TWI578985B - Extraction and purification of conjugated triene linoleic acid (CLN) - Google Patents

Description

共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法

本發明係關於一種從苦瓜籽中有效地萃取出苦瓜籽油、並分離出酯化不飽和脂肪酸之方法，特別是關於一種利用超臨界流體與模擬移動床，從苦瓜籽中萃取分離得到高純度的共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化之方法。

苦瓜已經被認為是一種降血糖的天然蔬果。許多醫學研究已明確指出：苦瓜中屬於葫蘆烷型三萜化合物的苦瓜皂苷、與苦瓜籽中之苦瓜籽油皆具有降低體脂肪、降血脂、降血糖、誘發癌細胞凋亡等之功效。另一方面，由於在苦瓜中亦存在有許多化合物結構與胰島素相似的多胜肽-P，因而苦瓜亦有「植物胰島素」之稱號。

存在於苦瓜籽油中的脂肪酸類化合物主要包括共軛三烯次亞麻油酸(9c, 11t, 13t-congugated linolenic acid, CLN) 及其異構物、硬脂酸系不飽和脂肪酸、共軛雙鍵的亞麻油酸、葉黃素等。在這些苦瓜籽油的脂肪酸類化合物之中， CLN的含量是最高的，整體來說，共軛雙鍵的次亞麻油酸或亞麻油酸的含量高於50%以上，而硬脂酸的含量大約是佔10~35%；雖然上述含量會隨著苦瓜的熟度而有些許差異，然而從發表的文獻資料來看，大體上由於品種不同所引起的含量差異並不明顯。

通常，該等脂肪酸類化合物在研究上一般係利用GC/MS、或HPLC來進行分析。關於苦瓜籽油之萃取方法一般是使用烷系溶劑，例如，己烷等；至於苦瓜籽油中之主要油脂含量組成，詳如下示： <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 乾燥 (重量%) </td><td> C18:3 (重量%) </td><td> C18:1+C18:2 (重量%) </td><td> C18:0  (重量%) </td><td> 萃取 </td></tr><tr><td> 24.6 </td><td> 50.0 </td><td> 14.2 </td><td> 28.7 </td><td> 己烷 </td></tr><tr><td> NA </td><td> 60.2 </td><td> 9.7 </td><td> 27.2 </td><td> 己烷 </td></tr><tr><td> NA </td><td> 56.2 </td><td> NA </td><td> 27.2 </td><td> 己烷 </td></tr><tr><td> 36.89 </td><td> 56.68 </td><td> 5.86 </td><td> 34.74 </td><td> 超臨界流體 ( 30 MPa、 33 ℃) </td></tr><tr><td> 38.0 </td><td> 34.92 </td><td> 44.68 </td><td> 8.07 </td><td> 超臨界流體 (37~40 MPa、40 C) </td></tr></TBODY></TABLE>

傳統的分離純化技術方面，主要是採用從果肉或全果直接多步驟萃取提純的手段例如，利用超臨界流體、或樹脂吸附方法、或尿素結晶法等來進行分離的方法。然而，由於此等習用的技術手段是批次而非連續生產，以及經常需要使用溶劑、高溫處理等輔助處理程序，以致會有生產成本提高、時間過長、產品純度不易控制、不利於工業化量產等等之問題點，甚至也會有因為殘存的有害溶劑而對人體造成不良影響之虞。

因此，亟待開發出一種不具有傳統技術之上述問題點並且能夠降低生產成本提高、縮短生產時間、精確控制產品純度、有利於工業化連續量產之萃取純化CLN的方法。

有鑑於此，本發明人等經由潛心研究及尋找用於解決傳統技術問題點的各種可能方案，進而開發出一種不但能夠解決習用萃取技術之上述問題點，不但能夠降低生產成本提高、縮短生產時間、精確控制產品純度，並且能夠有利於工業化連續量產共軛不飽和脂肪酸之萃取純化方法，特別是萃取效果不佳以及製造成本較高等之問題點，特別是一種能夠以低溫低壓從苦瓜籽中連續萃取純化出共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之新穎的萃取精煉方法，至此乃完成本發明。

亦即，本發明提供一種共軛三烯次亞麻油酸 (CLN)之萃取純化方法，其係包括： (a) 萃取步驟：將苦瓜籽樣品置於萃取容器中，利用超臨界流體萃取出苦瓜籽油粗萃物；(b) 酯化步驟：將上述(a)所得到之該苦瓜籽油粗萃物與酯化劑發生酯化反應而形成酯化苦瓜籽油；(c) 純化步驟：以模擬移動床，從上述(b)所得到之該酯化苦瓜籽油中分離出與碳18固體吸附劑的亨利常數為3以下的酯化不飽和脂肪酸，然後進一步純化而獲得苦瓜籽油包含共軛三烯次亞麻油酸 (CLN)。更具體而言，藉由本發明之萃取純化方法，能夠獲得具有共軛三烯次亞麻油酸 (CLN)之總含量超過50重量%的苦瓜籽油。

