CN111349133B - 一种乙酰化罗汉果醇及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乙酰化罗汉果醇，其结构如式(I)所示。所述乙酰化罗汉果醇的制备方法，包括以下步骤：酰化反应，硅胶拌样，硅胶柱分离，精制，最终得到纯度在96％以上的高品质乙酰化罗汉果醇，具有优异的抗氧化性，适合作为保健品，食品，药品，饮品等中的抗氧化剂成分。

Description

一种乙酰化罗汉果醇及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及天然产物衍生物，具体涉及一种乙酰化罗汉果醇及其制备方法和用途。
背景技术
罗汉果醇(Mogrol)是罗汉果甜苷ⅠA1、ⅠE1、ⅡE、Ⅲ、Ⅳ、ⅣE、Ⅴ和赛门苷I等的苷元；11-O-罗汉果醇(11-O-Mogrol)则是11-O-罗汉果苷V的苷元。
罗汉果醇的化学结构如下：
Figure BDA0002428015440000011
近年来有学者提出，罗汉果醇对于老年性痴呆(阿尔茨海默症，AD)以及缺血性脑痴呆引起的空间认知障碍和学习记忆功能下降具有明显的改善作用。罗汉果醇能够增加老年性痴呆大鼠大脑皮层抑制性氨基酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸的含量，降低兴奋性谷氨酸的毒性，并能减少AD大鼠大脑海马组织中β-AP的产生，对于脑缺血引起的学习记忆功能下降也具有明显改善作用。罗汉果醇也能明显改善NaNO2所致的小鼠记忆障碍。由此可见，罗汉果醇具有明显的抗老年痴呆的作用，可以作为临床药物开发使用。然而，罗汉果醇的溶解性极差，导致其在食品、保健品、化妆品及药品等领域的应用受到了局限。
发明内容
为了解决罗汉果醇溶解性差，生物利用度不高的缺陷，本发明提供了一种罗汉果醇衍生物—乙酰化罗汉果醇，具体通过乙酰化反应，将罗汉果醇分子中的四个羟基乙酰化，不改变其药理活性的前提下，修饰分子结构从而提高溶解性。除了溶解性得到改善，乙酰化罗汉果醇的分子稳定性得到了提高，可以有效的延长其在生物体内的停留时间，从而提高生物利用度。发明人还预料不到地发现，羟基乙酰化后的罗汉果醇衍生物具有优异的抗氧化、除自由基的生理活性，可以作为保健品，药品，饮品，食品中抗氧化的添加剂。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种乙酰化罗汉果醇，其结构式如下式(I)所示：
Figure BDA0002428015440000021
其中Ac表示乙酰基。
本发明还提供了一种乙酰化罗汉果醇的制备方法，包括以下步骤：
(1)酰化反应：将罗汉果醇配制为溶液，加入乙酰化试剂和缚酸剂，保温反应，得反应液；
(2)硅胶拌样：将步骤(1)所得反应液用水洗至中性，减压浓缩，得到浓缩液I；往浓缩液I中加入硅胶搅拌均匀，干燥，得到拌样硅胶；
(3)硅胶柱分离：将步骤(2)所得拌样硅胶，加入预装硅胶的硅胶柱进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到乙酰化罗汉果醇粗品；
(4)精制：将乙酰化罗汉果醇粗品用醇溶剂加热溶解，加入活性炭，加热回流，冷却至室温，过滤，将滤液减压浓缩，得到浓缩液II，将浓缩液II冷却、搅拌析晶，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果醇精品。
步骤(1)中，配制罗汉果醇的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、乙醇，四氢呋喃，二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、苯和甲苯中的至少一种，有机溶剂的用量为罗汉果醇重量的1～2.5倍。
步骤(1)中，所述的乙酰化试剂是本领域所熟知的，比如乙酸酐，乙酰化试剂的用量是罗汉果醇重量的2～3倍；所述缚酸剂没有特别的限定，为本领域所熟知，比如有机碱，具体是指吡啶、哌啶、咪唑、甲基咪唑、二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙二胺、丙二胺、环己胺、二环己胺中的一种或几种，所述缚酸剂的用量为罗汉果醇重量的2～3倍。加入缚酸剂的目的是，与反应过程中生成的酸结合，使反应平衡向右进行，以加速并完全反应。若缚酸剂的用量过少，将无法充分的达到上述目的；若缚酸剂的用量过多，将造成能源和物料的浪费。
