CN113185398A - 一种苦瓜籽油中高含量共轭亚麻酸α-桐酸的富集方法 - Google Patents

一种苦瓜籽油中高含量共轭亚麻酸α-桐酸的富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苦瓜籽油中高含量共轭亚麻酸α‑桐酸的富集方法，其包括如下步骤：S1、提取苦瓜籽油；S2、将苦瓜籽油与氢氧化钾－乙醇溶液混合均匀，以得到混合体系；S3、混合体系用石油醚萃取，合并有机相，得到苦瓜籽油混合脂肪酸；S4、向尿素中加入乙醇、苦瓜籽油混合脂肪酸，得到包合体系；S5、将包合体系进行超高压处理，得到共轭亚麻酸含量为50‑72％的苦瓜籽油，其中α‑桐酸纯度达到48‑62％；以及S6、采用半制备型HPLC对苦瓜籽油中的共轭亚麻酸进行收集。本发明通过尿素包合结合高压处理、半制备型HPLC的方式对苦瓜籽油中典型共轭亚麻酸，即α‑桐酸进行富集，其可以大幅提高α‑桐酸的纯度和产物收率。

Description

一种苦瓜籽油中高含量共轭亚麻酸α-桐酸的富集方法
技术领域
本发明涉及食品科学领域，具体为一种苦瓜籽油中高含量共轭亚麻酸α-桐酸的富集方法。
背景技术
苦瓜籽仁富含多肽、多糖、皂苷等多种生物活性成分以及大量油脂，尤其富含共轭亚麻酸(CLN)中的α-桐酸。近年来，许多研究表明CLN具有减肥、抗癌、抗糖尿病和调节肝脂代谢等多种生理功能。苦瓜籽仁油是为数不多富含α-桐酸的可食用植物油来源之一，是富含CLN的重要植物资源，具有良好应用开发价值。
但目前对于苦瓜及苦瓜籽中生物活性物质分离纯化的研究多集中在活性蛋白多肽、多糖及皂苷等成分，而苦瓜籽仁功能性脂肪酸的分离方面研究未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种苦瓜籽油中高含量共轭亚麻酸α-桐酸的富集方法，其通过尿素包合结合高压处理、半制备型HPLC的方式对苦瓜籽油中典型CLN，即α-桐酸进行富集，其可以大幅提高α-桐酸的纯度和产物收率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
提供了一种苦瓜籽油中高含量共轭亚麻酸α-桐酸的富集方法，其包括如下步骤：
S1、从苦瓜籽仁中提取苦瓜籽油；
S2、将苦瓜籽油与氢氧化钾－乙醇溶液混合均匀，以得到混合体系，再将所述混合体系置于65-75℃(优选70℃)水浴条件下磁力搅拌回流1-2h(优选1.5h)；
S3、所述混合体系冷却至室温，加入蒸馏水后用石油醚萃取2-3次，以除去混合体系中的不皂化物，萃取后的底层溶液用HCl溶液调节pH至2-3范围内，再用石油醚萃取2-3次后，然后合并有机相，采用无水硫酸钠对有机相进行脱水、旋转蒸发，以得到苦瓜籽油混合脂肪酸；
S4、向尿素中加入体积分数95％的乙醇，置于75℃条件下加热回流并磁力搅拌，待尿素完全溶解后，再加入苦瓜籽油混合脂肪酸，以得到尿素-苦瓜籽油混浊液；再将所述混浊液置于70℃条件下水浴加热回流并磁力搅拌，直至变为澄清透明的溶液，室温冷却后，再将其置于-8-8℃的包合温度下包合6-30h，以得到包合体系；
S5、将所述包合体系倒入PE袋中，于室温下冷却30min，然后再将装有包合体系的PE袋(不完全密封)置于100-300MPa条件下进行超高压处理，且超高压处理时间为5-15min；
超高压处理完毕后，对所述包合体系进行抽滤，再对抽滤得到的滤液进行减压浓缩，以去除乙醇；再向经减压浓缩后的滤液中加入石油醚萃取脂肪酸，石油醚萃取3次后，合并有机相加温水水洗至中性，以去除尿素，再用无水硫酸钠干燥，且进行减压浓缩，以得到共轭亚麻酸含量50-72％的苦瓜籽油，其中α-桐酸纯度达到48-62％；
以及S6、采用半制备型HPLC对含有共轭亚麻酸的苦瓜籽油中的共轭亚麻酸进行收集，收集得到的目标组分经减压、浓缩后即得到α-桐酸的纯度达到90-93％的苦瓜籽油。
优选的，步骤S1中，采用超临界CO2萃取方式从苦瓜籽仁中提取苦瓜籽油。
优选的，步骤S1中，采用超临界CO2萃取方式从苦瓜籽仁中提取苦瓜籽油的步骤包括：
用超微植物粉碎机将苦瓜籽仁磨粉至20目左右，以得到苦瓜籽仁粉；
