TWI703121B - 純化三萜類化合物的方法 - Google Patents

純化三萜類化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI703121B
TWI703121B TW108108768A TW108108768A TWI703121B TW I703121 B TWI703121 B TW I703121B TW 108108768 A TW108108768 A TW 108108768A TW 108108768 A TW108108768 A TW 108108768A TW I703121 B TWI703121 B TW I703121B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
triterpenoids
section
moving bed
simulated moving
type
Prior art date
Application number
TW108108768A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202035353A (zh
Inventor
梁明在
包曉青
梁茹茜
Original Assignee
喬璞科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 喬璞科技有限公司 filed Critical 喬璞科技有限公司
Priority to TW108108768A priority Critical patent/TWI703121B/zh
Priority to CN201910391788.6A priority patent/CN111686136B/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI703121B publication Critical patent/TWI703121B/zh
Publication of TW202035353A publication Critical patent/TW202035353A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
    • A61K36/074—Ganoderma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/37—Extraction at elevated pressure or temperature, e.g. pressurized solvent extraction [PSE], supercritical carbon dioxide extraction or subcritical water extraction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

一種純化三萜類化合物的方法，包括提供靈芝粗萃物，所述靈芝粗萃物包括第一類三萜類化合物以及第二類三萜類化合物。第一類三萜類化合物包括靈芝酸A，第二類三萜類化合物包括靈芝酸F以及靈芝醇B。接著，以模擬移動床層析法將所述靈芝粗萃物中的三萜類化合物分離開來。運用此模擬移動床層析法可將靈芝粗萃物中的包括靈芝酸A的第一類三萜類化合物與包括靈芝酸F以及靈芝醇B的第二類三萜類化合物分離開來，以產生高純度的三萜類化合物。

Description

純化三萜類化合物的方法
本發明是有關於一種純化方法，且特別是有關於一種純化三萜類化合物的方法。
靈芝作為傳統的中藥材具有很高的藥用價值，已經成為保健食品的主要原料之一。研究發現靈芝具有調節免疫系統，心血管系統的作用，可用於抗突變，抗衰老等作用。靈芝中主要的活性成分為三萜類化合物的靈芝酸及靈芝醇，具有抗腫瘤、保肝護肝、抗菌消炎等藥理作用。
目前從靈芝粗萃物中分離純化出三萜類化合物的方法主要是採用傳統的製備色譜分離技術進行分離。然而，現有的分離純化的方法皆為間歇式操作的純化方式，在實際的生產過程中往往會導致產物稀釋嚴重，操作重複性低，穩定性不佳，不適宜工業化的生產。
本發明提供一種純化三萜類化合物的方法，可有效地分離出高純度的三萜類化合物。
本發明的實施例提供一種純化三萜類化合物的方法。所述方法包括以下步驟。首先，提供靈芝粗萃物，靈芝粗萃物包括第一類三萜類化合物及第二類三萜類化合物。第一類三萜類化合物包括靈芝酸A，第二類三萜類化合物包括靈芝酸F以及靈芝醇B。接著，以模擬移動床層析法將靈芝粗萃物中的三萜類化合物分離開來。模擬移動床層析法包含：（i）提供模擬移動床，模擬移動床依序包括第一區段、第二區段以及第三區段，其中模擬移動床是由移動相及固定相所組成，固定相為內部具有孔隙的顆粒，移動相對於模擬移動床是朝同一方向從沖滌端入口流經第一區段、第二區段以及第三區段之間，固定相是相對於移動相朝反方向模擬移動，移動相為包含超臨界二氧化碳與乙醇的沖滌劑；（ii）將靈芝粗萃物從進料入口注入模擬移動床的第二區段與第三區段之間，並使第一類三萜類化合物隨固定相移動至第一區段與第二區段之間的萃出端，並使第二類三萜類化合物隨移動相移動至第三區段的萃餘端，以分離純化出第一類三萜類化合物及第二類三萜類化合物。