步骤(1)中，所述保温反应的温度为80～120℃，所述反应的时间为3～8小时。
优选地，在步骤(2)中，所述减压浓缩的温度为40～100℃，真空度为-0.06～-0.09Mpa，浓缩液I中的固形物含量为20％～50％。将水洗后的反应液浓缩的目的，第一是回收溶剂、并循环套用，第二是酰化反应所用的溶剂，有的极性过大，不能直接通过硅胶层析柱，否则目标成分将无法吸附在硅胶柱中，从而达不到分离、纯化的目的。
优选地，步骤(2)中，所述拌样硅胶中硅胶的用量为罗汉果醇重量的8-12倍。使用硅胶拌样、干燥的目的是，硅胶的吸附能力极强，可将浓缩液I中各种成分均匀的吸附，经过干燥的过程，浓缩液I中各种成分已经牢牢的被吸附在硅胶中，如此，可以高效的取代传统硅胶柱层析分离中的“上柱-吸附”过程。
优选地，步骤(3)中，所述预装的硅胶用量为拌样硅胶10～15倍，所述硅胶柱的高径比为3～6：1。将拌样硅胶加入预先装好硅胶的硅胶柱上方，目的是提供洗脱过程中目标成分(乙酰化罗汉果醇)和杂质的分离载体。若硅胶的用量过少或硅胶柱的高径比过小，目标成分和杂质将无法完全分离；若硅胶的用量过多或硅胶柱的高径比过大，将造成能源和物料的浪费。
优选地，步骤(3)中，所述洗脱剂为石油醚、环己烷、正己烷、6#溶剂油、120#溶剂油中任意一种溶剂与乙酸乙酯的混合溶剂，混合溶剂的比例为10～20：1(V/V)，所述洗脱剂的用量为3～5BV，所述洗脱的流速为0.5～2BV/小时。使用洗脱剂对装有拌样硅胶的硅胶柱经行洗脱，目的是将拌样硅胶中的各种成分洗脱，利用在相同的洗脱条件下各种成分在硅胶柱中的停留时间不同，实现目标成分(乙酰化罗汉果醇)与杂质的分离。由于乙酰化罗汉果醇的极性是拌样硅胶中所有成分中最小的，因此根据硅胶分离的特性，乙酰化罗汉果醇是洗脱过程中最先洗脱、流出的成分。若洗脱剂中混合溶剂的比例过大，将导致洗脱剂的极性过小、洗脱能力过弱，导致目标成分(乙酰化罗汉果醇)与杂质都无法被洗脱，无法达到分离的目的；若洗脱剂中混合溶剂的比例过小，将导致洗脱剂的极性过大、洗脱能力过强，导致目标成分(乙酰化罗汉果醇)与杂质都将快速的被洗脱，且两者在硅胶柱中停留的时间几乎一致，同样无法达到分离的目的。
优选地，步骤(4)中，所述醇溶剂甲醇或乙醇，醇的体积用量为乙酰化罗汉果醇粗品重量的10～20倍(ml/g)。
优选的，步骤(4)中，所述的浓缩液II中的固形物含量为20％～30％，所述冷却的温度为5～10℃，所述搅拌的速度为10～20r/min，所述析晶的时间为12～24小时。
本发明所述制备乙酰化罗汉果醇方法中，步骤(1)所述罗汉果醇的制备，参考申请人在前的专利，申请号为202010084840.6中记载的方法得到，具体包括以下步骤：
(S1)加压水解：将罗汉果提取物用水溶解，加入酸，加压加热水解，冷却后得水解液；
(S2)上柱吸附：往水解液中加入醇，醇水溶液通过吸附树脂柱；
(S3)梯度洗脱：先用水或醇水溶液将树脂柱冲洗至中性，再用低度醇洗脱，最后用高度醇洗脱，收集高度乙醇洗脱液；
(S4)浓缩、干燥：将高度醇洗脱液减压浓缩，干燥，得罗汉果醇粗品；
(S5)精制：罗汉果醇精制：将罗汉果醇粗品用有机溶剂加热溶解，加入活性炭，加热回流，冷却至室温，过滤，浓缩，搅拌，冷却析晶，抽滤，干燥，得罗汉果醇精品；11-O-罗汉果醇精制：结晶母液浓缩后经硅胶柱吸附、洗脱，洗脱液浓缩、干燥，得11-O-罗汉果醇。
优选地，步骤(S1)中，所述的罗汉果提取物，是以天然罗汉果果实为原料，通过提取、大孔树脂层析、浓缩、干燥步骤，得到的干燥粉末。所述的罗汉果提取物中，罗汉果苷V的质量百分比含量为25％～50％，11-O-罗汉果苷V的质量百分比含量为5％～15％。