依據本發明之一觀點，本發明之共軛三烯次亞麻油酸 (CLN)之萃取純化方法較佳為包括：在進行(a) 萃取步驟之前，先對苦瓜籽進行加熱處理4〜8個小時，使該苦瓜籽的含水率低於 8 %。

依據本發明之另一觀點，在本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法中，該超臨界流體萃取之條件較佳者是：壓力為10 MPa ~ 60 MPa、溫度 為20 ℃~ 60 ℃。

依據本發明之又一觀點，本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法較佳為進一步在該超臨界流體中添加0 wt % ~ 40 wt%的輔溶劑；該輔溶劑較佳為自有機醇類、含有1個碳至6個碳之短碳鏈有機醇類、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種。

依據本發明之其他的觀點，在本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法中，該酯化劑較佳者是自有機醇類、含有1個碳至6個碳之短碳鏈有機醇類、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種。

另外，依據本發明之一觀點，在本發明之共軛三烯次亞麻油酸 (CLN)之萃取純化方法中，該酯化反應較佳為鹼催化反應、或離子交換樹脂催化反應。

再者，依據本發明之另一觀點，在本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法中，該模擬移動床之固定相為二氧化矽經4~30個碳之烷類表面改質之顆粒，較佳為18個碳之表面改質顆粒。

依據本發明之又一觀點，在本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法中，該模擬移動床之移動相較佳為100重量%〜80重量%之乙醇、及0重量%〜20重量% 之去離水。

以下，針對本發明的實施態樣列舉不同的具體實施例而更加詳盡地敘述與說明，以便使本發明的精神與內容更為完備而易於瞭解；然而，本項技藝中具有通常知識者應當明瞭本發明當然不受限於此等實例而已，亦可利用其他相同或均等的功能與步驟順序來達成本發明。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

以下，首先說明本文中所使用的各項技術名詞與專門用語之定義。

本文中之「苦瓜籽」係指例如包括但不限定於野生採集到的苦瓜籽、或人工培育方式獲得的苦瓜籽。又，本發明中所使用的苦瓜籽之含水量並未特別限制，例如，可以使用乾燥至含水量低於10%以下的苦瓜籽。其次，苦瓜籽的大小亦沒有特別限制，只要是不影響萃取效率即可；例如，可以使用破碎成粒徑在5毫米以下之小顆粒苦瓜籽。另外，本發明中所使用的苦瓜籽的品種並未特別加以限制，例如，包括但不限於使用由寰宇生技股份有限公司所提供之花蓮4號苦瓜籽。

本文中之「萃取」係指例如包括但不限定於利用超臨界流體萃取出苦瓜籽油之程序。

本文中之「酯化」係指例如在一製程步驟中藉由添加醇類化合物而致使苦瓜籽中的活性成分發生酯化的作用，例如包括但不限定於「甲酯化」、「乙酯化」等。

本文中之「純化」係指藉由各種手段將粗萃物、含雜質物予以分離移除而形成高純度產物之作用，例如，藉由利用模擬移動床(Simulated Moving Bed，簡稱SMB)將苦瓜籽油中的乙酯化共軛不飽和脂肪酸分離並純化之程序。

以下，說明本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法。

如圖2所示，本發明共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法的實施步驟係包含：萃取步驟S1、轉酯步驟S2、及分離步驟S3。

在萃取步驟S1之特定具體例子中，例如，首先可以將一乾燥苦瓜籽樣品置於一萃取溶劑中，以使該苦瓜籽中之共軛不飽和脂肪酸成分溶於該萃取溶劑中而形成一苦瓜籽萃取液。在本發明之萃取步驟S1中所使用之萃取溶劑並未特別限制，例如，可以是水、有機溶劑或超臨界流體。一般而言，有機溶劑及超臨界流體較有利於萃取極性低或親有機性之活性成分，水則較有利於萃取極性特性高之活性成分。

其次，本發明之萃取步驟S1亦適合採用一種超臨界流體萃取法。又，適用於本發明之超臨界流體萃取法的設備並未特別加以限制；舉例而言，可以使用一種如圖3所示之超臨界二氧化碳萃取裝置。一般而言，超臨界二氧化碳萃取裝置通常是包括二氧化碳儲槽1及一輔溶劑儲槽2，分別與一萃取槽3連通，以一背壓閥4調節該萃取槽3之內部壓力，另以數個溫度調節器5調控該超臨界二氧化碳萃取裝置之內部溫度，使通入該萃取槽3之二氧化碳能夠在達到臨界壓力及臨界溫度時轉變為超臨界流體以進行萃取，該萃取槽3與一氣液分離槽6連通，以供減壓時回復成氣態的二氧化碳流入，並且回收至該二氧化碳儲槽1，其中，該超臨界二氧化碳萃取裝置中設有數個液泵7及數個閥門8，以調控該二氧化碳或輔溶劑於該超臨界二氧化碳萃取裝置之流動，該二氧化碳儲槽1及該氣液分離槽6之間較佳係包含一吸附管柱9，以去除該二氧化碳氣體內之雜質。