在本發明的一實施例中，上述的固定相為表面改質的二氧化矽填料。
在本發明的一實施例中，上述的第一區段、第二區段以及第三區段各自包含2根管柱，且每根管柱內填充有固定相。
在本發明的一實施例中，上述固定相的顆粒間的孔隙度為0.38。
在本發明的一實施例中，其中上述沖滌劑是藉由高壓二氧化碳與95%乙醇混合後而形成。
在本發明的一實施例中，其中以上述二氧化碳的總量計，上述的乙醇的含量為20 wt%~30 wt%。
在本發明的一實施例中，其中以上述二氧化碳的總量計，上述的乙醇的含量為25 wt%~30 wt%。
在本發明的一實施例中，上述的模擬移動床使用的分離條件為：二氧化碳的流速在沖滌端入口為8.088 公克/分鐘、在進料入口為0.33 公克/分鐘、在萃出端為5.928 公克/分鐘以及在萃餘端為2.49 公克/分鐘，且乙醇的流速在沖滌端入口為3.911 毫升/分鐘、在進料入口為0.16 毫升/分鐘、在萃出端為2.866 毫升/分鐘以及在萃餘端為1.205 毫升/分鐘，且模擬移動床的切換時間為9分鐘至10分鐘。
在本發明的另一實施例中，其中以上述二氧化碳的總量計，上述的乙醇的含量為20 wt%~25 wt%。
在本發明的另一實施例中，上述的模擬移動床使用的分離條件為：二氧化碳的流速在沖滌端入口為8.48 公克/分鐘、在進料入口為0.804 公克/分鐘、在萃出端為4.88 公克/分鐘以及在萃餘端為4.404 公克/分鐘，且乙醇的流速在沖滌端入口為3.294 毫升/分鐘、在進料入口為0.312 毫升/分鐘、在萃出端為1.896 毫升/分鐘以及在萃餘端為1.748 毫升/分鐘，且模擬移動床的切換時間為8分鐘至10分鐘。
在本發明的一實施例中，上述靈芝粗萃物的製備方法包括使用超臨界流體對靈芝進行萃取，以得到靈芝粗萃物。
在本發明的一實施例中，其中所分離的第一類三萜類化合物中靈芝酸A的含量大於5%，所分離的第二類三萜類化合物中靈芝酸F的含量大於2.3%，所分離的第二類三萜類化合物中靈芝醇B的含量大於0.3%。
基於上述，本發明的三萜類化合物的純化方法透過應用模擬移動床層析法將靈芝粗萃物中的包括靈芝酸A的第一類三萜類化合物與包括靈芝酸F以及靈芝醇B的第二類三萜類化合物分離開來，所述方法操作穩定、溶劑耗量小且可實現自動化，不僅可有效提升分離效率，更可獲得高純度的三萜類化合物。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
本發明實施例的純化三萜類化合物的方法，可用以將第一類三萜類化合物、第二類三萜類化合物以及其它混合物從靈芝粗萃物中分離純化出來。藉此，能夠得到高純度的三萜類化合物。更具體來說，本發明的純化三萜類化合物的方法可將靈芝粗萃物中不同種類的三萜類化合物分離。
圖1為依照本發明一實施例的純化三萜類化合物的方法的步驟圖。
請參照圖1。首先，進行步驟S100，提供靈芝粗萃物。靈芝粗萃物包括第一類三萜類化合物及第二類三萜類化合物，其中第一類三萜類化合物包括靈芝酸A，第二類三萜類化合物包括靈芝酸F以及靈芝醇B。接著，進行步驟S110，以模擬移動床（Simulated Moving Bed，SMB）層析法將靈芝粗萃物中的第一類三萜類化合物與第二類三萜類化合物分離開來。
以下列舉實施例以說明本發明的生產方法的細節或條件，但這些實施例非用以限制本發明保護範圍。所繪圖式係為示意圖僅為說明方便而繪製，並非代表限制其實際的方法、條件或裝置等。
[ 靈芝粗萃物的製備 ]
在本實施例中，靈芝粗萃物的製備方法包括使用超臨界流體對靈芝進行萃取而取得。舉例而言，可將靈芝切丁後置入分離槽，使用二氧化碳進行萃取；同時泵入輔助溶劑，以與二氧化碳共同進行3個小時的萃取。在本實施例中，輔助溶劑為乙醇，但不以此為限。上述萃取條件為：壓力為45 MPa、溫度為45°C、二氧化碳流速為10 公斤/小時且乙醇流速為1.6 公斤/小時。在3個小時的萃取中，每半個小時自分離槽中取樣一次。接著，將收集到的6瓶萃取液進行混合、濃縮及過濾，以得到靈芝粗萃物。
[ 分析方法 ]
使用高效液相層析儀紫外線偵測器（HPLC/UV）（泵：日立2130；紫外線偵測器：日立L-2455）進行樣品的分析，其中分析管柱採用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；移動相以1毫升/分鐘（mL/min）的流速進行沖滌，沖滌方式則使用乙腈（acetonitrile，ACN）溶液及0.1%乙酸（HAc）水溶液的梯度沖滌，梯度沖滌的設定整理於表1，檢測波長則設定為252 nm。
[表1]
時間（分鐘） 乙腈（%） 0.1%乙酸水溶液（%）
0 28 72
25 30 70
50 39 61
60 60 40
85 100 0
100 100 0
101 28 72
110 28 72