优选地，步骤(S1)中，所述的水和罗汉果提取物体积重量比为10～20(ml/g)；和/或加入酸后溶液中酸(H+)的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；所述加压是对体系施加0.1～0.5Mpa的相对压强，加热温度为105～150℃，优选为110～130℃，水解的时间为0.5～5h，优选为1-3h。
优选地，步骤(S2)中，所述醇水溶液中醇的体积百分比浓度为12％～20％；所述吸附树脂的体积用量为罗汉果醇重量的15～20倍(ml/g)，所述吸附树脂柱的高径比为2～10:1，优选为5～8:1，上柱的流速为0.5～1.0BV/h；所述吸附树脂为大孔吸附树脂、层析硅胶、层析氧化铝或聚酰胺树脂。
优选地，步骤(S3)中，所述冲洗中，水或醇水溶液的用量为2～5BV，冲洗的流速是1～2BV/h；和/或所述低度醇的体积百分比浓度为25％～35％，低度醇的用量为2～3BV，低度乙醇洗脱的流速是1～2BV/h；和/或所述高度醇的体积百分比浓度为60％～75％，高度醇的用量为2～3BV，高度醇洗脱的流速是1～2BV/h。
优选地，步骤(S5)中，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙酮、四氢呋喃中的一种或几种，有机溶剂的体积用量为罗汉果醇粗品重量的10～15倍(ml/g)；所述罗汉果醇精制中，浓缩液中的固形物含量为18％～30％，所述冷却析晶的温度为0～5℃，所述搅拌的速度为10～30r/min，所述析晶的时间为12～24小时。
按照上述方法得到的罗汉果醇含量高，品质好，用于制备乙酰化罗汉果醇，能够得到高纯度的乙酰化罗汉果醇，生物活性好。采用一般工艺制备得到的罗汉果醇，由于含有一定含量的11-O-罗汉果醇，在乙酰化反应时，11-O-罗汉果醇也会发生乙酰化，乙酰化罗汉果醇和乙酰化11-O-罗汉果醇理化性质接近，难以利用一般分离手段纯化。发明人发现，乙酰化罗汉果醇中如果混杂有一部分的乙酰化11-O-罗汉果醇，会对产品的生物活性有一定不利影响。
本发明还提供了上述乙酰化罗汉果醇的用途，具体是用于保健品，药品，食品，饮料中的抗氧化剂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的罗汉果提取物购于湖南华诚生物资源股份有限公司，其中罗汉果苷V的含量为31.65％、11-O-罗汉果苷V的含量为7.85％；本发明实施例所使用的辅料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用高效液相色谱(HPLC)外标法检测罗汉果甜苷的含量。
制备例 罗汉果醇的提取制备
制备例1
(1)加压水解：取罗汉果提取物100g，用1000ml水溶解，加入盐酸，使酸水溶液中酸(H+)的摩尔浓度为0.4mol/L，在温度为125℃、相对压力为0.35Mpa的条件下加压水解1.5h，冷却至室温得水解液；
(2)低醇上柱吸附：往水解液中加入乙醇得醇水溶液，其中乙醇的体积百分比浓度为16％。将低醇溶液通过聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂的用量为1500ml，聚酰胺树脂柱的高径比为8:1，上柱的流速为1.0BV/h；
(3)梯度洗脱：先用5BV纯水将树脂柱冲洗至中性(流速2BV/h)，再用2.5BV体积百分比浓度为30％的低度乙醇洗脱(流速1.5BV/h)，最后用2BV体积百分比浓度为75％的高度乙醇洗脱(流速1.5BV/h)，收集高度乙醇洗脱液；
(4)浓缩、干燥：将高度乙醇洗脱液减压浓缩，干燥，得罗汉果醇粗品17.25g；
(5)精制：罗汉果醇的精制：将罗汉果醇粗品用300ml乙酸乙酯与石油醚的混合溶剂加热溶解(乙酸乙酯：石油醚＝1：1，V/V)，加入2.3g活性炭，加热回流1h，冷却至室温，过滤，将滤液减压浓缩至固形物含量为18％。将浓缩液冷却至温度为0℃，以20r/min搅拌速度，析晶18小时，抽滤，干燥，得罗汉果醇精品11.37g。将结晶母液浓缩至干，用石油醚溶解至固形物浓度为3％，以1bv/h的流速通过硅胶层析柱，硅胶重量为母液干物种量的20～30倍，硅胶层析柱的高径比为4:1，上柱毕，用2～4BV体积比8:1的石油醚：乙酸乙酯对硅胶层析柱进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，结晶，过滤，干燥，得1.92g11-O-罗汉果醇。