将苦瓜籽仁粉放入超临界CO2萃取釜中，按如下流程进行苦瓜籽油萃取：加压达到超临界状态→热交换升温→按设定条件萃取→节流减压→萃取物与溶剂分离→溶剂热交换→加压达到超临界状态；如此进行萃取-分离的循环操作，直至完成设定条件；
其中，萃取条件为：反应釜压力30-40MPa，提取温度45-50℃，提取2-3h；分离器一压力5.5-7.0MPa，温度40-55℃，分离器二压力4.0-5.5MPa，温度35-40℃。
优选的，步骤S2中，苦瓜籽油与氢氧化钾－乙醇溶液的质量体积比(g/mL)为1:5。
优选的，步骤S2中，所述氢氧化钾－乙醇溶液的浓度为0.5mol/L，其配制过程包括：准确称取40g KOH于烧杯，用不含CO2的纯水约50mL溶解，转移至容量瓶后用无水乙醇定容至1L，再于聚乙烯容器中密闭避光放置1周，然后过滤，即得0.5mol/L的氢氧化钾－乙醇溶液。
优选的，步骤S4中，尿素与体积分数95％的乙醇的质量体积比(g/mL)为1:5。
优选的，步骤S4中，苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:3。
优选的，步骤S6中，色谱柱采用C18柱。
优选的，步骤S6中，所述流动相由质量分数0.1％的乙酸溶液和甲醇配制而成，且质量分数0.1％的乙酸溶液和甲醇的体积比为10:90。
优选的，步骤S6中，过柱时的柱温为35℃，进样量为50μL/次，流速为1mL/min。
与现有技术相比，本发明采用复合富集方式，即尿素包合+高压处理+半制备型HPLC完成对苦瓜籽油中典型CLN，即α-桐酸的提取，其可以大幅提高α-桐酸的纯度和产物收率。
附图说明
图1为不同高压处理压力条件下苦瓜籽油中α-桐酸的纯度和收率；
图2为尿素包合溶剂种类对富集效果的影响；
图3为尿素、乙醇比例对富集效果的影响；
图4为苦瓜籽油混合脂肪酸、尿素比例对富集效果的影响；
图5为包合时间对富集效果的影响；
图6为包合温度对富集效果的影响；
图7a为尿素包合前苦瓜籽油中脂肪酸种类的检测结果；
图7b为尿素包合后苦瓜籽油中脂肪酸种类的检测结果；
图8为本发明实施例2中高含量α-桐酸苦瓜籽油UV检测的色谱图；
图9为对比例1、对比例2以及实施例2中最终获得的苦瓜籽油的纯度和收率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
超高压处理对富集共轭亚麻酸中α-桐酸的影响
从苦瓜中获取苦瓜籽仁，洗净、干燥后用超微植物粉碎机磨粉至20目左右，以得到苦瓜籽仁粉；
将苦瓜籽仁粉放入超临界CO2萃取釜中，按如下流程进行苦瓜籽油萃取：加压达到超临界状态→热交换升温→按设定条件萃取→节流减压→萃取物与溶剂分离→溶剂热交换→加压达到超临界状态；如此进行萃取-分离的循环操作，直至完成设定条件；
其中，萃取条件为：反应釜压力30.0MPa，提取温度50℃，提取3h；分离器一压力6.8MPa，温度45℃，分离器二压力5.0MPa，温度36℃。
称取4g左右的苦瓜籽油，加入0.5mol/L的氢氧化钾－乙醇溶液20mL，混合均匀，以得到混合体系；再将所述混合体系置于70℃水浴条件下磁力搅拌回流1.5h；其中，所述氢氧化钾－乙醇溶液的浓度为0.5mol/L，其配制过程包括：准确称取40g KOH于烧杯，用不含CO2的纯水约50mL溶解，转移至容量瓶后用无水乙醇定容至1L，再于聚乙烯容器中密闭避光放置1周，然后过滤，即得0.5mol/L的氢氧化钾－乙醇溶液；
所述混合体系冷却至室温，加入2ml蒸馏水后用石油醚萃取3次，以除去混合体系中的不皂化物；萃取后的底层溶液用2mol/L的HCl调节pH至2-3范围内，再用石油醚萃取2-3次后，然后合并有机相，采用无水硫酸钠对有机相进行脱水、旋转蒸发，以得到苦瓜籽油混合脂肪酸；
按质量体积比(g/mL)1:5的比例向尿素中加入体积分数95％的乙醇，置于75℃条件下加热回流并磁力搅拌，待尿素完全溶解后，再加入苦瓜籽油混合脂肪酸，以得到尿素-苦瓜籽油混浊液，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:3；再将所述混浊液置于70℃条件下水浴加热回流并磁力搅拌，直至混浊液变为澄清透明的溶液，室温冷却后，再将此溶液置于0℃条件下包合24h，以得到包合体系；