圖2為依照本發明一實施例的靈芝粗萃物的HPLC圖譜。在本實施例中，靈芝粗萃物中的三萜類化合物包括靈芝酸A、靈芝酸F以及靈芝醇B。將所得之靈芝粗萃物的高效液相層析分析圖與靈芝酸A、靈芝酸F以及靈芝醇B各自的標準品溶液所得之高效液相層析分析圖相比較，可從圖2的分析圖中清楚判讀出靈芝酸A、靈芝酸F以及靈芝醇B的波鋒位置，藉由此結果做為分析標準。標準溶液的配製方法為：取標的物靈芝酸A，用甲醇配製成一系列濃度，分別為115、230、460及920 mg/L，分別進樣20 μL，得回歸方程為Y=16196X (R 2=0.9967)。取標的物靈芝酸F，用甲醇配製成一系列濃度，分別為160、320及640 mg/L，分別進樣20 μL，得回歸方程為Y=12230X (R 2=0.9992)。靈芝醇B使用甲醇配制成濃度為300 ppm，分析後HPLC圖譜中面積為5967659，採用外標一點法進行含量檢測。
[ 模擬移動床的組態設計 ]
圖3為本發明實施例的一種純化三萜類化合物的方法中所使用的模擬移動床之組態設計圖。本實驗例是以提供圖3所示的模擬移動床100來進行模擬移動床層析法。請參考圖3，模擬移動床100包括第一區段110A、第二區段110B與第三區段110C。在本實施例中，第一區段110A包含兩根管柱C1與C2，第二區段110B包含兩根管柱C3與C4、且第三區段110C包含兩根管柱C5與C6，上述6根管柱串聯。
模擬移動床100是由移動相（未繪示）及固定相（未繪示）所組成。移動相包括沖滌劑，而固定相為內部具有孔隙的顆粒。舉例而言，固定相的顆粒間的孔隙度為0.38。每根管柱（C1~C6）內是填充顆粒內部具有孔隙的固定相。在本實施例中，固定相為經表面改質的二氧化矽填料，而移動相為包含超臨界二氧化碳與輔助溶劑的沖滌劑。舉例來說，沖滌劑可藉由二氧化碳液泵產生的高壓二氧化碳與另外輸入的輔助溶劑混合後而形成。在本實施例中，移動相中的輔助溶劑例如是乙醇。在本實施例中，沖滌劑是藉由高壓二氧化碳與95%乙醇混合後而形成。然而，本發明不以此為限。在本實施例中，以二氧化碳的總量計，乙醇的含量為20 wt%~30 wt%，亦即，乙醇的含量除以二氧化碳的總量約為20 wt%~30 wt%，但不限於此。在一實施例中，以二氧化碳的總量計，乙醇的含量為25 wt%~30 wt%。在另一實施例中，以二氧化碳的總量計，乙醇的含量為20 wt%~25 wt%。一般而言，固定相以及移動相的選擇可以依據所欲分離的產物之需求而進行調整。
在本實施例中，藉由固定相及移動相於三區段之間的相對流動，以分離混合物中的物質。移動相是相對於模擬移動床100中是朝同一方向從沖滌端入口D流經第一區段110A、第二區段110B以及第三區段110C之間，而固定相是相對於移動相朝反方向模擬移動。舉例來說，請參考圖3，若固定相是朝X1方向模擬移動（例如向左移動），則移動相會朝與X1相反的方向移動（例如向右移動）。藉由進料口切換裝置改變混合物之進料位置，以模擬固定相與移動相之相對流動方向。混合物進入層析管柱(進料)後，混合物所包含的成分A及成分B會依照各物質的亨利常數K分別被固定相滯留或隨著移動相移動，進而分離或純化成分A及成分B。具體而言，是將靈芝粗萃物102的進料溶液從進料入口F注入模擬移動床100的第二區段110B與第三區段110C之間，並且使包括第一類三萜類化合物的成分102A隨固定相移動至第一區段110A與第二區段110B之間的萃出端E，並使包括第二類三萜類化合物的成分102B隨移動相移動至第三區段110C的萃餘端R。
[ 亨利常數 K 的計算 ]
混合物進入層析管柱（進料）後，混合物所包含的成分會依照各物質的亨利常數K分別被固定相滯留或隨著移動相移動，進而分離或純化成分。亨利常數K值的計算方式如式(1)所示：
Figure 02_image001
式(1) 式(1)中： t為超臨界流體層析分析圖中的待測成分的滯留時間； t 0為不滯留成分的流出時間； t d為超臨界流體層析系統的死角體積，本實施例中忽略t d； ε e為填充管柱的外孔孔隙度（即固定相的顆粒間的孔隙度），本實施例中ε e為0.38。
[ 模擬移動床層析法的操作條件 ]
依據上述計算得亨利常數K並結合三角形理論，以得到模擬移動床層析法的操作條件，包括實驗所需設定的移動相端（即沖滌劑端入口）、進料端、萃出端（萃餘端）的二氧化碳與輔助溶劑流速以及切換時間。三角形理論的主要參數m j為各區段移動相的體積流速與固體體積流速的比值，參數m j的定義如下：
Figure 02_image004
式(2) 式(2)中： Q j為j區段流體的體積流速； t sw為切換時間； ε t為填料總孔隙度，且ε t=ε e+(1-ε e)ε i，本實施例中ε e為0.38且ε t為0.659； V c為管住體積，本實施例中V c為19.635； V d為模擬移動床系統的死角體積，本實施例中V d為0.1個管柱體積，即V d為1.963。
接著，以下將對利用模擬移動床層析法將三萜類化合物成分從靈芝粗萃物中分離開來的方式進行說明。
實施例 1
[ 單一管柱測試 ]
