CN113583077A

CN113583077A - 甾醇的制备方法

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Publication number: CN113583077A
Application number: CN202110981200.XA
Authority: CN
Inventors: 廖勤俭; 胡娇; 李杨华; 安明哲; 赵东; 乔宗伟; 王小琴; 周韩玲; 宋廷富
Original assignee: Wuliangye Yibin Co Ltd
Current assignee: Wuliangye Yibin Co Ltd
Priority date: 2021-08-25
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-08-25
Also published as: CN113583077B

Abstract

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及甾醇的制备方法。本发明所要解决的技术问题是现有制备方法原料不易得到、制备工艺复杂的问题，其技术方案是提供了甾醇的制备方法：从丢糟中分离得到。该方法包括如下步骤：a、取丢糟，有机溶剂A提取，浓缩，得到甾醇提取液；b、将甾醇提取液，有机溶剂B萃取，浓缩，得到甾醇粗提液；c、将甾醇粗提液进行硅胶正相柱层析，收集含有甾醇的洗脱液，浓缩，得到粗品；d、将粗品进行制备色谱反相柱分离，收集含有甾醇的洗脱液，浓缩，即得甾醇。本发明将液液萃取、柱层析等多种分离技术相结合，从丢糟中分离制备出12种甾醇，分离度高，产品纯度高。

Description

甾醇的制备方法

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及甾醇的制备方法。

背景技术

甾醇，一类由3个己烷环及一个环戊烷稠合而成的环戊烷多氢菲衍生物。除细菌中缺少外，是广泛存在于生物体内的一种重要的天然活性物质，按其原料来源分为动物性甾醇、植物性甾醇和菌类甾醇等三大类。甾醇有多种不同的生物学功能,如作为细胞膜的成分及构成肾上腺皮质激素和性激素等。不少植物甾醇还具有很强的药理或毒理效应，如β-谷甾醇有降胆甾醇、止咳、祛痰及抑制肿瘤和修复组织作用。

丢糟是固态酿造白酒蒸馏取酒后废弃的糟醅，是酿酒的副产物。我国丟糟年产量高达几千万吨，由于含40～50％的发酵填充物稻壳，而稻壳主要成分为粗纤维，因此限制了丟糟的回收利用。此外，丟糟含有60％左右的水份，贮存困难，易霉变，常常只能作为废弃物丢掉，既污染环境，又造成了极大的资源浪费。丢糟是粮食原料经长时间的复合微生物发酵产物，其中含有粮食原料中的，也有微生物代谢、酶解等产生的活性功能因子，由此，探究丢糟中的含有的植物性甾醇和菌类甾醇等活性功能因子，可以提供丟糟的更多利用途径，提高其应用价值，具有很大的环保效益和经济效益。

目前，未见丢糟中分离制备甾醇的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供甾醇的制备方法，更具体的是提供从丢糟中分离制备甾醇的方法，以解决现有制备方法存在的原料不易得到、制备工艺复杂等问题。