将所述包合体系倒入PE袋中，于室温下冷却30min，然后再将装有包合体系的PE袋(不完全密封)分别置于100MPa、200MPa、300MPa条件下进行超高压处理，且超高压处理时间为10min；
超高压处理完毕后，对所述包合体系进行抽滤，再对抽滤得到的滤液进行减压浓缩，以去除乙醇；再向经减压浓缩后的滤液中加入石油醚萃取脂肪酸，石油醚萃取3次后，合并有机相加温水水洗至中性，以去除尿素，再用无水硫酸钠干燥，且进行减压浓缩，以分别得到共轭亚麻酸含量52.36％、65.48％、71.59％的苦瓜籽油。
取上述3种不同共轭亚麻酸含量的苦瓜籽油，经甲酯化后用GC-MS测定α-桐酸含量，并按照公式(1)-(2)分别计算α-桐酸纯度以及产物收率，结果如图1所示。
Figure BDA0003069854640000051
Figure BDA0003069854640000052
一般认为，脂肪酸与尿素包合过程是一个反应结晶(沉淀)过程，高压作用有望促进尿素-脂肪酸包合结晶过程。如图2所示，本申请中采用超高压条件对包合溶液进行处理时，压力对α-桐酸纯度影响较小，如100MPa、200MPa、300MPa时α-桐酸纯度分别为59.56％、59.33％、59.26％。然而，增加压力可明显提高产物收率，未施加压力时，产物收率仅为20.14％，当处理压力为100MPa时，产物收率增至38.82％。继续增加处理压力，产物收率增长趋势变缓，变化不大。因此，经综合考虑，本申请中步骤S5中，优选将装有包合溶液的PE袋(不完全密封)置于100MPa条件下进行超高压处理。
对比例1：尿素包合法富集α-桐酸
1.1尿素包合溶剂种类对富集α-桐酸的影响
称取4g左右的苦瓜籽油，加入0.5mol/L的氢氧化钾－乙醇溶液20mL，混合均匀，以得到混合体系；再将所述混合体系置于70℃水浴条件下磁力搅拌回流1.5h；其中，所述氢氧化钾－乙醇溶液的浓度为0.5mol/L，其配制过程同实施例1；
所述混合体系冷却至室温，加入2ml蒸馏水后用石油醚萃取3次，以除去混合体系中的不皂化物；萃取后的底层溶液用2mol/L的HCl调节pH至2-3范围内，再用石油醚萃取2-3次后，然后合并有机相，采用无水硫酸钠对有机相进行脱水、旋转蒸发，以得到苦瓜籽油混合脂肪酸；
按质量体积比(g/mL)1:5的比例向尿素中加入体积分数95％甲醇或体积分数95％乙醇，然后置于75℃条件下加热回流并磁力搅拌，待尿素完全溶解后，再加入苦瓜籽油混合脂肪酸，以得到尿素-苦瓜籽油混浊液，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:3；再将所述混浊液置于70℃条件下水浴加热回流并磁力搅拌，直至混浊液变为澄清透明的溶液，室温冷却后，再将此溶液置于0℃条件下包合18h，以得到包合体系；然后对包合体系减压抽滤，回收甲醇或乙醇，滤液中加2ml蒸馏水并用2mol/L的6mL HCl酸化滤液至pH为2-3后，加石油醚进行3次萃取，合并有机相后加温水水洗至中性，无水硫酸钠脱水，旋转蒸发回收石油醚，即得到α-桐酸含量较高的苦瓜籽油，同样按照公式(1)-(2)分别计算α-桐酸纯度以及产物收率，其结果如图2所示。
从图2可知，分别将体积分数95％甲醇、95％乙醇作为溶剂时，包合后得到的α-桐酸纯度和收率相差不大，考虑到用甲醇作溶剂会形成少量甲酯，甲酯具有一定的毒性，可能对人体产生危害，且影响α-桐酸后续在保健品等方面的应用，综合考虑，本申请中选取体积分数95％的乙醇用作分离脂肪酸的溶剂最为合适，此时α-桐酸纯度为46.59％。
1.2尿素溶剂比例对富集α-桐酸的影响
分别按质量体积比(g/mL)1:2、1:3、1:4、1:5、1:6的比例向尿素中加入体积分数95％乙醇，其他步骤同1.1，在此不再赘诉，即得到α-桐酸含量较高的苦瓜籽油，同样按照公式(1)-(2)分别计算α-桐酸纯度以及产物收率，其结果如图3所示。