為了設定模擬移動床層析法的操作條件，在本實施例中，先篩選出適合的流動相，並調查三萜類化合物與其他主要雜質的滯留行為。在本實施例中，以靈芝粗萃物作為分析樣品，並使用高效液相層析儀紫外線偵測器（HPLC/UV）以上述分析方法進行分析。固定相為經表面改質的二氧化矽填料，移動相為包含超臨界二氧化碳與輔助溶劑的沖滌劑。在本實施例中，沖滌劑是藉由高壓二氧化碳與95%乙醇混合後而形成。作為固定相的二氧化矽填料填充於1 cm ID× 25 cm L的填充管柱再串接於超臨界流體層析（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）設備，檢測波長則設定為252 nm。超臨界流體層析設備的操作條件設定為壓力180 bar，溫度50°C，二氧化碳流速設定為4.0公克/分鐘（g/min），乙醇流速為1.934毫升/分鐘（mL/min）。在本實施例中，以二氧化碳的總量計，乙醇的含量約為28 wt%，在此條件下的超臨界流體密度為0.837公克/毫升（g/mL）。
圖4為依照本發明一實施例的靈芝粗萃物在單一管柱測試中所得的超臨界流體層析分析圖。請參考圖4，樣品在滯留時間為15分鐘時可完全脫附。詳細而言，可將樣品分為4個族群，並與三個標的物的出峰時間進行比對，其中標的物為三萜類化合物所包括的靈芝酸A、靈芝酸F以及靈芝醇B。第一個峰代表低極性雜質成分群，滯留時間t A=3.9 min；第二個峰代表靈芝酸F與靈芝醇B以及其他雜質，滯留時間t B=5.2 min；第三個峰代表靈芝酸A與雜質，滯留時間t C=8.3 min；第4個峰代表高極性雜質，滯留時間t D=12.3 min。依據上文所述的亨利常數K的計算可得第一個峰的亨利常數K A=1.513，第二個峰的亨利常數K B=2.221，第三個峰的亨利常數K C=3.911，第四個峰的亨利常數K D=6.091。
[ 三萜類化合物的分離 ]
在本步驟中，是將超臨界二氧化碳萃取靈芝所得的靈芝萃取物用95%乙醇溶解且配置成濃度為5278 ppm的進料溶液後，將靈芝粗萃物102的進料溶液從進料入口F注入模擬移動床100的第二區段110B與第三區段110C之間。接著，使包括第一類三萜類化合物的成分102A隨固定相移動至第一區段110A與第二區段110B之間的萃出端E，並使包括第二類三萜類化合物的成分102B隨移動相移動至第三區段110C的萃餘端R。具體而言，成分102A包括靈芝酸A，成分102B包括靈芝醇B及靈芝酸F。
為了達到上述的分離結果，本實施例使用上述的三角形理論設定模擬移動床層析法的操作條件。模擬移動床100使用的分離條件為：管柱（C1~C6）的規格為1 cm ID× 25 cm L，填充於管柱內的固定相為經表面改質的二氧化矽填料，移動相為包含超臨界二氧化碳與輔助溶劑的沖滌劑，其中輔助溶劑為乙醇。模擬移動床層析法的沖滌端入口D、進料入口F、萃出端E及萃餘端R的流速設定如下表2所示。
[表2]
  CO 2(g/min) 95%乙醇(mL/min)
入口端 沖滌端入口D 8.088 3.911
進料入口F 0.33 0.16
出口端 萃出端E 5.928 2.866
萃餘端R 2.49 1.205
在本步驟中，進行層析分離時的溫度固定為50°C、萃餘端R的出口壓力設定為180 bar且沖滌端入口D的壓力顯示為200 bar。在本步驟中，當使用上述的方式操作一段時間以後，如6分鐘，便將所有的出口以及入口同時往下一根管柱切換。再持續一段相同時間後，再一次將所有出入口移往下一根管柱，如此持續的切換各出入口端的位置，便可模擬固體沿著圖3的左手方向移動，而形成固體與液體逆向流動的行為。在本實施例中，測試了五種不同切換時間（6分鐘、6.5分鐘、7.5分鐘、9分鐘及10分鐘）。當模擬移動床的操作達4次循環以上的穩態操作以後，便開始在萃餘端R及萃出端E收集樣品，分析結果顯示於圖5及表3中。
[表3]
切換時間 (分鐘) 進出口端 總物質濃度 (ppm) 靈芝酸A 靈芝酸F 靈芝醇B 總靈芝酸含量 (%)
面積 濃度 (ppm) 含量(%) 面積 濃度 (ppm) 含量(%) 面積 濃度 (ppm) 含量(%)
6 萃出端E 172.73 205963 12.72 7.36 68790 5.62 3.26 9386 0.47 0.27 10.89
萃餘端R 230.56 0 0.00 0.00 0 0.00 0.00 0 0.00 0.00 0
6.5 萃出端E 168.78 204589 12.63 7.48 34513 2.82 1.67 2926 0.15 0.09 9.24
萃餘端R 196.40 3645 0.23 0.11 10683 0.87 0.44 10707 0.54 0.27 0.82
7.5 萃出端E 137.33 203041 12.54 9.13 15902 1.30 0.95 0 0.00 0.00 10.08
萃餘端R 246.43 0 0.00 0.00 45460 3.72 1.51 15070 0.76 0.31 1.82
