CN104418925B - 一种制备高纯度非达霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备高纯度非达霉素的方法。具体的，本发明的方法包括使用树脂层析和结晶的技术制备高纯度非达霉素。本发明的优点是两次柱层析都采用了普通的常压柱而没有采用中压制备色谱，从而大大减少了生产的前期设备投入，对设备要求低，有效的降低了生产成本，并且本发明采用树脂吸附和结晶的技术方法纯化非达霉素，操作方法简单，收率和纯度大大提高，本发明的总收率为50~60%，纯度99%以上，更适合应用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，具体涉及一种大环内酯类抗生素的提取方法，更具体的，涉及非达霉素的提取方法。
背景技术
艰难梭菌感染（Clostridium dfficile infection，CDI）是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌过度生长并释放毒素引起，可导致结肠炎症、严重腹泻甚至死亡。
非达霉素（Fidaxomicin）是一种由放线菌属指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subspecie hamdenensis NRRL 18085 发酵产生的18元环大环内酯类抗生素，又叫非达米星、台勾霉素B，2011年5月27日获FDA批准，用于治疗难辨梭菌（难辨梭状芽胞杆菌）相关性腹泻（CDAD）的抗生素。其作用机理新颖，主要是通过抑制细菌的RNA聚合酶而产生迅速的抗难治梭状芽孢杆菌感染（CDI）作用。其治疗CDI优于现有药物。同时，研究发现非达霉素可用于治疗胃肠癌，具有非常广阔的前景。非达霉素CAS Registry Number:873857-62-6；分子式：C52H74Cl2O18；结构式如下式I：
现有技术中，多采用反相色谱的方法制备非达霉素。
中国专利CN102219815A 中公开了一种非达霉素的制备方法，该方法通过凝胶Sephadex LH-20和硅胶YMCGEL ODS-A反相中压色谱和薄层层析法相结合得到非达霉素。该方法步骤繁多，得到的非达霉素纯度低。
中国专利CN1688707A公开了采用反相介质压力液相色谱法，以硅胶键合C18为固相，以乙腈/水/乙酸为流动相，提纯非达霉素的方法。该方法的缺点是只能制得93%纯度的非达霉素，收率只有30%，成本较高，不适合工业化生产。
中国专利CN102993251A公开了一种用高效液相色谱纯化非达霉素的方法。该方法用Uni30BPC单分散性聚合物微球作为填料进行制备柱层析以制得较高纯度的非达霉素。但该方法的缺点是填料价格高，填料上样量低，制备色谱的投入大，生产成本高，不适合工业化生产。
中国专利CN102030791B公开了四种台勾菌素的制备方法，该方法将从大孔吸附树脂中提取的粗提物，先进行萃取和浓缩，得到粗品，粗品经过硅胶柱层析，凝胶柱层析，再次用硅胶柱层析，最后经过ODS反相中压液相色谱才能分别制备得到四中台勾菌素类化合物。该方法需要使用两次硅胶柱层析，并用到ODS反相中压液相色谱，操作繁琐，成本高。
现有技术中都会用到制备色谱这一设备，而该设备存在前期投入大、运行成本高等缺点。
因此急需找到一种操作简单，收率高，纯度高且生产成本低，适合于工业生产的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种产品纯度高，生产成本低的非达霉素的制备方法，其技术方案如下：
一种制备高纯度非达霉素的方法，该方法包括以下步骤：
1）将非达霉素发酵液用极性有机溶剂浸提，过滤得到滤液；