依據本發明之一觀點，在本發明的共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法中所使用的萃取溶劑，舉例來說，例如，可以是親有機性(或低極性)之超臨界流體，較佳為超臨界態的二氧化碳。更詳言之，根據某些實施例，在本發明中所使用的超臨界二氧化碳流體宜為一種在大於臨界壓力35 MPa、大於臨界溫度50℃以上之條件下可形成超臨界態之二氧化碳，較佳者是壓力為20~35 MPa，溫度為40~60℃之條件下可形成超臨界態之二氧化碳。

該超臨界流體萃取法亦可混合另外，根據本發明之一觀點，在本發明之萃取方法中可以進一步使用一種能夠促進超臨界流體之物化特性並增進萃取效率的輔溶劑。

以下，參照圖2更詳細地說明本發明共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法中的酯化步驟S2。

根據本發明之一觀點，在本發明的酯化步驟S2中之酯化手段並未特別限制；舉例來說，例如，可以藉由鹼催化反應、或離子交換樹脂催化反應來達成。當藉由鹼催化反應來實現酯化時，例如，可以使用但不限於NaOH、乙醇等之鹼催化劑。又，在本發明中，該鹼催化劑之使用量並未特別限制，舉例來說，例如，相對於苦瓜籽油的總重量而言，可以是在約1重量%~50重量%之範圍。另外，適用於本發明之方法的鹼催化劑較佳為使用NaOH。

以下，參照圖2更詳細地說明本發明之分離步驟S3。

根據本發明之一觀點，在本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法中，該分離步驟S3主要是用來分離經酯化的苦瓜籽油中之共軛不飽和脂肪酸，如硬脂酸，可以藉由使用但不限於使用模擬移動床來達成，或是使用較低效率的批次式層析加以達成。

所謂之模擬移動床層析法(SMB：simulated moving bed chromatography)係以高效能液體層析(HPLC)原理為基礎，而衍生出的一種連續式層析製程，藉由在特定切換時間下改變流動相(mobile phase)、進料液和萃取液流入/流出固體吸附相所構築的層析床體之位置，並使固體吸附相(stationary phase)產生一相反於流動相流動方向的模擬移動固體吸附相而促成固定相與流動相逆向流動接觸的作用，進而提高層析的解析度，具有產物濃度高、分離效果佳以及回收率高的優點。在某些特定的實施例中，本發明基於此一技術原理並加以改良而利用於共軛三烯次亞麻油酸(CLN)的分離及純化之方法中。

又，根據某些實施例，本發明之模擬移動床較佳為至少包含第一區段、第二區段、第三區段等之三個分離區段，在該等區段之各後端處分別設置有第一萃取液出料口(Extract outlet，QE)、回收沖滌液之進料口(Feed inlet，QF)、第二萃取液出料口(Raffinate outlet，QR)。又，在該三個分離區段設置有相互連通的分離管柱；而在該等分離管柱之內分別填充有可以使得移動相朝同一方向依序流通的固定相，該等固定相的顆粒較佳為能夠具有可供移動相通過之孔隙。

根據某些實施例，在本發明所使用的模擬移動床中，固定相(Stationary phase，簡稱SP)可以使用與低極性溶質具有吸附性之固體物品。又，根據本發明之一觀點，在本發明之純化分離步驟S3中，該固定相較佳為使用經表面改質之二氧化矽固體顆粒。較佳者為在二氧化矽表面鍵結十八烷基(Octadecyl)

另外，模擬移動床中之移動相(Mobile phase，簡稱MP) 除了要能夠溶解該經酯化的苦瓜籽油，還要能夠促成模擬移動床對CLN純化之目的；例如，在本發明之某些實施例中，移動相可以使用水、或乙醇等極性溶劑或其混合液。根據本發明之某些實施例，例如，移動相較佳為含有95%的乙醇之水溶液。

又，依據本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法，該流動相混合液比例並未特別限制，例如，在某些實施例中，較佳為0：100至10：90，更佳為5：95。

又，模擬移動床層析法之三角理論公式(1)、公式(2)分別為如下所示： (1) (2)   式中，K _A為待分離成分A之亨利常數(等溫吸附常數)； K _B為待分離成分B之亨利常數(等溫吸附常數)； t ₀為未被固定相吸附之物質流經管柱之滯留時間； t _A為未被固定相吸附之待分離成分A流經管柱之滯留時間； t _B為未被固定相吸附之待分離成分B流經管柱之滯留時間； t _d為欲純化成分之滯留時間； ε _t為使用管柱之孔隙度； m1、m2、及m3為各區段的相對體積流速。