9 萃出端E 104.07 171385 10.58 10.17 0 0.00 0.00 0 0.00 0.00 10.17
萃餘端R 304.35 0 0.00 0.00 86507 7.07 2.32 21528 1.08 0.36 2.68
10 萃出端E 80.14 73143 4.52 5.64 0 0.00 0.00 0 0.00 0.00 5.64
萃餘端R 342.31 0 0.00 0.00 179819 14.70 4.30 24000 1.21 0.35 4.65
進料入口F 5278.00 4079144 251.86 4.77 1294647 105.86 2.01 265527 13.35 0.25 7.03
圖5為依照本發明一實施例的利用模擬移動床層析法從靈芝粗萃物中分離純化出三萜類化合物的結果分析圖。請參照圖5及表3，比對模擬移動床的進料入口F的溶液與在萃餘端R及萃出端E收集到的溶液之分析結果，可以得知的是，第一類三萜類化合物可由萃出端E分離出來，而第二類三萜類化合物可由萃餘端R分離出來。舉例來說，在切換時間為9分鐘的條件下，靈芝酸A在萃出端E所收集到的含量可由進料的4.77%提高至10.17%，靈芝酸F在萃餘端R所收集到的含量可由進料的2.01%提高至2.32%，靈芝醇B在萃餘端R所收集到的含量可由進料的0.25%提高至0.36%；而在切換時間為10分鐘的條件下，靈芝酸A在萃出端E所收集到的含量可由進料的4.77%提高至5.64%，靈芝酸F在萃餘端R所收集到的含量可由進料的2.01%提高至4.30%，靈芝醇B在萃餘端R所收集到的含量可由進料的0.25%提高至0.35%。藉此，可有效地將第一類三萜類化合物與第二類三萜類化合物分離，以提高第一類三萜類化合物的純度。
實施例 2
[ 單一管柱測試 ]
為了設定模擬移動床層析法的操作條件，在本實施例中，先篩選出適合的流動相，並調查三萜類化合物與其他主要雜質在此層析系統中的滯留行為。在本實施例中，以靈芝粗萃物作為分析樣品，並使用高效液相層析儀紫外線偵測器（HPLC/UV）以上述分析方法進行分析。固定相為經表面改質的二氧化矽填料，移動相為包含超臨界二氧化碳與輔助溶劑的沖滌劑。在本實施例中，沖滌劑是藉由高壓二氧化碳與95%乙醇混合後而形成。作為固定相的二氧化矽填料填充於1 cm ID× 25 cm L的填充管柱再串接於超臨界流體層析（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）設備，檢測波長則設定為252 nm。在本實施例中，超臨界流體層析設備的操作條件設定為壓力160 bar，溫度50°C，二氧化碳流速設定為4.0 g/min，95%乙醇流速為1.554 mL/min，並假設ε t=ε e+(1-ε e)*0.45 =0.659，計算得乙醇的含量在二氧化碳的總量中約為23.8 wt%，在此條件下的超臨界流體密度為0.83 g/mL。
圖6為依照本發明另一實施例的靈芝粗萃物在單一管柱測試中所得的超臨界流體層析分析圖。請參考圖6，樣品在滯留時間為25分鐘時可完全脫附。詳細而言，可將樣品分為4個族群，並與三個標的物的出峰時間進行比對，其中標的物為三萜類化合物所包括的靈芝酸A、靈芝酸F以及靈芝醇B。第一個峰代表低極性雜質成分群，滯留時間t A=5.28 min；第二個峰代表靈芝酸F與靈芝醇B以及其他雜質，滯留時間t B=10.05 min；第三個峰代表靈芝酸A與雜質，滯留時間t C=17.0 min；第4個峰代表高極性雜質，滯留時間t D=22.0 min。依據上文所述的亨利常數K的計算可得第一個峰的亨利常數K A=3.58，第二個峰的亨利常數K B=4.603，第三個峰的亨利常數K C=8.21，第四個峰的亨利常數K D=10.804。
[ 三萜類化合物的分離 ]
在本步驟中，是將超臨界二氧化碳萃取靈芝所得的靈芝萃取物用95%乙醇溶解且配置成濃度為5000 ppm的進料溶液後，將靈芝粗萃物102的進料溶液從進料入口F注入模擬移動床100的第二區段110B與第三區段110C之間，並且使包括第一類三萜類化合物的成分102A隨固定相移動至第一區段110A與第二區段110B之間的萃出端E，並使包括第二類三萜類化合物的成分102B隨移動相移動至第三區段110C的萃餘端R。具體而言，成分102A包括靈芝酸A，成分102B包括靈芝醇B及靈芝酸F。
為了達到上述的分離結果，本實施例使用上述的三角形理論設定模擬移動床層析法的操作條件。模擬移動床100使用的分離條件為：管柱（C1~C6）的規格為1 cm ID× 25 cm L，填充於管柱內的固定相為經表面改質的二氧化矽填料，移動相為包含超臨界二氧化碳與輔助溶劑的沖滌劑，其中輔助溶劑為乙醇。模擬移動床層析法的沖滌端入口D、進料入口F、萃出端E及萃餘端R的流速設定如下表4所示。
[表4]
  CO 2(g/min) 95%乙醇(mL/min)
入口端 沖滌端入口D 8.48 3.294
進料入口F 0.804 0.312
出口端 萃出端E 4.88 1.896
萃餘端R 4.404 1.748