2）将滤液加水稀释后，导入大孔吸附树脂进行吸附；
3）吸附完毕，采用极性溶剂的水溶液作为预洗液对树脂净化，然后用极性溶剂与水混合而成的解吸液进行解吸，得到非达霉素的粗品解吸液I；
4）将解吸液I浓缩，结晶，得到非达霉素粗品；
5）非达霉素粗品用乙腈的水溶液溶解成上柱液，导入大孔吸附树脂吸附进行吸附，经解吸液解吸得到非达霉素解吸液II；
6）将非达霉素解吸液II蒸除溶剂得到固体，固体用极性有机溶剂结晶，得到非达霉素产品。
其中，步骤1）中所述的发酵液包括将发酵液过滤或离心后得到的菌丝体；所述的极性溶剂选自甲醇、乙醇或丙酮中的一种，或其中任一种与水的混合溶液，所述混合溶液的浓度为50%~80%（V/V），优选70%；所述极性溶剂用量与菌丝体的体积重量比为1~5:1（ml/g），优选2~3:1（ml/g）。
步骤2）所述的大孔树脂为DIAION HP20、HP21、SEPABEADS、SP825L、SP850、SP700、SP70或SP207，优选SP825L；其用量与上柱液中非达霉素的体积重量比为50~150:1（ml/g），优选100:1（ml/g）。
步骤2）所述的将滤液加水稀释是将滤液稀释至有机溶剂浓度为30%~60%，优选50%。
步骤3）所述的极性溶剂为甲醇、乙醇或丙酮；所述的预洗液浓度为50%-70%（V/V），用量为2~3倍柱体积，优选乙醇的水溶液为预洗液；所述的解吸液的浓度为60-90%（V/V），用量为2~5倍柱体积，优选乙醇与水的混合溶液作为解吸液。
步骤4）所述的浓缩是在40℃~60℃温度条件下进行，浓缩至有机溶剂浓度为10%~15%。
步骤4）所述的结晶为将浓缩后的解吸液I温度降至0℃~20℃，抽滤、压滤或离心后得到非达霉素的一次结晶品的过程或者是将非达霉素的一次结晶品再用有机溶剂进行一次或多次结晶的过程。所述的有机溶剂结晶，包括在合适的溶剂体系（例如甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯中的一种，或混合溶剂甲醇/水、乙醇/水、乙酸乙酯/石油醚、乙醇乙酯/正已烷中的一种）和合适的温度条件下进行；例如先将非达霉素的一次结晶品溶于乙酸乙酯中，然后将溶液降温至5℃，再向其中滴加5℃的石油醚，将混合溶液在3℃~8℃条件下搅拌至晶体析出量不再增加，过滤，干燥后得到非达霉素粗品。
步骤5）所述的大孔吸附树脂选自UniPS3、UniPS5、UniPS10、UniPS15、UniPS20、UniPS30、UniPS40或UniPS50，其用量与上柱液中非达霉素重量比为50~150:1（V/W）优选100:1；所述的乙腈水溶液浓度优选50%；所述解吸液为40~70%的乙腈水溶液，优选50%，用量为5~12倍柱体积，分段收集解吸液。
步骤6）所述的将非达霉素解析液II蒸除溶剂得到固体，可以在50℃~60℃温度条件下，通过真空减压浓缩至有固体析出，然后冷却至室温，加入合适的非水溶性有机溶剂（例如乙酸乙酯）进行溶解，萃取，除去水层，再将有机层浓缩至干，得到固体；所述的固体用极性溶剂结晶，包括将固体用合适的极性溶剂（如甲醇、乙醇或异丙醇）在适当的温度条件下进行结晶，在适当的温度条件包括先将固体的极性溶液加热到50℃溶解，然后降温至5℃继续搅拌，通常在此条件下，会有白色固体析出，将析出的固体过滤，干燥，即可得到非达霉素的白色固体粉末。
本发明提供的非达霉素的制备方法是一个具有工业化价值的新工艺，主要具有如下优点和积极效果：
首先，在制备的过程中，本发明两次柱层析都采用了普通的常压柱而没有采用中压制备色谱，从而大大减少了生产的前期设备投入，对设备要求低，有效的降低了生产成本。
第二，本发明采用的都是常用的工业设备，具有操作简便、运行费用低等特点。本发明采用的树脂具有上柱量大，适于大规模生产，降低生产成本的优点。
