TWI635075B

TWI635075B - 純化共軛次亞麻油酸的方法

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Publication number: TWI635075B
Application number: TW106109881A
Authority: TW
Inventors: 梁明在; 林柏豪; 包曉青
Original assignee: 義守大學
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2018-09-11
Also published as: TW201835023A

Abstract

一種純化共軛次亞麻油酸的方法，包括提供天然產物，所述天然產物包括有共軛次亞麻油酸以及其它混合物。將天然產物乙酯化之後，以模擬移動床層析法將天然產物中的共軛次亞麻油酸分離開來。模擬移動床層析法包含利用具有三區段的模擬移動床，使用超臨界二氧化碳並添加液體輔溶劑的沖滌液做為移動相。用此模擬移動床層析法可將共軛次亞麻油酸分離純化，以產生高純度的共軛次亞麻油酸。

Description

純化共軛次亞麻油酸的方法

本發明是有關於一種純化方法，且特別是有關於一種純化共軛次亞麻油酸的方法。

共軛次亞麻油酸(conjugated linolenic acid; CLN) 在延緩體脂生成的功效已經獲得研究的證實，比如有研究證實c9、t11、 t13的共軛次亞麻油酸是苦瓜籽油中的降肝脂功能成分之一。高純度的共軛次亞麻油酸異構體具有抗癌、降血脂、減肥、提高免疫力等許多重要的生物活性，因此有必要尋找一種能夠大量生產高純度的共軛次亞麻油酸活性異構體的工業製備方法。

目前，有關共軛次亞麻油酸分離純化的方法包括有化學法、生物法和天然產物提取法等，以上方法皆有各自的局限。舉例來說，常見的化學法中化學合成法、脫水法、鹼異構化法等，得到的產物多是共軛次亞麻油酸異構體的混合物，並且該方法的產率均不太高，產品的分離和純化比較困難。另外，採用生物酶促合成法可以得到共軛次亞麻油酸單體，但是生物酶促合成的產率較低。而採用從天然產物中提取並經過後期的分離純化是目前大規模製備共軛次亞麻油酸的一個有效方法。但是，利用傳統的層析分離手段時，在分離純化過程中會採用多次重複的層析進行目標物的純化，然而這種常用的吸附與層析技術往往會導致產物稀釋嚴重，且溶劑耗量大、吸附劑效能低、操作成本高，不適宜工業化生產。

有鑑於此，如何克服傳統層析技術中，純化共軛次亞麻油酸時所消耗大量的溶劑與等待的時間，以及產出率低等缺點，為目前亟需解決的問題。

本發明提供一種純化共軛次亞麻油酸的方法，可有效地分離出高純度的共軛次亞麻油酸。

本發明實施例提供一種純化共軛次亞麻油酸的方法。所述方法包括提供天然產物，所述天然產物包括有共軛次亞麻油酸以及其它混合物。將天然產物乙酯化，並以模擬移動床層析法將天然產物中的共軛次亞麻油酸分離開來。所述模擬移動床層析法包含：（i）提供模擬移動床，所述模擬移動床包括第一區段、第二區段以及第三區段，其中模擬移動床是由移動相及固定相所組成，其中移動相包括超臨界二氧化碳的沖滌液，固定相顆粒內部是具有孔隙，移動相對於模擬移動床中朝同一方向從沖滌端入口流經第一區段、第二區段以及第三區段之間，固定相是相對於移動相朝反方向模擬移動；（ii）將天然產物從進料入口注入模擬移動床的第二區段以及第三區段之間，並使天然產物中的共軛次亞麻油酸隨固定相移動至第一區段與第二區段之間的萃出端，並使天然產物中的其它混合物隨移動相移動至第三區段的萃餘端，以分離出共軛次亞麻油酸。

在本發明的一實施例中，上述的第一區段、第二區段以及第三區段各自包含兩根管柱，且每根管柱內填充顆粒內部具有孔隙之固定相。

在本發明的一實施例中，移動相的超臨界二氧化碳的沖滌液是藉由二氧化碳液泵產生高壓二氧化碳並與輔助溶劑混合後而形成。

在本發明的一實施例中，上述的天然產物為苦瓜籽油。

在本發明的一實施例中，將苦瓜籽油乙酯化後，將共軛次亞麻油酸分離的條件為：沖滌端入口壓力160 bar、萃餘端壓力140 bar、溫度為40℃，且二氧化碳流速在沖滌端入口為10.8克/分鐘、在進料入口為0.4克/分鐘、在萃出端為4.8克/分鐘，且輔助溶劑流速在沖滌端入口為1.08毫升/分鐘、在進料入口為0.04毫升/分鐘。