在本步驟中，進行層析分離時的溫度固定為50°C、萃餘端R的出口壓力設定為160 bar且沖滌端入口D的壓力顯示為190 bar。在本步驟中，當使用上述的方式操作一段時間以後，如4分鐘，便將所有的出口以及入口同時往下一根管柱切換。再持續一段相同時間後，再一次將所有出入口移往下一根管柱，如此持續的切換各出入口端的位置，便可模擬固體沿著圖3的左手方向移動，而形成與液體逆向流動的行為。在本實施例中，測試了六種不同切換時間（4分鐘、6分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘及12分鐘）。當模擬移動床的操作達4次循環以上的穩態操作以後，便開始在萃餘端R及萃出端E收集樣品，分析結果顯示於圖7。
圖7為依照本發明另一實施例的利用模擬移動床層析法從靈芝粗萃物中分離純化出三萜類化合物的結果分析圖。請參照圖7，比對模擬移動床的進料口F溶液與在萃餘端R及萃出端E收集到的溶液之分析結果，可以得知的是，第一類三萜類化合物可由萃出端E分離出來，而第二類三萜類化合物可由萃餘端R分離出來。舉例來說，在切換時間為8分鐘至10分鐘範圍的條件下，可有效地將第一類三萜類化合物與第二類三萜類化合物分離，以提高第一類三萜類化合物的純度。
綜上所述，由於本發明所提供的模擬移動床技術可以連續式進料，操作步驟簡易，穩定性佳，與傳統的製備方法相比較具有實現自動化、溶劑消耗少，產率高等優勢，容易工業化生產高純度三萜類化合物。因此，本發明所提供的藉由使用超臨界流體模擬移動床層析技術純化三萜類化合物的方法能夠解決傳統技術中產物稀釋嚴重、操作重複性低，穩定性不佳等問題。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
S100、S110:步驟 102:靈芝粗萃物 102A、102B:成分 110A:第一區段 110B:第二區段 110C:第三區段 C1、C2、C3、C4、C5、C6:管柱 D:沖滌端入口 E:萃出端 F:進料入口 R:萃餘端 X1:方向
圖1為依照本發明一實施例的純化三萜類化合物的方法的步驟圖。 圖2為依照本發明一實施例的靈芝粗萃物的HPLC圖譜。 圖3為本發明實施例的一種純化三萜類化合物的方法中所使用的模擬移動床之組態設計圖。 圖4為依照本發明一實施例的靈芝粗萃物在單一管柱測試中所得的超臨界流體層析分析圖。 圖5為依照本發明一實施例的利用模擬移動床層析法從靈芝粗萃物中分離純化出三萜類化合物的結果分析圖。 圖6為依照本發明另一實施例的靈芝粗萃物在單一管柱測試中所得的超臨界流體層析分析圖。 圖7為依照本發明另一實施例的利用模擬移動床層析法從靈芝粗萃物中分離純化出三萜類化合物的結果分析圖。
S100、S110:步驟

Claims (7)

  1. 一種純化三萜類化合物的方法，包括：提供靈芝粗萃物，所述靈芝粗萃物包括第一類三萜類化合物及第二類三萜類化合物，其中所述第一類三萜類化合物包括靈芝酸A，所述第二類三萜類化合物包括靈芝酸F以及靈芝醇B；以及以模擬移動床層析法將所述靈芝粗萃物中的所述第一類三萜類化合物與所述第二類三萜類化合物分離開來，其中所述模擬移動床層析法包含：(i)提供模擬移動床，所述模擬移動床依序包括第一區段、第二區段以及第三區段，其中所述模擬移動床是由移動相及固定相所組成，所述固定相為內部具有孔隙的顆粒，所述移動相對於所述模擬移動床是朝同一方向從沖滌端入口流經所述第一區段、所述第二區段以及所述第三區段之間，所述固定相是相對於所述移動相朝反方向模擬移動，所述移動相為包含超臨界二氧化碳與乙醇的沖滌劑；(ii)將所述靈芝粗萃物從進料入口注入所述模擬移動床的所述第二區段與所述第三區段之間，並使所述第一類三萜類化合物隨所述固定相移動至所述第一區段與所述第二區段之間的萃出端，並使所述第二類三萜類化合物隨所述移動相移動至所述第三區段的萃餘端，以分離純化出所述第一類三萜類化合物及所述第二類三萜類化合物，其中以二氧化碳的總量計，所述乙醇的含量為25wt%~30wt%， 其中所述模擬移動床使用的分離條件為：所述二氧化碳的流速在所述沖滌端入口為8.088公克/分鐘、在所述進料入口為0.33公克/分鐘、在所述萃出端為5.928公克/分鐘以及在所述萃餘端為2.49公克/分鐘，且所述乙醇的流速在所述沖滌端入口為3.911毫升/分鐘、在所述進料入口為0.16毫升/分鐘、在所述萃出端為2.866毫升/分鐘以及在所述萃餘端為1.205毫升/分鐘，且所述模擬移動床的切換時間為9分鐘至10分鐘，其中所分離的第一類三萜類化合物中所述靈芝酸A的含量大於5%，所分離的第二類三萜類化合物中所述靈芝酸F的含量大於2.3%，所分離的第二類三萜類化合物中所述靈芝醇B的含量大於0.3%。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的純化三萜類化合物的方法，其中所述固定相為表面改質的二氧化矽填料。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的純化三萜類化合物的方法，其中所述第一區段、所述第二區段以及所述第三區段各自包含2根管柱，且每根管柱內填充有所述固定相。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的純化三萜類化合物的方法，其中所述固定相的所述顆粒間的孔隙度為0.38。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的純化三萜類化合物的方法，其中所述沖滌劑是藉由高壓二氧化碳與95%乙醇混合後而形成。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的純化三萜類化合物的方法，其中其中所述靈芝粗萃物的製備方法包括：使用超臨界流體對靈芝進行萃取，以得到所述靈芝粗萃物。