從而，可以根據上述模擬移動床層析法之三角理論公式(1)、公式(2)計算而求得第一區段、第二區段、第三區段間之第一萃取液出料口、回收沖滌液之進料口、第二萃取液出料口的特定切換時間，藉以達成促進分離效率、提高分離產物的濃度、增加回收率之目標。

例如，在本發明之某些實施例的模擬移動床中，固定相為使用碳18固體吸附劑；待分離成分之一的共軛不飽和脂肪酸之亨利常數為1.89；另一待分離成分的硬脂酸之亨利常數為3.59；當各分離區段中之該共軛不飽和脂肪酸之淨質量通量為FA及該硬脂酸A之淨質量通量為FB；而各分離區段之體積流速比值m1、m2、及m3時；即可根據上述之公式(1)、公式(2)計算而求得特定的切換時間。

以下，列舉數個萃取、分離與純化棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、共軛次亞麻油酸的實施例，以更具體地描述本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法。 《實施例1~9》(苦瓜籽中所含脂肪酸之萃取)

首先，採用如圖3所示的二氧化碳超臨界流體萃取設備(床體孔隙度：0.582)，分別依照如以下表1所示的40℃、50℃、60℃之溫度；20MPa、25MPa、 35 MPa之壓力； 30 g/mL 、45 g/mL、60 g/mL之流速；以及在添加或不添加輔溶劑的操作條件下；分別對於寰宇生物科技公司所提供之顆粒大小為8 mesh的含水量8.65%之曬乾苦瓜籽粉(苦瓜籽密度為1.10 g/mL)進行實施例1至實施例9的九種不同操作條件之萃取，為了完整回收苦瓜籽中的可萃取成分，首先萃取6小時，然後將乙醇改為在萃取槽前與二氧化碳混合並持續2.0~2.5小時，接著再次調整為在萃取槽出口端與二氧化碳混合並持續0.5小時，以完整乾燥在萃取槽內的苦瓜籽殘渣，進而得到苦瓜籽油萃取物。

表1    超臨界流體萃取苦瓜籽油之操作條件一覽表 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="_0003"><TBODY><tr><td> 實施例 </td><td> T (℃) </td><td> P (MPa) </td><td> Q_SF (g/min) </td><td> Q_L (mL/min) </td><td> r (g/cm3) </td><td> x_o   </td><td> x_k   </td><td> k_fa (1/s) </td><td> k_sa (1/s) </td><td> y_r</td><td> Time (hr) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 40 </td><td> 35 </td><td> 60 </td><td> 0 </td><td> 0.9628 </td><td> 0.112 </td><td> 0.111 </td><td> 4.5 </td><td> 1.12 </td><td> 0.01283 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 50 </td><td> 35 </td><td> 60 </td><td> 0 </td><td> 0.9197 </td><td> 0.112 </td><td> 0.093 </td><td> 90.0 </td><td> 0.98 </td><td> 0.01341 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 60 </td><td> 35 </td><td> 60 </td><td> 0 </td><td> 0.8760 </td><td> 0.095 </td><td> 0.076 </td><td> 4.5 </td><td> 4.48 </td><td> 0.01376 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 60 </td><td> 0 </td><td> 0.7629 </td><td> 0.074 </td><td> 0.073 </td><td> 18.0 </td><td> 0.644 </td><td> 0.00218 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 50 </td><td> 25 </td><td> 60 </td><td> 0 </td><td> 0.8302 </td><td> 0.078 </td><td> 0.078 </td><td> 10.8 </td><td> 2.03 </td><td> 0.00496 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 50 </td><td> 35 </td><td> 30 </td><td> 0 </td><td> 0.9197 </td><td> 0.112 </td><td> 0.093 </td><td> 13.5 </td><td> 0.84 </td><td> 0.01341 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 50 </td><td> 35 </td><td> 45 </td><td> 0 </td><td> 0.9197 </td><td> 0.112 </td><td> 0.056 </td><td> 13.5 </td><td> 1.33 </td><td> 0.01341 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 50 </td><td> 35 </td><td> 60 </td><td> 6 </td><td> 0.9296 </td><td> 0.121 </td><td> 0.063 </td><td> 22.5 </td><td> 1.40 </td><td> 0.01488 </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 50 </td><td> 35 </td><td> 60 </td><td> 12 </td><td> 0.9337 </td><td> 0.168 </td><td> 0.118 </td><td> 18.0 </td><td> 1.33 </td><td> 0.01531 </td><td> 8 </td></tr></TBODY></TABLE>

在實施例1~實施例7中不添加輔溶劑，而在實施例8與實施例9中則添加乙醇做為輔溶劑，乙醇的添加濃度分別為 7.31 wt%、13.63 wt%。此外，在實施例1~實施例9的實驗過程中並同時利用Sovova的萃取動力學模式進行萃取實驗的擬合，並將擬合所獲得的動力學參數整理於表1之中。