本发明提供了甾醇的制备方法：从丢糟中分离得到。

进一步地，所述的甾醇的制备方法，包括如下步骤：

a、取丢糟，有机溶剂A提取，浓缩，得到甾醇提取液；

b、将甾醇提取液，有机溶剂B萃取，浓缩，得到甾醇粗提液；

c、将甾醇粗提液进行硅胶正相柱层析，收集含有甾醇的洗脱液，浓缩，得到粗品；

d、将粗品进行制备色谱反相柱分离，收集含有甾醇的洗脱液，浓缩，即得甾醇。

进一步地，所述有机溶剂A为醇系溶剂。

优选地，所述醇系溶剂为甲醇或乙醇。

进一步地，所述有机溶剂A为甲醇或乙醇，甲醇或乙醇用量为酒糟重量的3～6倍。

进一步地，步骤a中，提取温度为15～40℃。

优选地，提取温度为20℃。

进一步地，步骤a中，提取次数为2～4次。

进一步地，步骤a中，提取时间为每次1～2天。

进一步地，所述有机溶剂B为石油醚或乙酸乙酯。

进一步地，石油醚或乙酸乙酯与提取液体积比为(1：1～1：2)。

进一步地，步骤b中，萃取温度为15～40℃。

优选地，萃取温度为20℃。

进一步地，步骤b中，萃取次数为2～4次。

进一步地，步骤c中，硅胶正相柱层析过程中，所述的硅胶为100～300目正相硅胶。

以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂。

进一步地，步骤c中，以石油醚/乙酸乙酯，v/v，1:0，20:1，10:1，2:1，1:1的比例进行梯度洗脱。

进一步地，步骤d中，采用制备色谱。

进一步地，步骤d中，固定相为C18柱。

进一步地，步骤d中，以甲醇和/或乙醇与水为洗脱试剂。

优选地，采用梯度洗脱。

进一步地，步骤d中，色谱流速为10～20mL/min，进样量为1～10mL。

优选地，色谱流速为10mL/min，进样量为5mL。

进一步地，所述的制备方法还包括重结晶的步骤，重结晶溶剂为甲醇或石油醚。

重结晶次数为2～4次。

进一步地，所述丢糟为酿造五粮浓香型白酒产生的丢糟。

进一步地，所述五粮浓香型白酒丢糟是以大米、糯米、玉米、高粱、小麦五种粮食为原料，加入大曲发酵剂及网络酿酒环境微生物自然发酵，再蒸馏取酒之后，废弃的糟醅。

进一步地，所述甾醇为麦角甾酮-5,24(28)-二烯-3-醇、麦角甾烷醇、豆甾-7,24(28)-二烯-3醇、豆甾醇、菜油甾醇、豆甾烷醇、异岩藻甾醇、β-谷甾醇、4-菜油甾烯-3-酮、豆固酮、豆甾-4-烯-3-酮、豆甾烷-3,6-二酮中的任一种或任意几种。

有益效果：

1、本发明提供了一种制备甾醇的新方法：从五粮浓香型白酒副产物丢糟中分离得到。发明人在探索白酒中健康功能因子的过程中，首次发现酿酒副产物丢糟中存在甾醇，为从丢糟中分离制备甾醇提供了可能，也为该类化合物的大量获得提供了新的方法。

2、丢糟属于固态酿造白酒副产物，产量大，因贮存困难，易霉变等因素，常常只能作为废弃物丢掉，既污染环境，又造成了极大的资源浪费。本发明从丢糟中探究并制备甾醇，既可提高丢糟的应用价值，增大丢糟用途，又可以为进一步探究白酒中的甾醇类活性功能因子提供技术支撑。

3、本发明制备分离方法简便，产物纯度高：本发明首次从五粮浓香型白酒丢糟中分离得麦角甾酮-5,24(28)-二烯-3-醇、麦角甾烷醇、豆甾-7,24(28)-二烯-3醇、豆甾醇、菜油甾醇、豆甾烷醇、异岩藻甾醇、β-谷甾醇、4-菜油甾烯-3-酮、豆固酮、豆甾-4-烯-3-酮、豆甾烷-3,6-二酮12种甾醇，纯度高。

4、进一步地，本发明创造性地将硅胶正相柱层析、制备色谱反相柱等多种分离技术相结合，从成分复杂的丢糟中首次分离得到了纯度在95％以上的甾醇。采用气相质谱对纯品目标化合物进行了定性分析，确定各甾醇化合物。