在本發明的一實施例中，模擬移動床的切換時間為1分45秒，且所分離出共軛次亞麻油酸的百分比含量為90.5%。

在本發明的一實施例中，上述的天然產物為桐油。

在本發明的一實施例中，將桐油乙酯化後，將共軛次亞麻油酸分離的條件為：沖滌端入口壓力165bar、萃餘端壓力120 bar、溫度為40℃，且二氧化碳流速在沖滌端入口為9克/分鐘、在進料入口為0.64克/分鐘、在萃出端為4克/分鐘，且輔助溶劑流速在沖滌端入口為0.599毫升/分鐘、在進料入口為0.042毫升/分鐘。

在本發明的一實施例中，模擬移動床的切換時間為2分45秒，且所分離出共軛次亞麻油酸的百分比含量為82.7%。

基於上述，本發明所提供的一種純化共軛次亞麻油酸的方法能夠有效的分離出高純度的共軛次亞麻油酸，並解決傳統技術中會消耗大量的溶劑與等待的時間，以及產出率低等缺點。

為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。

本發明實施例的純化共軛次亞麻油酸的方法，是可用以將共軛次亞麻油酸以及其它混合物從天然產物中分離純化出來的方法。藉此，能夠得到高純度的共軛次亞麻油酸。在本發明實施例中，是以提供有圖1所示的模擬移動床100來進行模擬移動床層析法。圖1是依照本發明實施例的一種純化共軛次亞麻油酸的方法中所使用的模擬移動床之組態設計圖。參考圖1，模擬移動床100包括第一區段110A、第二區段110B與第三區段110C。模擬移動床100是由移動相(未繪示)及固定相(未繪示)所組成，其中移動相包括超臨界二氧化碳的沖滌液，而固定相顆粒內部是具有孔隙。移動相是相對於模擬移動床100中是朝同一方向從沖滌端入口D1流經第一區段110A、第二區段110B以及第三區段110C之間，而固定相是相對於移動相朝反方向模擬移動。舉例來說，參考圖1，若固定相是朝X1方向模擬移動(例如向左移動)，則移動相會朝與X1相反的方向移動(例如向右移動)。

此外，在本實施例中，第一區段110A包含兩根管柱C1與C2，第二區段110B包含兩根管柱C3與C4、且第三區段110C各自包含兩根管柱C5與C6，而上述每根管柱(C1~C6)內是填充顆粒內部具有孔隙之固定相。固定相的選擇並沒有特別限制，且可以為習知常用的固定相材料，例如反相填料AQ-C ₁₈。固定相的選擇可以依據所分離的自然產物之需求而進行調整。另外，移動相的超臨界二氧化碳的沖滌液則是藉由二氧化碳液泵產生高壓二氧化碳並與輔助溶劑混合後而形成。天然產物102的選擇可例如包括苦瓜籽油或桐油，但本發明不以此為限。詳細來說，天然產物102指的是包括有共軛次亞麻油酸以及其它混合物的任何天然產物。

在本實施例中，圖1所示的模擬移動床100之組態設計是以圖2所示的設備管線流程圖進行配置。圖2是依照本發明實施例的一種純化共軛次亞麻油酸的方法中所使用的模擬移動床之設備管線流程圖。詳細來說，模擬移動床100包括兩個入料口，分別為進料入口F1與沖滌端入口D1(或移動相入口)，且包括兩個出料口，分別為萃出端E1與萃餘端R1。參考圖2，由於本發明實施例是使用超臨界二氧化碳做為沖滌劑/移動相，因此需要設置一個高壓的二氧化碳供應源210。

如圖2所示，模擬移動床100是利用二氧化碳液泵215從二氧化碳供應源210產生高壓二氧化碳，並暫存於緩衝槽220之中。接著，再以前端壓力調壓閥222或是後端壓力調壓閥223以及質量流量計搭配控制閥(未繪示)控制進料的二氧化碳流速。除了二氧化碳質量流量的控制以外，輔助溶劑的輸入則從沖滌端入口D1藉由高效能液相層析液泵225加以控制，而天然產物102的輸入則從進料入口F1藉由高效能液相層析液泵225加以控制。詳細來說，待天然產物102的進料溶解於輔助溶劑之中後，其是利用高效能液相層析液泵225從進料入口F1輸入與二氧化碳混合後再進入模擬移動床100中。相同地，做為移動相，超臨界二氧化碳的沖滌液是藉由二氧化碳液泵215產生的高壓二氧化碳與從沖滌端入口D1輸入的輔助溶劑混合後而形成。此外，上述的二氧化碳與輔助溶劑混合的步驟可藉由混合器230來達成。另一方面，在萃出端E1與萃餘端R1中，是先用後端壓力調壓閥223降壓並透過加熱器240預熱後，使輔助溶劑與分離的產物流入氣液分離槽245中，並暫儲留於槽底。另外，二氧化碳的沖滌液是經氣化再經後端壓力調壓閥223調壓之後，以質量流量計控制其流量，經過冷卻器250再從出口V1排放至大氣。