第三，本发明采用树脂吸附和结晶的技术方法纯化非达霉素，操作方法简单，收率和纯度大大提高，本发明的总收率为50~60%，纯度99%以上，更适合应用于工业化生产。
附图说明
图1是实施例一中所用发酵液的HPLC色谱图，非达霉素的保留时间约为13.10分钟。
图2是按照实施例一制备的非达霉素粗品1的HPLC色谱图，非达霉素的保留时间约为16.06分钟。
图3是按照实施例二制备的非达霉素粗品2的HPLC色谱图，非达霉素的保留时间约为16.04分钟。
图4是按照实施例三制备的高纯度非达霉素的HPLC色谱图，非达霉素的保留时间约为11.80 分钟。
具体实施方法
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。发明所用非达霉素发酵液均为重庆乾泰生物医药有限公司发酵部门用微生物培育手段获得；SP825L、SP700、HP21等树脂是由日本三菱化学公司生产；UniPS40、UniPS 50、UniPS3等是由苏州纳微生物科技有限公司生产；乙醇、乙腈、乙酸乙酯等溶剂均为市售。
实施例1
将80L发酵液（HPLC色谱图如图1所示）压滤得到28.5kg菌丝体。向菌丝体中加入90L 70%的乙醇溶液，搅拌5小时，过滤得到滤液94.3L，经HPLC检测滤液内含非达霉素187g。将滤液用纯化水稀释至乙醇浓度为50%后，导入SP825L吸附树脂，装量为20L，树脂用40L 60%的乙醇溶液预洗，流速（1BV/h），然后用100L 70%的乙醇溶液解吸，流速（1BV/h），每2L收集一个组份，并将纯度在70%以上的组份混合。然后将混合组份减压浓缩至乙醇浓度为13%。静置冷却至15℃，抽滤，干燥得到224g黄色固体，收率71.8%，HPLC：76.7%（HPLC如图2所示）。
实施例2
将实施例1得到的224g黄色固体溶于3.5L乙酸乙酯中，溶解，降温至5℃，在搅拌下将2.3L 5℃的石油醚滴入上述乙酸乙酯溶液中，滴加完后维持温度在3-8℃下搅拌5小时。过滤，将滤饼真空干燥，得到类白色粉末192g，收率85%，HPLC: 77.3%（HPLC色谱如图3所示）。
实施例3
将实施例2得到的类白色粉末40g用1L 50%乙腈水溶液溶解成上柱液，导入UniPS40树脂进行吸附，树脂装量为5L，上柱流速为5L/h。然后用40L 65%的乙腈水溶液解吸，分段收集，将纯度95%以上组份混合。将混合液在50-60℃温度下真空浓缩至有固体析出后停止浓缩，冷却至室温，加入乙酸乙酯搅拌，溶解，萃取，弃去水层。合并乙酸乙酯层浓缩至干，得到白色固体，加入乙醇加热至50℃溶解，乙醇用量为白色固体重量的12倍，在搅拌下降温至5℃，有白色固体析出，继续搅拌至析出固体不再增加，过滤，真空干燥，得到白色粉末21.3g，HPLC：99.1%（ HPLC色谱图如附图4所示）。
经过以上三步骤非达霉素的总收率为52.3%，HPLC：99.1%。
实验例4
将80L发酵液（HPLC色谱图如图1所示）压滤得到29.5kg菌丝体。向菌丝体中加入59L乙醇溶液，搅拌5小时，过滤得到滤液约65L，经HPLC检测滤液内含非达霉素 188g。将滤液用纯化水稀释至乙醇浓度为50%后，导入SP825L吸附树脂，装量为18.8L，树脂用3倍柱体积的 60%的乙醇溶液预洗，流速（1BV/h），然后用2~3倍柱体积的70%的乙醇溶液解吸，流速（1BV/h），每2L收集一个组份，并将纯度在70%以上的组份混合。然后将混合组份减压浓缩至乙醇浓度为13%。静置冷却至15℃，抽滤，干燥得到224g黄色固体。