  7. 一種純化三萜類化合物的方法，包括：提供靈芝粗萃物，所述靈芝粗萃物包括第一類三萜類化合物及第二類三萜類化合物，其中所述第一類三萜類化合物包括靈芝酸A，所述第二類三萜類化合物包括靈芝酸F以及靈芝醇B；以及以模擬移動床層析法將所述靈芝粗萃物中的所述第一類三萜類化合物與所述第二類三萜類化合物分離開來，其中所述模擬移動床層析法包含：(i)提供模擬移動床，所述模擬移動床依序包括第一區段、第二區段以及第三區段，其中所述模擬移動床是由移動相及固定相所組成，所述固定相為內部具有孔隙的顆粒，所述移動相對於所述模擬移動床是朝同一方向從沖滌端入口流經所述第一區段、所述第二區段以及所述第三區段之間，所述固定相是相對於所述移動相朝反方向模擬移動，所述移動相為包含超臨界二氧化碳與乙醇的沖滌劑；(ii)將所述靈芝粗萃物從進料入口注入所述模擬移動床的所述第二區段與所述第三區段之間，並使所述第一類三萜類化合物隨所述固定相移動至所述第一區段與所述第二區段之間的萃出端，並使所述第二類三萜類化合物隨所述移動相移動至所述第 三區段的萃餘端，以分離純化出所述第一類三萜類化合物及所述第二類三萜類化合物，其中以二氧化碳的總量計，所述乙醇的含量為20wt%~25wt%，其中所述模擬移動床使用的分離條件為：所述二氧化碳的流速在所述沖滌端入口為8.48公克/分鐘、在所述進料入口為0.804公克/分鐘、在所述萃出端為4.88公克/分鐘以及在所述萃餘端為4.404公克/分鐘，且所述乙醇的流速在所述沖滌端入口為3.294毫升/分鐘、在所述進料入口為0.312毫升/分鐘、在所述萃出端為1.896毫升/分鐘以及在所述萃餘端為1.748毫升/分鐘，且所述模擬移動床的切換時間為8分鐘至10分鐘。
TW108108768A 2019-03-15 2019-03-15 純化三萜類化合物的方法 TWI703121B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW108108768A TWI703121B (zh) 2019-03-15 2019-03-15 純化三萜類化合物的方法
CN201910391788.6A CN111686136B (zh) 2019-03-15 2019-05-10 纯化三萜类化合物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW108108768A TWI703121B (zh) 2019-03-15 2019-03-15 純化三萜類化合物的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TWI703121B true TWI703121B (zh) 2020-09-01
TW202035353A TW202035353A (zh) 2020-10-01

Family

ID=72476022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108108768A TWI703121B (zh) 2019-03-15 2019-03-15 純化三萜類化合物的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111686136B (zh)
TW (1) TWI703121B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103251658A (zh) * 2012-02-21 2013-08-21 乔本生医股份有限公司 牛樟芝萃取浓缩物及其制造方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935832A (zh) * 2005-09-23 2007-03-28 中国科学院大连化学物理研究所 Co2－sfe在提取灵芝子实体中三萜类物质上的应用
CN100998613B (zh) * 2006-01-11 2010-12-08 蒋濡蔚 一种超临界技术生产灵芝有效成分的方法
CN101186630A (zh) * 2007-12-13 2008-05-28 上海科鑫生物工程有限公司 灵芝三萜类化合物的快速制备方法及其产品
CN104257701B (zh) * 2014-09-25 2017-07-25 齐鲁工业大学 一种制备灵芝三萜类化合物的方法