附图说明

图1为实施例1所得麦角甾酮-5,24(28)-二烯-3-醇气相质谱图；

图2为实施例1所得麦角甾烷醇气相质谱图；

图3为实施例1所得豆甾-7,24(28)-二烯-3醇气相质谱图；

图4为实施例1所得豆甾醇气相质谱图；

图5为实施例1所得菜油甾醇气相质谱图；

图6为实施例1所得豆甾烷醇气相质谱图；

图7为实施例1所得异岩藻甾醇质谱图；

图8为实施例1所得β-谷甾醇气相质谱图；

图9为实施例1所得4-菜油甾烯-3-酮气相质谱图；

图10为实施例1所得豆固酮气相质谱图；

图11为实施例1所得豆甾-4-烯-3-酮气相质谱图；

图12为实施例1所得豆甾烷-3,6-二酮气相质谱图；

图13为不同条件β-谷甾醇提取效率对比图。

具体实施方式

本发明的目的在于提供甾醇的制备方法，以解决现有制备方法存在的原料不易得到、制备工艺复杂等问题。

本发明提供了甾醇的制备方法：从丢糟中分离得到。

其中，所述的制备方法包括如下步骤：

a、取丢糟，有机溶剂A提取，浓缩，得到甾醇提取液；

b、将甾醇提取液，有机溶剂B萃取，浓缩，得到甾醇粗提物；

本发明首先选用合适有机溶剂A将丢糟中的微量目标物质提取出来，同时要避免淀粉、糖类、蛋白质等进入到提取液中，再根据相似相溶原理，选用有机溶剂B进行萃取，进一步地除去提取液中的强极性化合物，得甾醇粗提物。

然后，采用硅胶正相柱层析、制备色谱反相柱分离，其原理是根据化合物的极性不同进行分离，从而达到分离纯化甾醇的目的。

要想从成分复杂的丢糟中分离出高纯度的甾醇，必须将上述分离手段结合起来，以上a、b、c、d四个步骤缺一不可。申请人经过大量实验发现，若缺少其中任一步骤，均难将甾醇提取分离出来。

本发明采用醇系溶剂作为提取溶剂，能将丢糟中的甾醇充分提取出来，同时能避免淀粉、糖类、蛋白质等成分进入到提取液中。在优选的实施方案中，甲醇和乙醇的沸点较低，减压浓缩时无需设置太高的温度，既能避免目标化合物被高温破坏，又能节省时间，便于溶剂回收。因此，在本发明制备方法步骤a中，所述有机溶剂A为醇系溶剂。优选地，所述醇系溶剂为甲醇或乙醇。

经过考察，甲醇或乙醇用量为酒糟重量的3～6倍最佳，既能充分提取出酒糟中甾醇，又不至于造成溶剂的浪费。提取温度为15～40℃，特别是提取温度为20℃最佳，既能充分提取出酒糟中甾醇，也不会造成溶剂挥发严重、损失过多。提取次数为2～4次，每次提取时间为1～2天最佳，既能充分提取出酒糟中甾醇，又能够避免杂质过多地进入提取液，给后续的分离纯化带来困难。因此，本发明制备方法步骤a中，有机溶剂A为甲醇或乙醇，甲醇或乙醇用量为酒糟重量的3～6倍；提取温度为15～40℃；优选地，提取温度为20℃；提取次数为2～4次；提取时间为每次1～2天。

当使用甲醇或乙醇作为提取溶剂时，丢糟中的目标甾醇及多种不同极性的杂质都能溶解于其中，因此，本发明再采用极性较弱的石油醚或乙酸乙酯对浓缩后的提取液进行萃取，根据相似相溶原理，既能将极性弱的甾醇萃取出来，又可以进一步除去大量的杂质，以减小后续的分离难度。因此，所述步骤b中，有机溶剂B为石油醚或乙酸乙酯；石油醚或乙酸乙酯与提取液体积比为(1：1～1：2)；萃取温度为15～40℃；优选地，萃取温度为20℃；萃取次数为2～4次。