经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，所得罗汉果醇含量98.73％。
制备例2
其他条件和操作和实施例1相同，区别在于步骤(1)中加入硫酸，使酸水溶液中酸(H+)的摩尔浓度为0.3mol/L，在温度为110℃、相对压力为0.3Mpa的条件下加压水解3h。最终得到11.18g罗汉果醇精品，含量98.63％。
制备例3
其他条件和操作和实施例1相同，区别在于步骤(2)中聚酰胺树脂的用量为2000ml，聚酰胺树脂柱的高径比为5:1，上柱的流速为0.5BV/h。最终得到11.52g罗汉果醇精品，含量98.15％；得1.87g11-O-罗汉果醇，含量94.72％。
制备例4
其他条件和操作和制备例1相同，区别在于步骤(2)中醇水溶液中乙醇浓度为20％。最终得到11.27g罗汉果醇精品，含量98.32％。
制备例5
其他条件和操作和制备例1相同，区别在于步骤(2)中醇水溶液中乙醇浓度为10％。最终得到10.31g罗汉果醇精品，含量95.18％。
制备例6
其他条件和操作和制备例1相同，区别在于步骤(5)将滤液减压浓缩至固形物含量为30％。最终得到11.62g罗汉果醇精品，含量96.38％。
制备例7
其他条件和操作和制备例1相同，区别在于步骤(5)罗汉果醇的精制中，浓缩液冷却至温度5℃，以10r/min搅拌速度，析晶24h。最终得到11.62g罗汉果醇精品，含量96.76％。
制备例8
其他条件和操作和制备例1相同，区别在于步骤(5)罗汉果醇的精制中，浓缩液冷却至温度-3℃析晶。最终得到14.15g罗汉果醇精品，含量86.83％。
对比制备例1
其他条件和操作和实施例1相同，区别在于步骤(1)中不对体系进行加压，水解温度为95℃，水解时间3h。最终得到8.20g罗汉果醇，含量92.73％。
对比制备例2
其他条件和操作和实施例1相同，区别在于步骤(2)中不加入乙醇，发生堵柱、结块现象，无法继续后续流程。
对比制备例3
其他条件和操作和制备例1相同，区别在于步骤(3)中不采用梯度洗脱，水洗至中性后，直接用4.5BV的体积百分比浓度为75％的高度乙醇洗脱，流速1.5BV/h。最终得到14.74g罗汉果醇，含量86.72％。
实施例 乙酰化罗汉果醇的制备
实施例1
(1)酰化反应：向制备例1得到的10g罗汉果醇中加入150mL乙酸乙酯，配制为溶液，加入25g乙酸酐，缓慢滴加20g环己胺，在温度为80℃条件下保温反应6小时至反应结束，得到含有乙酰化罗汉果醇的反应液；
(2)硅胶拌样：将反应液用水洗至中性，在温度为60℃、真空度为-0.08Mpa的条件下减压浓缩至固形物含量为40％，得到浓缩液I；往浓缩液I中加入100g硅胶搅拌均匀，干燥，得到拌样硅胶；
(3)硅胶柱分离：将拌样硅胶缓慢、匀速地加入预先装好硅胶的硅胶柱上方(硅胶柱中硅胶的用量为1000g，硅胶柱的高径比为5：1)，铺平并压紧，用3BV洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)对硅胶柱进行洗脱，洗脱的流速为0.5BV/小时，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到乙酰化罗汉果醇粗品18.53g；
(4)精制：将乙酰化罗汉果醇粗品用200ml甲醇加热溶解，加入活性炭，加热回流，冷却至室温，过滤，将滤液减压浓缩至固形物含量为25％，得到浓缩液II。将浓缩液II冷却至温度8℃，以15r/min搅拌速度，析晶20小时，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果醇精品14.25g，经过HPLC检测，纯度为98.11％。
实施例2
(1)酰化反应：向制备例2得到的10g罗汉果醇中加入200mL四氢呋喃配制为溶液，加入30g乙酸酐，缓慢滴加30g吡啶，在温度为110℃条件下保温反应5小时至反应结束，得到含有乙酰化罗汉果醇的反应液；
(2)硅胶拌样：将反应液用水洗至中性，在温度为100℃、真空度为-0.09Mpa的条件下减压浓缩至固形物含量为30％，得到浓缩液I；往浓缩液I中加入120g硅胶搅拌均匀，干燥，得到拌样硅胶；