乙醇的用量决定了尿素在乙醇中的溶解程度，当乙醇用量过少时，尿素不能溶解完全，加入油脂时会产生浑浊的絮状物，使得反应不完全，所以醇脲比是尿素包合法的重要影响因素。从图3中可以看出，α-桐酸的纯度和产物收率均随着乙醇用量的逐渐增加而增大。这可能是由于溶剂的增加降低了混合脂肪酸的浓度，尿素对单不饱和脂肪酸的包合变得更加容易。同时，乙醇用量的增加使得混合脂肪酸的黏度逐渐减小，进一步导致过滤过程中晶粒的包藏现象随之减少，从而使得滤液中α-桐酸的纯度有效提高。当尿素乙醇的质量体积比达到1:5时，尿素分子的包合能力即将达到限值，α-桐酸纯度和产物收率增加都趋于平缓，此时α-桐酸纯度为43.69％。
1.3苦瓜籽油混合脂肪酸、尿素比例对富集共轭亚麻酸中α-桐酸的影响
按质量体积比(g/mL)1:5的比例向尿素中加入体积分数95％乙醇；
且待尿素完全溶解后，加入含有混合脂肪酸的苦瓜籽油，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)分别为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6；其他步骤同1.2，在此不再赘诉，即得到α-桐酸含量较高的苦瓜籽油，同样按照公式(1)-(2)分别计算α-桐酸纯度以及产物收率，其结果如图4所示。
尿素脂肪酸比值，是影响尿素包合法富集纯化效果的又一重要因素，尿素用量过低时，富集纯化效果不理想，尿素用量用量过高，又会使大量不饱和脂肪酸被夹杂在尿素晶体之间，随着过滤而损失掉，进而使得多不饱和脂肪酸得率过低。由图4看出，尿素含量的增加会导致更多的脂肪酸被困在包合物内，从而提高包合物内脂肪酸的纯度，即α-桐酸纯度提高；而产物收率与苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素比例的增加成反比趋势。这是因为在低温条件下，单不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸与尿素形成了较稳定的晶体包合物析出，但是尿素与脂肪酸的包合能力是恒定的，随着尿素用量的增加，部分剩余的尿素会开始与多不饱和脂肪酸包合，形成包合物，进而将部分多不饱和脂肪酸携带出来，从而导致产物收率下降。另外，多不饱和脂肪酸和尿素分子的极性均较强，有相互吸附作用，还能形成氢键，因此在过滤过程中，部分多不饱和脂肪酸仍能被尿素吸附。而当尿素的用量较少时，虽然此时产物收率较高，但尿素无法将单不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸完全包合，此时滤液中残留了较多未被包合的单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸，使得α-桐酸的纯度不高。因此选择苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:4时，此时α-桐酸纯度为44.16％。
1.4包合时间对分离效果的影响
待尿素完全溶解后，向包合体系中加入苦瓜籽油混合脂肪酸，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)分别为1:4；
室温冷却后，再将包合体系置于0℃条件下分别包合6h、12h、18h、24h、30h，以得到包合溶液；其他步骤同1.3，在此不再赘诉，即得到α-桐酸含量较高的苦瓜籽油，同样按照公式(1)-(2)分别计算α-桐酸纯度以及产物收率，其结果如图5所示。
在尿素包合的过程当中，若包合的时间过短，会导致α-桐酸无法完全从混合脂肪酸中分离开来，因此在过滤时会存在包藏现象，致使最终纯度较低。但若包合的时间过长，α-桐酸已经完全从混合脂肪酸中分离开，继续包合只会造成能耗增加。因此包合时间也是影响尿素包合实验包合效果的重要影响因素。从图5可以看出，随着包合时间增加，α-桐酸的纯度先增加后趋于平缓，同时α-桐酸的收率随着包合时间的而减少。即当尿素包合达到平衡条件后，α-桐酸的纯度和产物收率都趋于稳定。这可能是由于在较短的包合时间内，尿素晶粒生长会受到影响，包合时间增加后，尿素与α-桐酸的包合更加充分，从而使得α-桐酸的纯度逐渐增加。然而当尿素的晶粒长到限度时，继续包合会导致尿素包合反应朝分解的方向进行，导致产物收率降低。因此在尿素包合实验中，尿素的包合时间不宜过长，选择包合时间为18h时，此时α-桐酸纯度为47.03％。