又，在實施例1~實施例7中雖不使用輔溶劑，但是但是同時利用另一台HPLC泵注入6 mL/min的乙醇(100%)與二氧化碳在萃取槽的出口端混合，然後一同洩壓後進入分離槽，以避免萃取出來的高黏度油膏沾黏在管壁之間。另外，在實施例8與實施例9中，則乙醇輔溶劑在一開始時便與二氧化碳在萃取槽入口端混合，等待萃取結束後，再調整為萃取槽出口端混合以乾燥苦瓜籽殘渣。

在超臨界流體萃取的過程當中，每半小時收集樣品一次，秤取全部樣品重量並計算所收集的液體體積。每半小時所收集的樣品經震盪混合均勻以後進行自然乾燥，以推算每半小時所萃出的全部油脂重量。乾燥所獲得的油脂再以正己烷回溶，然後進行甲酯化，接著使用安捷倫GC/MS進行分析經甲酯化的苦瓜籽油樣品的成分含量。

在上述GC/MS分析中所使用的管柱為DB-5MS (30m×250μm×0.25 μm)；選用氦氣為挾帶氣體；GC之升溫條件：起始120℃以10℃/min升至220℃持溫6分鐘，再以10℃/min升至250℃持溫12分鐘，再以10℃/min升至320℃持溫5分鐘，分析時間共43分鐘；進樣量為1 μL。在究GC/MS進行分析中，選用十五烷(Pentadecane)為內標準品建立FAME(甲酯化脂肪酸)含量的檢量線。

藉由經甲酯化後之苦瓜籽油樣品的GC/MS圖譜、及以下所示之方程式推算出棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亞麻油酸(C18:2)、共軛次亞麻油酸(c9, t11,t13-CLN; C18:3)之五種脂肪酸的濃度。 其中，A為圖譜訊號峰之面積； C為樣品濃度； V為樣品體積； 下標FAME與IS分別代表甲酯化脂肪酸以及內標準品。

在實施例1至實施例9中所採用的甲酯化脂肪酸之標準對照品係購自以下所示之各公司：甲酯化棕櫚酸(C16:0)(景明化工股份有限公司製，純度＞ 97%)；甲酯化硬脂酸(C18:0)(友和貿易股份有限公司，純度＞ 99.5%)；甲酯化油酸(C18:1)(友和貿易股份有限公司，純度＞ 99.3%)；甲酯化亞麻油酸(C18:2)(友和貿易股份有限公司，純度＞99.3%)；甲酯化共軛次亞麻油酸(c9, t11,t13-CLN; C18:3)(Cayman公司製，純度＞ 98%)；99.5%無水乙醇(景明化工股份有限公司製，純度為LC) 。

在實施例1至實施例9所得到的苦瓜籽油萃取物樣品中，包括棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亞麻油酸(C18:2)、共軛次亞麻油酸(c9, t11,t13-CLN; C18:3) 之五種脂肪酸的各平均含量濃度分別為如表2所示。

表2   苦瓜籽油中五種甲酯化脂肪酸濃度 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="_0005"><TBODY><tr><td> Peak </td><td> RT(min) </td><td> MS </td><td> m </td><td> A/A_IS</td><td> 濃度 (mg/L) </td><td> 平均含量 wt % </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 10.046 </td><td> C16:0 </td><td> 1.472 </td><td> 2.2285 </td><td> 84.1 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 12.047 </td><td> C18:2 </td><td> 1.182 </td><td> 2.9525 </td><td> 139 </td><td> 9.0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 12.125 </td><td> C18:1 </td><td> 1.535 </td><td> 3.4785 </td><td> 126 </td><td> 8.2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 12.486 </td><td> C18:0 </td><td> 1.613 </td><td> 19.0635 </td><td> 657 </td><td> 42.8 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 14.505 </td><td> CLN </td><td> 2.895 </td><td> 27.593 </td><td> 530 </td><td> 34.5 </td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 1535 </td><td> 100 </td></tr></TBODY></TABLE>註：棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亞麻油酸(C18:2)、共軛次亞麻油酸(c9, t11,t13-CLN; C18:3)。   《實施例10》共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之分離與純化

首先，按照與上述實施例1至實施例9之相同設備、手段與操作方式，同樣地利用二氧化碳超臨界流體設備 (床體孔隙度：0.582)，對於寰宇生物科技公司所提供之顆粒大小為8 mesh的含水量8.65%之曬乾苦瓜籽粉(苦瓜籽密度為1.10 g/mL)進行萃取而得到苦瓜籽油萃取物。