接著，請同時參考圖1及圖2，以下將繼續對利用模擬移動床層析法將共軛次亞麻油酸分離開來的方式進行說明。在提供如圖1及圖2所示的模擬移動床100之後，是將天然產物102從進料入口F1注入模擬移動床100的第二區段110B以及第三區段110C之間。由於共軛次亞麻油酸102A的吸附常數是大於其它混合物102B的吸附常數，因此，共軛次亞麻油酸102A於模擬移動床100之移動速度是小於其它混合物102B之移動速度，進而會使共軛次亞麻油酸102A隨固定相移動至第一區段110A與第二區段110B之間的萃出端E1。另外，由於天然產物102中的其它混合物102B的移動速度較快，因此會隨移動相移動至第三區段110C的萃餘端R1。據此，能夠有效分離並純化出高純度的共軛次亞麻油酸102A。 實驗例

以下，將藉由實驗來證明本發明純化共軛次亞麻油酸的方法能夠有效分離並純化出高純度的共軛次亞麻油酸。 實驗例 A

在實驗例A中，是以苦瓜籽油做為天然產物，並欲分離純化出苦瓜籽油中的共軛次亞麻油酸。 樣品製備

超臨界二氧化碳萃取出的苦瓜籽油是經除水再乙酯化後所得到的乙酯化苦瓜籽油(MCOILEE樣品)。 分析方法建立

分析方法中是使用氣相層析質譜儀(GC/MS)(Agilent Technologies 7890B GC / 5977A MSD)進行樣品的分析，所使用的分析毛細管柱為DB-5MS (30 m× 250μm)，並選用1.0毫升/分鐘氦氣作為挾帶氣體。氣相層析質譜儀的升溫條件設定如下：起始120℃並以10℃/分鐘升溫至220℃後持溫6分鐘，再以10℃/分鐘升溫至250℃持溫12分鐘，再以5℃/min升溫至300℃持溫5min，進樣量為1μL。樣品的GC/MS圖譜如圖3A所示。圖3A為甲酯化與乙酯化的苦瓜籽油之氣相色譜質譜分析圖。在圖3A中，內標準品IS採用167毫克/升的十五烷。由於共軛次亞麻油酸並無乙酯化標準品，因此各訊號峰的判讀主要以MS分析的結果加以判讀，同時也比較甲酯化苦瓜籽油301與乙酯化苦瓜籽油302的GC/MS圖譜之間的差異。如圖3A所示，比較甲酯化苦瓜籽油301與乙酯化苦瓜籽油302樣品的圖譜，可以發現乙酯化苦瓜籽油302的滯留時間全部都延後了，但是相對位置與高度則仍保持對應。詳細來說，從GC/MS圖譜可以清楚判讀出共軛次亞麻油酸102A與其它混合物102B的波鋒延後及改變位置，因此，可藉由此結果做為分析標準。 共軛次亞麻油酸的含量計算

天然產物的分離純化實驗過程中，萃出端E1取樣得到的樣品需進行其中共軛次亞麻油酸102A的含量計算，並與進料入口F1中共軛次亞麻油酸的含量相比較，以判定分離的效果。從萃出端E1中量取一定體積的樣品，按照體積比為9:1的比例與已知濃度的內標物IS均勻混和後進行GC/MS分析，那麼共軛次亞麻油酸102A的百分含量計算公式如下式1所示。 (式1)

在式1中，E為共軛次亞麻油酸102A的純度或百分比含量，A _CLN為GC圖譜中共軛次亞麻油酸102A的峰面積，而A表示圖譜中其他混合物102B的峰面積。 純化苦瓜籽油的方法

在本實驗例中，是利用圖1及圖2所示的模擬移動床100來進行苦瓜籽油的分離操作。將苦瓜籽油乙酯化後，共軛次亞麻油酸於模擬移動床100的分離的條件為：沖滌端入口D1壓力160 bar、萃餘端R1壓力140 bar、溫度為40℃，且二氧化碳流速在沖滌端入口D1為10.8克/分鐘、在進料入口F1為0.4克/分鐘、在萃出端E1為4.8克/分鐘，且輔助溶劑流速在沖滌端入口D1為1.08毫升/分鐘、在進料入口F1為0.04毫升/分鐘。另外，模擬移動床100的切換時間為1分45秒。採用以上條件進行模擬移動床層析法所得到的結果分析如圖3B所示。