1.5包合温度对分离效果的影响
待尿素完全溶解后，向包合体系中加入苦瓜籽油混合脂肪酸，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)分别为1:4；
室温冷却后，再将包合体系分别置于-8℃、-4℃、0℃、4℃、8℃条件下包合18h，以得到包合溶液；其他步骤同1.4，在此不再赘诉，即得到α-桐酸含量较高的苦瓜籽油，同样按照公式(1)-(2)分别计算α-桐酸纯度以及产物收率，其结果如图6所示。
由图7可知，包合温度升高，产物收率随之增加，是因为尿素包合反应是一个放热的过程，低温条件下能够促进包合物生成；但当包合温度过低时，尿素包合物晶体形成速度过快，包合不充分，反而会使产物收率偏低；升高反应温度后，产物收率升高，而α-桐酸纯度降低。是因为反应温度升高，尿素分子运动速率加快，多不饱和脂肪酸不易被析出，然而此时脂肪酸与尿素形成的晶粒大而粗糙并且结合不牢固，导致饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸很容易从包合物中脱离出来，从而影响富集后α-桐酸的纯度，因此包合温度为0℃时较为适宜，此时α-桐酸纯度为39.71％。
1.6正交试验优化尿素包含法富集α-桐酸工艺
由于溶剂种类对α-桐酸纯度影响不大，且还随着乙醇用量的逐渐增加而增加，考虑到实际生产可行性以及α-桐酸得率、生产成本的因素，选择体积分数95％乙醇作为尿素溶剂，尿素与体积分数95％的乙醇的质量体积比(g/mL)为1:5，其他三个因素在单因素提取的试验基础上，考察多因素的综合效应，以脂肪酸尿素比例、包合温度、包合时间、空白列为影响α-桐酸纯度的因素设计正交试验，以苦瓜籽油中α-桐酸纯度(Y)为指标，试验的因素和水平的取值见表1。正交试验结果见表2。
表1正交试验因素与水平设计
Figure BDA0003069854640000081
由表1可以看出，各因素极差比较大小为A＞C＞B，其中脂肪酸尿素比例的极差最大，为34.438，是影响α-桐酸纯度的主要因素，其次是包合时间、包合温度，说明三因素中，包合温度对α-桐酸纯度的影响最小。因此，由正交试验结果得出的最佳试验组合为A1B3C3，因此本申请中的优选方案为，步骤S4中尿素与体积分数95％的乙醇的质量体积比(g/mL)为1:5、苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:3、包合温度为4℃、包合时间为24h，此时苦瓜籽油中共轭亚麻酸含量为71.28％，其中α-桐酸纯度为60.03％，产物收率为33.94％。
表2尿素包合正交试验结果
Figure BDA0003069854640000091
表3方差分析结果
Figure BDA0003069854640000092
极差分析得到尿素包合的最优组合，而三个因素对α-桐酸纯度影响的显著性则需要进行方差分析，见表3。由表中结果可以看出，脂肪酸尿素比例对α-桐酸纯度的影响最为显著(FA＝20.81)，其他因素对α-桐酸纯度的影响不显著。
1.7尿素包合前后苦瓜籽油脂肪酸成分分析
采用气相色谱质谱联用仪对尿素包合前后的苦瓜籽油脂肪酸成分组成以及含量进行测定，其结果如图7a-7b、表4所示。
表4苦瓜籽油富集前后脂肪酸含量对比
Figure BDA0003069854640000101
由图7a-7b可知，苦瓜籽油共有8种脂肪酸被检出，其中饱和脂肪酸3种，占54.26％，不饱和脂肪酸5种，占45.74％。通过表4可知，富集前苦瓜籽油中主要的脂肪酸成分是硬脂酸和α-桐酸，分别占37.64％、32.97％，通过尿素包合法富集后，硬脂酸含量减少至16.10％，α-桐酸含量增加到53.94％，此时其纯度为60.03％，总共轭亚麻酸纯度达到71.28％，表明尿素包合法富集α-桐酸的方法是切实可行的。