(3)硅胶柱分离：将拌样硅胶缓慢、匀速地加入预先装好硅胶的硅胶柱上方(硅胶柱中硅胶的用量为1200g，硅胶柱的高径比为6：1)，铺平并压紧，用5BV洗脱剂(环己烷：乙酸乙酯＝15：1)对硅胶柱进行洗脱，洗脱的流速为1BV/小时，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到乙酰化罗汉果醇粗品18.21g；
(4)精制：将乙酰化罗汉果醇粗品用250ml乙醇加热溶解，加入活性炭，加热回流，冷却至室温，过滤，将滤液减压浓缩至固形物含量为20％，得到浓缩液II。将浓缩液II冷却至温度5℃，以10r/min搅拌速度，析晶16小时，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果醇精品14.17g，经过HPLC检测，纯度为98.24％。
实施例3
(1)酰化反应：向制备例3得到的10g罗汉果醇中加入180mL乙酸乙酯，加入30g乙酸酐，缓慢滴加30g三乙胺，在温度为120℃条件下保温反应3小时至反应结束，得到含有乙酰化罗汉果醇的反应液；
(2)硅胶拌样：将反应液用水洗至中性，在温度为50℃、真空度为-0.07Mpa的条件下减压浓缩至固形物含量为35％，得到浓缩液I；往浓缩液I中加入150g硅胶搅拌均匀，干燥，得到拌样硅胶；
(3)硅胶柱分离：将拌样硅胶缓慢、匀速地加入预先装好硅胶的硅胶柱上方(硅胶柱中硅胶的用量为1500g，硅胶柱的高径比为4.5：1)，铺平并压紧，用4BV洗脱剂(6#溶剂油：乙酸乙酯＝20：1)对硅胶柱进行洗脱，洗脱的流速为1.2BV/小时，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到乙酰化罗汉果醇粗品18.05g；
(4)精制：将乙酰化罗汉果醇粗品用250ml乙醇加热溶解，加入活性炭，加热回流，冷却至室温，过滤，将滤液减压浓缩至固形物含量为30％，得到浓缩液II。将浓缩液II冷却至温度10℃，以10r/min搅拌速度，析晶24小时，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果醇精品13.95g，经过HPLC检测，纯度为98.53％。
实施例4
其他条件和实施例3相同，区别在于罗汉果醇为制备例4得到。最终得到乙酰化罗汉果醇精品13.87g，经过HPLC检测，纯度为98.56％。
实施例5
其他条件和实施例3相同，区别在于罗汉果醇为制备例5得到。最终得到乙酰化罗汉果醇精品13.72g，经过HPLC检测，纯度为96.31％。
实施例6
其他条件和实施例3相同，区别在于罗汉果醇为制备例6得到。最终得到乙酰化罗汉果醇精品13.96g，经过HPLC检测，纯度为97.49％。
实施例7
其他条件和实施例3相同，区别在于罗汉果醇为制备例7得到。最终得到乙酰化罗汉果醇精品13.87g，经过HPLC检测，纯度为97.43％。
实施例8
其他条件和实施例3相同，区别在于罗汉果醇为制备例8得到。最终得到乙酰化罗汉果醇14.12g，经过HPLC检测，纯度为93.25％。
对比实施例1
其他条件和实施例3相同，区别在于罗汉果醇为对比制备例1得到。最终得到乙酰化罗汉果醇13.41g，经过HPLC检测，纯度为87.62％。
对比实施例2
其他条件和实施例3相同，区别在于罗汉果醇为对比制备例3得到。最终得到乙酰化罗汉果醇14.05g，经过HPLC检测，纯度为82.53％。
对比实施例3
其他条件和实施例3相同，区别在于省去步骤(2)的硅胶拌样，直接将步骤(1)的反应液浓缩后加入到装有1500g硅胶的硅胶柱上进行吸附和洗脱。最终得到乙酰化罗汉果醇12.26g，经过HPLC检测，纯度为84.16％。
效果例
效果例1毒性实验
(1)口服给药
用昆明种小鼠，体重20g±2g，雌雄各半。将实施例3制备得到的乙酰化罗汉果醇制成5％的水混悬液，一日3次灌胃给予禁食小鼠、每次0.5mL，连续观察7天，未见死亡，未见毒副反应。
(2)注射给药