圖3B為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從苦瓜籽油中分離純化出共軛次亞麻油酸的結果分析圖。參考圖3B，比對一開始在進料入口F1針對苦瓜籽油中所檢測到的混合物之分析圖，可以得知的是，共軛次亞麻油酸102A是從萃出端E1分離出來，而大部分的其它混合物102B是從萃餘端R1分離出來。透過上述的共軛次亞麻油酸的含量計算方法，所分離/純化出的共軛次亞麻油酸102A的百分比含量為90.5%。據此，可得到高純度的共軛次亞麻油酸102A。 實驗例 B

在實驗例B中，是以桐油做為天然產物，並欲分離純化出桐油中的共軛次亞麻油酸。 樣品製備

將市售的桐油樣品進行乙酯化反應後即得乙酯化桐油。 分析方法建立

分析方法中是使用氣相層析質譜儀(GC/MS)(Agilent Technologies 7890B GC / 5977A MSD)進行樣品的分析，所使用的分析毛細管柱為DB-5MS (30 m× 250μm)，並選用1.0毫升/分鐘氦氣作為挾帶氣體。氣相層析質譜儀的升溫條件設定如下：起始120℃並以10℃/分鐘升溫至220℃後持溫6分鐘，再以10℃/分鐘升溫至250℃持溫12分鐘，再以5℃/分鐘升溫至300℃持溫5分鐘，進樣量為1 μL。樣品的GC/MS圖譜如圖4A所示。圖4A為乙酯化的桐油之氣相色譜質譜分析圖。詳細來說，如同上述實驗例A的乙酯化苦瓜籽油302樣品的圖譜所示，相較於甲酯化樣品，實驗例B的乙酯化桐油402亦會有類似的波鋒延後及位置改變。也就是說，從圖4A所示的GC/MS圖譜可以清楚判讀出共軛次亞麻油酸102A與其它混合物102B的波鋒位置，因此，可藉由此結果做為分析標準。 純化桐油的方法

在本實驗例中，是利用圖1及圖2所示的模擬移動床100來進行桐油的分離操作。將桐油乙酯化後，共軛次亞麻油酸於模擬移動床100的分離的條件為：沖滌端入口D1壓力165bar、萃餘端R1壓力120 bar、溫度為40℃，且二氧化碳流速在沖滌端入口D1為9克/分鐘、在進料入口F1為0.64克/分鐘、在萃出端E1為4克/分鐘，且輔助溶劑流速在沖滌端入口D1為0.599毫升/分鐘、在進料入口F1為0.042毫升/分鐘。另外，模擬移動床100的切換時間為2分45秒。採用以上條件進行模擬移動床層析法所得到的結果分析如圖4B所示。

圖4B為為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從桐油中分離純化出共軛次亞麻油酸的結果分析圖。參考圖4B，比對一開始在進料入口F1針對桐油中所檢測到的混合物之分析圖，可以得知的是，共軛次亞麻油酸102A是從萃出端E1分離出來，而部分的其它混合物102B是從萃餘端R1分離出來。透過與實驗例A相同的共軛次亞麻油酸的含量計算方法，所分離/純化出的共軛次亞麻油酸102A的百分比含量為82.7%，且回收率為99.5%。據此，可得到高純度的共軛次亞麻油酸102A。

綜上所述，本發明所提供的一種純化共軛次亞麻油酸的方法能夠有效的分離出高純度的共軛次亞麻油酸，並解決傳統技術中會消耗大量的溶劑與等待的時間，以及產出率低等缺點。特別是，以超臨界二氧化碳取代傳統液體沖滌劑最主要的優點為二氧化碳易於產物的濃縮，以及可以產生壓力梯度的操作。因此，能夠提高模擬移動床之效率，並獲得更高的產出率。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