进一步地，步骤c中，所述的硅胶为100～300目正相硅胶；本发明优选100～300目正相硅胶目的在于，既能达到较好的纯化效果，又能保证分离的速度。

本发明制备方法步骤c中，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂；以石油醚/乙酸乙酯，v/v，1:0，20:1，10:1，2:1，1:1的比例进行梯度洗脱。目的在于以石油醚-乙酸乙酯为洗脱试剂，并通过调整洗脱液的梯度，能够将甾醇粗提物的不同化合物从极性弱到极性强逐步洗脱下来。

本发明制备方法步骤d中，采用制备色谱；

固定相为C18柱；

以甲醇和/或乙醇与水为洗脱试剂；

优选地，采用梯度洗脱；

色谱流速为10～20mL/min，进样量为1～10mL；

优选地，色谱流速为10mL/min，进样量为5mL。

上述参数目的在于采用反相色谱进一步分离纯化，甲醇和/或乙醇为洗脱试剂进行洗脱，能够将粗品中的化合物从极性强到极性弱逐步洗脱下来，达到分离纯化甾醇的目的。

进一步地，本发明制备方法还包括重结晶的步骤，重结晶溶剂为甲醇或石油醚；重结晶次数为2～4次。

本发明制备方法中的丢糟为酿造五粮浓香型白酒产生的丢糟。所述五粮浓香型白酒丢糟是以大米、糯米、玉米、高粱、小麦五种粮食为原料，加入大曲发酵剂及网络酿酒环境微生物自然发酵，再蒸馏取酒之后，废弃的糟醅。

本发明提供了甾醇的制备方法，将多种层析技术相结合，首次从丢糟中分离制备出甾醇，主要具有以下优势：

3、制备分离方法简便，产物纯度高：本发明首次从五粮浓香型白酒丢糟中分离得麦角甾酮-5,24(28)-二烯-3-醇、麦角甾烷醇、豆甾-7,24(28)-二烯-3醇、豆甾醇、菜油甾醇、豆甾烷醇、异岩藻甾醇、β-谷甾醇、4-菜油甾烯-3-酮、豆固酮、豆甾-4-烯-3-酮、豆甾烷-3,6-二酮12种甾醇，纯度高。

目前，尚未见丢糟中甾醇的相关报道，更未见从丢糟中分离制备出甾醇的报道。

以下通过具体实施例对本发明制备方法进一步阐述，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1采用本发明方法制备甾醇

(1)取五粮浓香型白酒的丢糟10kg，干燥至水份15％，加入30kg无水乙醇，于20℃提取2次，每次2天，提取液过滤，60℃减压浓缩得到提取液5L，再于分液漏斗中以10L石油醚萃取2次，收集石油醚相，经40℃减压浓缩后得到甾醇粗提液156g。

(2)将甾醇粗提液与100～200目正相硅胶均匀搅拌，200～300目硅胶装柱进行硅胶正相柱层析，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱试剂，以1:0，20:1，10:1，2:1，1:1(石油醚/乙酸乙酯，v/v)的比例进行梯度洗脱，每个比例洗脱6L；将20:1洗脱部分分段收集，进行减压干燥，得到组分S10。

(3)将步骤(2)得到的组分S10，乙醇溶解，以制备色谱进行反相柱分离纯化，以甲醇为洗脱试剂进行洗脱，减压干燥，得到S10-5，S10-8，S10-11，S10-14，S10-15，S10-16,S10-17,S10-18，S10-19,S10-23,S10-24,S10-25共12个化合物。

(4)将步骤(3)所得到的目标化合物溶解于甲醇中，重结晶2次，得到各纯品化合物。

(5)将步骤(4)所得到的各纯品化合物经气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MSMS)定性分析，经HPLC以β-谷甾醇作为标准品进行定量分析，结果为：

