CN109879923A - 可制备高纯度天然熊去氧胆酸的分离纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药生物技术领域,特别是涉及一种可制备高纯度天然熊去氧胆酸的分离纯化工艺。高纯度天然熊去氧胆酸由人工引流熊胆制备的熊胆粉分离纯化所得,高效液相色谱纯度不低于98%。其制备方法是:首先应用阳离子交换介质分离纯化制备纯度不低于90%的牛磺熊去氧胆酸,然后将牛磺熊去氧胆酸在碱性条件下彻底水解为熊去氧胆酸和牛磺酸,再应用硅胶吸附色谱技术分离纯化制备纯度不低于98%的熊去氧胆酸。本发明制得的天然熊去氧胆酸具有治疗原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎作用。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,特别是涉及一种可制备高纯度天然熊去氧胆酸的分离纯化工艺.
背景技术
熊去氧胆酸(3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸,简称UDCA)是中药熊胆的主要成分,曾主要用于治疗胆石疾病。近年来,国外报道了UDCA在治疗各种急性、慢性肝病中的应用。新的研究表明,UDCA不仅对于治疗原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、慢性活动性肝炎具有良好疗效,还可用于治疗慢性肝炎和肝移植后排斥反应。
熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸、牛羊胆酸的分子式相同,立体结构不同,化学上把这两种化合物的结构关系称为同分异构体。最早的提取工艺是直接从熊胆汁中提取。后来发明了另一种工艺:以鹅去氧胆酸(简称CDCA)为原料合成UDCA。现在大多数是采用醇+金属钠体系进行氢化还原反应,此体系在进行氢化还原反应时立体选择性较差,大概只有80%的7-酮石胆酸还原成熊去氧胆酸,另外20%还原成鹅去氧胆酸,反应完成后还需要进行分离纯化,最后得到的熊去氧胆酸产品大概只有鹅去氧胆酸的60%。
鉴于中药和天然药物现代化的迅猛发展,对于相关中药和天然药物的有效活性成分的质量标准和质量要求也日益提高。如高纯度的天然熊去氧胆酸,已经是诸多相关中药和天然药物注射剂所需的重要原料,因此研究一种可制备高纯度天然熊去氧胆酸的分离纯化工艺具有非常重要的价值和意义。
发明内容
本发明旨在公开一种以人工引流熊胆粉为原料,经两步柱层析法快速制备高纯度、高收率天然熊去氧胆酸的工艺方法。
本发明是通过以下途径得以实现:
人工引流熊胆粉是经人工饲养的黑熊胆汁引流干燥制备所得,该熊胆粉的主要物质成分为牛磺熊去氧胆酸(含量约30%)、牛磺鹅去氧胆酸(含量约25%)、熊去氧胆酸(含量约3%)、鹅去氧胆酸(含量约2%)、牛磺酸(含量约8%)和其他胆酸盐等成分。其中的牛磺熊去氧胆酸是主要目的成分,该成分经碱水解可得目的物熊去氧胆酸和杂质牛磺酸。因熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸在碱性条件下都会水解,为避免鹅去氧胆酸的干扰,因此首先分离出牛磺熊去氧胆酸。鉴于牛磺熊去氧胆酸在酸性条件下可吸附于阳离子交换介质上,因此选用CM Sepharose Fast Flow作为吸附介质,具体吸附和洗脱条件如下:
将人工引流制备的熊胆粉用20~70%的甲醇溶液溶解,浓度为3~15%(w/w),加入乙酸钠,终浓度为5~20mmol/L,用乙酸调节pH值为3~5;用与溶解熊胆粉相同的甲醇溶液浸泡并装柱CM Sepharose Fast Flow阳离子交换介质,平衡后上样,然后在含250mmol/L的NaCL的上述甲醇溶液中洗脱牛磺熊去氧胆酸。
阳离子交换层析所得牛磺熊去氧胆酸在碱性条件下可彻底水解为熊去氧胆酸钠和牛磺酸,具体水解条件如下:
阳离子层析所得牛磺熊去氧胆酸加水稀释3~10倍,加入10~40%(w/w)NaOH,于80~110℃水解20~30小时,得熊去氧胆酸钠和牛磺酸。
水解产物用稀盐酸调节酸度至1~2熊去氧胆酸钠酸化为熊去氧胆酸析出,牛磺酸保留溶液中,过滤干燥后得熊去氧胆酸粗品,该粗品溶解于硅胶流动相中经硅胶吸附层析可得纯度大于98%的熊去氧胆酸,具体硅胶层析条件如下:
装柱200~300目层析用硅胶,以乙酸乙酯-甲醇为流动相,其中流动相中甲醇含量为0~25%(v/v)。熊去氧胆酸粗品用流动相溶解,上柱,流速为0.8~3倍柱体积/小时,薄层色谱检测收集熊去氧胆酸,浓缩后乙酸乙酯结晶得高纯度熊去氧胆酸。
本发明所制备的熊去氧胆酸可用于原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎的治疗。
具体实施方式
现以一个较佳工艺条件例证举阐明本发明所述方法:
取熊胆粉饮片1公斤,用10公斤50%的甲醇溶液搅拌溶解,加入乙酸钠至终浓度25mmol/L,用乙酸调节酸度值至5.8,过滤,得熊胆粉饮片溶液10.6升。
取CM Sephrose Fast Flow阳离子层析介质装填玻璃层析柱,柱规格10cm×80cm,填料高度60cm。配制平衡缓冲液:50%甲醇,25mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲,pH5.8。用平衡缓冲液平衡3倍柱体积,上样熊胆粉饮片样品溶液,上样结束后再平衡3倍柱体积。配制洗脱缓冲液I:50%甲醇,25mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲,100mmol/L氯化钠,pH5.8。用洗脱缓冲液I洗脱3~5倍柱体积,至薄层检测无显色斑点结束。配制洗脱缓冲液II:50%甲醇,25mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲,250mmol/L氯化钠,pH 5.8。用洗脱缓冲液II洗脱3~5倍柱体积,至薄层检测无牛磺熊去氧胆酸显色斑点结束。收集洗脱液,减压浓缩至无醇味,得样品8.5升。
取阳离子交换层析样品,加入纯水40升,氢氧化钠5公斤,置反应釜110℃搅拌24小时,冷却至室温后用6mmol/L盐酸调至pH 1.5,过滤干燥,得熊去氧胆酸粗品320克。
取200~300目层析用硅胶,装填玻璃层析柱,柱规格15cm×80cm,填料高度120cm。以乙酸乙酯为流动相。熊去氧胆酸粗品320可用1升乙酸乙酯溶解,过滤,上样,调节流速为350ml/min,分布收集流出液,高效薄层色谱检测,收集熊去氧胆酸部分,合并。得收集液54升,减压浓缩至6.3升,置室温放置结晶24小时,过滤,干燥,得晶体272.8克。
经反相高效液相色谱检测,所得熊去氧胆酸含量为99.12%,鹅去氧胆酸含量为0.33%,牛磺酸未检出。
Claims (3)
1.一种天然熊去氧胆酸,化学式为C 24H 40O 4;结构式为3a,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸。
2.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸,其特征是反相高效液相色谱纯度不低于98%,主要相关杂质鹅去氧胆酸含量不高于0.8%,牛磺酸含量不高于0.8%。
3.一种权利要求1、2所述的熊去氧胆酸,其特征是可用于原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎的治疗。
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