100‧‧‧模擬移動床

102‧‧‧天然產物

102A‧‧‧共軛次亞麻油酸

102B‧‧‧其它混合物

110A‧‧‧第一區段

110B‧‧‧第二區段

110C‧‧‧第三區段

210‧‧‧二氧化碳供應源

215‧‧‧二氧化碳液泵

220‧‧‧緩衝槽

222‧‧‧前端壓力調壓閥

223‧‧‧後端壓力調壓閥

225‧‧‧高效能液相層析液泵

230‧‧‧混合器

240‧‧‧加熱器

245‧‧‧氣液分離槽

250‧‧‧冷卻器

301‧‧‧甲酯化苦瓜籽油

302‧‧‧乙酯化苦瓜籽油

402‧‧‧乙酯化桐油

C1、C2、C3、C4、C5、C6‧‧‧管柱

D1‧‧‧沖滌端入口

E1‧‧‧萃出端

F1‧‧‧進料入口

IS‧‧‧內標準品

R1‧‧‧萃餘端

V1‧‧‧出口

X1‧‧‧方向

圖1是依照本發明實施例的一種純化共軛次亞麻油酸的方法中所使用的模擬移動床之組態設計圖。圖2是依照本發明實施例的一種純化共軛次亞麻油酸的方法中所使用的模擬移動床之設備管線流程圖。圖3A為甲酯化與乙酯化的苦瓜籽油之氣相色譜質譜分析圖。圖3B為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從苦瓜籽油中分離純化出共軛次亞麻油酸的結果分析圖。圖4A為乙酯化的桐油之氣相色譜質譜分析圖。圖4B為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從桐油中分離純化出共軛次亞麻油酸的結果分析圖。

Claims

一種純化共軛次亞麻油酸的方法，包括：提供一天然產物，該天然產物包括有共軛次亞麻油酸以及其它混合物；將該天然產物乙酯化，並以模擬移動床層析法將該天然產物中的該共軛次亞麻油酸分離開來，其中該模擬移動床層析法包含：(i)提供一模擬移動床，該模擬移動床包括一第一區段、一第二區段以及一第三區段，其中該模擬移動床是由一移動相及一固定相所組成，其中該移動相包括超臨界二氧化碳的沖滌液，該固定相顆粒內部是具有孔隙，該移動相是相對於該模擬移動床中是朝同一方向從一沖滌端入口流經該第一區段、該第二區段以及該第三區段之間，該固定相是相對於該移動相朝反方向模擬移動；(ii)將該天然產物從一進料入口注入該模擬移動床的該第二區段以及該第三區段之間，並使該天然產物中的該共軛次亞麻油酸隨該固定相移動至該第一區段與該第二區段之間的一萃出端，並使該天然產物中的其它混合物隨該移動相移動至該第三區段的一萃餘端，以分離出該共軛次亞麻油酸。
如申請專利範圍第1項所述的純化共軛次亞麻油酸的方法，其中該第一區段、該第二區段以及該第三區段各自包含兩根管柱，且每根管柱內填充顆粒內部具有該孔隙之該固定相。
如申請專利範圍第1項所述的純化共軛次亞麻油酸的方法，其中該移動相的該超臨界二氧化碳的沖滌液是藉由一二氧化碳液泵產生高壓二氧化碳並與一輔助溶劑混合後而形成。
如申請專利範圍第1項所述的純化共軛次亞麻油酸的方法，其中該天然產物為苦瓜籽油。
如申請專利範圍第4項所述的純化共軛次亞麻油酸的方法，其中將該苦瓜籽油乙酯化後，將該共軛次亞麻油酸分離的條件為：該沖滌端入口壓力160 bar、該萃餘端壓力140 bar、溫度為40℃，且二氧化碳流速在該沖滌端入口為10.8克/分鐘、在該進料入口為0.4克/分鐘、在該萃出端為4.8克/分鐘，且一輔助溶劑流速在該沖滌端入口為1.08毫升/分鐘、在該進料入口為0.04毫升/分鐘。
如申請專利範圍第5項所述的純化共軛次亞麻油酸的方法，其中該模擬移動床的切換時間為1分45秒，且所分離出該共軛次亞麻油酸的百分比含量為90.5%。
如申請專利範圍第1項所述的純化共軛次亞麻油酸的方法，其中該天然產物為桐油。
如申請專利範圍第7項所述的純化共軛次亞麻油酸的方法，其中將該桐油乙酯化後，將該共軛次亞麻油酸分離的條件為：該沖滌端入口壓力165bar、該萃餘端壓力120 bar、溫度為40℃，且二氧化碳流速在該沖滌端入口為9克/分鐘、在該進料入口為0.64克/分鐘、在該萃出端為4克/分鐘，且一輔助溶劑流速在該沖滌端入口為0.599毫升/分鐘、在該進料入口為0.042毫升/分鐘。
如申請專利範圍第8項所述的純化共軛次亞麻油酸的方法，其中該模擬移動床的切換時間為2分45秒，且所分離出該共軛次亞麻油酸的百分比含量為82.7%。