用昆明种小鼠，体重20g±2g，雌雄各半。将实施例3制备得到的乙酰化罗汉果醇配制成3％的注射液。注射给药，每次0.4mL。连续观察7天，未见死亡，未见毒副反应。
(3)长期毒性试验
用SD大鼠，体重200±20g，雌雄各半，共180只。分别灌胃给药。将实施例3制备得到的乙酰化罗汉果醇配制成10％的水混悬液，剂量按照每两周按照5mg/kg/d、10mg/kg/d、20mg/kg/d、40mg/kg/d，60mg/kg/d，80mg/kg/d六个浓度递增，每天连续给药，持续12周。对外周血象和肝，肾功能及血糖等生化指标均无明显差异；对重要脏器未引起明显的病理改善，表明80mg/kg/d时没有明显的毒副反应。
效果例2抗氧化性的测试
1.自由基DPPH的清除试验.采用DPPH法定量测定乙酰化罗汉果醇的抗氧化能力。原理是根据DPPH自由基有单电子，在520nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色。抗氧化剂能使单电子配对，从而使A520nm值降低，溶液褪色。由于这种变化其接受电子数量成定量关系，因而可用比色法(如分光光度计)进行测量。步骤如下：
(1)DPPH试剂的配制：精密称取DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)粉末(分子量＝394)0.00990g，置于250mL容量瓶，用适量95％乙醇溶解定容至250mL，得浓度为0.10mmol/L的DPPH试剂。
(2)供试品的制备：取实施例所得乙酰化罗汉果醇样品，加入95％乙醇溶液定容，分别配制成100μg/mL试液。同样发放配制罗汉果醇对照组和维生素C组，浓度均为100μg/mL。
(3)测定方法：
a.在10ml试管中依次加入4.0ml DPPH溶液和1.0ml95％乙醇，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以95％乙醇为参比，在520nm处测吸光值，得空白管吸光值，记为A0。
b.在10ml试管中依次加入4.0ml DPPH溶液和1.0ml待测试样溶液，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以95％乙醇为参比，在520nm处测吸光值，得样品管吸光值，记为A1。
c.在10ml试管中依次加入4.0ml95％乙醇溶液和1.0ml待测试样溶液，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以95％乙醇为参比，在520nm处测吸光值，得本底管吸光值，记为A2。
d.计算公式：样品对DPPH自由基的清除率SA(％)：
Figure BDA0002428015440000101
2.超氧阴离子自由基(O2-)的清除试验：邻苯三酚自氧化法。
采用邻苯三酚自氧化法，取4mL 0.1mol/L pH8.2Tris-HCl缓冲溶液和蒸馏水2mL，混匀后在25℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液(100μg/mL)2mL，取出后立即加入在25℃预热过的5mmol/L邻苯三酚0.5mL(以10mmol/L HCL配制，空白管用10mmol/L HCL代替邻苯三酚的HCL溶液)，摇匀后倒入比色皿，325nm下每隔30s测定吸光度，连续测定4min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。
抑制率(％)＝(△A0-△A)/△A0×100式中：△A0为邻苯三酚的自氧化速率；△A为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。
表1
Figure BDA0002428015440000102
Figure BDA0002428015440000111
测试结果如表1所示，实施例乙酰化罗汉果醇的添加量为100μg/mL时，具有优异的抗氧化性。发明人发现，乙酰化罗汉果醇的抗氧性和其纯度具有很大的关系，当纯度不够时，其抗氧化性会发生大幅度衰减。原因可能是其中的杂质11-O-罗汉果醇也参与了乙酰化反应，形成的杂质乙酰化11-O-罗汉果醇对抗氧化性具有不利影响。

