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种牛樟芝萃取浓缩方法，其特征在于，所述牛樟芝萃取浓缩方法包括如下步骤：

(1)萃取步骤，将牛樟芝样品置于萃取溶剂中共同形成牛樟芝萃取液，以使牛樟芝中抑制癌细胞的活性成分溶于所述牛樟芝萃取液中；以及

(2)浓缩步骤，采用模拟移动床，将所述牛樟芝萃取液中亨利常数为2.8以上的组份通过碳18固体吸附剂分离并浓缩。

2.如权利要求1所述的牛樟芝萃取浓缩方法，其特征在于，所述亨利常数为2.8以上的组份包含具有抑制癌细胞特性的活性成分。

3.如权利要求1所述的牛樟芝萃取浓缩方法，其特征在于，在浓缩步骤后，得到牛樟芝萃取浓缩液，所述亨利常数为2.8以上的组份占所述牛樟芝萃取浓缩液的重量百分比50％以上。

4.如权利要求1所述的牛樟芝萃取浓缩方法，其特征在于，所述碳18固体吸附剂为SUPELCO Ascentis^TM C18管柱。

5.如权利要求4所述的牛樟芝萃取浓缩方法，其特征在于，所述移动相为含有0.05％醋酸的去离子水与甲醇所组成的水溶液。

6.如权利要求1所述的牛樟芝萃取浓缩方法，其特征在于，所述牛樟芝样品为牛樟芝的子实体或菌丝体。

7.如权利要求1或6所述的牛樟芝萃取浓缩方法，其特征在于，所述牛樟芝样品为小于5毫米见方的颗粒。

8.一种通过如权利要求1所述的方法获得的牛樟芝萃取浓缩物，其特征在于，所述牛樟芝萃取浓缩物包括通过碳18固体吸附剂的亨利常数为2.8以上的组份。

9.如权利要求8所述的牛樟芝萃取浓缩物，其特征在于，所述亨利常数2.8以上的组份包含抑制癌细胞特性的活性成分。

10.如权利要求9所述的牛樟芝萃取浓缩物，其特征在于，所述癌细胞为肺癌细胞或肝癌细胞。

Images