对比例2：尿素包合法+超高压处理富集共轭亚麻酸中的α-桐酸
称取4g左右的苦瓜籽油，加入0.5mol/L的氢氧化钾－乙醇溶液20mL，混合均匀，以得到混合体系；再将所述混合体系置于70℃水浴条件下磁力搅拌回流1.5h；其中，所述氢氧化钾－乙醇溶液的浓度为0.5mol/L，其配制过程同实施例1；
所述混合体系冷却至室温，加入2ml蒸馏水后用石油醚萃取3次，以除去混合体系中的不皂化物；萃取后的底层溶液用2mol/L的HCl调节pH至2-3范围内，再用石油醚萃取2-3次后，然后合并有机相，采用无水硫酸钠对有机相进行脱水、旋转蒸发，以得到苦瓜籽油混合脂肪酸；
按质量体积比(g/mL)1:5的比例向尿素中加入体积分数95％甲醇或体积分数95％乙醇，然后置于75℃条件下加热回流并磁力搅拌，待尿素完全溶解后，再加入苦瓜籽油混合脂肪酸，以得到尿素-苦瓜籽油混浊液，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:3；再将所述混浊液置于70℃条件下水浴加热回流并磁力搅拌，直至混浊液变为澄清透明的溶液，室温冷却后，再将此溶液置于4℃条件下包合24h，以得到包合体系；
再将所述包合体系倒入PE袋中，于室温下冷却30min，然后再将装有包合体系的PE袋(不完全密封)置于100MPa条件下进行超高压处理，且超高压处理时间为20min；
超高压处理完毕后，对所述包合体系进行抽滤，再对抽滤得到的滤液进行减压浓缩，以去除乙醇；再向经减压浓缩后的滤液中加入石油醚萃取脂肪酸，石油醚萃取3次后，合并有机相加温水水洗至中性，以去除尿素，再用无水硫酸钠干燥，且进行减压浓缩，以得到共轭亚麻酸(α-桐酸)含量较高的苦瓜籽油；同样按照公式(1)-(2)分别计算α-桐酸纯度以及产物收率。
实施例1：
从苦瓜中获取苦瓜籽仁，洗净、干燥后用超微植物粉碎机磨粉至20目左右，以得到苦瓜籽仁粉；
将苦瓜籽仁粉放入超临界CO2萃取釜中，按如下流程进行苦瓜籽油萃取：加压达到超临界状态→热交换升温→按设定条件萃取→节流减压→萃取物与溶剂分离→溶剂热交换→加压达到超临界状态；如此进行萃取-分离的循环操作，直至完成设定条件；
其中，萃取条件为：反应釜压力30.0MPa，提取温度50℃，提取3h；分离器一压力6.8MPa，温度45℃，分离器二压力5.0MPa，温度36℃。
称取4g左右的苦瓜籽油，加入0.5mol/L的氢氧化钾－乙醇溶液20mL，混合均匀，以得到混合体系；再将所述混合体系置于70℃水浴条件下磁力搅拌回流1.5h；其中，所述氢氧化钾－乙醇溶液的浓度为0.5mol/L，其配制过程包括：准确称取40g KOH于烧杯，用不含CO2的纯水约50mL溶解，转移至容量瓶后用无水乙醇定容至1L，再于聚乙烯容器中密闭避光放置1周，然后过滤，即得0.5mol/L的氢氧化钾－乙醇溶液；
所述混合体系冷却至室温，加入2ml蒸馏水后用石油醚萃取3次，以除去混合体系中的不皂化物；萃取后的底层溶液用2mol/L的HCl调节pH至2-3范围内，再用石油醚萃取2-3次后，然后合并有机相，采用无水硫酸钠对有机相进行脱水、旋转蒸发，以得到苦瓜籽油混合脂肪酸；
按质量体积比(g/mL)1:4的比例向尿素中加入体积分数95％的乙醇，置于75℃条件下加热回流并磁力搅拌，待尿素完全溶解后，再加入苦瓜籽油混合脂肪酸，以得到尿素-苦瓜籽油混浊液，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:4；再将所述混浊液置于70℃条件下水浴加热回流并磁力搅拌，直至混浊液变为澄清透明的溶液，室温冷却后，再将此溶液置于-4℃条件下包合6h，以得到包合体系；
将所述包合体系倒入PE袋中，于室温下冷却30min，然后再将装有包合体系的PE袋(不完全密封)置于200MPa条件下进行超高压处理，且超高压处理时间为10min；
超高压处理完毕后，对所述包合体系进行抽滤，再对抽滤得到的滤液进行减压浓缩，以去除乙醇；再向经减压浓缩后的滤液中加入石油醚萃取脂肪酸，石油醚萃取3次后，合并有机相加温水水洗至中性，以去除尿素，再用无水硫酸钠干燥，且进行减压浓缩，以得到共轭亚麻酸含量54.15％的苦瓜籽油，其中α-桐酸纯度达到49.58％。