接著，將所得到之苦瓜籽油萃取物之樣品溶解於乙酸乙酯，接著先以活性碳進行脫色，然後再移除乙酸乙酯而獲得脫色苦瓜籽油。接著，將脫色苦瓜籽油溶解於乙醇，然後在80 C下以氫氧化鈉催化進行苦瓜籽油的乙酯化反應。反應進行三小時後，再以冰水終止反應，接著以正己烷萃取出乙酯化產物，並依序使用鹽酸水溶液以及純水清洗後，再移除正己烷得乙酯化苦瓜籽油。

其中乙酯化反應方法係依序將0.2 g之NaOH碎片、及10 mL的無水乙醇加入1.0克之上述脫色所獲得的苦瓜籽油粗萃物中，再置入85℃油浴中以冷水回流反應三小時，並保持攪拌轉速450 rpm；反應結束後液體放入冰箱冷凍庫靜置一小時；再加入1.0 mL二次水與20 mL正己烷進行攪拌20 min，轉速450rpm。

乙酯化反應後的溶液經攪拌後，靜置分層，去除下層液，取上層液加入0.6 mL濃鹽酸均勻混合後再靜置分層，去除下層鹽類層，留下上層有機層。加入與上層有機層等體積之二次水，震盪水洗，靜置分層後去除水層。重複一次水洗步驟後，再加入無水硫酸鎂進行除水，將除水後液體乾燥後，而獲得乙酯化苦瓜籽油。

再者，利用ELSD偵測器，以95%乙醇為流動相，在流速2.0 mL/min條件下進行苦瓜籽油的層析分離測試。試驗結果得到如圖4(a)所示之兩個主要的訊號峰，顯示分離效果良好。

又，硬脂酸乙酯標準品的層析圖譜顯示：硬脂酸乙酯的出峰滯留時間為7.49分鐘，而棕櫚酸乙酯滯留時間為6.37分鐘。因此，由如圖4(a)所示之乙酯化苦瓜籽油的層析圖譜，可判定苦瓜籽油中含有高量的硬脂酸乙酯(出峰滯留時間：7.49分鐘)、及棕櫚酸乙酯(出峰滯留時間為6.37分鐘)、以及脂肪酸C18:1與C18:2(出峰滯留時間：介於5.74~7.49分鐘之間)。

此外，根據本發明之一觀點，除了如上述以95%酒精當做本發明之流動相以外，亦可以適合使用其他極性溶劑、非極性溶劑；例如，可以使用純水、去離子、100%酒精等。舉例來說，在某些具體實施例中，可以使用0~30%的水、70~100%的酒精、及/或彼等之混合物，藉以移除苦瓜籽油中的大量不飽和的硬脂酸，以進一步提高CLN-EE游離脂肪酸(FFA: Free Fatty Acids)、16碳、18碳的飽和及/或不飽和脂肪酸、與硬脂酸乙酯的分離的效果。

接著，對於1.0克之上述所獲得的乙酯化苦瓜籽油，利用固定相管柱選用製備級的YMC-AQ C18 (50 um)並將其填充於6支不銹鋼填充管柱1.0 × 10 cm中，移動相為選用95%乙醇，利用模擬移動床(SMB：simulated moving bed)設備來進行逆相層析SMB試驗。該SMB設備配置有6支1.0 x 10 cm的不銹鋼填充柱，而且6支管柱為開放迴路的三個區段之組態，該組態一般被記載為2/2/2。該SMB設備係由一液泵(HITACHI L-2130)進行加壓，使移動相於各區段之管柱內朝向同一方向流動。

在本實施例之中，模擬移動床(SMB)的特定切換時間係藉由基於使用YMC-AQ C18之碳18固體吸附劑做為固定相；待分離成分之一的共軛不飽和脂肪酸之亨利常數為1.89；另一待分離成分的硬脂酸之亨利常數為3.59；以各分離區段中之該共軛不飽和脂肪酸之淨質量通量設為FA及該硬脂酸之淨質量通量設為FB；而各分離區段之體積流速比值分別設為m1、m2、及m3，依據下述模擬移動床層析法之三角理論公式(1)、公式(2)計算而求得特定的切換時間。

(1) (2)   式中，K _A為待分離成分A之亨利常數(等溫吸附常數)； K _B為待分離成分B之亨利常數(等溫吸附常數)； t ₀為未被固定相吸附之物質流經管柱之滯留時間； t _A為未被固定相吸附之待分離成分A流經管柱之滯留時間； t _B為未被固定相吸附之待分離成分B流經管柱之滯留時間； t _d為欲純化成分之滯留時間； ε _t為使用管柱之孔隙度； m1、m2、及m3為各區段的相對體積流速。

在本實施例中，填充管柱的總孔隙度：e = 0.73，不接管柱時的出峰時間：t _d= 0.76分鐘，因此在2.0 mL/min的流速下，本填充管柱的不滯留成分的出峰時間：t _o= 3.63分鐘。依據乙酯化苦瓜籽油的層析圖譜可得到兩個代表乙酯化CLN與硬脂酸之訊號峰的滯留時間為tA、tB分別為t _A= 5.74、t _B= 7.49分鐘，因此根據上述模擬移動床層析法之三角理論公式(1)、公式(2)計算而求得的代表乙酯化CLN與硬脂酸的亨利吸附常數K _A、K _B分別為K _A= 1.89與K _B= 3.59。因而，共軛三烯次亞麻油酸與硬脂酸之亨利常數比值為1以上。