S10-5为麦角甾酮-5,24(28)-二烯-3-醇，得22mg，含量为96.6％，气相质谱图见图1；

S10-8为麦角甾烷醇，得21mg，含量为95.1％，气相质谱图见图2；

S10-11为豆甾-7,24(28)-二烯-3醇，得35mg，含量为96.7％，气相质谱图见图3；

S10-14为豆甾醇，得146mg，含量为98.2％，气相质谱图见图4；

S10-15为菜油甾醇，得97mg，含量为96.8％，气相质谱图见图5；

S10-16为豆甾烷醇，得62mg，含量为97.1％，气相质谱图见图6；

S10-17为异岩藻甾醇，得9mg，含量为95.2％，气相质谱图见图7；

S10-18为β-谷甾醇，得485mg，含量为99.0％，气相质谱图见图8；

S10-19为4-菜油甾烯-3-酮，得22.5mg，含量为95.7％，气相质谱图见图9；

S10-23为豆固酮，得17mg，含量为97.2％，气相质谱图见图10；

S10-24为豆甾-4-烯-3-酮，得32mg，含量为98.3％，气相质谱图见图11；

S10-25为豆甾烷-3,6-二酮，得18mg，含量为98.1％，气相质谱图见图12；

实施例2采用本发明方法制备甾醇

(1)取五粮浓香型白酒的丢糟10kg，加入40kg无水乙醇，于30℃提取4次，每次1天，提取液过滤，60℃减压浓缩得到提取液7L，再于分液漏斗中以7L石油醚萃取3次，收集石油醚相，经40℃减压浓缩后得到甾醇粗提液260g。

(2)将甾醇粗提液与100～200目正相硅胶均匀搅拌，200～300目硅胶装柱进行硅胶正相柱层析，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱试剂，以1:0，20:1，10:1，2:1，1:1(石油醚/乙酸乙酯，v/v)的比例进行梯度洗脱，每个比例洗脱8L；将20:1洗脱部分分段收集，进行减压干燥，得到组分S12。

(3)将步骤(2)得到的组分S12,乙醇溶解，以制备色谱进行反相柱分离纯化，以乙醇为洗脱试剂进行洗脱，减压干燥，得到S12-7,S12-10,S12-13,S12-16,S12-17,S12-18,S12-19,S12-20,S12-21,S12-25,S12-26,S12-27共12个化合物。

(4)将步骤(3)所得到的目标化合物溶解于石油醚中，重结晶2次，得到各纯品化合物。

S12-7为麦角甾酮-5,24(28)-二烯-3-醇，得12mg；

S12-10为麦角甾烷醇，得18mg；

S12-13为豆甾-7,24(28)-二烯-3醇，得25mg；

S12-16为豆甾醇，得96mg；

S12-17为菜油甾醇，得77mg；

S12-18为豆甾烷醇，得42mg；

S12-19为异岩藻甾醇，得5mg；

S12-20为β-谷甾醇，得447mg；

S12-21为4-菜油甾烯-3-酮，得12.6mg；

S12-25为豆固酮，得11mg；

S12-26为豆甾-4-烯-3-酮，得23mg；

S12-27为豆甾烷-3,6-二酮，得12mg；

对比例1丢糟水份及提取次数对甾醇提取效率的影响

取实施例1中的丢糟5份，各20g，分别干燥至不同水份含量，分别为样品1#、样品2#、样品3#、样品4#、样品5#。提取条件分别为，

条件①：分别加入甲醇60mL浸泡24h后超声萃取30min，甲醇洗涤过滤，定容至100mL。

条件②：分别加入甲醇60mL浸泡24h后超声萃取30min，过滤后再加入甲醇60mL超声萃取30min，滤液定容至150mL。

条件③：分别加入甲醇60mL浸泡24h后超声萃取30min，过滤后，再分两次以甲醇60mL超声萃取30min，滤液定容至250mL。

提取液利用HPLC以β-谷甾醇作为参考进行定量分析，考察不同条件下，β-谷甾醇的提取效率，不同条件β-谷甾醇提取效率对比图见附图13。

样品1#为丢糟原样，水份含量62％；样品2#丢糟水份46％；样品3#丢糟水份29％；样品4#丢糟水份15％；样品5#丢糟绝干，水份0％。

条件①中，随着丢糟水份的降低，β-谷甾醇的提取效率增高，丢糟水份高于30％的样品1#和样品2#，β-谷甾醇的提取效率低于50％；丢糟水份低于30％的样品3#、样品4#和样品5#，β-谷甾醇的提取效率能达到76％以上。