将224g黄色固体溶于乙醇中，降温至3℃，搅拌析出晶体。将固体抽滤，干燥得到非达霉素粗品。将非达霉素粗品用50%的乙腈水溶液溶解成上柱液，导入UniPS 50 树脂，装量为22.4L，用9倍柱体积的70%乙腈水溶液解吸，分段收集解吸液，并将纯度90%以上的组份混合，将混合液浓缩至干，得到米白色固体。向固体中加入少量异丙醇并加热到50℃至固体完全溶解，然后降温至5℃继续搅拌至固体析出不再增加，过滤，干燥，得到非达霉素白色固体22.03g，收率54.1%，纯度98.88%。
实施例5
将80L发酵液（HPLC色谱图如图1所示）压滤得到30.3kg菌丝体。向菌丝体中加入50%甲醇溶液30.3L，搅拌5小时，过滤得到滤液33.1L，经HPLC检测滤液内含非达霉素191g。将滤液用纯化水稀释至甲醇浓度为30%后，导入SP700吸附树脂，装量为9.55L，树脂用50%的甲醇溶液预洗，用量为2~3倍柱体积，流速（1BV/h），然后用60%的甲醇溶液解吸，用量为5倍柱体积，流速（1BV/h），分段收集，并将纯度在70%以上的组份混合。然后将混合组份在40℃条件下减压浓缩至甲醇浓度为10%。静置冷却至0℃，抽滤，干燥得到178.2g黄色固体，收率71%，HPLC：73.4%。
实施例6
将实施例5得到的178.2g黄色固体溶于4L甲醇中，降温至5℃，维持温度在3-8℃下搅拌5小时。过滤，将滤饼真空干燥，得到类白色粉末155.8g，收率83%，HPLC: 77.3%。
实施例7
将实施例6得到的类白色粉末40g用1L 50%的乙腈水溶液溶解成上柱液，导入UniPS3树脂进行吸附，树脂装量为2L，上柱流速为5L/h。然后用40%的乙腈水溶液解吸，用量为5倍柱体积，分段收集，将纯度95%以上组份混合。将混合液在50-60℃温度下真空浓缩至有固体析出后停止浓缩，冷却至室温，加入乙酸乙酯搅拌，溶解，萃取，弃去水层。合并乙酸乙酯层浓缩至干，得到白色固体22.1g，加入乙醇200ml加热至50℃溶解，在搅拌下降温至5℃，有白色固体析出，继续搅拌至析出的固体不再增加，过滤，真空干燥，得到白色粉末19.3g。
经过以上三步骤非达霉素的总收率为50.6%，HPLC：98.7%。
实施例8
将80L发酵液（HPLC色谱图如图1所示）压滤得到28.5kg菌丝体。向菌丝体中加入80%丙酮溶液142.5L，搅拌5小时，过滤得到滤液149.1L，经HPLC检测滤液内含非达霉素177g。将滤液用纯化水稀释至丙酮浓度为60%后，导入HP21吸附树脂，装量为28L，树脂用70%的丙酮溶液预洗，用量为2倍柱体积，流速（1BV/h），然后用90%的丙酮溶液解吸，用量为3倍柱体积，流速（1BV/h），分段收集，并将质量浓度在1.5mg/ml以上的组份混合收集。然后将混合组份减压浓缩至乙醇浓度为15%。静置冷却至20℃，抽滤，干燥得到195.7g黄色固体，收率85.3%，HPLC：68.7%。
实施例9
将实施例8得到的195.7g黄色固体溶于8L甲醇中，溶解，降温至5℃，在搅拌下将18L 5℃的纯化水滴入上述甲醇溶液中，摘加完后维持温度在3-8℃下搅拌5小时。过滤，将滤饼真空干燥，得到类白色粉末160.8g，收率77%，HPLC: 73.8%。
实施例10
将实施例9得到的类白色粉末80g用2L 50%乙腈溶液溶解成上柱液，导入UniPS3树脂进行吸附，树脂装量为12L，上柱流速为5L/h。然后用70%的乙腈水溶液解吸，用量为12倍柱体积，分段收集，将纯度95%以上组份混合。将混合液在50-60℃温度下真空浓缩至有固体析出后停止浓缩，冷却至室温，加入乙酸乙酯搅拌，溶解，萃取，弃去水层。合并乙酸乙酯层浓缩至干，得到白色固体50.4g，加入605ml乙醇加热至50℃溶解，在搅拌下降温至5℃，有白色固体析出，继续搅拌至固体析出不再增加，过滤，真空干燥，得到白色粉末45.7g，HPLC：98.9%。