在本實施例中，每一次不同切換時間的實驗，收集第4迴圈以後的萃出端與萃餘端樣品，並進行GC/MS的分析，然後利用檢量線計算其中最具代表性的五個脂肪酸的分布，C16:0、C18:2、C18:1、C18:0、CLN，並計算CLN-EE回收率以探討分離成效。該CLN-EE回收率的定義如下： (4)     其中，C代表GC/MS所分析出來的濃度； 上標R與E代表萃餘端與萃出端。

本實施例之GC/MS分析的結果，棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亞麻油酸(C18:2)、共軛次亞麻油酸(c9, t11,t13-CLN; C18:3) 之五種脂肪酸的分布如圖5所示；另外，將五種乙酯化脂肪酸的重量分率計算於結果、及CLN-EE回收率記載於表3中。

參照表3所示，可以明顯見到硬脂酸乙酯出現在萃出端(Extract)，而滯留性較弱的CLN-EE則出現在萃餘端(Raffinate)。又，如表3所示，由於硬脂酸乙酯滯留性較強，因此可以見到CLN-EE在苦瓜籽油中的重量分率僅有0.296；但是，在經過SMB分離之後，由於大部分的硬脂酸乙酯已經被去除，所以在萃餘端所收集的乙酯化苦瓜籽油之 CLN-EE重量分率大幅提升到0.530~0.714。另外，依據上述(4)式所計算得到的CLN-EE回收率Y也顯示大部分的CLN-EE都在萃餘端被回收了。同時，在萃出端則收集到純度很高的硬脂酸乙酯，其中除了切換時間為4.5分鐘的實驗含有大約6.5 wt%的CLN-EE以外，其餘大部分全是硬脂酸乙酯。

表3    SMB分離前後乙酯化苦瓜籽脂肪酸分佈隨切換時間變化情形 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="_0009"><TBODY><tr><td> effluents </td><td> t_sw (min) </td><td> C16:0 </td><td> C18:2 </td><td> C18:1 </td><td> C18:0 </td><td> CLN </td><td> Y_CLN-EE</td></tr><tr><td> Feed </td><td> -- </td><td> 0.030 </td><td> 0.121 </td><td> 0.202 </td><td> 0.352 </td><td> 0.296 </td><td>   </td></tr><tr><td> Extract </td><td> 4.50 </td><td> 0.065 </td><td> 0.021 </td><td> 0.076 </td><td> 0.773 </td><td> 0.065 </td><td>   </td></tr><tr><td> 4.75 </td><td> 0.054 </td><td> 0.002 </td><td> 0.060 </td><td> 0.879 </td><td> 0.005 </td><td>   </td></tr><tr><td> 5.00 </td><td> 0.020 </td><td> 0.002 </td><td> 0.025 </td><td> 0.950 </td><td> 0.003 </td><td>   </td></tr><tr><td> 5.25 </td><td> 0.008 </td><td> 0.001 </td><td> 0.011 </td><td> 0.978 </td><td> 0.002 </td><td>   </td></tr><tr><td> 5.50 </td><td> 0.004 </td><td> 0.001 </td><td> 0.003 </td><td> 0.988 </td><td> 0.003 </td><td>   </td></tr><tr><td> Raffinate </td><td> 4.50 </td><td> 0.007 </td><td> 0.218 </td><td> 0.085 </td><td> 0.160 </td><td> 0.530 </td><td> 0.738 </td></tr><tr><td> 4.75 </td><td> 0.014 </td><td> 0.189 </td><td> 0.070 </td><td> 0.037 </td><td> 0.690 </td><td> 0.986 </td></tr><tr><td> 5.00 </td><td> 0.033 </td><td> 0.178 </td><td> 0.067 </td><td> 0.008 </td><td> 0.714 </td><td> 0.994 </td></tr><tr><td> 5.25 </td><td> 0.050 </td><td> 0.171 </td><td> 0.091 </td><td> 0.002 </td><td> 0.687 </td><td> 0.997 </td></tr><tr><td> 5.50 </td><td> 0.067 </td><td> 0.158 </td><td> 0.109 </td><td> 0.012 </td><td> 0.654 </td><td> 0.996 </td></tr></TBODY></TABLE>

由上述表3，可以確認在切換時間為4.75~5.50分鐘的條件下，苦瓜籽油中所含的硬脂酸乙酯與CLN-EE是可以被完全分離的，而切換時間為4.50分鐘的操作條件則被歸類為純萃餘端的操作條件。