条件②中，甲醇提取次数为两次，β-谷甾醇的提取效率明显增高，丢糟水份低于30％样品3#、样品4#和样品5#，β-谷甾醇的提取效率能达到97％以上，则最佳提取次数为两次；而丢糟水份高于30％的样品1#和样品2#，β-谷甾醇的提取效率低于90％，则需要增加提取次数。

条件③中，甲醇提取次数为4次，丢糟水份高于30％的样品1#和样品2#，β-谷甾醇的提取效率都达到最大值，由此，当丢糟水份高于30％时，最佳提取次数为4次。

Claims

1.甾醇的制备方法，其特征是：从丢糟中分离得到。

2.根据权利要求1所述的甾醇的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

a、取丢糟，有机溶剂A提取，浓缩，得到甾醇提取液；

3.根据权利要求2所述的甾醇的制备方法，其特征是：步骤a中，满足以下至少一项：

所述有机溶剂A为醇系溶剂；

优选地，所述醇系溶剂为甲醇或乙醇；

所述有机溶剂A用量为酒糟重量的3～6倍；

提取温度为15～40℃；

优选地，提取温度为20℃；

提取次数为2～4次；

提取时间为每次1～2天。

4.根据权利要求2所述的甾醇的制备方法，其特征是：步骤b中，满足以下至少一项：

所述有机溶剂B为石油醚或乙酸乙酯；

石油醚或乙酸乙酯与提取液体积比为(1：1～1：2)；

萃取温度为15～40℃；

优选地，萃取温度为20℃；

萃取次数为2～4次。

5.根据权利要求2所述的甾醇的制备方法，其特征是：步骤c中，满足以下至少一项：

硅胶正相柱层析过程中，所述的硅胶为100～300目正相硅胶；

以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂；

以石油醚/乙酸乙酯，v/v，1:0，20:1，10:1，2:1，1:1的比例进行梯度洗脱。

6.根据权利要求2所述的甾醇的制备方法，其特征是：步骤d中，满足以下至少一项：

采用制备色谱；

固定相为C18柱；

以甲醇和/或乙醇与水为洗脱试剂；

优选地，采用梯度洗脱；

色谱流速为10～20mL/min，进样量为1～10mL；

优选地，色谱流速为10mL/min，进样量为5mL。

7.根据权利要求2所述的甾醇的制备方法，其特征是：所述的制备方法还包括重结晶的步骤；优选地，所述重结晶的步骤中溶剂为甲醇或石油醚；更优选地，重结晶次数为2～4次。

8.根据权利要求1～7任一项所述的甾醇的制备方法，其特征是：所述丢糟为酿造五粮浓香型白酒产生的丢糟。

9.根据权利要求8所述的甾醇的制备方法，其特征是：所述五粮浓香型白酒丢糟是以大米、糯米、玉米、高粱、小麦五种粮食为原料，加入大曲发酵剂及网络酿酒环境微生物自然发酵，再蒸馏取酒之后，废弃的糟醅。

10.根据权利要求1～9任一项所述的甾醇的制备方法，其特征是：所述甾醇为麦角甾酮-5,24(28)-二烯-3-醇、麦角甾烷醇、豆甾-7,24(28)-二烯-3醇、豆甾醇、菜油甾醇、豆甾烷醇、异岩藻甾醇、β-谷甾醇、4-菜油甾烯-3-酮、豆固酮、豆甾-4-烯-3-酮、豆甾烷-3,6-二酮中的任一种或任意几种。