经过以上三步骤制备得到的非达霉素的总收率为 50%，HPLC：98.9%。
Claims (12)
1.一种制备高纯度非达霉素的方法，该方法包括以下步骤：
1)将从非达霉素发酵液中分离出的菌丝体用极性有机溶剂浸提，过滤得到滤液；所述的极性有机溶剂选自甲醇、乙醇或丙酮中的一种，或其中任一种与水的混合溶液，
2)将滤液加水稀释后，导入大孔吸附树脂进行吸附,所述的大孔树脂为DIAION HP20、HP21、SEPABEADS、SP825L、SP850、SP700、SP70或SP207；
3)吸附完毕，采用极性溶剂的水溶液作为预洗液对树脂净化，然后用极性溶剂与水混合而成的解吸液进行解吸，得到非达霉素的粗品解吸液I，所述极性溶剂为甲醇、乙醇或丙酮；
4)将解吸液I浓缩，结晶，得到非达霉素粗品；
5)非达霉素粗品用乙腈的水溶液溶解成上柱液，导入大孔吸附树脂进行吸附，经解吸液解吸得到高纯度的非达霉素解吸液II,所述的大孔吸附树脂为UniPS3、UniPS5、UniPS10、UniPS15、UniPS20、UniPS30、UniPS40或UniPS50；
6)将非达霉素解吸液II蒸除溶剂得到固体，再用极性有机溶剂重结晶，得到非达霉素产品。
2.根据权利要求1所述方法，其中步骤1)中所述的分离为过滤、压滤或离心；所述的溶剂用量与菌丝体的体积重量比为1～5:1(ml/g)。
3.根据权利要求1所述方法，其中步骤1)中所述甲醇、乙醇或丙酮中任一种与水的混合溶液的浓度为50％～80％(V/V)。
4.根据权利要求1所述方法，其中步骤2)所述的大孔树脂用量与上柱液中非达霉素的体积重量比为50～150:1(ml/g)。
5.根据权利要求1所述方法，其中步骤2)所述的将滤液加水稀释是将滤液稀释至有机溶剂浓度为30％～60％。
6.根据权利要求1所述方法，其中步骤3)所述的预洗液浓度为50％～70％(V/V)，用量为2～3倍柱体积；所述解吸液的浓度为60％-90％(V/V)，用量为2-5倍柱体积。
7.根据权利要求1所述方法，其中步骤4)所述的浓缩是在40℃～60℃温度下进行，浓缩至有机溶剂浓度为10～15％。
8.根据权利要求1所述方法，其中步骤4)所述的结晶为将浓缩后的解吸液I温度降至0℃～20℃，抽滤、压滤或离心后得到非达霉素的一次结晶品的过程或者是将非达霉素的一次结晶品再用有机溶剂进行一次或多次结晶的过程。
9.根据权利要求8所述方法，其中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯中的一种，或选自混合溶剂甲醇/水、乙醇/水、乙酸乙酯/石油醚、乙酸乙酯/正已烷中的一种。
10.根据权利要求1所述方法，其中步骤5)所述的大孔吸附树脂用量与上柱液中非达霉素粗品的体积重量比为50～150:1(ml/g)。
11.根据权利要求1所述方法，其中步骤5)所述的乙腈水溶液浓度为50％；所述的解吸液为40～70％的乙腈水溶液，所述解吸液用量为5～12倍柱体积。
12.根据权利要求1所述方法，其中步骤6)所述的极性溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。
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| CN102219815A (zh) * | 2010-12-14 | 2011-10-19 | 中国科学院南海海洋研究所 | 六种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 |
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