CN104666368B (zh) * 2014-10-17 2018-08-03 成都大学 高抗人源肿瘤细胞活性的灵芝总三萜纯化物及其纯化方法
CN108392500B (zh) * 2018-03-30 2020-08-11 上海市农业科学院 一种制备灵芝三萜的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103251658A (zh) * 2012-02-21 2013-08-21 乔本生医股份有限公司 牛樟芝萃取浓缩物及其制造方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2010年2月2日網路公開「SF-SMB技術簡介」
2017/7/5「義大建立生技醫藥產業化平台」之報導
2018-09-15第十二屆全國超臨界流體技術及應用研討會暨第五屆海峽兩岸超臨界流體技術研討會論文摘要集
2018-09-15第十二屆全國超臨界流體技術及應用研討會暨第五屆海峽兩岸超臨界流體技術研討會論文摘要集 2017/7/5「義大建立生技醫藥產業化平台」之報導 2010年2月2日網路公開「SF-SMB技術簡介」 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111686136B (zh) 2022-05-24
TW202035353A (zh) 2020-10-01
CN111686136A (zh) 2020-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111960926B (zh) 大麻二酚晶体的制备方法
US10183028B2 (en) Enrichment method of ergosterol peroxide from sporoderm-broken Ganoderma lucidum spore powder
Li et al. Extraction and isolation of potential anti-stroke compounds from flowers of Pueraria lobata guided by in vitro PC12 cell model
Chen et al. Enrichment and purification of gardenia yellow from Gardenia jasminoides var. radicans Makino by column chromatography technique
TWI648253B (zh) 純化奇壬醇的方法
Xu et al. D-limonene as an alternative for the extraction and purification of nuciferine from lotus leaf via multi-stage vortex assisted two-phase solvent extraction integrated with solid phase extraction using mesoporous material SBA-15 as adsorbent
TWI703121B (zh) 純化三萜類化合物的方法
CN108373474B (zh) 一种从银杏叶中提取的银杏内酯化合物及其制备方法
CN105017367B (zh) 一种分离羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇的方法
CN104592292B (zh) 一种注射用多烯磷脂酰胆碱的制备方法
TWI641585B (zh) 純化茄尼醇的方法
TWI697671B (zh) 純化丹參酮類化合物的方法
CN105859715A (zh) 一种从吴茱萸中分离纯化吴茱萸碱和吴茱萸次碱的临界流体色谱方法
CN105434539A (zh) 一种荷叶黄酮的组合物
TWI724419B (zh) 純化皂苷的方法
CN105693675A (zh) 一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法
TWI716829B (zh) 純化6-薑酚的方法
CN102276570A (zh) 一种提纯表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）的方法
TWI661856B (zh) 粗萃物的分離方法
CN114380666B (zh) 一种大麻二酚的工业化提取方法
CN107098838A (zh) 一种大蒜阿霍烯对照品的制备方法
TWI826944B (zh) 移除乙酯化魚油中塑化劑的方法
CN101823934B (zh) 一种从番茄中提取高纯番茄红素的工艺
TWI635075B (zh) 純化共軛次亞麻油酸的方法
CN106117032A (zh) 氧化樟脑分离纯化方法