最后采用半制备型HPLC对含有共轭亚麻酸的苦瓜籽油中的共轭亚麻酸进行收集，收集得到的目标组分于35℃水浴条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，直至有机溶剂全部挥发，即得到α-桐酸的纯度达到91.36％的苦瓜籽油；其中，收集条件如下：
色谱条件：HPLC系统，WaterTM 600(Waters公司)；
色谱柱：Gemini C18柱(10μm，250mm×4.6mm)
紫外检测器检测波长：270nm，过柱时的柱温：35℃，进样量：50μL/次，流速：1mL/min；
流动相：由质量分数0.1％的乙酸溶液和甲醇配制而成，且质量分数0.1％的乙酸溶液和甲醇的比例为10:90(v/v)。
实施例2：
按质量体积比(g/mL)1:5的比例向尿素中加入体积分数95％的乙醇，置于75℃条件下加热回流并磁力搅拌，待尿素完全溶解后，再加入苦瓜籽油混合脂肪酸，以得到尿素-苦瓜籽油混浊液，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:3；再将所述混浊液置于70℃条件下水浴加热回流并磁力搅拌，直至混浊液变为澄清透明的溶液，室温冷却后，再将此溶液置于0℃条件下包合24h，以得到包合体系；
将所述包合体系倒入PE袋中，于室温下冷却30min，然后再将装有包合体系的PE袋(不完全密封)置于100MPa条件下进行超高压处理，且超高压处理时间为10min；
超高压处理完毕后，对得到共轭亚麻酸含量71.54％的苦瓜籽油，其中α-桐酸纯度达到61.33％。
最后采用半制备型HPLC对含有共轭亚麻酸的苦瓜籽油中的共轭亚麻酸进行收集，得到α-桐酸的纯度达到92.52％的苦瓜籽油。
其他步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例3：
按质量体积比(g/mL)1:6的比例向尿素中加入体积分数95％的乙醇，置于75℃条件下加热回流并磁力搅拌，待尿素完全溶解后，再加入苦瓜籽油混合脂肪酸，以得到尿素-苦瓜籽油混浊液，且苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比(g/g)为1:3；再将所述混浊液置于70℃条件下水浴加热回流并磁力搅拌，直至混浊液变为澄清透明的溶液，室温冷却后，再将此溶液置于0℃条件下包合24h，以得到包合体系；
将所述包合体系倒入PE袋中，于室温下冷却30min，然后再将装有包合体系的PE袋(不完全密封)置于300MPa条件下进行超高压处理，且超高压处理时间为10min；
超高压处理完毕后，对得到共轭亚麻酸含量63.59％的苦瓜籽油，其中α-桐酸纯度达到58.47％。
最后采用半制备型HPLC对含有共轭亚麻酸的苦瓜籽油中的共轭亚麻酸进行收集，得到α-桐酸的纯度达到91.04％的苦瓜籽油。
其他步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
采用二极管阵列紫外检测器在270nm条件下对实施例2中最终获得的苦瓜籽油进行剂型扫描，结果如图8所示。
从图8中可以看出苦瓜籽仁油含有的共轭亚麻酸有三种，其中两种含量较少，本实施例中采用尿素包含+高压处理+半制备型HPLC制备得到苦瓜籽仁油的主要共轭亚麻酸类型，经与标品对照，确认为α-桐酸。
图9示出了对比例1(即“仅尿素包含”)、对比例2(即“尿素包含+高压处理”)以及实施例2中α-桐酸纯度以及产物收率。
本申请由于采用了尿素包含+高压处理+半制备型HPLC的复合方式富集苦瓜籽油中的α-桐酸，α-桐酸的纯度显著提升，可由59.56％增长到92.52％，产物收率由20.14％增长到39.37％，其显著高于对比例1、对比例2，其原因在于：随着压力增高，尿素包合物晶体的热力学性质较为稳定，六方晶系晶体融化所需能量较高，且其晶体分布较为密集。因此在抽滤过程中，晶体不易溶解残留于滤液中，使得产物收率升高。经半制备HPLC针对性收集组分后，α-桐酸纯度也出现大幅提高。