綜上，經由實施例1~10證實藉由使用以例如YMC-AQ C18的碳18的吸附管柱為固定相與乙醇水溶液為流動相之模擬移動床(SMB：simulated moving bed)，能夠從乙酯化苦瓜籽油中將硬脂酸乙酯完全分離出來，並獲得高CLN-EE含量的乙酯化苦瓜籽油。

換言之，藉由利用本發明之共軛三烯次亞麻油酸 (CLN)之萃取純化方法，能夠從苦瓜籽油萃取液中有效地分離共軛三烯次亞麻油酸，並且能夠以連續式進料方式，藉由模擬移動床而自乙酯化苦瓜籽油中獲得53.0wt% 〜71.4 wt%之超高含量的共軛三烯次亞麻油酸，亦即根據本發明即能夠實現促進苦瓜籽油之分離效率、提高苦瓜籽油之分離產物的濃度、增加回收率之目標，進而達到自苦瓜籽中萃取共軛三烯次亞麻油酸 (CLN)之工業化量產之功效。

綜上所述，在如上所列舉的數個實施例中已經舉例而具體地說明本發明的內容了，然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者應當明白：在不脫離本發明的精神和範圍內，當可再進行各種的更動與修飾；例如，將前述實施例中所例示的各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式也當然視為本發明所屬內容。因此，本案所欲保護的範圍也包括後述的申請專利範圍及其所界定的範圍。

S1‧‧‧萃取步驟

S2‧‧‧酯化步驟

S3‧‧‧分離步驟

1‧‧‧二氧化碳儲槽

2‧‧‧輔溶劑儲槽

3‧‧‧萃取槽

4‧‧‧背壓閥

5‧‧‧溫度調節器

6‧‧‧氣液分離槽

7‧‧‧液泵

8‧‧‧閥門

9‧‧‧吸附管柱

FM‧‧‧流量計

W‧‧‧液位計

圖1係顯示本發明中所使用的乾燥苦瓜籽及經粉碎的苦瓜籽之照片。 圖2係顯示本發明之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法的具體實施步驟之方塊圖。 圖3係顯示本發明之某一實施例中所使用的超臨界二氧化碳萃取裝置之外觀的照片。 圖4a係顯示本發明之某一實施例之單一管柱層析圖譜。 圖4b係顯示本發明之某一實施例之乙醇/水濃度影響。

S1‧‧‧萃取步驟

S2‧‧‧酯化步驟

S3‧‧‧分離步驟

Claims (8)

1. 一種共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法，其係包括：(a)萃取步驟：將苦瓜籽樣品置於萃取容器中，利用超臨界流體萃取出苦瓜籽油粗萃物；該苦瓜籽樣品的含水率為10%以下；該超臨界流體萃取之條件係壓力為10MPa~60MPa、溫度為20℃~60℃、流速為30~60g/mL；(b)酯化步驟：將上述(a)所得到之該苦瓜籽油粗萃物以活性碳進行脫色處理，再與酯化劑發生酯化反應而形成酯化苦瓜籽油；其中該酯化劑係乙醇；該酯化反應係使用氫氧化鈉做為鹼催化劑之鹼催化反應；該鹼催化劑之使用量係在該苦瓜籽油粗萃物總重量之1重量%~50重量%之範圍；(c)純化步驟：以模擬移動床，將上述(b)所得到之該酯化苦瓜籽油中的酯化之飽和脂肪酸從萃出端(Extract)分離出來，而從萃餘端(Raffinate)獲得以共軛三烯次亞麻油酸為主之苦瓜籽油；該共軛三烯次亞麻油酸經模擬移動床分離後在萃餘端(Raffinate)之回收率為73.8%以上。
2. 如請求項1所記載之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法，其係包括：在進行(a)萃取步驟之前，先於進行加熱處理4~8個小時。
3. 如請求項1所記載之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法，其在進行(c)純化步驟時，共軛三烯次亞麻油酸與硬脂酸之亨利常數比值為1以上。
4. 如請求項1所記載之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法，其中該超臨界流體萃取之時間為6-8小時。
5. 如請求項1所記載之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法，其係進一步在該超臨界流體中添加0wt%~40wt%的輔溶劑；該輔溶劑係自含有1個碳至6個碳之短碳鏈有機醇類、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種。
6. 如請求項1所記載之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)萃取純化方法，其中該模擬移動床之固定相為二氧化矽經4~30個碳之烷類表面改質之顆粒。
7. 如請求項1所記載之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)萃取純化方法，其中該模擬移動床之切換時間為4.75~5.50分鐘；該模擬移動床之移動相係由100重量%~80重量%之乙醇、及0重量%~20重量%之去離水所組成。
8. 如請求項1所記載之共軛三烯次亞麻油酸(CLN)之萃取純化方法，其係用於分離純化苦瓜籽油所含之棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、及共軛次亞麻油酸中之至少一種。