Claims (10)

1.一种乙酰化罗汉果醇，其结构式如下式(I)所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(I)
其中Ac表示乙酰基。
2.权利要求1所述乙酰化罗汉果醇的制备方法，包括以下步骤：
(1)酰化反应：将罗汉果醇配制为溶液，加入乙酰化试剂和缚酸剂，保温反应，得反应液；
(2)硅胶拌样：将步骤(1)所得反应液用水洗至中性，减压浓缩，得到浓缩液I；往浓缩液I中加入硅胶搅拌均匀，干燥，得到拌样硅胶；
(3)硅胶柱分离：将步骤(2)所得拌样硅胶，加入预装硅胶的硅胶柱进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到乙酰化罗汉果醇粗品；
(4)精制：将乙酰化罗汉果醇粗品用醇溶剂加热溶解，加入活性炭，加热回流，冷却至室温，过滤，将滤液减压浓缩，得到浓缩液II，冷却、搅拌析晶，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果醇精品。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的乙酰化试剂选自乙酸酐，乙酰化试剂的用量是罗汉果醇重量的2～3倍；所述缚酸剂选自吡啶、哌啶、咪唑、甲基咪唑、二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙二胺、丙二胺、环己胺、二环己胺中的一种或几种，所述缚酸剂的用量为罗汉果醇重量的2～3倍。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述保温反应的温度为80～120℃，所述反应的时间为3～8小时。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述减压浓缩的温度为40～100℃，真空度为-0.06MPa～-0.09MPa，浓缩液I中的固形物含量为20%～50%。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述拌样硅胶中硅胶的用量为罗汉果醇重量的8-12倍；所述预装的硅胶用量为拌样硅胶10～15倍，所述硅胶柱的高径比为3～6：1。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述洗脱剂为石油醚、环己烷、正己烷、6#溶剂油、120#溶剂油中任意一种溶剂与乙酸乙酯的混合溶剂，混合溶剂的体积比为10～20：1，所述洗脱剂的用量为3～5BV，所述洗脱的流速为0.5～2BV/小时。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述醇溶剂为甲醇或乙醇，醇的体积用量为乙酰化罗汉果醇粗品重量的10～20倍，ml/g；所述的浓缩液II中的固形物含量为20%～30%，所述冷却的温度为5～10℃，所述搅拌的速度为10～20 r/min，所述析晶的时间为12～24小时。
9.如权利要求2-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述罗汉果醇的制备包括以下步骤：
（S1）加压水解：将罗汉果提取物用水溶解，加入酸，加压加热水解，冷却后得水解液；
（S2）上柱吸附：往水解液中加入醇，醇水溶液通过吸附树脂柱；
（S3）梯度洗脱：先用水或醇水溶液将树脂柱冲洗至中性，再用低度醇洗脱，最后用高度醇洗脱，收集高度乙醇洗脱液；
（S4）浓缩、干燥：将高度醇洗脱液减压浓缩，干燥，得罗汉果醇粗品；
（S5）精制：罗汉果醇精制：将罗汉果醇粗品用有机溶剂加热溶解，加入活性炭，加热回流，冷却至室温，过滤，浓缩，搅拌，冷却析晶，抽滤，干燥，得罗汉果醇精品；11-O-罗汉果醇精制：结晶母液浓缩后经硅胶柱吸附、洗脱，洗脱液浓缩、干燥，得11-O-罗汉果醇。
10.权利要求1所述的乙酰化罗汉果醇或者权利要求2-9任一项所述制备方法制得的乙酰化罗汉果醇在制备药品中抗氧化剂的用途。
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