综上所述，本发明与现有技术相比，其即尿素包合+高压处理+半制备型HPLC完成对苦瓜籽油中典型CLN(α-桐酸)的提取，其可以大幅提高α-桐酸的纯度和产物收率。
需要说明的是，上述实施例1-3中的技术特征可任意组合，且组合而成的技术方案均属于本申请的保护范围。在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种苦瓜籽油中高含量共轭亚麻酸α-桐酸的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从苦瓜籽仁中提取苦瓜籽油；
S2、将苦瓜籽油与氢氧化钾－乙醇溶液混合均匀，以得到混合体系，再将所述混合体系置于65-75℃水浴条件下磁力搅拌回流1-2h；
S3、所述混合体系冷却至室温，加入蒸馏水后用石油醚萃取2-3次，萃取后的底层溶液用HCl溶液调节pH至2-3范围内，再用石油醚萃取2-3次后，然后合并有机相，采用无水硫酸钠对有机相进行脱水、旋转蒸发，以得到苦瓜籽油混合脂肪酸；
S4、向尿素中加入体积分数95％的乙醇，置于75℃条件下加热回流并磁力搅拌，待尿素完全溶解后，再加入苦瓜籽油混合脂肪酸，以得到尿素-苦瓜籽油混浊液；再将所述-混浊液置于70℃条件下水浴加热回流并磁力搅拌，直至变为澄清透明的溶液，室温冷却后，再将其置于-8-8℃的包合温度下包合6-30h，以得到包合体系；
S5、将所述包合体系倒入PE袋中，于室温下冷却30min，然后再将装有包合体系的PE袋置于100-300MPa条件下进行超高压处理，且超高压处理时间5-15min；
超高压处理完毕后，对所述包合体系进行抽滤，再对抽滤得到的滤液进行减压浓缩，以去除乙醇；再向经减压浓缩后的滤液中加入石油醚萃取脂肪酸，石油醚萃取3次后，合并有机相加温水水洗至中性，以去除尿素，再用无水硫酸钠干燥，且进行减压浓缩，以得到共轭亚麻酸含量50-72％的苦瓜籽油，其中α-桐酸纯度达到48-62％；
以及S6、采用半制备型HPLC对含有共轭亚麻酸的苦瓜籽油中的共轭亚麻酸进行收集，收集得到的目标组分经减压、浓缩后即得到α-桐酸的纯度达到90-93％的苦瓜籽油。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，采用超临界CO2萃取方式从苦瓜籽仁中提取苦瓜籽油。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中，采用超临界CO2萃取方式从苦瓜籽仁中提取苦瓜籽油的萃取条件为：反应釜压力30-40MPa，提取温度45-50℃，提取2-3h；分离器一压力5.5-7.0MPa，温度40-55℃，分离器二压力4.0-5.5MPa，温度35-40℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，苦瓜籽油与氢氧化钾－乙醇溶液的质量体积比为1:5。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述氢氧化钾－乙醇溶液的浓度为0.5mol/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，尿素与体积分数95％的乙醇的质量体积比为1:5。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素的重量比为1:3。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中，色谱柱采用C18柱。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中，所述流动相由质量分数0.1％的乙酸溶液和甲醇配制而成，且质量分数0.1％的乙酸溶液和甲醇的体积比为10:90；过柱时的柱温为35℃，进样量为50μL/次，流速为1mL/min。
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